JPS637782A - 微生物学的に製造されたα−アセチルアミノ桂皮酸−アシラ−ゼ、およびその取得法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、微生物学的に製造されたα−アセチルアミノ
桂皮酸−アシラーゼおよびその取得法に関する。

本発明は、以下の種類の反応に触媒作用する、これまで
記述されなかった酵素に関する：ＨＮ−Ｃ−ＣＨ３−Ｈ
Ａｃ　　　　　ＮＨ２殊に十分な反応率がＲ−Ｃ，Ｈ，
−で得られる。

問題点を解決するための手段 本発明による化合物、すなわちα−アセチルアミン桂皮
酸−アシラーゼは以下の％ＥＥｔｌ−特徴とする： １）反応性： α−７セチルアミノ桂皮酸と、α−イミノ−β−フェニ
ル−プロピオン酸ないＬＨフェニルピルビン酸の形成下
に反応する； ２）基質特異性： α−アセチルアミノ桂皮酸を加水分解するが、但し他の
α−アセチルアミノカルボン酸、例えばα−アセチルア
ミノアクリル酸またはＮ−アセチルフェニルアラニソを
加水分解しない； ６）最適−価： 蛙適−価が７．５±１である； ４）　　ｐｉ−１安定性ニ ー範囲６．９〜９．４で十分な安定性、すなわち４°Ｃ
で２週間後の反応率９０％以上を示す；５）最適温度： 最適温度が、−価７．５で５２°Ｃである：６）熱安定
性： ５５℃で、３０分の培養後になお反応率８０％が検出可
能であるニ ア）阻止剤および活性剤の影響： と９わけ水銀化合物、すなわちｐ−水銀ベンゾエートお
よびＨｇＣｌ２、ＣａＣｌ２および。−フェナンスロリ
ンが阻止的に作用し、ジチオトレイトール（１ｍモル）
の添加がこの酵素を活性化する： ８）分子量： 分子量が５００００±５０００ドルトンである： ９）構成単位： 分子が、それぞれ２６０００±３０００ドルトンを有す
る２つの同じ大きさの構成単位より成る； １０、）α−アセチルアミノ桂皮酸基質のｐ）１７．５
におけるＫＭ価が０．４５７７１モルである。

本発明によるα−アセチルアミノ桂皮酸−７シラーゼは
、アバディーン（スコツトランド）在のナショナル・コ
レクション・オプ・インダストリアル、バクテリア（Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏｆ　工ｎｄｕ
ｓｔｒｉａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　ｊｎ　Ａｂｅｒｄｅ
ｅｎ　（Ｓｃｈｏ−ｔｔｌａｎｄ　）　）に１９８６年
２月１４日付で番号ＮｃｒＢ１２２４６およびＮＣＩＢ
　１２２４７下に寄託された２２ｉのブレビバクテリウ
ム菌株を使用し得られることができる。

以下の特性は、これ２つの微生物がブレビバクテリウム
属であることを示す： これらは、世代の増大とともに球菌状態へ移行するダラ
ム陽性の短棒菌中で成長する。細、胞が不動であ夛かつ
胞子を形成しない。成長が厳密に好気性に行なわれる。

グルコースから酸が形成されない。カタラーゼ反応およ
び硝酸塩還元が正、尿素分解が正、ゼラチン−、カゼイ
ン−および殿粉分解が負、Ｈ２ｓ形成が負、４１℃にお
ける成長が負である。細胞壁糖として、アラビノース、
マンノースおよびガラクトースが検出された。これら微
生物は、親液化培養物として、−８０°でまたは液体窒
素中−１９６℃で貯蔵されることができる。使用培養物
が傾斜寒天試験管（ＡＣＡ媒体）で保持される。

本発明によるα−アセチルアはノ桂皮酸−アシラーゼを
取得するため、ブレビバクテリウム属菌ＮＣより　１２
２４６　またはＮＣＩＢ　１２２４７カζ炭素および窒
素の給源、チアミン、鉱物塩および、誘導物質としての
α−アセチルアミノ桂皮酸ｔ−官有する水性培養液中で
、出発−価６．０〜８．０および温度２５〜３５°Ｃで
通気培養され、　。

細胞物質が分離され、かつ酵素が細胞から単離される。

例えば、多重の酵素が、ブレビバクテリウム属菌ＮＣＩ
Ｂ　１２２４６またはＮＣＩＢ　１２２４７　ｔｌ”自
体公知の方法で所望の規模、例えば１０を規模のバイオ
リアクタ中で培養するようにして得られることができる
。有効な培養に１要なのが以下の通シであるニ ー十分な通気（好気性微生物に不可欠）；−媒体中の出
発−価６．０〜８．０； −鉱物塩の存在（例えば、とうもろこし膨化水として複
合せる形で）； −わずかな量のチアミン（１〜２μＭ／ｌ　）の存在、
および 一酵素誘導用媒体中のＡＣＡ　（０，２〜０．４］Ｌｔ
パーセント）の存在。

酵素の単離は、細胞を砕解した後、自体公知の酵素精製
法を組合せることによシ可能である。

このものは、中間工程ヲ紗てα−イミノ−β−フェニル
プロピオン酸ないしにフェニルピルビン酸を生じる酵素
反応用の結合酵素系の取分として使用されることができ
る。従って、例えばこのものｉｊ、ＡＣＡ’ｉ相応する
α−アミノカルボン酸まｆｃはα−ヒドロキシカルボン
酸へ変換するため、適当なデヒドロゲナーゼと組合せる
ことができる。このものは、例えばＡＣＡ　ｉ、Ｌ−フ
ェニルアラニン−デヒドロゲナーゼと組合せた場合Ｌ−
７二二ルアラニンヘｆ換Ｌ、Ｌ−２−ヒドロキシ−４−
メチルペンタン酸−デヒドロゲナーゼと組合せた場合し
一フェニル乳酸へ変換し、かつＤ−２−ヒドロキシ−４
−メチルペンタン酸−デヒドロゲナーゼと組合せた場合
Ｄ−フェニル乳敗へ変換する。

実施例 以下に、本発明を実施例につき詳説する。実施例中の「
パーセンテージ」は、他に別記しなイ１ｉｌｒ：！ｉｔ
パーセント」を表わす。

例１：α−アセチルアミノ桂皮酸−アシラーゼ産生菌の
スクリーニング ブラウンシュヴアイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）近
郊からの１０個の土壌テンプルを、無菌の塩溶ｇ　（Ｎ
ａＣｔＯ−９％）に懸濁し、常法で希釈し、かつ１部分
の水性上澄みｇ、ｔｌ−固体培地を有するベトリ皿へへ
らでなでつけた。この培地は以下の組＃：を有した（　
ＡＣＡ媒体）： α−アセチルアミノ桂皮酸（ＡＣＡ）　　　　５　、！
Ｔ’（ＮＨ４）２８０４　　　　　　　　　　　　　０
−２５＆に２ＨＰＯ４２Ｍ 酵母エキス　　　　　　　　　　　　　０．２＆トレー
サーの＃ｙ　　　　　　　　　　　　１成Ｍｇ５Ｏ，・
７Ｈ２０１００■ ＣａＣＯ３２０１ｎＱ 蒸溜水　　　　　　　　　　　　　　　　１を寒天　　
　　　　　　２０９ 一価　　　　　　　７・５ この媒体をオートクレーブ処理することによりＦｊ、菌
し、冷却後に、媒体１を当り滅菌濾過せるビタミン浴ｇ
１１Ｌｔおよびシクロヘキシミド（アクチジオン）５０
即ｔ’添加し、かつこの培地を無菌のペトリ皿へ注入し
た〔ビタミン溶液の組成は、Ｈ，Ｇ、シュレーグル（８
ｃｈｌｅｇｅｌ　）１アルデマイネ・ミクロピオロギー
“（Ａｌｌｇｅ−ｍｅｊｎｅ　Ｍｉｋｒｏｂｊｏｌｏｇ
ｉｅ　）、チーメ・フエルラーク（Ｔｈｊｅｍｅ　Ｖｅ
ｒｌａｇ）、１６９頁（１９８１年）による〕。

接種したプレートを、６〜４日２７°Ｃで培養した。微
生物の生長後、適当なコロニー数（５０〜２００）ｋ有
する寒天プレートからコロニーサンプルを無菌でビロー
ドスタンパ（Ｓａｍｔｓｔｅ−ｍｐｅｌ）に採夛、その
後に、異なる寒天培地金含有スる２つのプレートにスタ
ンプ移植した：１方のプレートが前記ＡＣＡ媒体を含有
し、他方が以下の組成を有するフェニルアラニン含有培
養液（フェニルアラニン媒体〕を含有した：Ｌ−フェニ
ルアラニン　　　　　　　　１０ＩＫＷ２Ｐ０．　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２　！１酵母
エキス　　　　　　　　　　　　　０．２Ｉ寒天　　　
　　　　２０　＆ 蒸溜水　　　　　　　　　　　　　　　１を一１曲を７
．２に調節した。

これらプレー）ｋ再び３〜５日２７℃で培養した。コロ
ニーサンプルを比較することにより、ＡＣＡ媒体でもま
たフェニルアラニン媒体でも成長することのできる同じ
微生物が検出されることができた。これらを採りかつ次
いでＡＣＡ媒体に保持した。

その後に、単離されたこれら微生物全常法で納置を検査
した（希釈塗布、顕微鏡検査）。その後に、同一と認め
られる菌株を、准状媒体１００Ｎ（２つのじゃま板を有
する５００Ｍエルレンマイヤーフラスコ）中で２７℃で
円運動振とり装置上１２　Ｏｒｐｍで繁殖させた。この
液状媒体は以下の組成？！−有しｆｃ＝ α−７セチルアミノ桂皮＃１．（ＡＣＡ）　　　　３１
１（ＮＨ４）２８０４　　　　　　　　　　　　０−２
５９酵母エキス　　　　　　　　　　　　１ｇとうもろ
こし膨化水（乾燥粉末＞　　　５ｆｌＫ、ＨＰｏ、　　
　　　　　　　　　　　　　２１１蒸溜水　　　　　　
　　　　　　　　１ｔｐＨ７，５ ２〜６日後、振とうフラスコの内容物を遠心分離しく２
０分冷間遠心分離機中１００００＆で）、かつ沈殿せる
細胞を０．０５　Ｍの燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４
）に懸濁し７？、（バクテリア−含水物質１１轟シ緩衝
液４Ｍ）０ その後に、この懸濁液中の微生物全常法で砕解する必要
がある（例えば、微小ながラスビーズを使用する振とう
、超音波処理、フレンチプレス）。本発明者等は、懸濁
液にガラスピーズ（０，１〜０．２　ｍφ）き混合し、
その場合細胞懸濁液１成１）ガラスピーズ２ｙを使用し
、かつその後に試験管中で１０分実験呈用振とう装置〔
リアツクス（Ｒｅａｘ　）　１−　Ｄ　−Ｒ型、ハイド
オルフ社（Ｆｉｒｍａ　Ｈｅｊｄｏｌｐｈ　）　）　ｆ
使用し混合した。これら条件下に、大部分の分離物を十
分に砕解することができた。禾浴解の細胞成分およびガ
ラスピーズを遠心分離によシ分離した〔エツペンドル７
卓上遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｔｉｓｃｈｚｅ
ｎｔｒｉｆｕｇｅ　）中１２００　Ｏｒｐｍで２分〕。

その後に、この上置み液を＃累源（粗製エキス）として
試験した。酵素を検出するため、測光法試験を使用した
。試験バッチは以下を含有した二ＮＡＤＨ０，１ｍＭ ＡＣＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍＭ
Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロ ＮＡＤＨの３４　ＯｎＩｎにおける吸光夏低減が測定さ
れた。得られた価から、試験がＡＣＡ添加なしに進行し
た場合に得られた零価を差引いた・酵素活性ｔ−国際単
位で記載した、その場合１単位がＮＡＤＨ１μモル／分
の低減を表わす。

この試験において最高の活性を示した凶株が、ブレビバ
クテリウム属菌５７／３　（ＮＣＩＢ　１２２４６）お
よび３８／３　（Ｎ（ＪＢ　１２２４７　）である。ア
シラーゼの大規模製造には菌株３７／３に使用する。

例２：α−アセチルアミノ桂皮酸−アシラーゼの製造 ａ）ブレビバクテリウム属菌３７／３の１０を規模の培
養 バイオリアクタを使用し、これに媒体１０ｔｔ−ａ填し
た。この媒体は、１を当９以下を官有した： ＡＣＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３　
、ｌｉ’（ＮＨａ）＊５Ｏ４０−２５ｇ 酵母エキス　　　　　　　　　　　　　１ｙとうもろこ
し膨化水（乾燥粉末）１０９に、ＨＰｏ、　　　　　　
　　　　　　　　　　２．９−価が７．５であった。

滅菌後、この媒体に、４８時間同じ媒体中で培養した前
培養物３ＱＱＩｎｔを接種した。発酵装置中の成長条件
は以下の通りであった：温度　　　　　　　３０°Ｃ 通気速度　　　　　　　　　　　空気６０ｔ／時間ター
ビンミキサ　　　　　　　　　２５　Ｏｒｐｍ種々の成
長時間でサンプル（１ＱＱａｕ）を採シ、かつこれら細
胞の酵素活性に関する試験により達成可能な最高酵素含
有率ないしは最有利な採取時点を確定した。さらに、培
養物成長の尺度として濁度（光密度）　ｔ−５７８ｎｍ
で測定した。土量の７シラーゼは、微生物が十分に成長
し去った場合に形成されると判明した。最高価に達した
後、酵素活性が相対的に迅速に再び低減する。

ｂ）粗抽出物の取得 バクテリア−言水物質（２３０，９）ｔ−１２０ｍＭ燐
酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）中に２−メルカゾトエタノー
ル０．１％の添加下に懸濁し、その結果細胞懸濁液の１
１１度が４０％であった（この場合の最終容積５７５Ｍ
）。細胞含有成分を、冷却せる懸濁液（〜４°Ｃ）から
、バッハオーフェン社（Ｆｉｒｍａ　Ｂａｃｈｏｆｅｎ
　）のガラスピーズミル〔ダイノミ＆　（Ｄｙｎｏ−Ｍ
ｉｌｌ　）、ＫＤＬ型〕中で機械的に細胞砕解すること
によシ分離した。この場合、３００μ容量のミル容器に
０．２５〜０．５籠のガラスピーズを装填し、その結果
嵩容積２５５１１１が得られた（８５％）１．砕解ｔ、
ミキサ軸回転数３００　Ｏｒｐｍおよび流量５ｔ／ｈで
実施した。生成物の発熱を十分に回避するため、ミル容
器の冷却ジャケット並びにミキサ軸々承を、回転中に一
２０℃のエチレングリコール溶液で冷却した。３回の通
過後に、砕解率９０％が得られた。ホモジナイズ後に、
懸濁液の一価を苛性カリ溶液でｐ）１７．５に調節した
。

Ｃ）液−液分散 第１の分散工程で、細胞破片を粗抽出物から西ドイツ国
特許明細書第２６３９１３９号によシ分離する。この目
的で、混合物１．１５に９中にポリエチレングリコール
６０００　１０（重量／菖量）％、ｐ）１８．０に相応
する燐酸塩緩衝剤７（１景／ｉｆ量）係、塩化ナトリウ
ム０．０５Ｍおよび粗抽出物５７５ｍ１ｔ含有する水性
の２相混合＠を製造した。分散の平衡を得るため、この
２相混合物を１時間にわたり攪拌しかつ引続き遠心分離
により分離した。

上相（７４５１Ｍ）がＡＣＡ−アシラーゼ９０％以上を
含有した。下相が細胞破片並びに、これら条件下に下相
中へ抽出きれた蛋白−ｉｔ金含有、かつこれを廃却した
。酵素金言有する上相に、ＮＬＰ：谷！１．５ｔに対し
、ｐｌＬ６．０に相応する燐酸塩緩衝剤８（Ｉｔ警／谷
甘せ％および塩化ナトリウム０．６　Ｍ　ｋ混合しかつ
１時間撹拌した。形成されたポリエチレングリコール／
塩混合物は、沈殿容器中でほぼ１時間で完全に沈殿する
ことができた。この分散工程において、ＡＣＡアシラー
ゼがほぼ完全に下相中へ抽出された。これら相の分離ヲ
、下相（１０４０μ）全排出することにより行なった。

ｄ）　　フェニル−セファロース（Ｐｈｅｎｙｌ−８ｅ
ｐｈａ−ｒｏａｅ）ＣＬ−４ＢＫよるりｏ”ｖトゲラフ
イーＡＣＡ−アシラーゼｔ−宮有する塩に冨む下相を、
直接に疎水性のフェニルセファロースＣＬ−４Ｂでクロ
マトグラフ処理した。この方法の利点は、塩に富む下相
の、クロマトグラフ工程前の時間のかかる透析がなくな
ることである。このフェニル−セファロースＣＬ−４Ｂ
は、ｐＨ７，５に相応する燐酸塩緩衝剤５０ｍＭ、２−
メルカプトエタノール０．１（谷！／容り％および硫酸
アンモニウムＩＭｔ−含有する緩衝液（出発緩衝液）に
対し平衡化されていた。第２の分散工程の下相’ｅ、５
Ｘ１１ｃＩｎカラムへ装入しかつ２カラム容量の出発緩
−Ｊ＃放で後洗浄し友。その後にＡＣＡ−７シラーゼを
、ｐＨ７，５に相応する燐酸塩緩衝液１　ｍＭで溶離し
た。

ｅ）モノＱ　（Ｍｏｎｏ　ｑ　）による高速蛋白質液体
クロマトグラフィー（Ｆａｓｉ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｊ
ｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　：　ＦＰＬＣ
）溶離物を、スーパー・ループ（５ｕｐｅｒ　Ｌｏｏｐ
）を経て０−５Ｘ５ｃ１ｎモノＱカラム（ＦＰＬＣ：　
スｘ−デン国つプサラ在ファーマシ７社（ＦｉｒｍａＰ
ｈａｒｍａｃｉａ　、　Ｕｐｐｓａｌａ　、　Ｓｃｈｗ
ｅｄｅｎ　）の装置〕へ装入しかつ圧力最高４０　ｂａ
ｒでクロマトグラフ処理した。蛋白質量５８ｒｎ９に対
し、２行程が必要であった。その前にアニオン交換体ヲ
、−７，５に相応する燐酸塩緩衝液１０　ｍＭに対し平
衡化した（出発緩衝液）。

塩 ＡＣＡアシラーゼを、出発緩衝液中に７化ナトリウム０
．１〜０．４　Ｍ　？含有する直線的な２０１ｄ勾配で
溶離した。溶離を塩化ナトリウム０．２５〜０．３Ｍで
行なった。このようなりロマトグラフイーの時間に約２
０分あてることができる。

ｆ）スプロース（５ｕｐｅｒｏｓｅ　）　１２による高
速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）スプロー
ス１２を充填したカラム（ＨＲ１０／３０）を、ｐ）１
７．５に相応する燐酸塩緩衝剤５０ｒＩＬＭおよび塩化
ナトリウム０．１５Ｍｔ−含有する緩衝液に対し平衡化
した。Ｑカラムからの溶離物を、差当りアミコン社（Ｆ
ａ、　Ａｕ１ｃｏｎ　）のミニコン濃縮装置（Ｍｉｎｉ
ｃＯｎ−ＫＯｎＺｅｎｔｒａｔＯｒ　）中で容積５００
μｔに濃縮しかつその後に２行程でそれぞれサンプルｆ
２５０μｔを使用しスプロース１２で濾別した。スプロ
ース１２によるグル濾過（ＨＲ１０／３０カラム；圧力
〜６０ｂａｒ　）の時間は約４０分である。

活性のフラクションを合し、グリセリン５０（ＴＬ量／
容ｆ）％を混合しかつ一２０°Ｃで凍結した。

精製の結果を第１表に１とめた。

例６：α−アセチルアミノ桂皮酸−アシラーゼの誘導 ａ）培養媒体の変更 アシラーゼは、ブレビバクテリウム属菌３７／３ｔ−１
Ｃ−およびＮ給源としてのＡＣＡ　含有する媒体中で培
養した場合に形成される。実際に酵素収率（Ｕ／、！ｉ
ｌ　　ＡＣＡ）は相対的にわずかである。第２表に示し
たように、収率は、媒体が付加的に適当な窒素含有化合
物を含有した場合に増大されることができる。グリセリ
ンまたはグルコースのよりなＣ給源がアシラーゼ形成全
阻止する。

第２衣：媒体の組成との関連におけるアシラーゼ活性（
全ての媒体は、それぞれ ＫＨ２ＰＯ４２＆　／　Ｌ　％　　ビタミン＋トレーサ
ーを含有した：ＰＨが７．５であった）媒体ＣＩＡ）　
　　　　ｕ／ｌ　　ｍｕ／ｍｇＡＣＡ　（５）　　　　
　　　　　　　　３３　　　６０ＡＣＡ　（５）　＋　
（ＮＨ４）２８０４　（０−２５）　　　８０　　　９
０ＡＣＡ　（５）生酵母エキス（１）　　　　４０　　
　７０ＡＣＡ　（５）＋とうもろこし膨化 水（５）　　　　　　　　　　　１００　　９５ＡＣＡ
　（５）＋とうもろこし膨化 水（５）　＋　（ＮＨ４）２８０４　（０，２５）　　
　１１０　　９５ＡＣＡ　（５）＋グリセリン（１０）
　　　　Ｏ０ＡＣＡ　（５）＋グルコース（１０）　　
　　Ｏ０ｂ）　　ＡＣＡ濃度の変更 とうもろこし膨化水　　　　　　　５ｇ（ＮＨ４）２Ｓ
Ｏ４０−２５、Ｓ’ ＫＩ（２Ｐ０．　　　　　　　　　　　　　２　！１ビ
タミン浴液　　　　　　　　　　１′トレーサー溶液　
　　　　　　　　　１ＭＨ２Ｏ１ｔ より成るベース媒体に、種々の濃度のＡＣＡ　ｋ添加し
た。第３表は、媒体が１を当りＡＣＡ　２〜５ｇ全含有
した場合に、粗抽出物の十分な活性が得られることを示
す。

第３表：増大量のＡＣＡの存在において培養した場合の
酵素含有率 α−７シルアミノ桂皮酸　　　　　　　　アシラーゼな
し　　　　　　　　　００ ０・５　　　　　　　　３９　　０．０３６１　　　　
　　　　　５１　　０．０６８２　　　　　　　　　９
５　　０．１００３　　　　　　　　　１１２　　０．
１０８４　　　　　　　　　１３６　　０．１１６５　
　　　　　　　　１６９　　０．１０５ルアミノ桂皮酸
倹ｔｗからの加水分解による酢酸離脱、および後続する
、生じたフェニルぎルベートの、Ｌ−フェニルアラニン
−デヒドロゲナーゼの存在におけるＬ−フェニルアラニ
ンへの還元アミン化、またはフェニルピルベートへＤ−
２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デヒドロゲナ
ーゼの存在におけるＤ−フェニル乳酸への水素添加の反
応速度を、反応溶液の一価との関連において試験した。

試験バッチは、Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロゲナー
ゼとの関連において以下の組成を有した： ＮＡＤＨ０，２３ｍＭ ＡＣＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉ６
ｍＭＬ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼ０．５Ｕ 種々の一価における塩化アンモニウム溶液０．７Ｍ および制限量のＡＣＡ−７シラーゼ。

選択され九−価７．５〜１０．３を、試験バッチを形成
する前に、アンモニアないしは塩酸を塩化アンモニウム
溶液０．７Ｍに添加することによシｐ４節した。

最適な反応速度が一範囲７．５〜９にある。

試験バッチは、Ｄ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタ
ン酸−デヒドロゲナーゼとの関連において以下の組成を
有した： ＮＡＤＨＯ，１８ｍＭ ＡＣＡ　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，８８ｍＭ
Ｄ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デヒドロ
ゲナーゼ　　　　　　　　　、２．７　Ｕ種々の一価に
おける燐酸塩緩衝剤　　０．１　Ｍおよび制限量のＡＣ
Ａ−アシラーゼ。

選択され７ｃＰＨ価が−６，２〜８．０であった。

最適な反応速度が一範囲６．５〜７．８にある。

分解による酢酸離脱の温度依存性ｔｂ　ＡＣＡ−アシラ
ーゼおよびＤ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸
−デヒドロゲナーゼの存在において試験した。

フェニルぎルベートｅ水素添加するための試験バッチは
以下の組成を有した： ＮＡＤＨＯ，２３ｍＭ ＡＣＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　５　ｍＭ
−７，５に相応する燐酸塩緩衝剤　　　Ｑ、１Ｍこの反
応混合物を、１０分２５〜６０℃の種々の温度で培養し
、それぞれＤ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸
−デヒドロゲナーゼ２．５Ｕおよび制限量のＡＣＡ−ア
シラーゼを混合し、かつその後に選択された培養温度に
おける反応の速度を分光測光計で測定した。最高反応速
度が５２℃で得られた、従ってこれは標準温度３０℃に
おけるよりも倍数２．５だけ大である。

例６：　ＡＣＡ−アシラーゼの一安定性ＡＣＡアシラー
ゼの一安定性を一価範囲５．０〜１１．０で試験した。

この酵素を所定の時間種々の一価に維持し、かつその後
にＡＣＡ−アシラーゼ活性を標準的条件下に３０℃で測
定した。試験的に、この酵ｙ／！、を、種々のめ価を有
する緩衝剤１００ｍＭで１：１１に希釈した。これら種
々の一範囲のために、以下の緩衝剤を使用した：クエン
ｉ！ｌ！　／　ＮａＯＨ１００ｍＭ　　　ｐ）１　ｓ、
　０＃　５−５；　６．０燐酸カリウム　　　　　　　
ｐＨ６，０：６．５；７．０ニア、５；８．０ トリス／　ＨＣ２ｐ）１８．０：８．５：９．ＯＮＨ，
ＣＬ　／　ＮＨ，ＯＨｐ）’１９．０：９．５グリシｙ
／ＮａＣＬ　／　ＮａＯＨｐＨ１０−０；１０−５：１
１−０；１１．５ 標準的条件： ＮＡＤＨＯ，２！１　ｍＭ ＡＣＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　５　ｍＭｐ
Ｈ７，５に相応する燐酸塩緩衝剤　　　０．１ＭＤ−２
−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−テヒドロデナー
ゼ　　　　　　　　　２．５０制限量のＡＣＡ−アシラ
ーゼ。

下記第４表は、ＡＣＡ−アシラーゼの、１時間、１日、
１週ないしは２週後の残存活性パーセンテージを示す。

２週後に、−範囲６．９〜９．４ではじめのＡＣＡ−ア
シラーゼ活性のなお９０％以上を検出することができた
。

例７　：　ＡＣＡ−アシラーゼの熱安定性ＡＣＡＣブー
ラーゼの熱安定性を温度範囲２５〜６０’Ｃで試験した
。この酵素ｔ、１０，２０および３０分選択された温度
で燐酸緩衝液（ｐｌ−１７，５）中で培養した。その後
に、残存するＡＣＡ−アシラーゼ活性を標準的条件下に
６０°Ｃで測定した。

標準的条件： ＮＡＤＨ０−２３ｍＭ ＡＣＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　５　ｍＭｐ
ｉ（７，５に相応する燐酸塩緩衝剤　　　０．１ＭＤ−
２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デヒドロゲナ
ーゼ　　　　　　　　　２．５Ｕ制限量のＡＣＡ−アシ
ラーゼ。

５５°Ｃで３０分培養した後、なお出発活性の８０％を
検出することができ、烙らに培養温度を増大させた場合
はＡＣＡ−アシラーゼが迅速に変性する。

例８：阻止剤および活性剤の影響 ＡＣＡ−アシラーゼの活性、およびこれから生じる化合
物：α−アセチルアミノ桂皮酸からの加水分解による酢
酸離脱の反応速度に対する種々の阻止剤および活性剤の
影響を、例７に記載せるような標準的条件下に測定した
。（変更：２価の金属イオン全使用する試験ｔ−ｐＨ８
，０用のトリス／　ＨＣｌ−緩衝剤０．１Ｍ中で実施し
た）。

結果を第５表にまとめた。

第５表：阻止剤および活性剤の影響 添加せず　　　　　　　　　０１００ ＭｎＣ２２１６３ 例９　：　ＡＣＡ−アシラーゼの分子量の測定および構
成単位の検出 天然酵素の分子ｉを、スプロース１２でｒル濾過するこ
とによシ測定した。ＦＰＬＣ装置（スエーデン国つプサ
ラ在ファーマシア社製）に連結せるカラム（１−ＯＸ３
０ｃ＊）ｋ、流ｉｔ　Ｏ，４ｄ／分で作動させ、その場
合被検物質として、モノＱで精製した酵素７５μｔｔ−
使用した。

基準蛋白質として、シトクロムＣ１ペプシン、オーバル
デミン、牛血漿アルブミン（ＢＳＡ　）、Ｄ−２−ヒド
ロキシイソカプロエート−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−２−
ヒドロキシイソカプロエートーデヒドログナーゼ、アル
ドラーゼ、Ｂ。

セレウス（ｃｅｒｅｕｓ　）からのＬ−アラニン−デヒ
ドロゲナーゼおよびＬ−ロイシン−デヒドロゲナーゼ、
およびフェリチンを使用した。

ＡＣＡ−アシラーゼの分子ｔは５ｏｏｏｏ±５０００ド
ルトンである。

ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤ８　）の存在に
おいてｒ／Ｉ／電気泳動することによシ、酵素の構成単
位の大き纒および数を測定することができた。構成単位
の分子量は２６０００士３０００ドルトンである。これ
は、ＡＣＡ−アシラーゼが２つの同じ構成単位より成る
ことを表わす。横蓋曲線には、ヘモグロビン、β−ラク
トグロブリン、キモトリデシノーｒンＡ１ペプシン、オ
ーバルデミンおよびＢＡＡ　′ｆ：使用した。

例１０：ＡＣＡ−アシラーゼ活性の基質濃度依存性 ａ）　　ＡＣＡ−アシラーゼの存在における化合物：α
−アセチルアミノ桂皮酸からの加水分解による酢酸離脱
、および後続する、Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロゲ
ナーゼの存在におけるＬ−フェニルアラニンへの還元ア
ミン化の反応速度の依存性を、以下の試験バッチで試験
した：塩化アンモニウム／アンモニア緩衝剤（ｐＨ８，
５）０．７　ｍＭ ＮＡＤＨ０，２３ｍＭ Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼ０．５Ｕ 制限蓄のＡＣＡ−アシラーゼ。

α−アセチルアミノ桂皮酸濃度を１〜３６ｒｎＭの範囲
内で変更し次。最適反応速度が１６ｍＭで得られると判
明した。α−アセチルアミン桂皮酸のＫＭ価が３．９鮨
である。

ｂ）　　ＡＣＡアシラーゼの存在における化合物：α−
アセチルアミノ桂皮酸からの加水分解による酢酸離脱、
および後続する、Ｄ−２−ヒドロキシ−４−メチルペン
タン酸−デヒドロゲナーゼの存在におけるフェニルピル
ベートのＤ−フェニル乳酸への水素添加の反応速度の依
存性を、以下の試験バッチで試験した： 燐酸塩緩衝剤（ｐ）１７．５　）　　・　　　　　０．
１ＭＮＡＤＨ’　　０−２３　ｍＭ Ｄ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デヒドロ
ゲナーゼ　　　　　　　　　　０．８Ｕ制限量のＡＣＡ
−アシラーゼ。

α−アセチルアミノ桂皮酸濃度ｔ　ｏ、ｉ〜１８ｍＭの
範囲内で変更した。最適反応速度が５　ｍＭで得られる
と判明した。α−アセチルアミノ桂皮酸のＫＭ価が０．
４５　ｍＭである。

測定は、にＭ価がＰＨ１曲に依存すること勿示す二ＫＭ
価が、ｐ）１７．５で０．４５　ｍＭであシ、ｐＨ８，
５で３．９　ｍＭである。酵素を特定するため、最適−
で測定された価を使用すべきであジ、すなわち基質ＡＣ
ＡＯＫＭ価が０．４５　ｍＭ　（ｐＨ７，５）である。

例１１　：　ＡＣＡ−アシラーゼの基質特異性１連の並
列バッチ中で、α−７セチルアミノ桂皮酸基員を他の化
合物によシ代替し、かつ酸素が他の基質を受容する程度
を試験した。

この場合以下の試験バッチを、使用基質に応じ使用した
： １８基質としてα−アセチルアミノ桂皮酸を使用する試
験： ＮＨ，ｃｔ　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，７ＭＮ
ＡＤＨ０，１ｍＭ α−７セチルアミノ桂皮’Ｉｌｌ　　　　　　　５０　
ｍＭＬ−フェニルアラニンーデヒドロデナーゼ　ＵＡｎ
ｔ ＡＣＡ−７シラーゼ　　　　　　　　　０．１明包ｐＨ
９，２ 活性を、例１に記載せるような測光試験により測定した
（　３４０　ｎｍにおいて）。

２、α−アセチルアミンアクリル酸を使用する試験： ＮＨ，ｃｔ　　　　　　　　　　　　Ｏ，７ＭＮＡＤＨ
０，１ｍＭ α−アセチルアミノアクリル酸　　　　５０　ｍＭＬ−
アラニンーデヒドロデナーゼ　　　１明鯰ＡＣＡ−アシ
ラーゼ　　　　　　　　　０．１いｔｐＨ８，０ 活性を、類似の方法で測光試験（３４０ｎｍにおける）
により測定した（　ＮＡＤＨ低減蓄低減上１３モルニン
形成ｆ１μモルに相応した）。

６、ペプチデンを使用する試験： 他の基質として、Ｎ−アセチル−Ｌ−７二二ルアラニン
、Ｎ−メトキシカルざニルーＤＬ−フェニルアラニンお
よび種々のペプチドを使用した。使用せるペプチドを第
６表Ｖｃ１とめた。

これらの場合、試験バッチは以下を含有した：燐酸カリ
ウム緩衝剤（ｐ）１７．５）　　　　　０．１　ＭＡＣ
Ａ−アシラーゼ（１７，８Ｕ／ｗ？）　　　　０．１　
Ｕ／ｆｎｇ基質　　　　　　　　　　　　　　　　５０
　ｍＭこれらバッチ（合計１　”　）　’ｆ”　攪拌し
く　３０　’Ｃ）かつ種々の時間でサンプルを採取した
。アシラーゼ作用による生じるアミノ酸を、アミノ酸分
折装置を使用し定量的に検出した。またこの場合、酵素
の活性が国際単位で記載されているが、活性１υが１分
車ジアミノ酸１μモルの形成に相応する。３つの試験バ
ッチで測定した活性を、第６表の第２欄に単位ｍＵ　／
　Ｍで記載した。相対活性（第６表の第３欄）ｔ−決め
るため、活性を基質：α−アセチルアミノ桂皮酸の丁度
に１００％に対比した。

第６表：　ＡＣＡ−アシラーゼの基質特異性アミノ酸誘
導体： α−アセチルアミン桂皮酸　　　　　　１２５　　１０
０α−アセチルアミノアクリル酸　　　　　０ＯＮ−７
セチルーＬ−フェニル− アラニン　　　　　　　　　　　　　　　ＯＯペゾチド
： Ｇｌｙ−Ｌ−ｐｈｅ４０　　３２ ’　Ｇｌｙ−Ｄ−ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　
　ＯＯＧｌｙ−ｇｌｙ−Ｌ−ｐｈｅ　　　　　　　　　
　　　　０　　　　０Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ｐｈｅ　　　　
　　　　　　　　　１０５　　　８４Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−
ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　１０２　　　８２Ｌ
−Ｐｈｅ−Ｌ−ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　４
１　　　　３３Ｌ−Ｈｌｓ−Ｌ−ｐｈｅ　　　　　　　
　　　　　　　４４　　　　３５Ｌ−８ｅｒ−Ｌ−ｐｈ
ｅ　　　　　　　　　　　　５６　　　２９Ｌ−Ａｓｐ
−Ｌ−ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　３８　　　３
０Ｌ−Ｌａｕ−Ｌ−ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　　
１０９　　　８７Ｌ−Ｌｓｕ−Ｌ−ｔ、ｒｐ　　　　　
　　　　　　　　６７　　　５４Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ｔｒ
ｐ　　　　　　　　　　　　　　６６　　　　５３Ｌ−
Ａｌａ−Ｌ−ｔ、ｙｒ　　　　　　　　　　　　　　７
８　　　　６２Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ｈｉｓ　　　　　　　
　　　　　　　　４３　　　　３４例１２　：　Ｌ−フ
ェニルアラニンの製造ＡＣＡ−アシラーゼにＬ−フェニ
ルアラニン−デヒドロブナ−＋Ｐを結合させた場合、生
じる中間生成物が還元アミン化によシ立体特異的にＬ−
フェニルアラニンに反応されることができる。

デヒドロダン化反応で酸化された補酵素を再生するため
、バッチにホルミエートーデヒドロｒナーゼ（Ｅ、Ｃ，
１，２，１，２−）およびホルミエートを添加する。こ
の場合、付加的生成物としてＣ０２が得られる。

種々の濃度のＡＣＡを有する種々のバッチを培養したが
、これらバッチはそれぞれ以下を含有したニ ア７モニｆ）ｌｈホルミエート（ｐＨ９，２）　　４０
０　ｍＭト　リ　ｘ／ＨＣ２（ｐ）１９−２　　）　　
　　　　　　　　　　　　２００　　ｍＭＮＡＤＨ０，
３ｍＭ ホルミエートーデヒドロｒナーゼ（クローネル等（Ｋｒ
ｏｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ　）　（１９８２年）ジエイ・ケ
ム・チクノル・バイオチクノル（Ｊ、　Ｃｈｅｍ。

Ｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　）第３２巻
、１３０〜１３７頁による試料〕　　　　　　　　１明
鍮Ｌ−フェニルアラニンーデヒドロデナーゼ（４４Ｕ／
Ｉｎｇｋ有する試料）　　　　　　　　　Ｉ　Ｕ／ｆｎ
ｌＡＣＡ−アシラーゼ　　　　　　　　Ｃ１，５ル似Ａ
ＣＡ　　　　　　　　　　　　　　　２Ｎ００騙罷容槓
が１Ｍであシ、培養を攪拌下に２８℃で行なった。産出
物形成をアミノ酸分析装置で追跡した。

第７表は、全てのバッチにおいて基質のフェニルアラニ
ンへの実際に完全な反応が行なわれたことを示す。

第７表二種々の量のＡＣＡのＬ−フェニルアラニンへの
反応 ２　　　　５０　　　　　６．５　　　５６３　　　１
００　　　　　６．５　　　９８反応後に、形成石れた
Ｌ−フェニルアラニンの光学的純度を測定した。このバ
ッチ中に、１部分の生成物が不溶性の形で結晶懸濁液と
して存在した（　ＰｈｅのＨ２０中溶解度（２５°Ｃ）
　−１８０ｍ１４　）　、全ての生成物を溶解するため
、バッチにＨ２Ｏ３１１１Ｊｉ添加した。セファデック
ス（８ｅｐｈａｄａｚ　）　Ｇ　−２５（ファーマシア
社製）でデル濾過することにより蛋白質を除去し、かつ
低分子物質を有するフラクションを凍結乾燥後にＨ，０
４，５紅に溶解した。

アミノ酸分析装置による試験は、Ｌ−７二二ルアラニン
含分３７．４　ｍＭが得られた。Ｌ−アミノ酸−オキシ
ダーゼを使用する試験は、Ｌ−Ｐｈｅ　３７　ｍＭが得
られた。Ｄ−アミノ酸−オキシダーゼを使用する試験は
負であった、その場合検出限界がＤ　−Ｐｈｅ　Ｏ，０
４ｍＭである。

例１３：Ｄ−フェニル乳酸の製造（連続的）ＡＣＡは、
ＡＣＡ−アシラーゼにＤ−２−ヒドロキシ酸−デヒドロ
ゲナーゼを結合させることにより、酵素法によシＤ−フ
ェニル乳酸に変換することができる。デヒドロゲナーゼ
として、相ンメル等（Ｈｕｍｍｅｄ　、　Ｗ、　ｅｔ、
　ａｌ　）、ユーロ・ジエイ・アシル・ミクロビオル・
ビオチクノル（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｊｃｒ
ｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　）１第１８巻＝
７５〜８５頁（１９８３年）参照〕またはＤ−２−ヒド
ロキシ−４−メチルペンタン酸−デヒドロデナーゼ七使
用することができる。この例において、補酵素栴生が、
ホルミエートの存在においてホルミエートーデヒドロｒ
ナーゼを使用し達成される。

バッチ（総容積１０Ｍ）は、詳しくは以下を含有した： ナトリウムホルミエート（ｐ）１７−５）　　４００ｍ
Ｍトリス／ＨＣｔ（Ｆ）１７−５　）　　　　　　　　
　２００ｍＭＰＥＧ　２００００−　ＮＡＤＨＯ，３ｍ
Ｍホルミエートーデヒドロｒナーゼ　　　　　　　　１
　ル似Ｄ−２−ヒドロキシー４−メチルペンタン酸−デ
ヒドロゲナーゼ（２７０Ｕ／卿に有する試料）１Ｕ／＆
４ ＡＣＡ−アシラーゼ（６Ｕ／Ｉｎ９に有する試料）０．
５Ｗ似 ＡＣＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２０　　ｍＭＭ続的反応が酵素−薄膜リアクタ中
で達成される。このため反応バッチを、限外濾過薄膜を
経てポンプ搬送する〔アミコン社（ＦｉｒｍａＡｍｉｃ
ｏｎ　）のＹＭ５型、濾別限界５０００ドルトン〕。こ
の場合、低分子成分が連続的に反応混合物から除去され
る（滞留時間３時間）。この試験装置中で、濾過された
総量の生成物浴液を連続的に基質溶液によシ補充した。

基質溶液は以下を含有した： ナトリウムホルミエー）　（ｐ）１７．５　）　　４０
０　！ＩＩＭトリス／　ＨＣＬ　　　　　　　　　　　
　　　２００　ｍＭＡＣＡ　　　　　　　　　　　　　
　　　　２０　ｍＭ反反応上、生成物溶液の旋光度αを
偏光測定法により測定することによシ確定した。その後
に生成物濃度を、市販のＤ−フェニル乳酸〔シグマ（８
１ｇｍａ　）　）　を使用し得られた基準曲線から測定
することができる。

第８費は、ＡＣＡ′ｔ−実際に完全にＤ−フェニル乳酸
に反応させうろことｔ示す。

第８表：　ＡＣＡ　Ｃ２０ｍＭ　）のＤ−フェニル乳酸
への反応率

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の特性： １）反応性： α−アセチルアミノ桂皮酸と、α−イミノ−β−フェニ
   ル−プロピオン酸ないしはフェニルピルビン酸の形成下
   に反応する； ２）基質特異性： α−アセチルアミノ桂皮酸を加水分解するが、但し他の
   α−アセチルアミノカルボン酸を加水分解しない； ３）最適ｐＨ価： 最適ｐＨ価が７．５±１である； ４）ｐＨ安定性： ｐＨ範囲６．９〜９．４で十分な安定性を示す； ５）最適温度： 最適温度が、ｐＨ価７．５で５２℃である； ６）熱安定性： ５５℃で、３０分の培養後になお反応率８０％が検出可
   能である； ７）阻止剤および活性剤の影響： とりわけ水銀化合物が阻止的に作用し、ジチオトレイト
   ールの添加がこの酵素を活性化する； ８）分子量： 分子量が５００００±５０００ドルトンである； ９）構成単位： 分子が、それぞれ２６０００±３０００ドルトンを有す
   る２つの同じ大きさの構成単位より成る； １０）α−アセチルアミノ桂皮酸基質のｐＨ７．５にお
   けるＫ＿Ｍ価が０．４５ｍモルである；ことを特徴とす
   る微生物学的に製造されたα−アセチルアミノ桂皮酸−
   アシラーゼ。 ２、以下の特性： １）反応性： α−アセチルアミノ桂皮酸と、α−イミノ−β−フェニ
   ループロピオン酸ないしはフェニルピルビン酸の形成下
   に反応する； ２）基質特異性： α−アセチルアミノ桂皮酸を加水分解するが、但し他の
   α−アセチルアミノカルボン酸を加水分解しない； ６）最適ｐＨ価： 最適ｐＨ価が７．５±１である； ４）ｐＨ安定性： ｐＨ範囲６．９〜９．４で十分な安定性を示す； ５）最適温度： 最適温度が、ｐＨ価７．５で５２℃である； ６）熱安定性： ５５℃で、３０分の培養後になお反応率８０％が検出可
   能である； ７）阻止剤および活性剤の影響： とりわけ水銀化合物が阻止的に作用し、ジチオトレイト
   ールの添加がこの酵素を活性化する； ８）分子量： 分子量が５００００±５０００ドルトンである； ９）構成単位： 分子が、それぞれ２６０００±３０００ドルトンを有す
   る２つの同じ大きさの構成単位より成る； １０）α−アセチルアミノ桂皮酸基質のｐＨ７．５にお
   けるＫ＿Ｍ価が０．４５ｍモルである；を有するα−ア
   セチルアミノ桂皮酸−アシラーゼを取得するに当り、ブ
   レビバクテリウム属菌ＮＣＩＢ１２２４６またはＮＣＩ
   Ｂ１２２４７を、炭素および窒素の給源、チアミン、鉱
   物塩および、誘導物質としてのα−アセチルアミノ桂皮
   酸を含有する水性培養液中で、出発ｐＨ価６．０〜８．
   ０および温度２５〜３５℃で通気培養し、細胞物質を分
   離しかつ酵素を細胞から単離することを特徴とする微生
   物学的に製造されたα−アセチルアミノ桂皮酸−アシラ
   ーゼの取得法。