JPH0362390B2

JPH0362390B2 -

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Publication number: JPH0362390B2
Application number: JP62153604A
Authority: JP
Inventors: Kura Mariaaregiina; Funmeru Uerunaa; Shutsute Horusuto; Roihitenberugaa Uorufugangu
Original assignee: BIOTEKUNOROGITSUSHE FUORUSHUNKU MBH G; DEGUTSUSA AG
Current assignee: BIOTEKUNOROGITSUSHE FUORUSHUNKU MBH G; DEGUTSUSA AG
Priority date: 1986-06-28
Filing date: 1987-06-22
Publication date: 1991-09-25
Also published as: EP0252216A2; EP0252216B1; DE3776432D1; JPS637782A; DK323987A; CA1287312C; DE3621839A1; EP0252216A3; US4877734A; DK323987D0

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は、微生物学的に製造されたα−アセチ
ルアミノ桂皮酸−アシラーゼおよびその取得法に
関する。本発明は、以下の種類の反応に触媒作用する、
これまで記述されなかつた酵素に関する：殊に十分な反応率がＲ＝C₆H₅−で得られる。問題点を解決するための手段本発明による化合物、すなわちα−アセチルア
ミノ桂皮酸−アシラーゼは以下の特性を特徴とす
る： (1) 反応性： α−アセチルアミノ桂皮酸と、α−イミノ−
β−フエニル−プロピオン酸ないしはフエニル
ピルビン酸の形成下に反応する； (2) 基質特異性： α−アセチルアミノ桂皮酸を加水分解する
が、但し他のα−アセチルアミノカルボン酸、
例えばα−アセチルアミノアクリル酸またはＮ
−アセチルフエニルアラニンを加水分解しな
い； (3) 最適PH価：最適PH価が7.5±１である； (4) PH安定性： PH範囲6.9〜9.4で十分な安定性、すなわち４
℃で２週間後の反応率90％以上を示す； (5) 最適温度：最適温度が、PH価7.5で52℃である； (6) 熱安定性： 55℃で、30分の培養後になお反応率80％が検
出可能である； (7) 阻止剤および活性剤の影響：とりわけ水銀化合物、すなわちｐ−水銀ベン
ゾエートおよびHgCl₂、CdCl₂およびｏ−フエ
ナンスロリンが阻止的に作用し、ジチオトレイ
トール（１ｍモル）の添加がこの酵素を活性化
する； (8) 分子量：分子量が50000±5000ドルトンである； (9) 構成単位：分子が、それぞれ26000±3000ドルトンを有
する２つの同じ大きさの構成単位より成る； (10) α−アセチレンアミノ桂皮酸基質のPH7.5に
おけるK_M価が0.45ｍモルである；本発明によるα−アセチルアミノ桂皮酸−アシ
ラーゼは、アバデイーン（スコツトランド）在の
ナシヨナル・コレクシヨン・オブ・インダストリ
アル・バクテリア〔National Collection of
Industrial Bacteria Aberdeen（Schottland）〕に
1986年２月14日付で番号NCIB12246および
NCIB12247下に寄託された２種のブレビバクテ
リウム菌株を使用し得られることができる。以下の特性は、これ２つの微生物がブレビバク
テリウム属であることを示す：これらは、世代の増大とともに球菌状態へ移行
するグラム陽性の短桿菌中で成長する。細胞が不
動でありかつ胞子を形成しない。成長が厳密に好
気性に行なわれる。グルコースから酸が形成され
ない。カタラーゼ反応および硝酸塩還元が正、尿
素分解が正、ゼラチン−、カゼイン−および殿粉
分解が負、H₂S形成が負、41℃における成長が負
である。細胞壁糖として、アラビノース、マンノ
ースおよびガラクトースが検出された。これら微
生物は、親液化培養物として、−80°でまたは液体
窒素中−196℃で貯蔵されることができる。使用
培養物が傾斜寒天試験管（ACA媒体）で保持さ
れる。本発明によるα−アセチルアミノ桂皮酸−アシ
ラーゼを取得するため、ブレビバクテリウム属菌
NCIB12246またはNCIB12247が、炭素および窒
素の給源、チアミン、鉱物塩および、誘導物質と
してのα−アセチルアミノ桂皮酸を含有する水性
培養液中で、出発PH価6.0〜8.0および温度25〜35
℃で通気培養され、細胞物質が分離され、かつ酵
素が細胞から単離される。例えば、多量の酵素が、ブレビバクテリウム属
菌NCIB12246またはNCIB12247を自体公知の方
法で所望の規模、例えば10規模のバイオリアク
タ中で培養するようにして得られることができ
る。有効な培養に重要なのが以下の通りである： −十分な通気（好気性微生物に不可欠）； −媒体中の出発PH価6.0〜8.0； −鉱物塩の存在（例えば、とうもろこし膨化水と
して複合せる形で）； −わずかな量のチアミン（１〜2μｇ／）の存
在、および −酵素誘導用媒体中のACA（0.2〜0.4重量パーセ
ント）の存在。酵素の単離は、細胞を砕解した後、自体公知の
酵素精製法を組合せることにより可能である。こ
のものは、中間工程を経てα−イミノ−β−フエ
ニルプロピオン酸ないしはフエニルピルビン酸を
生じる酵素反応用の結合酵素系の成分として使用
されることができる。従つて、例えばこのもの
は、ACAを相応するα−アミノカルボン酸また
はα−ヒドロキシカルボン酸へ変換するため、適
当なデヒドロゲナーゼと組合せることができる。
このものは、例えばACAを、Ｌ−フエニルアラ
ニン−デヒドロゲナーゼと組合せた場合Ｌ−フエ
ニルアラニンへ変換し、Ｌ−２−ヒドロキシ−４
−メチルペンタン酸−デヒドロゲナーゼと組合せ
た場合Ｌ−フエニル乳酸へ変換し、かつＤ−２−
ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デヒドロゲ
ナーゼと組合せた場合Ｄ−フエニル乳酸へ変換す
る。実施例以下に、本発明を実施例につき詳説する。実施
例中の「パーセンテージ」は、他に別記しない限
り「重量パーセント」を表わす。例１ α−アセチルアミノ桂皮酸−アシラーゼ産生菌
のスクリーニングブラウンシユヴアイク（Braunschweig）近郊
からの10個の土壌サンプルを、無菌の塩溶液
（NaCl0.9％）に懸濁し、常法で希釈し、かつ１
部分の水性上澄み液を固体培地を有するペトリ皿
へへらでなでつけた。この培地は以下の組成を有
した（ACA媒体）： α−アセチルアミノ桂皮酸（ACA）５ｇ（NH₄）₂SO₄ 0.25ｇ K₂HPO₄ ２ｇ酵母エキス 0.2ｇトレーサーの溶液１ml MgSO₄・7H₂O 100mg CaCO₃ 20mg 蒸溜水１寒天 20ｇ PH 価 7.5 この媒体をオートクレーブ処理することにより
滅菌し、冷却後に、媒体１当り滅菌濾過せるビ
タミン溶液１mlおよびシクロヘキシミド（アクチ
ジオン）50mgを添加し、かつこの培地を無菌のペ
トリ皿へ注入した〔ビタミン溶液の組成は、H.
G.シユレーゲル（Schlegel）“アルゲマイネ・ミ
クロビオロギー”（Allgemeine Mikrobiologie）、
チーメ・フエルラーク（Thieme Verlag）、169
頁（1981年）による〕。接種したプレートを、３〜４日27℃で培養し
た。微生物の生長後、適当なコロニー数（50〜
200）を有する寒天プレートからコロニーサンプ
ルを無菌でビロードスタンパ（Samtstempel）
に採り、その後に、異なる寒天培地を含有する２
つのプレートにスタンプ移植した：１方のプレー
トが前記ACA媒体を含有し、他方が以下の組成
を有するフエニルアラニン含有培養液（フエニル
アラニン媒体）を含有した：Ｌ−フエニルアラニン 10ｇ KH₂PO₄ ２ｇ酵母エキス 0.2ｇ寒天 20ｇ蒸溜水１ PH価を7.2に調節した。これらプレートを再び３〜５日27℃で培養し
た。コロニーサンプルを比較することにより、
ACA媒体でもまたフエニルアラニン媒体でも成
長することのできる同じ微生物が検出されること
ができた。これらを採りかつ次いでACA媒体に
保持した。その後に、単離されたこれら微生物を常法で純
度を検査した（希釈塗布、顕微鏡検査）。その後
に、同一と認められる菌株を、液状媒体100ml
（２つのじやま板を有する500mlエルレンマイヤー
フラスコ）中で27℃で円運動振とう装置上
120rpmで繁殖させた。この液状媒体は以下の組
成を有した： α−アセチルアミノ桂皮酸（ACA）３ｇ（NH₄）₂SO₄ 0.25ｇ酵母エキス１ｇとうもろこし膨化水（乾燥粉末）５ｇ K₂HPO₄ ２ｇ蒸溜水１ PH 7.5 ２〜３日後、振とうフラスコの内容物を遠心分
離し（20分冷間遠心分離機中10000ｇで）、かつ沈
殿せる細胞を0.05Mの燐酸カリウム緩衝液（PH
7.4）に懸濁した（バクテリア−含水物質１ｇ当
り緩衝液４ml）。その後に、この懸濁液中の微生物を常法で砕解
する必要がある（例えば、微小なガラスビーズを
使用する振とう、超音波処理、フレンチプレス）。
本発明者等は、懸濁液にガラスビーズ（0.1〜0.2
mmφ）を混合し、その場合細胞懸濁液１ml当りガ
ラスビーズ２ｇを使用し、かつその後に試験管中
で10分実験室用振とう装置〔リアツクス（Reax）
１−Ｄ−Ｒ型、ハイドオルフ社（Firma
Heidolph）〕を使用し混合した。これら条件下
に、大部分の分離物を十分に砕解することができ
た。未溶解の細胞成分およびガラスビーズを遠心
分離により分離した〔エツペンドルフ卓上遠心分
離機（Eppendorf−Tischzentrifuge）中
12000rpmで２分〕。その後に、この上澄み液を酵
素源（粗製エキス）として試験した。酵素を検出
するため、測光法試験を使用した。試験バツチは
以下を含有した：塩化アンモニウム／アンモニア緩衝剤（PH9.2に
相応） 0.7M NADH 0.1ｍＭ ACA 10ｍＭＬ−フエニルアラニン−デヒドロゲナーゼおよ
び制限量のアシラーゼ（１試験当り蛋白質１〜
20μｇ） 1U／ｍ NADHの340nｍにおける吸光度低域が測定さ
れた。得られた価から、試験がACA添加なしに
進行した場合に得られた零価を差引いた。酵素活
性を国際単位で記載した、その場合１単位が
NADH1μモル／分の低減を表わす。この試験において最高の活性を示した菌株が、
ブレビバクテリウム属菌37／３（NCIB12246）お
よび38／３（NCIB12247）である。アシラーゼの
大規模製造には菌株37／３を使用する。例２ α−アセチルアミノ桂皮酸−アシラーゼの製造 (a) ブレビバクテリウム属菌37／３の10規模の
培養バイオリアクタを使用し、これに媒体10を
装填した。この媒体は、１当り以下を含有し
た： ACA ３ｇ（NH₄）₂SO₄ 0.25ｇ酵母エキス１ｇとうもろこし膨化水（乾燥粉末） 10ｇ K₂HPO₄ ２ｇ PH価が7.5であつた。滅菌後、この媒体に、48時間同じ媒体中で培
養した前培養物300mlを接種した。発酵装置中
の成長条件は以下の通りであつた：温度 30℃ 通気速度空気60／時間タービンミキサ 250rpm 種々の成長時間でサンプル（100ml）を採り、
かつこれら細胞の酵素活性に関する試験により
達成可能な最高酵素含有率ないしは最有利な採
取時点を確定した。さらに、培養物成長の尺度
として濁度（光密度）を578nｍで測定した。
主量のアシラーゼは、微生物が十分に成長し去
つた場合に形成されると判明した。最高価に達
した後、酵素活性が相対的に迅速に再び低減す
る。 (b) 粗抽出物の取得バクテリア−含水物質（230ｇ）を、20ｍＭ
燐酸塩緩衝液（PH7.5）中に２−メルカプトエ
タノール0.1％の添加下に懸濁し、その結果細
胞懸濁液の濃度が40％であつた（この場合の最
終容積575ml）。細胞含有成分を、冷却せる懸濁
液（〜４℃）から、バツハオーフエン社
（Firma Bachofen）のガラスビーズミル〔ダ
イノミル（Dyno−Mill）、KDL型〕中で機械
的に細胞砕解することにより分離した。この場
合、300ml容量のミル容器に0.25〜0.5mmのガラ
スビーズを装填し、その結果嵩容積255mlが得
られた（85％）。砕解を、ミキサ軸回転数
3000rpmおよび流量５／ｈで実施した。生成
物の発熱を十分に回避するため、ミル容器の冷
却ジヤケツト並びにミキサ軸々承を、回転中に
−20℃のエチレングリコール溶液で冷却した。
３回の通過後に、砕解率90％が得られた。ホモ
ジナイズ後に、懸濁液のPH価を苛性カリ溶液で
PH7.5に調節した。 (c) 液−液分散第１の分散工程で、細胞破片を粗抽出物から
西ドイツ国特許明細書第2639139号により分離
する。この目的で、混合物1.15Kg中にポリエチ
レングリコール6000 10（重量／重量）％、PH
8.0に相応する燐酸塩緩衝剤７（重量／重量）
％、塩化ナトリウム0.05Mおよび粗抽出物575
mlを含有する水性の２相混合物を製造した。分
散の平衡を得るため、この２層混合物を１時間
にわたり撹拌しかつ引続き遠心分離により分離
した。上相（745ml）がACA−アシラーゼ90％以上
を含有した。下相が細胞破片並びに、これら条
件下に下相中へ抽出された蛋白質を含有し、か
つこれを廃却した。酵素を含有する上相に、最
終容量1.5に対し、PH6.0に相応する燐酸塩緩
衝剤８（重量／容量）％および塩化ナトリウム
0.6Mを混合しかつ１時間撹拌した。形成され
たポリエチレングリコール／塩混合物は、沈殿
容器中でほぼ１時間で完全に沈殿することがで
きた。この分散工程において、ACAアシラー
ゼがほぼ完全に下相中へ抽出された。これら相
の分離を、下相（1040ml）を排出することによ
り行なつた。 (d) フエニル−セフアロース（Phenyl−
Sepharose）CL−4Bによるクロマトグラフイ
ー ACA−アシラーゼを含有する塩に富む下相
を、直接に疎水性のフエニルセフアロースCL
−4Bでクロマトグラフ処理した。この方法の
利点は、塩に富む下相の、クロマトグラフ工程
前の時間のかかる透析がなくなることである。
このフエニル−セフアロースCL−4Bは、PH7.5
に相応する燐酸塩緩衝剤50ｍＭ、２−メルカプ
トエタノール0.1（容量／容量）％および硫酸ア
ンモニウム1Mを含有する緩衝液（出発緩衝液）
に対し平衡化されていた。第２の分散工程の下
相を、５×11cmカラムへ装入しかつ２カラム容
量の出発緩衝液で後洗浄した。その後にACA
−アシラーゼを、PH7.5に相応する燐酸塩乾燥
液１ｍＭで溶離した。 (e) モノＱ（Mono Ｑ）による高速蛋白質液体ク
ロマトグラフイー（Fast Protein Liquid
Chromatography：FPLC）溶離物を、スーパー・ループ（Super
Loop）を経て0.5×５cmモノＱカラム
〔FPLC：スエーデン国ウプサラ在フアーマシ
ア社（Firma Pharmacia、Uppsala、
Schweden）の装置〕へ装入しかつ圧力最高
40barでクロマトグラフ処理した。蛋白質量58
mgに対し、２行程が必要であつた。その前にア
ニオン交換体を、PH7.5に相応する燐酸塩緩衝
液10ｍＭに対し平衡化した（出発緩衝液）。 ACAアシラーゼを、出発緩衝液中に塩化ナ
トリウム0.1〜0.4Mを含有する直線的な20ml勾
配で溶離した。溶離を塩化ナトリウム0.25〜
0.3Mで行なつた。このようなクロマトグラフ
イーの時間に約20分あてることができる。 (f) スプロース（Superose）12による高速蛋白
質液体クロマトグラフイー（FPLC）スプロース12を充填したカラム（HR10／
30）を、PH7.5に相応する燐酸塩緩衝剤50ｍＭ
および塩化ナトリウム0.15Mを含有する緩衝液
に対し平衡化した。Ｑカラムからの溶離物を、
差当りアミコン社（Fa.Amicon）のミニコン
濃縮装置（Minicon−Konzentrator）中で容
積500μに濃縮しかつその後に２行程でそれ
ぞれサンプル量250μを使用しスプロース12
で濾別した。スプロース12によるゲル濾過
（HR10／30カラム；圧力〜30bar）の時間は約
40分である。活性のフラクシヨンを合し、グリセリン50
（重量／容量）％を混合しかつ−20℃で凍結し
た。精製の結果を第１表にまとめた。

【表】試験はＤ−２−ヒドロキシ−４−メチルペン
タン酸−デヒドロゲナーゼを使用。バクテリア−含水物質230ｇから精製。例３ α−アセチルアミノ桂皮酸−アシラーゼの誘導 (a) 培養媒体の変更アシラーゼは、ブレビバクテリウム属菌37／
３を、Ｃ−およびＮ給源としてのACAを有す
る媒体中で培養した場合に形成される。実際に
酵素収率（Ｕ／ｇ ACA）は相対的にわずか
である。第２表に示したように、収率は、媒体
が付加的に適当な窒素含有化合物を含有した場
合に増大されることができる。グリセリンまた
はグルコースのようなＣ給源がアシラーゼ形成
を阻止する。

【表】 (b) ACA濃度の変更とうもろこし膨化水５ｇ（NH₄）₂SO₄ 0.25ｇ KH₂PO₄ ２ｇビタミン溶液１ml トレーサー溶液１ml H₂O １より成るベース媒体に、種々の濃度のACAを
添加した。第３表は、媒体が１当りACA2〜
５ｇを含有した場合に、粗抽出物の十分な活性
が得られることを示す。

【表】例４反応速度のPH価依存性 ACA−アシラーゼの存在における化合物：α
−アセチルアミノ桂皮酸からの加水分解による酢
酸離脱、および後続する、生じたフエニルピルベ
ートの、Ｌ−フエニルアラニン−デヒドロゲナー
ゼの存在におけるＬ−フエニルアラニンへの還元
アミン化、またはフエニルピルベートの、Ｄ−２
−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デヒドロ
ゲナーゼの存在におけるＤ−フエニル乳酸への水
素添加の反応速度を、反応溶液のPH価との関連に
おいて試験した。試験バツチは、Ｌ−フエニルアラニン−デヒド
ロゲナーゼとの関連において以下の組成を有し
た： NADH 0.23ｍＭ ACA 16ｍＭＬ−フエニルアラニン−デヒドロゲナーゼ 0.5U 種々のPH価における塩化アンモニウム溶液 0.7M および制限量のACA−アシラーゼ。選択されたPH価7.5〜10.3を、試験バツチを形
成する前に、アンモニアないしは塩酸を塩化アン
モニウム溶液0.7Mに添加することにより調節し
た。最適な反応速度がPH範囲7.5〜９にある。試験バツチは、Ｄ−２−ヒドロキシ−４−メチ
ルペンタン酸−デヒドロゲナーゼとの関連におい
て以下の組成を有した： NADH 0.18ｍＭ ACA 0.88ｍＭＤ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デ
ヒドロゲナーゼ 2.7U 種々のPH価における燐酸塩緩衝液 0.1M および制限量のACA−アシラーゼ。選択されたPH価がPH6.2〜8.0であつた。最適な反応速度がPH範囲6.5〜7.8にある。例５最適温度化合物：α−アセチルアミノ桂皮酸からの加水
分解による酢酸離脱の温度依存性を、ACA−ア
シラーゼおよびＤ−２−ヒドロキシ−４−メチル
ペンタン酸−デヒドロゲナーゼの存在において試
験した。フエニルピルベートを水素添加するための試験
バツチは以下の組成を有した： NADH 0.23ｍＭ ACA ５ｍＭ PH7.5に相応する燐酸塩緩衝剤 0.1M この反応混合物を、10分25〜60℃の種々の温度
で培養し、それぞれＤ−２−ヒドロキシ−４−メ
チルペンタン酸−デヒドロゲナーゼ2.5Uおよび
制限量のACA−アシラーゼを混合し、かつその
後に選択された培養温度における反応の速度を分
光測光計で測定した。最高反応速度が52℃で得ら
れた、従つてこれは標準温度30℃におけるよりも
倍数2.5だけ大である。例６ ACA−アシラーゼのPH安定性 ACAアシラーゼのPH安定性をPH価範囲5.0〜
11.0で試験した。この酵素を所定の時間種々のPH
価に維持し、かつその後にACA−アシラーゼ活
性を標準的条件下に30℃で測定した。試験的に、
この酵素を、種々のPH価を有する緩衝剤100ｍＭ
で１：11に希釈した。これら種々のPH範囲のため
に、以下の緩衝剤を使用した：クエン酸／NaOH100ｍＭ PH5.0；5.5：6.0 燐酸カリウム PH6.0；6.5；7.0；7.5；8.0 トリス／HCl PH8.0；8.5；9.0 NH₄Cl／NH₄OH PH9.0；9.5 グリシン／NaCl／NaOH
PH10.0；10.5；11.0；11.5 標準的条件： NADH 0.23ｍＭ ACA ５ｍＭ PH7.5に相応する燐酸塩緩衝剤 0.1M Ｄ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−テ
ヒドロゲナーゼ 2.5U 制限量のACA−アシラーゼ。下記第４表は、ACA−アシラーゼの、１時間、
１日、１週ないしは２週後の残存活性パーセンテ
ージを示す。２週後に、PH範囲6.9〜9.4ではじめのACA−ア
シラーゼ活性のなお90％以上を検出することがで
きた。

【表】例７ ACA−アシラーゼの熱安定性 ACA−アシラーゼの熱安定性を温度範囲25〜
60℃で試験した。この酵素を、10、20および30分
選択された温度で燐酸緩衝液（PH7.5）中で培養
した。その後に、残存するACA−アシラーゼ活
性を標準的条件下に30℃で測定した。標準的条件： NADH 0.23ｍＭ ACA ５ｍＭ PH7.5に相応する燐酸塩緩衝剤 0.1M Ｄ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デ
ヒドロゲナーゼ 2.5U 制限量のACA−アシラーゼ。 55℃で30分培養した後、なお出発活性の80％を
検出することができ、さらに培養温度を増大させ
た場合はACA−アシラーゼが迅速に変性する。例８阻止剤および活性剤の影響 ACA−アシラーゼの活性、およびこれから生
じる化合物：α−アセチルアミノ桂皮酸からの加
水分解による酢酸離脱の反応速度に対する種々の
阻止剤および活性剤の影響を、例７に記載せるよ
うな標準的条件下に測定した。（変更：２価の金
属イオンを使用する試験をPH8.0用のトリス／
HCl−緩衝剤0.1M中で実施した）。結果を第５表にまとめた。

【表】

【表】例９ ACA−アシラーゼの分子量の測定および構成
単位の検出天然酵素の分子量を、スプロース12でゲル濾過
することにより測定した。FPLC装置（スエーデ
ン国ウプサラ在フアーマシア社製）に連結せるカ
ラム（1.0×30cm）を、流量0.4ml／分で作動さ
せ、その場合被検物質として、モノＱで精製した
酵素75μを使用した。基準蛋白質として、シトクロムＣ、ペプシン、
オーバルブミン、牛血漿アルブミン（BSA）、Ｄ
−２−ヒドロキシイソカプロエート−デヒドロゲ
ナーゼ、Ｌ−２−ヒドロキシイソカプロエート−
デヒドロゲナーゼ、アルドラーゼ、B.セレウス
（cereus）からのＬ−アラニン−デヒドロゲナー
ゼおよびＬ−ロイシン−デヒドロゲナーゼ、およ
びフエリチンを使用した。 ACA−アシラーゼの分子量は50000±5000ドル
トンである。ナトリウムドデシルサルフエート（SDS）の存
在においてゲル電気泳動することにより、酵素の
構成単位の大きさおよび数を測定することができ
た。構成単位の分子量は26000±3000ドルトンで
ある。これは、ACA−アシラーゼが２つの同じ
構成単位より成ることを表わす。検量曲線には、
ヘモグロビン、β−ラクトグロブリン、キモトリ
プシノーゲンＡ、ペプシン、オーバルブミンおよ
びBSAを使用した。例 10 ACA−アシラーゼ活性の基質濃度依存性 (a) ACA−アシラーゼの存在における化合物： α−アセチルアミノ桂皮酸からの加水分解に
よる酢酸離脱、および後続する、Ｌ−フエニル
アラニン−デヒドロゲナーゼの存在におけるＬ
−フエニルアラニンへの還元アミン化の反応速
度の依存性を、以下の試験バツチで試験した：塩化アンモニウム／アンモニウム緩衝剤（PH
8.5） 0.7ｍＭ NADH 0.23ｍＭＬ−フエニルアラニン−デヒドロゲナーゼ
0.5U 制限量のACA−アシラーゼ。 α−アセチルアミノ桂皮酸濃度を１〜36ｍＭ
の範囲内で変更した。最適反応速度が16ｍＭで
得られると判明した。α−アセチルアミノ桂皮
酸のK_M価が3.9ｍＭである。 (b) ACAアシラーゼの存在における化合物：α
−アセチルアミノ桂皮酸からの加水分解による
酢酸離脱、および後続する、Ｄ−２−ヒドロキ
シ−４−メチルペンタン酸−デヒドロゲナーゼ
の存在におけるフエニルピルベートのＤ−フエ
ニル乳酸への水素添加の反応速度の依存性を、
以下の試験バツチで試験した：燐酸塩乾燥剤（PH7.5） 0.1M NADH 0.23ｍＭＤ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−
デヒドロゲナーゼ 0.8U 制限量のACA−アシラーゼ。 α−アセチルアミノ桂皮酸濃度を0.1〜18ｍ
Ｍの範囲内で変更した。最適反応速度が５ｍＭ
で得られると判明した。α−アセチルアミノ桂
皮酸のK_M価が0.45ｍＭである。測定は、K_M価がPH価に依存することを示
す：K_M価が、PH7.5で0.45ｍＭであり、PH8.5で
3.9ｍＭである。酵素を特定するため、最適PH
で測定された価を使用すべきであり、すなわち
基質ACAのK_M価が0.45ｍＭ（PH7.5）である。例 11 ACA−アシラーゼの基質特異性１連の並列バツチ中で、α−アセチルアミノ桂
皮酸基質を他の化合物により代替し、かつ酵素が
他の基質を受容する程度を試験した。この場合以下の試験バツチを、使用基質に応じ
使用した：１基質としてα−アセチルアミノ桂皮酸を使用
する試験： NH₄Cl 0.7M NADH 0.1ｍＭ α−アセチルアミノ桂皮酸 50ｍＭＬ−フエニルアラニン−デヒドロゲナーゼ
1U／ml ACA−アシラーゼ 0.1U／ml PH9.2 活性を、例１に記載せるような測光試験によ
り測定した（340nｍにおいて）。２ α−アセチルアミノアクリル酸を使用する
試験： NH₄Cl 0.7M NADH 0.1ｍＭ α−アセチルアミノアクリル酸 50ｍＭＬ−アラニン−デヒドロゲナーゼ 1U／ml ACA−アシラーゼ 0.1U／ml PH8.0 活性を、類似の方法で測光試験（340nｍに
おける）により測定した（NADH低減量1μモ
ルがアラニン形成量1μモルに相応した）。３ペプチデンを使用する試験：他の基質として、Ｎ−アセチル−Ｌ−フエニ
ルアラニン、Ｎ−メトキシカルボニル−Ｄ，Ｌ
−フエニルアラニンおよび種々のペプチドを使
用した。使用せるペプチドを第６表にまとめ
た。これらの場合、試験バツチは以下を含有し
た：燐酸カリウム緩衝剤（PH7.5） 0.1M ACA−アシラーゼ（17.8U／mg） 0.1U／ml 基質 50ｍＭこれらバツチ（合計１ml）を撹拌し（30℃）
かつ種々の時間でサンプルを採取した。アシラ
ーゼ作用による生じるアミノ酸を、アミノ酸分
析装置を使用し定量的に検出した。またこの場
合、酵素の活性が国際単位で記載されている
が、活性1Uが１分当りアミノ酸1μモルの形成
に相応する。３つの試験バツチで測定した活性
を、第６表の第２欄に単位ｍＵ／mlで記載し
た。相対活性（第６表の第３欄）を決めるた
め、活性を基質：α−アセチルアミノ桂皮酸の
丁度に100％に対比した。

【表】例 12 Ｌ−フエニルアラニンの製造 ACA−アシラーゼにＬ−フエニルアラニン−
デヒドロゲナーゼを結合させた場合、生じる中間
生成物が還元アミン化により立体特異的にＬ−フ
エニルアラニンに反応されることができる。デヒ
ドロゲン化反応で酸化された補酵素を再生するた
め、バツチにホルミエート−デヒドロゲナーゼ
（E.C.1.2.1.2）およびホルイミエートを添加する。
この場合、付加的生成物としてCO₂が得られる。種々の濃度のACAを有する種々のバツチを培
養したが、これらバツチはそれぞれ以下を含有し
た：アンモニウムホルミエート（PH9.2） 400ｍＭトリス／HCl（PH9.2） 200ｍＭ NADH 0.3ｍＭホルミエート−デヒドロゲナーゼ〔クローネル等
（Kroner et al）（1982年）ジエイ・ケム・テク
ノル・バイオテクノル（J.Chem.Technol.
Biotechnol.）第32巻、130〜137頁による試料〕
1U／ml Ｌ−フエニルアラニン−デヒドロゲナーゼ
（44U／mgを有する試料） 1U／ml ACA−アシラーゼ 0.5U／ml ACA 20〜300ｍＭ総容積が１mlであり、培養を撹拌下に28℃で行
なつた。産出物形成をアミノ酸分析装置で追跡し
た。第７表は、全てのバツチにおいて基質のフエニ
ルアラニンへの実際に完全な反応が行なわれたこ
とを示す。

【表】基質300ｍＭを有するバツチ５で、75時間の反
応後に、形成されたＬ−フエニルアラニンの光学
的純度を測定した。このバツチ中に、１部分の生
成物が不溶性の形で結晶懸濁液として存在した
（PheのH₂O中溶解度（25℃）＝180ｍＭ）。全ての
生成物を溶解するため、バツチにH₂O3mlを添加
した。セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−25（フア
ーマシア社製）でゲル濾過することにより蛋白質
を除去し、かつ低分子物質を有するフラクシヨン
を凍結乾燥後にH₂O4.5mlに溶解した。アミノ酸分析装置による試験は、Ｌ−フエニル
アラニン含分37.4ｍＭが得られた。Ｌ−アミノ酸
−オキシダーゼを使用する試験は、Ｌ−Phe37ｍ
Ｍが得られた。Ｄ−アミノ酸−オキシダーゼを使
用する試験は負であつた、その場合検出限界がＤ
−Phe0.04ｍＭである。例 13 Ｄ−フエニル乳酸の製造（連続的） ACAは、ACA−アシラーゼにＤ−２−ヒドロ
キシ酸−デヒドロゲナーゼを結合させることによ
り、酵素法によりＤ−フエニル乳酸に変換するこ
とができる。デヒドロゲナーゼとして、相応する
Ｄ−ラクテート−デヒドロゲナーゼ〔例えば、ラ
クトバチルス・コンフーズス（Lactobacillus
Confusus）、W.フンメル等（Hummel，W.et.
al）、ユーロ・ジエイ・アプル・ミクロビオル・
ビオテクノル（Eur.J.Appl.Microbiol.
Biotechnol.）、第18巻：75〜85頁（1983年）参
照〕またはＤ−２−ヒドロキシ−４−メチルペン
タン酸−デヒドロゲナーゼを使用することができ
る。この例において、補酵素再生が、ホルミエー
トの存在においてホルミエート−デヒドロゲナー
ゼを使用し達成される。バツチ（総容積10ml）は、詳しくは以下を含有
した：ナトリウムホルミエート（PH7.5） 400ｍＭトリス／HCl（PH7.5） 200ｍＭ PEG20000−NADH 0.3ｍＭホルミエート−デヒドロゲナーゼ 1U／ml Ｄ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デ
ヒドロゲナーゼ（270U／mgを有する試料）
1U／ml ACA−アシラーゼ（6U／mgを有する試料）
0.5U／ml ACA 20ｍＭ連続的反応が酵素−薄膜リアクタ中で達成され
る。このため反応バツチを、限外濾過薄膜を経て
ポンプ搬送する〔アミコン社（Firma Amicon）
のYM5型、濾別限界5000ドルトン〕。この場合、
低分子成分が連続的に反応混合物から除去される
（滞留時間３時間）。この試験装置中で、濾過され
た総量の生成物溶液を連続的に基質溶液により補
充した。基質溶液は以下を含有した：ナトリウムホルミエート（PH7.5） 400ｍＭトリス／HCl 200ｍＭ ACA 20ｍＭ反応率を、生成物溶液の旋光度αを偏光測定法
により測定することにより確定した。その後に生
成物濃度を、市販のＤ−フエニル乳酸〔シグマ
（Sigma）〕を使用し得られた基準曲線から測定す
ることができる。第８表は、ACAを実際に完全にＤ−フエニル
乳酸に反応させうることを示す。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１以下の特性： (1) 反応性： α−アセチルアミノ桂皮酸と、α−イミノ−
β−フエニル−プロピオン酸ないしはフエニル
ピルビン酸の形成下に反応する； (2) 基質特異性： α−アセチルアミノ桂皮酸を加水分解する
が、但し他のα−アセチルアミノカルボン酸を
加水分解しない； (3) 最適PH価：最適PH価が7.5±１である； (4) PH安定性： PH範囲6.9〜9.4で十分な安定性を示す； (5) 最適温度：最適温度が、PH価7.5で52℃である； (6) 熱安定性： 55℃で、30分の培養後になお反応率80％が検
出可能である； (7) 阻止剤および活性剤の影響：とりわけ水銀化合物が阻止的に作用し、ジチ
オトレイトールの添加がこの酵素を活性化す
る； (8) 分子量：分子量が50000±5000ドルトンである； (9) 構成単位：分子が、それぞれ26000±3000ドルトンを有
する２つの同じ大きさの構成単位より成る； (10) α−アセチルアミノ桂皮酸基質のPH7.5にお
けるK_M価が0.45ｍモルである；ことを特徴とする微生物学的に製造されたα−ア
セチルアミノ桂皮酸−アシラーゼ。２以下の特性： (1) 反応性： α−アセチルアミノ桂皮酸と、α−イミノ−
β−フエニル−プロピオン酸ないしはフエニル
ピルビン酸の形成下に反応する； (2) 基質特異性： α−アセチルアミノ桂皮酸を加水分解する
が、但し他のα−アセチルアミノカルボン酸を
加水分解しない； (3) 最適PH価：最適PH価が7.5±１である； (4) PH安定性： PH範囲6.9〜9.4で十分な安定性を示す； (5) 最適温度：最適温度が、PH価7.5で52℃である； (6) 熱安定性： 55℃で、30分の培養後になお反応率80％が検
出可能である； (7) 阻止剤および活性剤の影響：とりわけ水銀化合物が阻止的に作用し、ジチ
オトレイトールの添加がこの酵素を活性化す
る； (8) 分子量：分子量が50000±5000ドルトンである； (9) 構成単位：分子が、それぞれ26000±3000ドルトンを有
する２つの同じ大きさの構成単位より成る； (10) α−アセチルアミノ桂皮酸基質のPH7.5にお
けるK_M価が0.45ｍモルである；を有するα−アセチルアミノ桂皮酸−アシラーゼ
を取得するに当り、ブレビバクテリウム属菌
NCIB12246またはNCIB12247を、炭素および窒
素の給源、チアミン、鉱物塩および、誘導物質と
してのα−アセチルアミノ桂皮酸を含有する水性
培養液中で、出発PH価6.0〜8.0および温度25〜35
℃で通気培養し、細胞物質を分離しかつ酵素を細
胞から単離することを特徴とする微生物学的に製
造されたα−アセチルアミノ桂皮酸−アシラーゼ
の取得法。