JPS5974994A - Ｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はｊ微生物を用い−（ｒｌ−アセトアミド桂皮ｆ
ｉ’ｅからＬ−フェニルアラニンを製造する方法に門す
る、 Ｌ−フェニルアラニンは必須アミノ酸の一つであり、栄
養」二あるいは医薬上取要な物質である。 本発明者らは先に、アクロモバクタ−属、アエロバクタ
−ｂ”＋　、シュードモナス属、アグロバクテリウム属
、フラボバクテリウム属、アルスロバクタ−属、コリネ
バクテリウム属又はミクロコツカス属に属するある種の
微生物がα−アセトアミド桂皮酸からＬ−フェニルアラ
ニンを生成せしめる能力を有していることを見い出し、
これにより新たなＬ−フェニルアラニンの製造法を開発
した（特開昭５７−９９１９８）。 本発明者らは、α−アセトアミド桂皮酸からＬ−フェニ
ルアラニンを生成せしめる能力を有する微生物について
、更に検索を進めた結果、自然界より分離したバチルス
属又はアルカリ土類金属に属する微生物が前記能力を有
していることを見い出し１本発明を完成するに至った。 即ち１本発明はバチルス属又はアルカリ土類金属に属し
、α−アセトアミド桂皮酸からＬ−フェニルアラニンを
生成せしめる能力を有するヤ１

【（生物の培養液、該培
養液から得た菌体又は該菌体の処理物をσ−アセトアミ
ド桂皮酸又はその塩に作用させ、生成したＬ−フェニル
アラニンを拌Ｉｔ”くすることを特徴とするＬ−フェニ
ルアラニンの製造法である。 本発明に、おいて使用する微生物は、バチルス属又はア
ルカリ土類金属に屈し、α−アセトアミド桂皮酸からＬ
−フェニルアラニンを生成せしめる能力を有するもので
あればいずれでもよい。かかる微生物の例としては、バ
チルス・スフエリカスＮ−７株（微工研閑寄第ｂ’ｙｑ
−ｂ　　号）及びアルカリゲネス・フェカリスＳ−７株
（ａ上研菌寄第６７≠５′号）等が好適に挙げられる。 上記の２閑株はα−アセトアミド桂皮酸を添加した最小
培地において、α−アセトアミド桂皮酸を弔−炭素源と
して生育し得る微生物の中から新たに分離された新菌株
であり、その菌学的性質は以下の通りである。 Ｎ−７株 （ａ）、形態 細胞の形：桿菌 細胞の大きさ：０．５〜０．７Ｘ１．Ｏ〜２．５μｍ細
胞の多形性の有無：無、運動性：有 鞭毛の着生状態二周鞭毛 胞子の有Ｊ！！１４　：有、胞子の形：球状〜わずかに
卵形胞子の大きさ＝０．６〜０．８μｍ 胞子の形成部位：末端付近 胞子のうの形：ふくらんでいる グラム染色性ニゲラド陽性 抗酸性：非抗酸性 （電　生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 生育状態：適度、形状：円形１周囲は不規則、表面はし
わ状、偏平〜わずかに隆起１色状：肌色、不透明 （２）肉汁寒天斜面培養 生育状態：適度、形状：糸状１表面はしわ状、色状：肌
色、鈍光 （３）肉汁液体培養 混濁しない、わずかに沈殿２表面に皮膜を形成する （４）肉汁ゼラチン穿刺培養 ゼラチンを液化しない、穿刺口周辺にのみ生育 （５）リドマス・ミルク アルカリ性、固化しない （Ｃ）、生理学的性質 （１）硝酸塩の還元：陽性 （２）脱窒反応：認められない （３１Ｍ　Ｒテスト：陰性 （４１Ｖ　Ｐテスト：＠性 （５）インドールの生成：無 （６）硫化水素の生成：無 （７）デンプンの加水分解：無 （８）クエン酸の利用 Ｋｏｓｅｒ培地：陽性 ０ｈｒｉｓｔ、ｅｎｓｅｎ培地：陽性 （９）無機窒素源の利用： 硝酸塩又はアンモニウム塩をｒｐ−窒素源として用いる （１■色素の生成：無 ＩＪＩＩウレアーゼ：陽性 （１２オキシダーゼ：陰性 （１，１カタラーゼ：陽性 （１４１生育の・邦）囲： 可（５へ・９（最適ｐｐｉ　７付近） １０゛℃で生育できる（最適温度２５〜３０℃）。３７
’Ｃで生育できない １１５１酸素に対する９し度：好気性 （１６）〇−Ｆテスト： 糖の分解は弱いながら酸化的 （１旧：ｌ’ｉ　ｉｌ＋１から酸及びガス生成の有無ｃ
ｄ）、その他の性質 （１）ジヒドロキシアセトン：生成しない（２）分離源
：土壌 ８　７株 （ａ）、形態 細胞の形：桿菌。 細胞の大きさ二０４５〜０．７Ｘ１．２〜２，５μｍ細
胞の多形性の有無：無 運動性の６無：有 鞭毛の着生状！メは二層鞭毛 ｎ；ｑ−ｆ−の有無：無 ダラム染色性：陰性 抗酸性：非抗酸性 （ｂ）、生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 生育二適度、形状：円形、全縁、隆起９表向は滑らか９
色状：肌色、光沢あり、不透明 （２）肉汁寒天斜面培養 生育：　１１９６度、形状：糸状９色状：肌色、光沢あ
り （３）肉汁ｌ（ダ体培イ）ｔ 〆１■濁しない、沈殿は生成しないかごくわずかに生成
する１表面に皮膜を形成する （４）肉汁ゼラチン穿刺培養 ゼラチンを液化をしない、穿刺１−１周辺にのみ生育 （５１リドマス・ミルク アルカリ性、ｕ１化しない （Ｃ）、生理学的性質 ＋１）硝酸塩の還元二陽性 （２）脱窒反応：認められない （３）入イＲテスト：陰性 ＋４）　Ｖ　Ｐテスト：陰性 （５）インドールの生成：無 １６）硫化水素の生成：無 （７）デンプンの加水分解：無 （８）クエン酸の利用 ＫＯ／ＪＩ９ｒ培地：陽性 （３ｈｒｉｓｔ、ｅｎｓ　ｅｎ培地：腸性（９）ブ（接
線′９ぜ素源の利用： アンモニウム塩又は硝酸塩を単一窒素源として利用 （１（２）色素の生成：無 （１１）ウレアーゼ：陽性 （１クオキシダーゼ：陰性 （１３）カタラーゼ：陽性 ＋１４）生育の範囲： ｐＨ５〜９（最適ｐ１（７付近） 】０℃で生育できる（最適温度２５〜３０℃）３７℃で
生育できない ０■酸素に対する態度：好気性 ＋１６１０　Ｆテスト：糖の分解は弱いながら酸化的（
１７１糖から酸及びガス生成の有無 （（至）、その他の性質 （１）酢酸、プロピオン酸又は酪酸を（１１を−の炭素
源、エネルギー源として生育する、 （２）分離源は土壌 以上述べた菌学的諸性質をバージエイのマニュアル・オ
ブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｉ）ｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｊ、ｖｅ　Ｂａｒ、ｔ、ｅ−ｒｉｏｌｏｇｙ　）　第
８版に基づき検索した結果、Ｎ−７株はグラム陽性。好
気性で胞子を形成する桿菌であることより、バチルス属
に含まれる細菌であると考えられる。そこでバチルス属
に含まれる種について検索を行った結果、バチルス・ス
フエリカスについての開戦事項と生理学的性質において
Ｄ−マンニットからの酸生成及び硝酸塩の還元テストの
２点において少し異なるが１本菌株をバチルス・スフエ
リカスの一菌株と見なすのが最も妥当であると結論し２
本菌をバチルス・スフエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５
ｐｈａｅｒｉＣｕｓ　）と同定した。一方、Ｓ−７株に
ついても同様に検索した結果、ダラム陰性、好気性及び
周Ｖｆψ毛を有する桿菌であること、更にその生理学的
性質からオキシダーゼ活性は非常に弱いが、アルカリ土
類金属に含まれる細菌であると考えられる。そこでアル
カリ土類金属に含まれる種について検索を行い１本菌を
アルカリゲネス９フエカリス（ＡＬｃａｌｉｇｅｎｅｓ
　ｆａｅｃｅｌｉｓ　）と同定し　ノこ　。 バチルス・スフズリカスＮ−７株及びアルカリゲネス・
フ、カリスＳ−７株は上記の如く、いずれもα−アセト
アミド桂皮酸を単一炭素源として含有する培地に生育し
うる微生物の中から分離されたものであるが、これら例
示菌株以外にも広く自然界のＦａｔ生物から本発明に使
用しうる菌株を分離することができる。例えば、リン酸
−カリウム０１％、硫酸マグネシウム０．０５％を含有
する基本培地に唯一の炭素源としてα−アセトアミド桂
皮酸を０．５〜５％稈度添加して作成した培地（ｐＨ７
，０）に適当ｔｉｔの自然界微生物試ネ・１を添加し、
３０℃で７〜１０日間振とう培養を行い、生育して来た
微生物を分離スることによって行われる。 本発明に係る微生物を培養する培地としては。 炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類などを含む通常
の栄養培地が使用できる。炭素源としては該微生物の利
用１．ＩＪ能なものであればいずれも使用することがで
き２例えばグルコース、フラクトース、マンノース、シ
ヨ糖、マンニット、ソルビトール、グリセリン等の糖も
しくは糖アルコール酢酸，クエン酸，フマール酸等の有
機酸が使用できる。窒素源としては．塩化アンモニウム
、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸−アン
モニウム，炭酸アンモニウム等の無機酸アンモニウム塩
，酢酸アンモニウム、クエン酸アンモニウノ、等の何機
酸アンモニウム塩等を使用すること力くてきる。有機栄
養源としては，例えば酵母エキス。 ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカー。 タンパク質加水分解物，アミノ酸等が使用できるう又，
無機塩類としては，例えば硫酸第一鉄，硫酸マグネシウ
ム、硫酸マンガン、リン酸−プｊ　ＩＪつム、リン酸ニ
ナトリウム、塩化ナトリウム等が使用できるっ培養は常
法により実施すればよく９例えば培地のｐＨを５〜９好
ましくはｐＨ６〜８に調整し、菌株を接種した後１０〜
ｂ は２５〜３０℃で好気的に培養する。尚、培養（こあた
って培地中にα−アセトアミド桂皮酸を少量添加してお
くことにより、得られる培養物又は菌体のα−アセトア
ミド桂皮酸からのＬ−フェニルアラニン生成能を凸める
ことかできる。この場合、α−アセトアミド桂皮酸の添
加晴は通常０．０１％以、−１−１とりわけ０．１〜１
％が好ましい。尚、この添加したα−アセトアミド桂皮
酸は上記培養において１１１ス：一の炭素源、窒素源と
して用いることができる。 この樺にして微生物を培養した後、得られる培養液、該
培養液から採取した菌体又は該菌体の処理物（例えば、
洗浄菌体、乾燥閑体、閑体刊砕物、菌体の自己消化物、
菌体の超音波処理物、菌体抽出物、ポリアクリルアミド
ゲル又はカラギーナンゲル等で固定化した６１体等）を
α−アセトアミド桂皮酸又はその塩に作用させることに
よりＬ−７エニルアラニンを生成させることができる。 該反応は培養後の菌体を含む培養液にα−アセトアミド
桂皮酸又はその塩を加えて実施してもよく、又培養液か
ら遠心分離、ろ過等により採取した菌体又は該菌体処理
物をα−アセトアミド桂皮酸含有水性溶媒中に加えて反
応せしめてもよい。 更に、これらの他１例えば菌体をカラギーナンゲル法又
はポリアクリルアミド法等により固定化して調製した固
定化菌体をカラムに充填した後、基質含有溶液を流下さ
せる連続法により実施することもできる。σ−アセトＴ
ミド桂ｔヶ酸のＬ−フェニルアラニンへの転換反応は上
記いずれの１人ろ合にも水性媒質中１０〜６０℃、とり
わけ３０℃刊近、ｐＨ５〜１０とりわけｐｌ（７〜８稈
度で実施するのが好ましいう又、基質であるα−アセト
アミド桂皮酸又はその塩の添加濃度はバッチ式か連続式
かによっても異なるが、バッチの場合一般に水性媒質中
０．５〜２０％、とりわけ３〜１０％程度が好ましく、
連続式の場合はこれよりやや低い濃度であるのが奸才し
い。 尚１本発明方法においてα−アセトアミド桂皮酸のＬ−
フェニルアラニンへの転換反応を実施するに当って＋１
．反応系にＬ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸とＬ−フェニ
ルアラニン・トランスアミナーゼとを添加しておけば反
応時間の短縮或いはＬ−フェニルアラニンのＭｍｍの増
加をはかることができるので好ましい。添加するＬ−ア
ミノ酸としては、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン
酸し−アラニンなどが好適に挙げられ、これらは単独で
又は４（ＩＩ　合ぜて用いてもよい。又、これらＬ−ア
ミノ酸の添加ｈｔは基質であるα−アセトアミド桂皮酸
と櫃ね当モル量程度が好ましい。又、Ｌ−フェニルｒラ
ニン・トランスアミナーゼは必ずしも積装されたもので
なくてもよ＜、Ｌ−フェニルアラニン・トランスアミナ
ーゼ活性の強いｆｆ＜　生物９例えばアクロモバクタ−
属〔アクロモバクタ−・アクアチリス（Ａｃｈｒｏｍｏ
ｂａｃｔｏｒ　ａｑｕａｔｉｌｉｓ　）　０ＵＴ８００
３．アクロモバクタ−・リクイダム　（Ａｃ）１ｒｏｍ
ｏｂａｃｔ、ｏｒ　ｌｉｑｕｉｄｕｍ　）　ＯＵＴ　８
０１２　’Ｊ　、　　アルカリ土類金属〔アルカリゲネ
ス・フヱカリス　（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｏ
ａｌｉｓ　）　ＯＵＴ　８０２５　）　、　　アルスロ
バクタ−属〔アルスロバクタ−・グロビホルミス（Ａｒ
ｔ、ｈｒｏｂａｃｔｏｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ　）
　ＩＦＯ１２９５６〕、バチルス属〔バチルス・セレウ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）　ＩＦＯ３００１
）　、　　コリネバクテリウム属（コリネバクテリウム
・ハイドロカルポクラスタス（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｃｌａｓｔｕｓ　）　
ＡＴＯ（，１１５５９２）、　　アシネトバクタ−属〔
アシネトバクタ−・カルコアセチフス（Ａｃ１ｎｅｔｏ
ｂａｃｔｏｒ　ｃａｌ　−ｃｏａａｅも１ｃｕｓ）ＩＦ
Ｏ１２５５２）、　　パラコ・ｙカス属〔バラコツカス
・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏ−ｃｃｕｓ　ｄｅ
ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ　）　ＩＦＯ１２４４２）　、
　　プロテウス属〔プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔ
ｅｕｓ　ｖｕｌ−ｇａｒｉＦ３）　ＯＵＴ　８１０２　
）　、　　シュードモナス属〔シュードモナス・オーレ
オファシェンス（Ｐｓｅｕｄｏ　−ｍｏｎｕｓ　ａｕｒ
ｅｏｆａｃｉｅｎｓ　）　Ｉ　ＡＭ　１００１　、　　
シュードモス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｃｈｕｙｌ
ｋｉｌｌｉｅｎｓｉ５）　Ｉ　ＡＭ　Ｉ　Ｏ９２）等の
微生物を常法に従って培養し、得られた培養液、該培養
酸から採取した菌体又は該菌体の処理物をそのまま該Ｌ
−フェニルアラニン・トランスアミナーゼとしてＪ−１
１いることができる、又２本発明方法において生菌体を
用いる場合。 反応液中に界面活１′４−剤（例えば、臭化セチルトリ
メチルアンモニウム、トリトンＸ　−１００等）　’ｉ
ｔ：添加しておけば反応時間の短縮あるいはＬ−フェニ
ルアラニンの蓄積（１４の増加をはかることができる。 界面活性剤の添加Ｆｉｔは反応液に対して概ね０゜００
０１〜０１％稈度が好ましい。 かくして反応液中に生成蓄積したＬ−フェニルアラニン
の分ｊ都イーｉ製は２通常のイオン交換樹脂法やその他
の公知方法を組合わせて容易に行うことができる。 以下、実施例をあげ−Ｃ本発明方法を具体的に説明する
。尚、実施例中のＬ−フヱニルアラニンの（布認及び定
Ｍはペーパークロマトグラフィーによるニンヒドリン発
色位（Ｈ，アミノ酸オー１〜アナライザー及びロイコノ
ストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕａｏｎｏｓｔｏｃ
　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　）　Ｐ　−６０を用い
たバイオアッセイ法により行った。 実施例１ グルコース０．５％　、１４　リペプトン１％、肉エキ
ス１％、酵母エキス１．２５％、塩化ナトリウム０．５
％及びα−アセトアミド桂皮酸０．２％を含有する培地
をｐＨ７，０に調整し、これを５００づ容肩付振とうフ
ラスコに１０　Ｄ　ｍｅ宛分注し。 １２０℃で１０分間蒸気滅菌した。これに予め寒天斜面
培地に３０℃で２４時間生育させた下記第１表に示す微
生物を一白金耳接種し、３０℃で２４時間培養した。各
微生物の培養液１００　ｍｌから遠心公序１Ｆにて菌体
を１１ｂめ、生理食塩水１００　ｍｌにけん濁し、洗浄
した。洗浄後９遠心分離（こて菌体を集め、この菌体を
３％α−アセトアミド桂皮酸水溶液（アンモニア水でｐ
、ｒ（７，５に調整）１００ｍｃｉこけん濁し、３０℃
で１８時間反応さゼた。反応液中に生成したＬ−フヱニ
ルアラニンの量は下記第１表の通りである。 第１表 実施例２ 下記第２表に示す微生物を実施例１と同一組成の培地１
００　ｍｌに同一条件で培養し、集菌した。このｎ体を
各々２％のＬ−アスパラギン酸及び００１％の臭化セチ
ルトリメチルアンモニラｌ、を含む３％α−アセトアミ
ド桂皮酸水溶液（アンモニア水でｐＦ■７．５に調整）
１００−にけん澗し、３０℃で１８時間反応させた。反
応液中に生１戊した■ヨーフヱニルアラニンの暗は下記
第２表のｉｉ’ｔｔりである。 第２表 実施例３ 下記第３表に示す微生物をグルコース５％。 酵母エキス０．５％、リン酸−カリウム０．１％。 硫酸マグネシウム０．０５％及びα−アセトアミド桂皮
酸０，５％を含有する培地（ｐＨ７，０）　１００　ｒ
ｒｔを用いて実施例１と同一条件で培養し、集菌した。 この菌体をそれぞれ／−，６ラコ・ソカス・デニトリフ
ィカンスＩＦＯ１２４４２の凍結乾燥菌体０．３％、Ｌ
−アスパラギン酸２％及び臭化セチルトリメチルアンモ
ニウム０．０５％を含有する３％α−アセトｒミド杆皮
酸水溶液（アンモニア水で１−ＩＩ−（７，５にＨ１？
ｌ１４’８　）　１００　ｍｇにけん１’：ｉ　Ｌ、３
０℃で１８時間反応させた。反応液中に生成したＬ−フ
ェニルアラニン量は■記第３表の通りである。 尚、バラコツカス・デニトリフィカンスＩＦ０１２４４
２のｌ束結乾燥［宥イ本は、グルコース１％、リン酸ニ
アンモニウム０．２％、酵母エキス１％、コーンステイ
ープリカー０．５％、リン酸−カリウノ、０１％、硫酸
マグネシウム０．０５％、硫、酸マンガン０．００１％
、硫酸第一鉄０．００５％、塩化カルシウム０．１％及
びカラリン０．００３９４を含有する培地（ＴＩＨ７，
０）を用いて、３０℃で２４時間培任し、純水で洗浄後
、常法によ　リ　ｉｌ、ＩＩＩ　栃　し　プこ。 第３表 実施例４ バチルス・スフエリカスＮ　−７株（微工研Ｍ寄第６７
４６　号）を実施例３と同一培地１００ｍ１を用い、同
一条件で培養し２％菌した。この菌体を、Ｌ−アスパラ
ギン酸２％、臭化セチルトリメチルアンモニウム０．０
５％及び実施例３と同様に調製したバラコツカス・デニ
トリフィカンスＩＦ０１２４４２の凍結乾燥菌体０．３
％を含む３％α−アセトアミド桂皮酸水溶液（アンモニ
ア水でｐＨ７，５に調整）１００ｍｉ！にけん濁し、３
０℃で反応させた。反応開始４８時間後、反応液中には
Ｌ−７エニルアラニン２．５Ｆが生成、蓄積した。この
反応液を遠心骨１１！Ｉ１１．　して菌体を除去し、−
上澄液を活性炭処理した後、濃縮し、少Ｉのメタノール
を添加して和結晶２．６７を得た。この粗結晶を加熱し
ながら少量の水に溶解し、ｐＨ５，５に調整後、メタノ
ールを加え。 析出晶をろ］国することによりＬ−フェニルアラニンの
結晶２．０２を得た。 Ｋ九Ｐ、２５９６Ｃ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バチルス属又はアルカリ土類金属に属し。 α−アセトアミド桂皮酸からＬ−７ヱニルアラニンを生
   成せしめる能力を有する微生物の培養液。 該培養液から得た菌体又は該菌体の処理物をα−アセト
   アミド桂皮４１ｐ又はその塩に作用させ、生成したＬ−
   フェニルアラニンを採取することを特徴とするＬ−フェ
   ニルアラニンの製造法。 ２、　　Ｌ−アミノ酸の存在下に微生物の培養液。 該培養液から採取した菌体又は該菌体の処理物をα−ア
   セトアミド桂皮酸又はその塩に作用させる特許請求の範
   囲第１項記載の製造法。 ３、　Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラ
   ギン酸又はＬ−アラニンである４’！ｊ’　＃’Ｉ’　
   Ｎｉ−２求の範囲第２項記載の製造法。 ４　Ｌ−アミノ酸及びＬ−フェニルアラニン・トランス
   アミナーゼの存在下に微生物の培養液。 該培？？液から得た菌体又は該菌体の処理物をα−アセ
   トアミド桂皮酸又はその塩に作用さぜる４ｅ　ｓ’ｒ請
   求の範囲第１項記載の製造法。 ５、Ｌ＝ニアミノがＬ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギ
   ン酸又はＬ−アラニンである特許請求の範囲第４項記載
   の製造法。 ６　微生物がα−アセトアミド桂皮酸からＬ−フェニル
   アラニンを生成せしめる能力を有するバチルス・スフエ
   リカスである特許請求の範囲第１＋ｆｉ　、第２項、！
   、（Ｓ３項、第４項又は第５項紀帷の製造法。 ７、　微生物がα−アセトアミド桂皮酸からＬ−フェニ
   ルアラニンを生成せしめる能力を有するアルカリゲネス
   ・フェカリスである特許請求の範囲！」３１項、第２項
   、第３項、？６４項又Ｉｔ　”Ｄ　５　［、ｔｌ　記ｔ
   ｉｉＱの製造法。