JPS5917987A - ウレア−ゼおよびその製造法 - Google Patents
ウレア−ゼおよびその製造法Info
- Publication number
- JPS5917987A JPS5917987A JP12836782A JP12836782A JPS5917987A JP S5917987 A JPS5917987 A JP S5917987A JP 12836782 A JP12836782 A JP 12836782A JP 12836782 A JP12836782 A JP 12836782A JP S5917987 A JPS5917987 A JP S5917987A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- urease
- mole
- measured
- stable
- stability
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はウレアーゼおよび発酵法によるウレアーゼの製
造法に関する。
造法に関する。
さらに詳しくは、本発明はＫｍ値大で、かつ安定性の良
好なウレアーゼおよびその発酵法による製法に関する。
好なウレアーゼおよびその発酵法による製法に関する。
ウレアーゼ（Ｅ、Ｃ，３，５，１，５）は尿素を分解し
てアンモニアと炭酸ガスを生ずる反応を触媒する酵素で
あり、植物、動物、微生物等天然界に広く存在すること
が知られている。すでにナタ豆由来のウレアーゼが工業
的に製造され、臨床検査薬や人工腎臓装置等に広く利用
されている。
てアンモニアと炭酸ガスを生ずる反応を触媒する酵素で
あり、植物、動物、微生物等天然界に広く存在すること
が知られている。すでにナタ豆由来のウレアーゼが工業
的に製造され、臨床検査薬や人工腎臓装置等に広く利用
されている。
臨床検査薬としては尿素純窒素の測定に用いられている
が、ナタ豆由来のウレアーゼの性質はＫｍ値が１〜３
ｘ １０” （ｐＨ７＋５リン酸緩衝液）であり、かか
る性質の酵素では尿素純窒素濃度の測定範囲が狭い欠点
を有している。また微生物由来のウレアーゼの研究は多
いが、酵素の性質あるいは応用に関する研究は少なく、
ナタ豆由来ウレアーゼに比しＫｍ値大なるウレアーゼの
微生物における存在については、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ５Ｊ１．６７〜７３（１
９５４）にバチルス・パストイリの報告があるが、安定
性が劣るため酵素を単離しても失活してしまうことが知
られており、実用化には難点がある。
が、ナタ豆由来のウレアーゼの性質はＫｍ値が１〜３
ｘ １０” （ｐＨ７＋５リン酸緩衝液）であり、かか
る性質の酵素では尿素純窒素濃度の測定範囲が狭い欠点
を有している。また微生物由来のウレアーゼの研究は多
いが、酵素の性質あるいは応用に関する研究は少なく、
ナタ豆由来ウレアーゼに比しＫｍ値大なるウレアーゼの
微生物における存在については、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ５Ｊ１．６７〜７３（１
９５４）にバチルス・パストイリの報告があるが、安定
性が劣るため酵素を単離しても失活してしまうことが知
られており、実用化には難点がある。
本発明者婢はＫｍ値大なる特徴を有し、がっ安定性の良
いウレアーゼを生産する微生物を探索した結果、静岡県
駿東郡長泉町の雑木林の土壌より分離したバチルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌ＵＲ−１５５株がその
菌体内にＫｍ値大でかつ安定性の良いウレアーゼを著量
に生産することを見い出し、本発明を完成した。
いウレアーゼを生産する微生物を探索した結果、静岡県
駿東郡長泉町の雑木林の土壌より分離したバチルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌ＵＲ−１５５株がその
菌体内にＫｍ値大でかつ安定性の良いウレアーゼを著量
に生産することを見い出し、本発明を完成した。
次に本発明をさらに詳しく説明する。
本発明のウレアーゼはＫｍ値大で、かつ良好な安定性を
示すが、具体的には次の性質を有する。なお、性質の特
定に用いた酵素は実施例工の方法で得られた精製酵素標
品であり、酵素力価の測定は以下の方法によった。
示すが、具体的には次の性質を有する。なお、性質の特
定に用いた酵素は実施例工の方法で得られた精製酵素標
品であり、酵素力価の測定は以下の方法によった。
力価の測定法：
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５） ２．６ｍｌ、α
−ケトゲルタール酸（１ｓ ｍｙ／ｍｔｌ ） ｏ、
Ｉ ＩＩｌ、尿素（２０７１ｖ／ｌｕｇ ） ０．１５
ｔｄ、ＮＡＤＰＨ（２，５ｍｆ ／ｘｉ ） ０．１
ｍｌ。
−ケトゲルタール酸（１ｓ ｍｙ／ｍｔｌ ） ｏ、
Ｉ ＩＩｌ、尿素（２０７１ｖ／ｌｕｇ ） ０．１５
ｔｄ、ＮＡＤＰＨ（２，５ｍｆ ／ｘｉ ） ０．１
ｍｌ。
グルタメートデヒドロゲナーゼ（１５００Ｕ／ｄ ）０
．０２ｄよりなる反応液を３７℃５分間放置後、測定す
べき酵素液０．０１１１ｇを添加し、３７℃１分後の吸
光度０Ｄ３４０よ（Ｅ、）および２分後の吸光の減少量
を求める。このＮＡＤＰＨの減少量より、ウレアーゼの
作用により生成したアンモニア量を求める。酵素活性は
１分間に１μｍｏｌｅのアンモニアを生成する酵素量を
１単位（ＩＵ）とする。
．０２ｄよりなる反応液を３７℃５分間放置後、測定す
べき酵素液０．０１１１ｇを添加し、３７℃１分後の吸
光度０Ｄ３４０よ（Ｅ、）および２分後の吸光の減少量
を求める。このＮＡＤＰＨの減少量より、ウレアーゼの
作用により生成したアンモニア量を求める。酵素活性は
１分間に１μｍｏｌｅのアンモニアを生成する酵素量を
１単位（ＩＵ）とする。
酵素の性質：
（＆）作用
１モルの尿素より１モルの水を消費し、２モルのアンモ
ニアと１モルの炭酸ガスを生成する０ （ｂ） 至適ｐＨ ７，８〜８．３ （ｃ） 至適温度 ３５〜４０℃ （ｄ） ｐＨ安定性 ３７℃、３０分間の処理でｐＨ８〜１０で安定（、）
温度安定性 ｐ）（８，３０分間の処理で４５℃まで安定（ｆ）
基質特異性 基質 相２対活性（イ） 尿素 １００ ビウレット ４ アラントイン ６ （ｇ）阻害剤 阻害剤 濃度（Ｍ） 相対活性（→−１０
０ Ａｇ１００Ａ Ｘ １０−’ ３ＣｕＳＯ
４１ＸＩＯ−’ ４グアニジン塩酸 ４
Ｘ１０−３ ８（ｈ） Ｋｍ値 本酵素の脂値（ｐＴ（７，ｓ １７ン酸緩衝液）は４．
５ Ｘ １０”Ｍであり、ナタ豆由来ウレアーゼに比し
約２０倍を示す特徴を有している。
ニアと１モルの炭酸ガスを生成する０ （ｂ） 至適ｐＨ ７，８〜８．３ （ｃ） 至適温度 ３５〜４０℃ （ｄ） ｐＨ安定性 ３７℃、３０分間の処理でｐＨ８〜１０で安定（、）
温度安定性 ｐ）（８，３０分間の処理で４５℃まで安定（ｆ）
基質特異性 基質 相２対活性（イ） 尿素 １００ ビウレット ４ アラントイン ６ （ｇ）阻害剤 阻害剤 濃度（Ｍ） 相対活性（→−１０
０ Ａｇ１００Ａ Ｘ １０−’ ３ＣｕＳＯ
４１ＸＩＯ−’ ４グアニジン塩酸 ４
Ｘ１０−３ ８（ｈ） Ｋｍ値 本酵素の脂値（ｐＴ（７，ｓ １７ン酸緩衝液）は４．
５ Ｘ １０”Ｍであり、ナタ豆由来ウレアーゼに比し
約２０倍を示す特徴を有している。
０）分子量
約４４０，０００（ケ／ｌＪＱＭ法により測定）（ｊ）
等電点 ｐＨ５，０付近（キャリア・アンホ〉イトを用いた等電
点分画法により測定） さらに本発明の酵素は安定性に優れている。
等電点 ｐＨ５，０付近（キャリア・アンホ〉イトを用いた等電
点分画法により測定） さらに本発明の酵素は安定性に優れている。
すなわち、前記バチルス・パストイリの産生酵素は氷室
中でもすぐに失活する旨記載されているが、本酵素は５
℃、４日の保存で７０−７５チ活性が残存し、ラクトー
スを添加する場合は同一条件で９０−９５チ残存する。
中でもすぐに失活する旨記載されているが、本酵素は５
℃、４日の保存で７０−７５チ活性が残存し、ラクトー
スを添加する場合は同一条件で９０−９５チ残存する。
本発明のウレアーゼは尿累態蒙素の測定範囲として従来
のナタマメ由来のウレアーゼに比し２〜４倍となること
を確認した。このように臨床検査薬として用いるために
は充分精製できたが、単一な酵素蛋白として結晶化させ
るに至っておらず、従って元素分析、結晶構造について
は明らかにされていない。
のナタマメ由来のウレアーゼに比し２〜４倍となること
を確認した。このように臨床検査薬として用いるために
は充分精製できたが、単一な酵素蛋白として結晶化させ
るに至っておらず、従って元素分析、結晶構造について
は明らかにされていない。
本発明のウレアーゼはバチルス属に属し、該ウレアーゼ
生産能を有する菌株を栄養培地に培養して培養物中、主
として菌体中に核ウレアーゼを生成蓄積せｌ−め、つい
でこれを採取することにより得ることができる。
生産能を有する菌株を栄養培地に培養して培養物中、主
として菌体中に核ウレアーゼを生成蓄積せｌ−め、つい
でこれを採取することにより得ることができる。
本発明に使用する微生物は上記性質を有するものであれ
ばいずれの微生物でもよいが、具体的には前記バチルス
・スピシーズＵＲ−１５５があげられる。
ばいずれの微生物でもよいが、具体的には前記バチルス
・スピシーズＵＲ−１５５があげられる。
上記の苗株ＵＲ−１５５株の菌学的性質および同定の準
拠について以下に示す。同定のための実験方法は主に長
谷用武治編著「微生物の分類と同定」学会出版センター
（１９７５）によった。
拠について以下に示す。同定のための実験方法は主に長
谷用武治編著「微生物の分類と同定」学会出版センター
（１９７５）によった。
また分類同定の基準としてバーシーズ・マニユアル・オ
プ・デターミナティプ・バクテリオロジー、第８版（１
９７４）および）％ Ｆ４Ｇｏｒｄｏｎら著； Ｔｈｅ
ＧｅｎｕｓＢａｃｉｌｌａ （Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｖ
ａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ５ｅｒｖｉｃｅ 、 Ｕ、
８゜Ｄｅｐｅｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｖｅ 、 １９７３ ）などを参考にした。
プ・デターミナティプ・バクテリオロジー、第８版（１
９７４）および）％ Ｆ４Ｇｏｒｄｏｎら著； Ｔｈｅ
ＧｅｎｕｓＢａｃｉｌｌａ （Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｖ
ａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ５ｅｒｖｉｃｅ 、 Ｕ、
８゜Ｄｅｐｅｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｖｅ 、 １９７３ ）などを参考にした。
Ａ、細胞形態
肉汁寒天培地２５℃ ２４時間培養にて（０，８〜１．
０μ） Ｘ （２，０〜８．０μ）の長桿菌で稀にフィ
ラメント状になる。ダラム染色は不定で運動性を有する
。胞子は極めて稀にしか観察されないが、古い培養では
細胞内に顆粒状物質が存在する。
０μ） Ｘ （２，０〜８．０μ）の長桿菌で稀にフィ
ラメント状になる。ダラム染色は不定で運動性を有する
。胞子は極めて稀にしか観察されないが、古い培養では
細胞内に顆粒状物質が存在する。
Ｂ、培養的性質
（１）肉汁寒天平板培養２５℃４８時間で直径３〜５
ｍｍの円形のコロニーを形成する。
ｍｍの円形のコロニーを形成する。
表面は平滑で光沢があり、隆起は凸円状、コロニー周縁
は金縁。コロニーは均質、不透明でクリーム色、可溶性
色素社形成しない。
は金縁。コロニーは均質、不透明でクリーム色、可溶性
色素社形成しない。
（２）肉汁斜面培養２５℃ ２４時間で糸状良好な生育
を示す。コロニーはクリーム色でバター質である。
を示す。コロニーはクリーム色でバター質である。
（３）肉汁寒天穿刺培養では表面にのみ生育する。
（４）肉汁液体培養ではや＼濁る程度で粉状の沈渣を生
ずる。
ずる。
Ｃ０生理学的性質
（リ 生育温度；範囲 １５〜３３℃
至適 ２０〜２５℃
（２）生育Ｐ Ｈｙ範囲６．５〜９．５．至適７，０〜
９．０（３）酵素の要求性；好気性 （４）０・Ｔテスト；好気性で生育するが、酸およびガ
スを生成しない。
９．０（３）酵素の要求性；好気性 （４）０・Ｔテスト；好気性で生育するが、酸およびガ
スを生成しない。
（５）ゼラチンの液化；陽性
リドマスミルク；不変
硝酸塩の還元；陽性
ＭＲテスト ；陰性
ｖＰテスト ；陰性（ｐＨの上昇は認められない）イン
ドールの生成；陰性 でん粉の加水分解；陰性 ウレアーゼ ；陽性 カタラーゼ ；陽性 オキシダーゼ；陽性 フェニルアラニンの分解；陰性 チロシンの分解；陰性 食品抵抗性；７％で非生育 クエン酸の利用；陰性 プロピオン酸の利用；陰性 ｏ、ｏｏｔ％リゾチーム耐性；陽性 栄養要求性；なし 糖から酸の生成；グルコース、アラビノーズ、キシロー
ス、マンニットカラ酸ヲ生成 しない。
ドールの生成；陰性 でん粉の加水分解；陰性 ウレアーゼ ；陽性 カタラーゼ ；陽性 オキシダーゼ；陽性 フェニルアラニンの分解；陰性 チロシンの分解；陰性 食品抵抗性；７％で非生育 クエン酸の利用；陰性 プロピオン酸の利用；陰性 ｏ、ｏｏｔ％リゾチーム耐性；陽性 栄養要求性；なし 糖から酸の生成；グルコース、アラビノーズ、キシロー
ス、マンニットカラ酸ヲ生成 しない。
Ｄ、ＤＮＡのＧ−Ｃ含量；３７モルパーセント以上本１
ｌｌ（ＵＲ−１５５株は内生胞子を生成すること（観察
できるのは極めて稀である）、ダラム変性、好気性の桿
菌であるとみなされる。
ｌｌ（ＵＲ−１５５株は内生胞子を生成すること（観察
できるのは極めて稀である）、ダラム変性、好気性の桿
菌であるとみなされる。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の中で種々の菌学的性質を比較検討
するとＢａｅｌｌ ｌｕｇ ｐａｓｔｅｕｒｌｌ とよ
く一致していることが認められた。しかし前記の引用文
献には該菌種の菌学的性質は多くは記載されてない。
するとＢａｅｌｌ ｌｕｇ ｐａｓｔｅｕｒｌｌ とよ
く一致していることが認められた。しかし前記の引用文
献には該菌種の菌学的性質は多くは記載されてない。
従ってＢａｃｉｌｌｕｓ ｐ＠５ｔｅｕｖｌｌのｔｙｐ
ｅ ５ｐｅｃ１ｅｓであり、かつＪ、ｏｆ Ｂａｅｔｅ
ｒｌｏｌｏｇｙ ６８．６７−７３（１９５４）に報告
されているＡＴＣＣ−１８５９との比較を行なった。生
々相違点を第１表にまとめる。
ｅ ５ｐｅｃ１ｅｓであり、かつＪ、ｏｆ Ｂａｅｔｅ
ｒｌｏｌｏｇｙ ６８．６７−７３（１９５４）に報告
されているＡＴＣＣ−１８５９との比較を行なった。生
々相違点を第１表にまとめる。
第１表
ＵＲ−１５５ＡＴＣＣ１１８５９
グラム染色 不 定 陽性内生胞子
稀にのみ観察されゐ よく生成するｐＨ５，６で
の成育 陰 性 （陽性）却−スから酸の
生成 ｌ ０剤ｍ−スか
ら酸の生成 （陽性）（）；
文献に記載がない × ； 文献の記載と異なる 以上の比較の結果と重曹が特徴的なウレアーゼを生産す
る点から、重曹はＢａｅｌｌｌｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｌ
ｉＡＴＣＣ１１８５９とは明らかに区別されうる。
稀にのみ観察されゐ よく生成するｐＨ５，６で
の成育 陰 性 （陽性）却−スから酸の
生成 ｌ ０剤ｍ−スか
ら酸の生成 （陽性）（）；
文献に記載がない × ； 文献の記載と異なる 以上の比較の結果と重曹が特徴的なウレアーゼを生産す
る点から、重曹はＢａｅｌｌｌｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｌ
ｉＡＴＣＣ１１８５９とは明らかに区別されうる。
またＢａｃｉｌｌｕｓ属の他の菌種とも明らかにＰｃａ
る。
る。
従って重曹はＢａｅｌｌｌｕｍ ｓｐ、ＵＲ−１５５と
命名され、ＡＲ８Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ＦｅｒｍａｎｔａｔｌｏｎＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ（米）にＮＲＲＬ Ｂ−１５１１３と
して寄託されている。
命名され、ＡＲ８Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ＦｅｒｍａｎｔａｔｌｏｎＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ（米）にＮＲＲＬ Ｂ−１５１１３と
して寄託されている。
使用菌株の培養においては、通常の栄養培地が用いられ
る。炭素源としてはグルコース、シス−クロース、フジ
クトース、殿粉、廃糖蜜、アルコール類、有機酸類等、
天然栄養源としてハヘフトン、肉エキス、酵母エキス、
コーン参ステイープ・リカー等、窒素源としてはアンモ
ニア、硫安、硝安、塩安、尿素等、無機塩類としては、
リン酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸
マグネミウム、硫酸亜鉛等をそれぞれ単独又は組み合せ
て用いられる。培養は通常振とりまたは通気攪拌培養で
行う。培養温度は２０〜３０℃、培地ｐ Ｉ［は６〜８
であることが好適である。通常１〜４日間培養を行うと
菌体中にウレアーゼが生成蓄積する。培養を停止した発
酵液より遠心分離などにより菌体を分離する。該菌体を
適当な手段で破砕し、破砕液から遠心分離などによって
上清を得る。上清液からのウレアーゼの精製単離は通常
酵素精製に用いられる方法、例えば、塩析、有機溶媒沈
殿、透析、等電点沈殿、吸着体などを用いる方法に本発
明の実施例を示す。
る。炭素源としてはグルコース、シス−クロース、フジ
クトース、殿粉、廃糖蜜、アルコール類、有機酸類等、
天然栄養源としてハヘフトン、肉エキス、酵母エキス、
コーン参ステイープ・リカー等、窒素源としてはアンモ
ニア、硫安、硝安、塩安、尿素等、無機塩類としては、
リン酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸
マグネミウム、硫酸亜鉛等をそれぞれ単独又は組み合せ
て用いられる。培養は通常振とりまたは通気攪拌培養で
行う。培養温度は２０〜３０℃、培地ｐ Ｉ［は６〜８
であることが好適である。通常１〜４日間培養を行うと
菌体中にウレアーゼが生成蓄積する。培養を停止した発
酵液より遠心分離などにより菌体を分離する。該菌体を
適当な手段で破砕し、破砕液から遠心分離などによって
上清を得る。上清液からのウレアーゼの精製単離は通常
酵素精製に用いられる方法、例えば、塩析、有機溶媒沈
殿、透析、等電点沈殿、吸着体などを用いる方法に本発
明の実施例を示す。
実施例１゜
１次種培地として、ペプトンｌｖ／ｄ／、肉エキス１ｅ
／ｃｔｌｓ食塩０．３ｆｌｄｉ％ｐ Ｈ７，２からなる
培地３０ｔｎｌを２５０Ｍ１容三角フラスコに分注し、
１２０℃１５分殺菌する。（以下培地はすべて該条件で
殺菌すム）種菌としてバチルス・エスピーＵ、Ｒ−１５
５を１白金耳、１次種培地に接種し、２８℃で２４時間
振とう培養する。
／ｃｔｌｓ食塩０．３ｆｌｄｉ％ｐ Ｈ７，２からなる
培地３０ｔｎｌを２５０Ｍ１容三角フラスコに分注し、
１２０℃１５分殺菌する。（以下培地はすべて該条件で
殺菌すム）種菌としてバチルス・エスピーＵ、Ｒ−１５
５を１白金耳、１次種培地に接種し、２８℃で２４時間
振とう培養する。
次に１次種培地と同じ組成の培地３００ｍ１ｌ’を２ノ
容三角フラスコに分注し、１次種培養液３０ｍ１を移し
、２８℃、２４時間振とり培養する。
容三角フラスコに分注し、１次種培養液３０ｍ１を移し
、２８℃、２４時間振とり培養する。
かくして得られた２次種培養液１１を、３０１容ジャー
ファーメンタ−中、１５１の発酵培地（グルコースＩＱ
ｆ／ｄｉ、 コーン°ステイープ°リカー２０ｆ／ｄ
ｉ、硫安１９／ｄｉ、リン酸１カリウム０．５９／ｄｉ
、塩化カリウム０．５ｆ／ｄｉ、硫酸マグネシウム０、
ｓｙ／ｄｉ、ｐＨ７，２）に移し、３００ ｒ、 ｐ、
ｎｔ、通気ｉ１ｉ ５ Ｊ／ｍｉｎ、 ２５℃で４８時
間培養する。かくして得られた培養液のウレアーゼ力価
は６５ Ｕ／ｙｔｔｌでありた。° 培養液１６１を遠
心分離し、菌体を集め、ｏ、 ｏ ａ Ｍ ｌ＞ン酸緩
衝液に懸濁してＩＩｌとし、マントンガラリン菌体破砕
機で菌体を破砕する。菌体破砕液を遠心分離して粗酵素
液を得る。この粗酵素液Ｋ １．５倍量のア七トンを添
加し、生成してくる沈殿物を遠心分離によりて集める。
ファーメンタ−中、１５１の発酵培地（グルコースＩＱ
ｆ／ｄｉ、 コーン°ステイープ°リカー２０ｆ／ｄ
ｉ、硫安１９／ｄｉ、リン酸１カリウム０．５９／ｄｉ
、塩化カリウム０．５ｆ／ｄｉ、硫酸マグネシウム０、
ｓｙ／ｄｉ、ｐＨ７，２）に移し、３００ ｒ、 ｐ、
ｎｔ、通気ｉ１ｉ ５ Ｊ／ｍｉｎ、 ２５℃で４８時
間培養する。かくして得られた培養液のウレアーゼ力価
は６５ Ｕ／ｙｔｔｌでありた。° 培養液１６１を遠
心分離し、菌体を集め、ｏ、 ｏ ａ Ｍ ｌ＞ン酸緩
衝液に懸濁してＩＩｌとし、マントンガラリン菌体破砕
機で菌体を破砕する。菌体破砕液を遠心分離して粗酵素
液を得る。この粗酵素液Ｋ １．５倍量のア七トンを添
加し、生成してくる沈殿物を遠心分離によりて集める。
この沈殿物を０．０３Ｍリン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，０）
５０肩Ｅに溶解し、これをセロファンテ鼻−・ブを透析
膜として、０、０３ Ｍリン酸緩衝液５１を外液として
４℃１夜透析する。この濃縮酵素液をＤＥＡＥ−セルロ
ースカラム６００ｍ１に通塔し吸着させ、０．４Ｍ食塩
にて溶出する。溶出液に含まれる酵素の比活性は５７０
Ｕ／ｌＦ９蛋白であった。溶出液は限外濾過にて濃縮し
、ラクトースを０．０１■／Ｕ添加し、凍結乾燥し約２
５ｆの粉末を得た。この粉末中の酵素の比活性は５５０
Ｕ／■蛋白でありた。
５０肩Ｅに溶解し、これをセロファンテ鼻−・ブを透析
膜として、０、０３ Ｍリン酸緩衝液５１を外液として
４℃１夜透析する。この濃縮酵素液をＤＥＡＥ−セルロ
ースカラム６００ｍ１に通塔し吸着させ、０．４Ｍ食塩
にて溶出する。溶出液に含まれる酵素の比活性は５７０
Ｕ／ｌＦ９蛋白であった。溶出液は限外濾過にて濃縮し
、ラクトースを０．０１■／Ｕ添加し、凍結乾燥し約２
５ｆの粉末を得た。この粉末中の酵素の比活性は５５０
Ｕ／■蛋白でありた。
手続補正書
１、事件の表示
昭和５７年特許願第１２８３６７号
２、発明の名称
ウレアーゼおよびその製造法
３、補正をする者
事件との関係 特許出願人
郵便番号 １００
住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名称
（１０２）協和醗酵工業株式会社願書の添付書類の目録
の欄および明細書の発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容 （１）受託証（ＮＲＲＩＪ ）を別紙のとおシ添付する
。
（１０２）協和醗酵工業株式会社願書の添付書類の目録
の欄および明細書の発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容 （１）受託証（ＮＲＲＩＪ ）を別紙のとおシ添付する
。
（２） 明細書６頁下７−３行を次のごとく訂正する
。
。
ｒ ０． Ｉ Ｍリン酸緩衝液（ｐａ７．５）２．２ｍ
ｚ。
ｚ。
α−ケトグルタル酸（１ｓ ＊ｄｌ ） ｏ、１ｍ１．
尿素（２（１９／ｍ／）０．５ｍｊ、 ＮＡＤｐＨ（ｚ
、５票ｍＱ０．１５ｍ／、グルタメートデヒドロゲナー
ゼ（１５００ＵＡＲＩ ） ０．０３ ｍ／よυなる反
応液を３７℃で５分間放置後、」 （３） 明細書１２頁Ｔａ行の「食品抵抗性」を「食
塩抵抗性」に訂正する。
尿素（２（１９／ｍ／）０．５ｍｊ、 ＮＡＤｐＨ（ｚ
、５票ｍＱ０．１５ｍ／、グルタメートデヒドロゲナー
ゼ（１５００ＵＡＲＩ ） ０．０３ ｍ／よυなる反
応液を３７℃で５分間放置後、」 （３） 明細書１２頁Ｔａ行の「食品抵抗性」を「食
塩抵抗性」に訂正する。
（４）明細ｔ１３頁１１行のｒＡＴｃｃ−ｘｓｓ９ｊを
ｒＡＴＣＩＣ１１８５９ｊに訂正する。
ｒＡＴＣＩＣ１１８５９ｊに訂正する。
（５）明細書１６頁８−１１行を次のごとく訂正する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）以下の性質を有するウレアーゼ （、） 作用 １−ｒ−ルノ尿素より１モルの水を消費し、２モルのア
ンモニアと１モルの炭酸ガスを生成する。 （ｂ） 至適ｐＨ ７，８〜８．３ （ｃ） 至適温度 ３６〜４０℃ （ｄ）ｐＨ安定性 ３７℃、３０分間の処理でｐＨ８〜１０で安定（、）
温度安定性 ｐａｌ ８．３’Ｏ分間の処理で４５℃まで安定（ｇ）
阻害剤 阻害剤 濃度（Ｍ） 相対活性−一
１００ＡｇＮＯ８１
００Ａ°５３ ＣｕＳＯ４１ＸＩＯ−’ ４グアニジン塩
酸 ４Ｘ１０−” ８伽） ｈ値 本酵素のＫｍ値（ｐＨ７，ｆｌ １７）酸緩衝液）は４
．５ Ｘ １０−” Ｍである。 ０） 分子量 約４４０，０００（外濾過法により測定）（ｊ） 郷
電点 ｐＨ５，ｏ付近（キャリア・アンホライトを用いた等電
点分画法により測定） （２）バチルス属菌株の産生ずる特許請求の範囲第１項
記載のウレアーゼ。 （３）バチルス属に属し、下記の性質を有するウレアー
ゼ生産能を有する菌株を栄養培地に培養して培養物中に
咳ウレアーゼを生成蓄積せしめ、ついでこれを採取する
ことを特徴とする特許 る該ウレアーゼの製造法。 ウレアーゼの性質： （、） 作用 １モルの尿素より１モルの水を消費し、２モルのアンモ
ニアと１モルの炭酸ガスを生成する。 （ｂ） 至適ｐＨ ７，８〜８．３ （ｃ）至適温度 ３５〜４０℃ （ｄ）ｐＨ安定性 ３７℃、３０分間の処理でｐＨ８〜１ｏで安定（、）
温度安定性 ｐ）（８，３０分間の処理で４５℃まで安定（ｆ）
基質特異性 基質 相対活性（イ） 尿素 １００ ビウレット ４ アラントイン ６ Ｑ）阻害剤 阻害剤 濃度（Ｍ） 相対活性（イ）−１０
０ １００Ａ ３１ Ｘ １０− ’ ３ＣｕＳＯ
４１ＸＩＯ−曹 ４グアニジン塩酸
４Ｘ１０−３ ８色）Ｋｍ値 本酵素の読値（ｐＨ７，５１）ン酸緩衝液）は４．５
Ｘ １０ ” Ｍでアル。 （１）分子量 約４４０，０００（ゲー過法により測定）（ｊ） 等
電点 ｐＨ５・０付近（キャリア・アンポライドを用いた等電
点分画法により測定）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12836782A JPS5917987A (ja) | 1982-07-23 | 1982-07-23 | ウレア−ゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12836782A JPS5917987A (ja) | 1982-07-23 | 1982-07-23 | ウレア−ゼおよびその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5917987A true JPS5917987A (ja) | 1984-01-30 |
Family
ID=14983066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12836782A Pending JPS5917987A (ja) | 1982-07-23 | 1982-07-23 | ウレア−ゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5917987A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0229219A2 (en) * | 1986-01-13 | 1987-07-22 | Sapporo Breweries Limited | Urease and process for preparation thereof |
| US5298399A (en) * | 1990-08-10 | 1994-03-29 | Sapporo Breweries Limited | Gene and process for producing a thermostable urease |
-
1982
- 1982-07-23 JP JP12836782A patent/JPS5917987A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0229219A2 (en) * | 1986-01-13 | 1987-07-22 | Sapporo Breweries Limited | Urease and process for preparation thereof |
| US4753882A (en) * | 1986-01-13 | 1988-06-28 | Sapporo Breweries Limited | Urease and process for preparation thereof |
| US5298399A (en) * | 1990-08-10 | 1994-03-29 | Sapporo Breweries Limited | Gene and process for producing a thermostable urease |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4039384A (en) | Creatinine amidohydrolase and creatine amidinohydrolase and process for producing them | |
| US4237230A (en) | Novel lactase | |
| US5416019A (en) | Rhodococcus microorganisms that produce phenylalanine dehydroganase | |
| CA1284464C (en) | D(-)-mandelate dehydrogenase produced microbiologically, a process for its production and application thereof | |
| JPS5917987A (ja) | ウレア−ゼおよびその製造法 | |
| US5206162A (en) | Process for making D-aminoacylase | |
| US4357425A (en) | Process for producing L-amino acid oxidase | |
| JPS5810074B2 (ja) | 新規微生物 | |
| JPH0364107B2 (ja) | ||
| JPH02265478A (ja) | 新規なザルコシンオキシダーゼおよびその製法 | |
| JPH0158957B2 (ja) | ||
| JP3433300B2 (ja) | 酵母細胞壁溶解酵素高生産菌及びこれを用いる酵母細胞壁の溶解方法 | |
| JPS6055119B2 (ja) | 発酵法によるウレア−ゼの製造法 | |
| JPH0362397B2 (ja) | ||
| JPH07274961A (ja) | クレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法 | |
| JP2004208644A (ja) | 新規メタノール資化性菌およびそれを用いたｌ−セリン製造方法 | |
| JPS63248393A (ja) | 微生物によるｄ−ピペコリン酸の製造法 | |
| JPS63129988A (ja) | トランス−４−シアノシクロヘキサン−１−カルボン酸を製造する方法 | |
| DK148360B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af uricase | |
| JPS5817590B2 (ja) | Ｌ−リンゴ酸脱水素酸素の製造法 | |
| JPS6033473B2 (ja) | モノメチルアミン酸化酵素およびその製造法 | |
| JPS6339577A (ja) | 耐熱性／耐酸性グルコアミラ−ゼを生産する嫌気性細菌 | |
| JPS62232381A (ja) | バチルス属に属する好熱性細菌 | |
| JPS6027515B2 (ja) | ２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸加水分解酵素の製造法 | |
| JPS6022914B2 (ja) | ３α−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナ−ゼの製造法 |