JPS6339577A - 耐熱性／耐酸性グルコアミラ−ゼを生産する嫌気性細菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なグルコアミラーゼの生産に用いられる嫌
気性細菌に係り、さらに詳しくは、ぶとう糖等の製造等
におけるでん粉の糖化反応に好適な酸性条件下でもすぐ
れた耐熱性を有する耐熱性／耐酸性グルコアミラーゼを
生産するクロスツリジウム・エスピーに関する。

〔従来の技術〕

酵素は基質特異性が高く、常温、常圧下でも反応を触媒
できる特徴を有するが、−ｇに加熱やｐＨ変化に対し極
めて不安定である。最近、酵素を固定化してバイオリア
クターに組み込み、異性化糖やＬ−アミノ酸が生産でき
るようになった。これらのりアクタの運転に際しては、
雑菌の繁殖防止や反応速度をあげるため、常温より高い
６０℃以上の温度で行うことが望まれている。このため
、旧来の常温性酵素にかわり、加熱やｐＨ変化にも安定
な、いわゆる耐熱酵素の開発が進められてきた。

現在、工業的に用いられているグルコアミラーゼは５０
℃を越えると急速に酵素活性が失活する常温性酵素であ
り　（酵素利用ハンドブック、　ｐ６２．他人書かん、
昭和５７年）主としてリゾプス（Ｒｈ　１ｚｏｐｕｓ）
属およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ　ｉｓ）属
がら生産されている。これらのグルコアミラーゼの作用
好適ｐＨは４〜５である。

耐熱性に優れたグルコアミラーゼについては、Ｖ、Ｂａ
ｓａｖｅｓｗａｒａ等（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　、　１
９３．３７９．１９８１年）やカドコシン等（特開昭６
０−５４６８０号）の例があるが、いずれも熱安定性を
発揮するためにはｐ）１６程度の中性条件が必要である
。

ところで、でん扮を原料とするぶとう糖の製造は１０〜
４０％）溶度のでん粉スラリーをα−アミラーゼにより
液化する液化工程と、この液化でん粉溶液をグルコアミ
ラーゼにより糖化する徳化工程の２工程により行われて
いる。液化工程においては原料でん粉中に含まれる不純
物の有ａ酸のためにｐＨは５以下、しばしば４以下を呈
する。このため先に本発明者らは４付近においてもすぐ
れた耐熱性を存する新規なα−アミラーゼを開発しく特
願昭５９−２３６９１７号）、でん粉スラリーをアルカ
リで中和することなく酸性状態のままで液化することを
可能にした。しかしながら、液化工程にひき続いて行わ
れる糖化工程に使用するグルコアミラーゼに関しては、
ｐＨ４〜５の酸性条件下で糖化を行える耐熱性酵素はま
だ未開発である。先に述べたカドコシン等の耐熱性グル
コアミラーゼの作用好適ｐＨは６付近であるため、糖化
工程を行うには液化でん粉溶液にアルカリを加えて中和
しなければならない。その結果、ぶとう糖や異性化糖等
のでん粉加工の最終製品を得る場合には、反応後に中和
剤を除去することが必要となり、イオン交換樹脂を用い
る脱塩工程への負化を著しく増大させている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、上記従来技術の問題点を解決し、でん
粉を原料としてぶとう等を製造するにあたりｐＨ４〜５
の酸性条件下、６０〜７０℃の高温下で作用可能なグル
コアミラーゼ、すなわち耐熱性／耐酸性に優れた新規な
グルコアミラーゼを生産する微生物を提供することにあ
る。

〔問題点を解決するための技術手段〕

本発明者らは耐熱性にすぐれ、かつ耐酸性を有する新規
なグルコアミラーゼを生産する微生物の探索を行った。

その結果、クロスッリジウムに属する偏性嫌気性細菌で
あるクロスッリジウム・エスピーＧ−０００５（ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ　Ｇ−０００５）　（微工研菌
寄第８７３７号）が酵素の特性、特に酸性領域での耐熱
性について従来のグルコアミラーゼと異なる新規なグル
コアミラーゼを生成することを見い出し、本発明に至っ
た。本発明のクロスツリジウム属細菌は、濃厚有機廃液
の高温メタン醗酵スラリーを起源として分離したもので
ある。本菌の分離は次のようにして行った。まずメタン
醗酵スラリーを低速遠心分離（１０００ｒｐｍ、　　５
分間）にかけ、粗大粒子を／、を降除去した後、殺閏生
理食塩水で希釈した。

これを菌液とし、でん粉粒を炭素源とする寒天平板上に
窒素雰囲気下で塗布し、６０℃で嫌気的にでん粉粒を溶
解することなく生育するコロニーを分離した。さらに、
上記コロニーの希釈液か１マイクロマニユプレークによ
り栄養細胞を単離した。

寒天平板による分離とマイクロマニュプレークによる分
離とをさらに数回重ね、本発明の菌を得た。

本発明のクロスツリジウム属細菌は工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託しである（受託番号：微工研菌寄第
８７３７号（ＦＥＲＭ　Ｐ−８７３７））。まず、本菌
の菌学的性質の詳細を説明する。なお、以下の記載にお
いて％は特に士旨示しない限り重量％である。

Ａ、形態的性質 （１）栄養細胞の形態 下記のデキストリン・ペプトン培地の寒天平板上、嫌気
性雰囲気中、６０℃で２日間培養した場合、栄養細胞は
０．３〜０．５　Ｘ　２〜４μｍの大きさの直状の桿菌
である。上記の栄養細胞は単独あるいは連鎖して存在す
る。液体培養においても同様となる。また、細胞の多形
性はみられない。

なお、この菌の生物形態の顕微鏡写真を第１図に示す。

デキストリン−ペプトン培地の組成 デキストリン　　　　　　　　　　１．５％ペプトン　
　　　　　　　　　　０．５％酵母エキス　　　　　　
　　　　０．５％ＫＨｚＰＯｎ０．７％ ＮａｚＨＰＯａ　　　　　　　　　　　　Ｏ，２％Ｍｇ
５Ｏ，・７Ｈ！０　　　　　　　　　０．００１％寒天
　　　　　　　　　　　　　２．０％チオグリコール酸
ナトリウム　　０．１％水道水 ｐＨ６，０ （２）運動性の有無 運動性は認められない （３）胞子の有無 でん粉−ペプトン培地の寒天平板培養において胞子の形
成が認められる。胞子は栄養細胞内端部に形成され、直
径０．５μｍ程度の球状をなしている。

（４）ダラム染色性 陰性 Ｂ、各培地における生育状態 （１）コロニーの形態 でん粉−ペプトン培地の寒天平板培養でのコロニーは、
中心部がやや隆起した扁平な円形となり、周縁部は不規
則である。色素は産生ぜず、乳白色半透明である。

（２）肉汁寒天平板培養 生育は認められない 肉汁寒天培地組成 肉エキス　　　　　　　　　　１．０％ペプトン　　　
　　　　　　　１．０％食塩　　　　　０．２％ チオグリコール酸ナトリウム　０．１％寒天　　　　　
２．０％ 蒸留水 ｐＨ６，。

（３）肉汁寒天斜面培養 生育は認められない （４）肉汁寒天穿刺培養 穿刺線にそってわずかに増殖していることが観察される
。色素の産生は認められない。

（５）肉汁液体培養 生育は認められない 肉汁培地の組成 肉エキス　　　　　　　　　　１．０％ペプトン　　　
　　　　　　　１．０％食塩　　　　　０．２％ チオグリコール酸ナトリウム　０．０１％蒸留水 ｐＨ６，０ （６）肉汁・ゼラチン培養 生育は認められない。ゼラチンの液化も認められない。

肉汁ゼラチン培地の組成 肉エキス　　　　　　　　　　１．０％ペプトン　　　
　　　　　　　１．０％食塩　　　　　０．２％ ゼラチン　　　　　　　　　１５．０％チオグリコール
酸ナトリウム　０．１％蒸留水 ｐＨ６，０ （７）リドマスミルク培養 酸を生成して赤変し、固く凝固する。ガスの発生が認め
られる。

Ｃ０生理的性質 （１）生育の温度範囲 ４９〜６４℃で生育する。４６℃、６９℃では生育は認
められない。５７〜６１℃付近で良好に生育する。

（２）生育のｐＨ範囲 ｐＨ４，８〜７．５で生育する。ｐＨ６，０付近で良好
に生育する。

（３）酸素に対する態度 ゛　　偏性嫌気性 （４）０−Ｆテスト　（Ｈｕｇｈ　Ｌａ１ｆｓｏｎ法）
陰性。空気雰囲気中及び流動パラフィン重層による嫌気
性条件下共にガス生成を伴って生育し、酸の生成により
黄色となる。空気雰囲気中での培養においては、気相境
界部より約１０下より、底部にかけて生育した。

培地組成 ペプトン　　　　　　　　　　０．２％ぶとうｔ）！　
　　　　　　　　　　１．ｏ％食塩　　　　　０．５％ ＫＪＰＯ＊　　　　　　　　　　　　０．０３％ブロム
クレゾールパープル　　０．００２％寒天　　　　　０
．３％ 蒸留水 ｐ　Ｈ６，０ （５）硝酸塩の還元 陰性 （６）ＶＰテスト 陰性 （７）ＭＲテスト 陽性。赤変化する。

（８）インドール生成 ペプトン水に生育しないため測定できない。

（９）硫化水素の生成 陰性（Ｋｌｉｇｒｅｒの培地使用において）（１０）で
ん粉の加水分解 陽性 （１１）クエン酸の利用 陽性（Ｓｉｍｏｎｓ培地使用において）（１２）アンモ
ニウム塩の利用 ペプトン水に生育せず、測定できない。

（１３）色素の菌体外生成 陰性 （！４）ウレアーゼ 陰性 （１５）オキシダーゼ 陰性 （１６）カタラーゼ 陰性 （１７）糖の資化性 糖の資化性及びダーラム管を用いたガス発生有無の観察
結果を第１表に示す。表中、資化性及びガスの生成が認
められた場合には＋、認められない場合には−の記号で
示した。

（木頁以下余白） 第　　　１　　　表 糖資化性試験用液体焙地組成 炭素源（糖）１．０％ ペプトン　　　　　　　　　　１．０％ＮａＣ！　　　
　　　　　　　　　０．２％チオグリコール酸ナトリウ
ム　０．１％薫留水 ｐＨ６，０ （１８）無機塩培地への生育 生育は認められない。

これらの結果よりバージ−の細菌分類マニュアル（Ｂｅ
ｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅ　Ｂｏｃｔｅｒｉ−ｏｌｏｇｙ　８ｔｈ　Ｅ
ｄｉｔｉｏｎ）に基づき、クロスツリジウムに属する細
菌と同定した。

次に、本発明の細菌を用いて生産した耐熱性グリコアミ
ラーゼの酵素的特性について記す。

なお、グルコアミラーゼ活性の測定は次のように行った
。

グルコアミラーゼ活性測定の基質には可溶性でん粉（和
光純薬製、生化学用）を用いた。まず、５％可溶性でん
粉溶液９．５ｍＺ、　　ｐＨ４，５の０．１Ｍ酢酸−酢
酸ナトリウム緩衝液０．５ｍＺ、純水１ｍ！。

酵素溶液０．５　ｍｌを混合し、６０℃で３０分間酵素
反応を行わせた。次いで、反応液中のぶどう糖量をグル
コース分析ＨＣ米国、イエロー・スプリングス・インス
ッルメント・カンパニー（Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｐｒｉｎｇ
ｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ）社製、グ
ルコースオキシダーゼ法により測定する。）を用いて測
定した。

グルコアミラーゼ活性の１単位は、上記測定条件下で１
分間に１μｍｏｌのぶとう糖を生成する能力と定義した
。

（１）調製方法 デキストリン１．５％、ポリペプトン０．５％、酵母エ
キス０．５％、リン酸第１カリウム０．７％、リン酸第
２ナトリウム０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物ｏ
、ｏｏｉ％、チオグリコール酸ナトリウム０．１％及び
水道水を含む液体培地（ｐ　Ｈ６，０）　３２ｋｇを内
容積５Ｎの培養槽１０基に３．１５　ｋｇづつ分注し、
１２０℃で１５分間殺菌した。それぞれの培養槽に上記
培地を用いて嫌気的に培養した本発明のクロスツリジウ
ム属細菌Ｇ−０００５菌の菌体懸濁液０．３５ｋｇを添
加した。次いで、ガス出口に水封トラップを付し、培養
槽内気相部をアルゴンガス（酸素濃度ｌｐｐｍ以下）で
十分置換後、嫌気条件下で培養した。

培養液のｐＨは６．０に、培養液の温度は６０℃にそれ
ぞれ自動調整した。２１時間培養後、培養液を合せ、６
０００ｒｐｍで遠心分離し、菌体を除去した。回収した
上澄液についてガラス濾紙（東洋科学産業型、　ＧＡ−
１００及びＧＣ−５０）メンブレンフィルタ　（東洋科
学産業製、ポアサイズ１μｍ及び０．４５μｍ）を用い
て加圧濾過し、菌体及びその他の固形物を除去して培養
濾液を得た。この培養濾液より１０ｍ１を採取し、純水
にて２４時間透析したのち、グルコアミラーゼ活性を測
定したところ、培養濾液１ｇあたり０．０５単位のグル
コアミラーゼが存在していた。

次に上記培養濾液２９ｋｇを中空繊維型モレキュラーシ
ーブ膜（分画分子量１０，０００．　　米国アミコン製
（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏ、）ＨＩＰＩＯ−２０）で加圧濾
過し、２　ｋｇに濃縮した。上記濃縮液について硫安を
用いた塩析を行い、飽和度（硫安飽和濃度に対す割合、
％で表わす）　２０％にて析出せず、飽和度５５％にて
析出した固形物を１４．００Ｏｒｐｍで遠心分離し回収
した。次いで飽和度５５％の硫安溶液で固形物を洗浄し
回収した。次いで、固形物を０．０５Ｍ　）リス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し２４０ｇとした。次いで
上記緩衝液１０１を用いて、２４時間透析を２回繰返し
実施した。そののち、透析した液中の固形物を、ガラス
濾紙（東洋濾紙型、　ＧＣ−５０）を用いた濾過で除去
した。清澄化した透析液は３１０ｇであった。

次に、上記透析液をジエチルアミノエチル化架橋アガロ
ースゲル（フラクション、　ＤＥＡεセファロースＣＬ
−６Ｂ）を用いたイオン交換クロマト　（カラムサイズ
φ４４　Ｘ　５００ｍｍ）により精製した。０．０５Ｍ
トリス−塩酸緩衝液で平衡化したゲルカラムに上記透析
液をチャージし、洗滌した。次いで緩衝液中の塩化ナト
リウム濃度を直線勾配で上昇しつつ展開した。グルコア
ミラーゼの溶出パターンを図６に示す。塩化ナトリウム
濃度０．２５Ｍの溶出位置にグルコアミラーゼ活性を有
するピークが認められた。グルコアミラーゼフラクショ
ンとして３６０ｇを回収し、次いでモレキュラーシーブ
膜（分画分子量１０，０００．米国アミコン製、　ＰＭ
−１０，）を用い、純水１０ｋｇを加えて加圧濾過し、
脱塩、濃縮を行い粗精製グルコアミラーゼ液１６０ｇを
得た。本溶液中のグルコアミラーゼ活性は３．３単位７
ｇであった。

次に上記粗精製グルコアミラーゼにつきゲル濾過により
精製した。まず、上記ゲルコミラーゼ液１００ｇを０．
０４Ｔｏｒｒの減圧下で凍結乾燥し、これを０．０５Ｍ
クエン酸・第２クエン酸緩衝液（ｐＨ４，５）４−に溶
解し、固形物を４００Ｏｒｐｍの遠心分離で除去した。

次に、上記緩衝液で平衡化した架橋デキストランゲル（
ファルマシア製、セファデックスＧ−１００）を充填し
たクロマトカラム（φ１５　Ｘ　９００ｍｍ）に上記グ
ルコアミラーゼ液１−をチャージし同じ緩衝液で展開し
た。その結果を第７図に示した。

溶出液ｉ６５＋ｎＺの位置にグルコアミラーゼ活性のピ
ークが認められた。上記ゲル濾過を残りの粗精製グルコ
アミラーゼについても実施し、精製グルコアミラーゼフ
ラクション４０ｇを得た。本フラクションのグルコアミ
ラーゼ活性は１２単位／ｇであった。

以上の精製操作により、培養濾液基準の比活性は１７１
倍に向上した。また、培養濾液基準の活性回収率は２３
％である。培養濾液を基準とした各工程の標品の比活性
、収量、活性回収率を第２表に示した。

なお、液体培養における液体培地の炭素源としては、上
記デキストリンに限るものではなく、可溶性でん粉、馬
鈴薯でん粉、コーンスターチ、甘薯でん粉、廃糖みつ等
を用いてもよい。また、その他の栄養成分も上記に限定
するものではなく、コーンステイープリカー、各種アミ
ノ酸、ビタミン、各種塩等を単独もしくは混合して用い
てもよい。

（２）作用及び基質特異性 本酵素は、馬鈴薯、とうもろこし、甘薯等のでん粉、お
よびこれらを加水分解して得た可溶性でん粉、デキスト
リン、マルトース等をぶとう糖に加水分解するグルコア
ミラーゼである。マルトース基質の場合、ぶどう糖生成
速度は可溶性でん粉基質の約２である。

（３）至適ｐＨ 本酵素の６０℃における作用ｐＨ曲線を第２図に示す。

本酵素の６０℃における最適ｐＨ域は４〜５にあり、か
つ、好適ｐＨは（最適ｐＨでの活性の８０％を有するｐ
Ｈ域とする）３．８〜５．７にある。

なお、反応の際のｐ　Ｈ１１衝液としては、塩化カリウ
ム−塩酸（ｐＨ２，０）、グリシン−塩酸（ｐＨ２，５
〜３．５）、β：β−ジメチルグルグル酸−トリスヒド
ロキシメチルアミノメタン−２−アミノ−２−メチル−
１：３−プロパンジオール（以下「ＧＴＡＪと略称）（
ｐＨ３，５〜９）の０．０５Ｍ緩衝液を用いた。

（４）ｐＨ安定性 本発明によるグルコアミラーゼをｐＨ２，３゜４、４．
５．　５．　６．　７．　９の各ｐＨ下（０，０５Ｍ塩
化カリウム−塩酸、　０．０５Ｍグリシン−塩酸及び０
゜０５ＭＧＴＡ緩衝液を使用）で７０℃、３０分間イン
キュベートした。そののち、反応液を希釈し、ｐＨ４，
５に調整したのち、可溶性でん粉を基質として残存活性
を測定した。その結果を第３図に示した。

本発明によるグルコアミラーゼはｐＨ４，５〜５．０の
範囲で完全に活性が保持されていた。したがって、木グ
ルコアミラーゼは酸性領域ですぐれた安定性を有する酵
素であることがわかった。

（５）至適温度 本発明によるグルコアミラーゼの活性をｐＨ４゜５の条
件下、４０．５０．６０．６５．７０．７５℃の温度に
て測定したところ、第４図に示す結果を得た。本結果よ
り、至適温度は７０℃付近にある。好適温度（最適温度
での活性の８０％を有する温度域とする）は５３〜７３
℃である。

（６）グルコアミラーゼ活性に及ぼす金属塩の形容 本発明によるグルコアミラーゼの活性に及ぼす金属塩の
影響を第３表に示す。グルコアミラーゼ活性の測定にお
いて各種の金属塩を５ｍＭになるように添加した。そし
て、金属塩無添加に対する活性を％で表示した。なお、
アンモニウム塩及びＥＤＴＡ添加の場合についても第３
表に付記した。マグネシウムイオン、カルシウムイオン
、カリウムイオンがグルコアミラーゼ活性作用を有する
ことが認められる。ニッケルイオン、鉄イオンには阻害
作用が認められる。

第　　　３　　　表 活性測定条件 ｐＨ５，０（０，１Ｍクエン酸−第２クエン酸ナトリウ
ム緩衝液）活性測定温度：６０℃（７）熱安定性 本発明によるグルコアミラーゼを基質無添加下、ｐＨ４
，５にて、６０〜８０℃の加熱処理を行い、一定時間毎
（２０，４０秒、　　１．　２．　４．１０．２０．４
０分、１゜２．４，６，８．１６時間、１，２，４，７
．１０゜１５、２０日）に処理液の一部を採取し、液中
のグルコアミラーゼ活性を６０℃、ｐＨ４，５にて測定
した。

これをもとに各温度における活性半減期を求め、その結
果を第５図に示した。７０℃及び７５℃における基質無
添加下での活性半減期はそれぞれ、６時間、１分間であ
る。本グルコアミラーゼはこれまで公知のグルコアミラ
ーゼに較べ高度の耐熱性を有している。一方、ｐＨ４，
０，４，３，４，５，５，０゜６、０の各ｐＨにおける
基質無添加下、７０℃での活性半減期を求め、第４表に
示した。この結果から、本グルコアミラーゼは、クロス
ツリジウム・サーモアミロリデイクム（Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏ−１ｙｔｉｃｕｍ）
　＋　サーモマイセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍ
ｙｃｅｓ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、及びタラロミセ
ス０デュポンティ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｕｐｏ
ｎｔｉ）により産生されるグルコアミラーゼよりも特に
、ｐＨ４〜５の酸性領域においてすぐれた耐熱性をもつ
ことを示す。

（本頁以下余白） （８）耐熱性に及ぼす金属塩の影響 本発明によるグルコアミラーゼの耐熱性に及ぼす金属塩
の影響を第５表に示す。グルコアミラーゼの水溶液（０
，０５Ｍ酢酸−酢酸す）　ＩＪウム緩衝液に溶解、ｐＨ
４，５）に各種の金属塩を５ｍＭ濃度になるように添加
し、７０℃、１時間の加熱処理を行ったのち、ｐＨ４，
５，６０℃でグルコアミラーゼ活性を測定した。そして
、加熱処理前に対する加熱処理後の活性、すなわち残存
活性を％で表示した。

第５表から、ニッケルイオン、マンガンイオン、マグネ
シウムイオンに保護効果のあることが認められる。コバ
ルトイオン、カルシウムイオンについては保護効果は認
められない。亜鉛イオンは耐熱性を著しく低下させる。

（本頁以下余白） 第　　　５　　　表 （９）分子量 本発明によるグルコアミラーゼの分子量はゲル濾過クロ
マト法（スエーデン、ファルマシア製セファデックスｃ
Ｌｔｏｏを使用）による溶出パターンから３．８　Ｘ　
１０−’と測定される。

〔作　用〕

以上述べたことから明らかなように、本発明細菌より産
生される新しい耐熱性グルコアミラーゼは、特にｐＨ４
〜５の酸性領域での耐熱性において、従来の嫌気性細菌
の産生ずる耐熱性酵素と著しく異なる。

ところで、ぶどう糖や異性化糖を製造するには、まず、
原料のでん粉をα−アミラーゼで液化し、そのあとグル
コアミラーゼで糖化している。液化の際、原料のでん粉
を２０〜４０％の高濃度に仕込むため、液の［）Ｈは酸
性を呈する。このため、従来の耐熱性α−アミラーゼ及
び耐熱性グルコアミラーゼを用いる場合には、作用ｐＨ
域が中性域にあるため、アルカリで中和しなければなら
ない。

これに対し、先に本発明者らが見い出した耐熱性・耐酸
性の新規なα−アミラーゼ（特願昭５９−２３６９１７
号）及び、本発明による新規なグルコアミラーゼを用い
ることにより、液化での中和を行うことなく酸性の状態
のままで液化及び糖化を行うことが可能となり、ひいて
は反応後の脱塩工程への負荷を大幅に軽減できる。

〔実施例〕

実施例１ ポリペプトン０．５６％、酵素エキス０．５６％、リン
酸第１カリウム０．７８％、リン酸第２ナトリウム０゜
３９％、硫酸マグネシウム・７水和物０．００１％、チ
オグリコール酸ナトリウム０．１％、水道水を含む合成
培地（ｐ　Ｈ６，５）２０００ｇ調製し、その２７０ｇ
を５００ｄ容坂ロ振盪フラスコ７個に分注し、それぞれ
を１２１°Ｃ１１５分間殺菌した。一方、デキストリン
、馬鈴薯でん粉、マルトース、ぶどう糖、ラクトース、
シュークロース及びフラクトースの各炭素源についてそ
れぞれの１０％溶液３０ｇを調製し、１１０’Ｃ，１５
分間の殺菌を行った。ついで、上記坂ロフラスコに炭素
源溶液をそれぞれ無菌的に添加した。

そののち、あらかじめ、デキストリンを炭素源とした上
記液体培地を用いて調製した本発明の嫌気性細菌クロス
ツリジウムＧ−０００５の菌体懸濁液３０ｍ１づつを各
振盪フラスコに添加した。次いで、ガス出口に水封トラ
ップを付したのち、フラスコ内に窒素ガスを注入して嫌
気条件とし、６０℃で振盪培養した。４０時間後、各振
盪フラスコから培養液４０ｇを採取した。次いで、採取
した各培養液試料の半量を分取し、１５．ＯＯＯｒｐｍ
の遠心分離により菌体を除去し、培養上澄液を調製した
。残りの培養液試料については、水冷却下にて超音波破
砕処理を行い、次いで１５．００Ｏｒｐｍの遠心分離に
より固形物を除去し菌体破砕培養液上澄液を調製した。

次いで、各炭素源毎の培養上澄液及び菌体破砕培養液上
澄液中のグルコアミラーゼ活性を測定した。なお、活性
測定にあたっては、各試料を純水を用いて２４時間透析
処理し、次いで７０℃、５分間の熱処理を加え、さらに
遠心分離で固形物を除去した試料を用いた。測定の結果
を第６表に示した。

（本頁以下余白） 実施例２ 馬鈴薯でん粉１．５％、ふどう糖０．２％、コーンステ
イープリカー０．３％、硫酸アンモニウム０．３％、リ
ン酸第１カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．０１
％、硫酸第１鉄０．０１％、硫酸マンガン０．０１％、
システィン０．１％、水道水を含む液体培地（ｐＨ６、
５）　３．１５ｋｇを内容積５１の培養槽に入れ、次い
で、　　１２１℃、１５分間の殺菌を行った。次いで、
６０°Ｃまで冷却したのち、培養槽内の気相部を窒素ガ
スで置換した。次に、あらかじめ、上記液体培地を用い
て調製した本発明の嫌気性細菌クロスツリジウム属細菌
Ｇ−０００５の菌体懸濁液０．３５ｋｇを添加し、次い
で、ガス出口に水封トラップを付したのち、気相部、培
地内に窒素ガスを注入し、嫌気状態となし、培養を開始
した。培養のｐＨは６．５．温度は６０℃に調節した。

４１時間後、培養を停止し、培養液３．５５ｋｇを得た
。次いで、遠心分離により菌体を含む固形物を除去し、
さらにガラス濾紙（東洋濾紙型、　ＧＡ−１００，ＧＣ
−５０）及びメンブレンフィルタ（東洋濾紙製、ポアサ
イズ１μｍ、　　０．４５μｍ）を用いて加圧濾過し、
培養濾液３．２５ｋｇを得た。培養濾液の一部をとり、
純水に対して２４時間透析したのち液中の活性を測定し
たところ、培養濾液１ｇあたり０．１２単位のグルコア
ミラーゼ活性が認められた。

〔発明の効果〕

本発明の細菌の産生ずる新規な耐熱性／耐酸性グルコア
ミラーゼは、特にｐＨ４〜５の酸性領域下にてすぐれた
耐熱性を有するため、でん粉を原料としてぶどう糖を製
造する際、でん粉溶液を中和することなく酸性状態での
糖化が可能となる。

これに比べ、従来公知の耐熱性グルコアミラーゼを用い
る場合には、でん粉溶液を中性化するためにアルカリを
添加しなければならない。したがって、本発明の細菌の
産生ずるグルコアミラーゼを用いることにより、でん粉
溶液の中和工程が不要となり、かつ反応後の脱塩工程へ
の負荷を大幅に軽減できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明細菌（クロスツリジウム属細菌Ｇ−００
０５）の生物形態を示す顕微鏡写真、第２図は本発明細
菌により生産されたグルコアミラーゼの活性に及ぼすｐ
Ｈの影響を示す特性図、第３図は前記グルコアミラーゼ
の熱安定性に及ぼすｐＨの影響を示す特性図、第４図は
前記グルコアミラーゼの活性に及ぼす温度の影響を示す
特性図、第５図は前記グルコアミラーゼの耐熱性を示す
特性図、第６図は前記グルコアミラーゼのジエチルアミ
ノエチル架橋アガロースゲルを用いたイオン交換液体ク
ロマトグラフにおけるグルコアミラーゼ活性溶出パター
ン図、第７図は前記グルコアミラーゼの架橋デキストラ
ンゲルを用いたゲル濾過におけるグルコアミラーゼ活性
溶出パターン図である。 特許出願人　株式会社日立製作所 代理人　弁理士　平　木　祐　輔 ｐＨ 第３図 ｐＨ 温度（−Ｃン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、温度４９℃〜６５℃で生育し、且つ、耐熱性／耐酸
   性グルコアミラーゼ生産能を有するクロスツリジウム・
   エスビー。 ２、微生物が微工研菌寄第８７３７号と同定される性質
   を有する特許請求の範囲第１項記載のクロスツリジウム
   ・エスビー。