JPH047672B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なグルコアミラーゼとその製造
法に係わり、特にぶどう糖製造におけるでん粉の
糖化反応に好適な耐熱性／耐酸性グルコアミラー
ゼとその製造法に関する。 〔従来技術〕 耐熱性酵素は、常温用酵素に比べ、加熱やPHの
変化にも安定性が高く、酵素利用工業には極めて
有用である。現在、工業用に用いられているグル
コアミラーゼはリゾプス（Rhizopus）属および
アスペルギルス（Aspergillus）属から産生され
ており、いずれも常温性酵素であり、50℃を越え
ると急速な酵素活性の失活が起る（酵素利用ハン
ドブツクp62、地人書館、昭和57年）。耐熱性に
優れたグルコアミラーゼについては、V.
Basaveswra等（Biochem.J.，193，379，1981
年）やカトコシン等（特開昭60−54680号）の例
があるが、いずれも熱安定性を発揮するためには
PH６程度の中性条件が必要である。ところで、で
ん粉を原料とするぶどう糖の製造は、10〜40％濃
度のでん粉スラリーをα−アミラーゼにより液化
する液化工程及びこの液化でん粉溶液をグルコア
ミラーゼにより糖化する糖化工程の２工程により
行われている。液化工程においては、原料でん粉
中に含まれる不純物の有機酸のためにPHは５以
下、しばしば４以下を呈する。このため、先に本
発明者らはPH４においてもすぐれた耐熱性を有す
る新規なα−アミラーゼを開発し（特願昭59−
236917号）、でん粉スラリーを酸性状態のままで
液化することを可能にした。しかしながら、液化
工程にひきつづいて行われる糖化反応に使用する
グルコアミラーゼには、PH４〜５の酸性条件下で
作用可能な耐熱性酵素はまだ未開発である。先に
述べたカトコシン等の耐熱性グルコアミラーゼの
作用好適PHは６付近であり、このため、液化でん
粉溶液にアルカリを加えて中和しなければならな
い。その結果、ぶどう糖や異性化糖等の最終製品
を得る場合には、反応後に中和剤を除去すること
が必要となり、イオン交換樹脂を用いる脱塩工程
への負荷を著しく増大させている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的は、上記従来技術の問題点を解決
し、でん粉を原料としてぶどう等を製造するにあ
たり、PH５以下、60〜75℃の条件下で使用可能な
グルコアミラーゼ、すなわち偏性嫌気性菌を起源
とし、耐熱性に優れるのみならず、耐酸性をも有
する新規なグルコアミラーゼとその製造法を提供
することにある。 〔問題点を解決するための技術手段〕 本発明者らは、耐熱性にすぐれ、かつ耐酸性を
有する新規なグルコアミラーゼを得ることを目的
に、酵素及び酵素産生用微生物の探索を行つた。
その結果、60℃で培養した高温メタン醗酵液より
分離したクロスツリジウム属に属する偏性嫌気性
細菌であるクロスツリジウム・エスピーＧ−0005
（clostridium sp Ｇ−0005）（微工研菌寄第8737
号）が、酵素の特性が従来のグルコアミラーゼと
全く異なる新規な耐熱性グルコアミラーゼを産生
することを見い出し、本発明に至つた。本発明の
グルコアミラーゼを産生するクロスツリジウム属
細菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
している（受託番号：微工研菌寄第8737号
（FERM Ｐ−8737））。まず、本菌の菌学的性質
の詳細を説明する。なお、以下の記載において％
は特に指示しない限り重量％である。 Ａ 形態的性質 (1) 栄養細胞の形態 下記のデキストリン・ペプトン培地の寒天平板
上、嫌気性雰囲気中、60℃で２日間培養した場
合、栄養細胞は0.3〜0.5×２〜4μmの大きさの直
状の桿菌である。上記の栄養細胞は単独あるいは
連鎖して存在する。液体培養においても同様とな
る。また、細胞の多形性はみられない。 デキストリン−ペプトン培地の組成 デキストリン 1.5％ ペプトン 0.5％ 酵母エキス 0.5％ KH₂PO₄ 0.7％ Na₂HPO₄ 0.2％ MgSO₄・7H₂Ｏ 0.001％ 寒天 2.0％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 水道水 PH6.0 (2) 運動性の有無 運動性は認められない。 (3) 胞子の有無 でん粉−ペプトン培地の寒天平板培養において
胞子の形成が認められる。胞子は栄養細胞内端部
に形成され、直径0.5μm程度の球状をなしてい
る。 (4) グラム染色性 陰 性 Ｂ 各培地における生産状態 (1) コロニーの形態 でん粉−ペプトン培地の寒天平板培養でのコロ
ニーは、中心部がやや隆起した扁平な円形とな
り、周縁部は不規則である。色素は産生せず、乳
白色半透明である。 (2) 肉汁寒天平板培養 生育は認められない。 肉汁寒天培地組成 肉エキス 1.0％ ペプトン 1.0％ 食 塩 0.2％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 寒 天 2.0％ 蒸留水 PH6.0 (3) 肉汁寒天斜面培養 生育は認められない。 (4) 肉汁寒天穿刺培養 穿刺線にそつてわずかに増殖していることが観
察される。色素の産生は認められない。 (5) 肉汁液体培養 生育は認められない。 肉汁培地の組成 肉エキス 1.0％ ペプトン 1.0％ 食 塩 0.2％ チオグリコール酸ナトリウム 0.01％ 蒸留水 PH6.0 (6) 肉汁・ゼラチン培養 生育は認められない。ゼラチンの液化も認めら
れない。 肉汁ゼラチン培地の組成 肉エキス 1.0％ ペプトン 1.0％ 食 塩 0.2％ ゼラチン 15.0％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 蒸留水 PH6.0 (7) リトマスミルク培養 酸を生成して赤変し、固く凝固する。ガスの発
生が認められる。 Ｃ 生理的性質 (1) 生育の温度範囲 49〜64℃で生育する。46℃，69℃では生育は認
められない。57〜61℃付近で良好に生育する。 (2) 生育のPH範囲 PH4.8〜7.5で生育する。PH6.0付近で良好に生育
する。 (3) 酸素に対する態度 偏性嫌気性 (4) Ｏ−Ｆテスト（Hugh Laifson法） 陰性。空気雰囲気中及び流動パラフイン重層に
よる嫌気性条件下共にガス生成を伴つて生育し、
酸の生成により黄色となる。空気雰囲気中での培
養においては、気相境界部より約１cm下より、底
部にかけて生育した。 培 地 組 成 ペプトン 0.2％ ぶどう糖 1.0％ 食 塩 0.5％ K₂HPO₄ 0.03％ ブロムクレゾールパープル 0.002％ 寒 天 0.3％ 蒸留水 PH6.0 (5) 硝酸塩の還元 陰 性 (6) VPテスト 陰 性 (7) MRテスト 陽性。赤変化する。 (8) インドール生成 ペプトン水に生育しないため測定できない。 (9) 硫化水素の生成 陰性（Kligrerの培地使用において） (10) でん粉の加水分解 陽 性 （11） クエン酸の利用 陽性（Simons培地使用において） （12） アンニウム塩の利用 ペプトン水に生育せず、測定できない。 （13） 色素の菌体外生成 陰 性 （14） ウレアーゼ 陰 性 （15） オキシダーゼ 陰 性 （16） カタラーゼ 陰 性 （17） 糖の資化性 糖の資化性及びダーラム管を用いたガス発生有
無の観察結果を第１表に示す。表中、資化性及び
ガスの生成が認められた場合には＋、認められな
い場合には−の記号で示した。

【表】 糖資化性試験用液体培地組成 炭素源（糖） 1.0％ ペプトン 1.0％ NaCl 0.2％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 蒸留水 PH6.0 （18） 無機塩培地への生育 生育は認められない。 これらの結果よりバージの細菌分類マニユアル
（Bergey，ｓ Manual of Determinative
Bactreiology 8th Edition）に基づき、クロスツ
リジウムに属する細菌と同定した。 次に、本発明なる耐熱性グリコアミラーゼの酵
素的特性について記す。 なお、グルコアミラーゼ活性の測定は次のよう
に行つた。 グルコアミラーゼ活性測定の基質には可溶性で
ん粉（和光純薬製、生化学用）を用いた。まず、
５％可溶性でん粉溶液0.5ml，PH4.5の0.1M酢酸−
酢酸ナトリウム緩衝液0.5ml、純水１ml、酵素溶
液0.5mlを混合し、60℃で30分間酵素反応を行わ
せた。次いで、反応液中のぶどう糖量をグルコー
ス分析器（米国、イエロー、スプリングス・イン
スツルメント・カンパニー（Yellow Springs
Instrument Company）社製、グルコースオキシ
ターゼ法により測定する。）を用いて測定した。
グルコアミラーゼ活性の１単位は、上記測定条件
下で１分間に1μmolのぶどう糖を生成する能力と
定義した。 (1) 調製方法 実施例において詳細に説明するので、ここでは
簡単な説明にとどめる。 本発明になるクロスツリジウム属細菌Ｇ−0005
菌を、デキストリン・ペプトン及び酵母エキスを
含有する液体培地に接種し、嫌気条件下、60℃に
て１〜３日間培養する。培養液を遠心分離等によ
り菌体及びそれ以外の不溶物質を除去したいわゆ
る培養濾液を得る。次いで、培養濾液を、モレキ
ユラーシーブ膜濾過、塩析イオン交換クロマト、
ゲル濾過クロマト等、公知の方法を適宜利用して
本発明のグルコアミラーゼを濃縮するとともに、
それ以外の不純物を除く。 なお、液体培養における液体培地の炭素源とし
ては、上記デキストリンに限るものではなく、可
溶性でん粉、馬鈴薯でん粉、コーンスターチ、甘
薯でん粉、廃糖みつ等を用いてもよい。また、そ
の他の栄養成分も上記に限定するものではなく、
コーンステイープリカー、各種アミノ酸、ビタミ
ン、各種塩等を単独もしくは混合して用いてもよ
い。 (2) 作用及び基質特異性 本酵素は、馬鈴薯、とうもろこし、甘薯等ので
ん粉、およびこれらを加水分解して得た可溶性で
ん粉、デキストリン、マルトース等をぶどう糖に
加水分解するグルコアミラーゼである。マルトー
ス基質の場合、ぶどう糖生成速度は可溶性でん粉
基質の約1/2である。 (3) 至適PH 本酵素の60℃における作用PH曲線を第１図に示
す。本酵素の60℃における最適PH域は４〜５にあ
り、かつ、好適PHは（最適PHでの活性の80％を有
するPH域とする）3.8〜5.7にある。なお、反応の
際のPH緩衝液としては、塩化カリウム−塩酸（PH
2.0）、グリシン−塩酸（PH2.5〜3.5）、β：β′−ジ
メチルグルタル酸−トリス（ヒドロキシメチルア
ミノ）メタン−２−アミノ−２−メチル−１：３
−プロパンジオール（以下「GTA」と略称）（PH
3.5〜９）の0.05M緩衝液を用いた。 (4) PH安定性 本発明のグルコアミラーゼをPH２，３，４，
4.5，５，６，７，９の各PH下（0.05M塩化カリ
ウム−塩酸、0.05Mグリシン−塩酸及び
0.05MGTA緩衝液を使用）で70℃、30分間イン
キユベートした。そののち、反応液を希釈し、PH
4.5に調整したのち、可溶性でん粉を基質として
残存活性を測定した。その結果を第２図に示し
た。本発明のグルコアミラーゼはPH4.5〜5.0の範
囲で完全に活性が保持されていた。したがつて、
本グルコアミラーゼは酸性領域ですぐれた安定性
を有する酵素であることがわかつた。 (5) 至適温度 本発明のグルコアミラーゼの活性をPH4.5の条
件下、40，50，60，65，70，75℃の温度にて測定
したところ、第３図に示す結果を得た。本結果よ
り、至適温度は70℃付近にある。好適温度（最適
温度での活性の80％を有する温度域とする）は53
〜73℃である。 (6) グルコアミラーゼ活性に及ぼす金属塩の影響 本発明のグルコアミラーゼの活性に及ぼす金属
塩の影響を第２表に示す。グルコアミラーゼ活性
の測定において各種の金属塩を5mMになるよう
に添加した。そして、金属塩無添加に対する活性
を％で表示した。なお、アンモニウム塩及び
EDTA添加の場合についても第２表に付記した。
マグネシウムイオン、カルシウムイオン、カリウ
ムイオンがグルコアミラーゼ活性作用を有するこ
とが認められる。ニツケルイオン、鉄イオンには
阻害作用が認められる。

【表】

【表】 活性測定条件 PH5.0（0.1Mクエン酸−第２クエン酸ナトリウ
ム緩衝液）活性測定温度：60℃ (7) 熱安定性 本発明のグルコアミラーゼを基質無添加下、PH
4.5にて、60〜80℃の加熱処理を行い、一定時間
毎（20，40秒、１，２，４，10，20，40分、１，
２，４，６，８，16時間、１，２，４，７，10，
15，20日）に処理液の一部を採取し、液中のグル
コアミラーゼ活性を60℃、PH4.5にて測定した。
これをもとに各温度における活性半減期を求め、
その結果を第４図に示した。70℃及び75℃におけ
る基質無添加下での活性半減期はそれぞれ、６時
間、１分間である。本グルコアミラーゼはこれま
で公知のグルコアミラーゼに較べ高度の耐熱性を
有している。一方、PH4.0，4.3，4.5，5.0，6.0の
各PHにおける基質無添加下、70℃での活性半減期
を求め、第３表に示した。この結果から、本グル
コアミラーゼは、クロスツリジウム・サーモアミ
ロリデイクム（Clostridium
thermoamylolyticum），サーモマイセス．ラヌ
ギノスス（Thermomyces lanuginosus），及び
タラロミセス・デユポンテイ（Talaromyces
duponti）により産生されるグルコアミラーゼよ
りも、特に、PH４〜５の酸性領域においてすぐれ
た耐熱性をもつことを示す。

【表】 (8) 耐熱性に及ぼす金属塩の影響 本発明のグルコアミラーゼの耐熱性に及ぼす金
属塩の影響を第４表に示す。グルコアミラーゼ水
溶液（0.05M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液に溶
解、PH4.5）に各種の金属塩を5mM濃度になるよ
うに添加し、70℃、１時間の加熱処理を行つたの
ち、PH4.5，60℃でグルコアミラーゼ活性を測定
した。そして、加熱処理前に対する加熱処理後の
活性、すなわち残存活性を％で表示した。 第４表から、ニツケルイオン、マンガンイオ
ン、マグネシウムイオンに保護効果のあることが
認められる。コバルトイオン、カルシウムイオン
については保護効果は認められない。亜鉛イオン
は耐熱性を著しく低下させる。

〔作用〕

以上述べたことから明らかなように、本発明の
新しい耐熱性グルコアミラーゼは、特にPH４〜５
の酸性領域での耐熱性において、従来の嫌気性細
菌の産生する耐熱性酵素と著しく異なる。 とこるで、ぶどう糖や異性化糖を製造するに
は、まず、原料のでん粉をα−アミラーゼで液化
し、そのあとグルコアミラーゼで糖化している。
液化の際、原料のでん粉を20〜40％の高濃度に仕
込むため、液のPHは酸性を呈する。このため、従
来の耐熱性α−アミラーゼ及び耐熱性グルコアミ
ラーゼを用いる場合には、作用PH域が中性域にあ
るため、アルカリで中和しなければならない。 これに対し、先に本発明者らが見い出した耐熱
性・耐酸性の新規なα−アミラーゼ（特願昭59−
236917号）及び、本発明の新規なグルコアミラー
ゼを用いることにより、液化での中和を行うこと
なく酸性の状態でのまま液化及び糖化を行うこと
が可能となり、ひいては反応後の脱塩工程への負
荷を大幅に軽減できる。 〔実施例〕 以下、本発明の実施例を示し、さらに詳しく説
明する。 実施例 １ デキストリン1.5％、ポリペプトン0.5％、酵母
エキス0.5％、リン酸第１カリウム0.7％、リン酸
第２ナトリウム0.2％、硫酸マグネシウム・７水
和物0.001％、チオグリコール酸ナトリウム0.1％
及び水道水を含む液体培地（PH6.0）32Kgを内容
積５の培養槽10基に3.15Kgづつ分注し、120℃
で15分間殺菌した。それぞれの培養槽に上記培地
を用いて嫌気的に培養したクロスツリジウム属細
菌Ｇ−0005の菌体懸濁液0.35Kgを添加した。次い
で、ガス出口に水封トラツプを付し、培養槽内気
相部をアルゴンガス（酸素濃度1ppm以下）で十
分置換後、嫌気条件下で培養した。培養液のPHは
6.0に、培養液の温度は60℃にそれぞれ自動調整
した。21時間培養後、培養液を合せ、6000rpmで
遠心分離し、菌体を除去した。回収した上澄液に
ついてガラス濾紙（東洋科学産業製、GA−100
及びGC−50）メンブレンフイルタ（東洋科学産
業製、ポアサイズ1μm及び0.45μm）を用いて加
圧濾過し、菌体及びその他の固形物を除去して培
養濾液を得た。この培養濾液より10mlを採取し、
純水にて24時間透析したのち、グルコアミラーゼ
活性を測定したところ、培養濾液１ｇあたり0.05
単位のグルコアミラーゼが存在していた。 次に上記培養濾液29Kgを中空繊維型モレキユラ
ーシーブ膜（分画分子量10000、米国アミコン製
（Amicon.Co.）HlP10−20）で加圧濾過し、２Kg
に濃縮した。上記濃縮液について硫安を用いた塩
析を行い、飽和度（硫安飽和濃度に対す割合、％
で表わす）20％にて析出せず、飽和度55％にて析
出した固形物を14000rpmで遠心分離し回収した。
次いで飽和度55％の硫安溶液で固形物を洗浄し回
収した。次いで、固形物を0.05Mトリス−塩酸緩
衝液（PH7.5）に溶解し240ｇとした。次いで上記
緩衝液10を用いて、24時間の透析を２回繰返し
実施した。そののち、透析した液中の固形物を、
ガラス濾紙（東洋濾紙製、GC−50）を用いた濾
過で除去した。清澄化した透析液は310ｇであつ
た。 次に、上記透析液をジエチルアミノエチル化架
橋アガロースゲル（フアルマシア製、DEAEセフ
アロースCL−6B）を用いたイオン交換クロマト
（カラムサイズ44×500mm）により精製した。
0.05Mトリス−塩酸緩衝液で平衡化したゲルカラ
ムに上記透析液をチヤージし、洗滌した。次いで
緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線勾配で上昇
しつつ展開した。グルコアミラーゼの溶出パター
ンを第５図に示す。塩化ナトリウム濃度0.25Mの
溶出位置にグルコアミラーゼ活性を有するピーク
が認められた。グルコアミラーゼフラクシヨンと
して360ｇを回収し、次いでモレキユラーシーブ
膜（分画分子量10000、米国アミコン製、PM−
10）を用い、純水10Kgを加えて加圧濾過し、脱
塩、濃縮を行い粗精製グルコアミラーゼ液160ｇ
を得た。本溶液中のグルコアミラーゼ活性は3.3
単位／ｇであつた。 次に上記粗精製グルコアミラーゼにつきゲル濾
過により精製した。まず、上記グルコアミラーゼ
液100ｇを40Torrの減圧下で凍結乾燥し、これを
0.05Mクエン酸・第２クエン酸緩衝液（PH4.5）
４mlに溶解し、固形物を400rpmの遠心分離で除
去した。次に、上記緩衝液で平衡化した架橋デキ
ストランゲル（フアルマシア製、セフアデツクス
Ｇ−100）を充填したクロマトカラム（15×900
mm）に上記グルコアミラーゼ液１mlをチヤージし
同じ緩衝液で展開した。その結果を第６図に示し
た。溶出液量65mlの位置にグルコアミラーゼ活性
のピークが認められた。上記ゲル濾過を残りの粗
精製グルコアミラーゼについても実施し、精製グ
ルコアミラーゼフラクシヨン40ｇを得た。本フラ
クシヨンのグルコアミラーゼ活性は12単位／ｇで
あつた。 以上の精製操作により、培養濾液基準の比活性
は171倍に向上した。また、培養濾液基準の活性
回収率は23％である。培養濾液を基準とした各工
程の標品の比活性、収量、活性回収率を第５表に
示した。

【表】

【表】 実施例 ２ 実施例１において、培養液から遠心分離により
菌体を含む固形物400ｇを回収した。 次いで、生理食塩水600ｇを加えてスラリー化
し、菌体スラリー1000ｇを得た。次いで菌体スラ
リーより40ｇを分取し、フレンチプレス（大岳製
作所製）用加圧セルにセツトした。次いで油圧プ
レスにより、1600Kg／cm²の圧力をかけたのち、細
口より５ml／分の速度で大気中に噴出させて菌体
を破砕した。残りの菌体スラリーについても上記
操作を行つて菌体破砕スラリー1000ｇを得た。 次いで、菌体スラリーより16000rpmの遠心分離
により固形物を除去しさらにガラス濾紙（東洋濾
紙製、GA−100，GC−50）及びメンブレンフイ
ルタ（東洋濾紙製、ポアサイズ１，0.45μm）を
用いて加圧濾過し、菌体破砕上澄液800mlを得た。 次いで、菌体破砕上澄液に70℃、５分間の熱処
理を行い、熱変性を起しやすいたん白質を変性さ
せた。５℃以下まで冷却したのち、8000rpmの遠
心分離により固形物を除去した。得られた熱処理
上澄液は760mlであつた。 次に、実施例１記載の手法により、硫安沈澱、
透析、イオン交換クロマト、ゲル濾過の各精製を
実施した。菌体破砕上澄液を基準とした各工程の
標品の比活性、収量、活性回収率を表６に示し
た。

〔発明の効果〕

本発明の新規な耐熱性／耐酸性グルコアミラー
ゼは、特にPH４〜５の酸性領域下にてすぐれた耐
熱性を有するため、でん粉を原料としてぶどう糖
を製造する際、でん粉溶液を中和することなく酸
性状態での糖化が可能となる。これに比べ、従来
公知の耐熱性グルコアミラーゼを用いる場合に
は、でん粉溶液を中性化するためにアルカリを添
加しなければならない。したがつて、本発明のグ
ルコアミラーゼを用いることにより、でん粉溶液
の中和工程が不要となり、かつ反応後の脱塩工程
への負荷を大幅に軽減できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のグルコアミラーゼの活性に及
ぼすPHの影響を示す特性図、第２図は本グルコア
ミラーゼの熱安定性に及ぼすPHの影響を示す特性
図、第３図は本グルコアミラーゼの活性に及ぼす
温度の影響を示す特性図、第４図は本グルコアミ
ラーゼの耐熱性を示す特性図、第５図は本グルコ
アミラーゼのジエチルアミノエチル架橋アガロー
スゲルを用いたイオン交換液体クロマトグラフに
おけるグルコアミラーゼ活性溶出パターン図、第
６図は本グルコアミラーゼの架橋デキストランゲ
ルを用いたゲル濾過におけるグルコアミラーゼ活
性溶出パターン図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を示す耐熱性グルコアミ
   ラーゼ。 (1) 作用至適PH：４〜５ (2) 作用至適温度：70℃ (3) 安定PH：4.5〜5.0 (4) PH4.5かつ温度70℃における酵素活性半減期
   が６時間以上 (5) PH4.0かつ温度70℃における酵素活性半減期
   が5.5時間 (6) 分子量：3.8×10⁴ ２ クロスツリジウム属に属する下記理化学的性
   質のグルコアミラーゼ生産菌を培養し、菌体及び
   培地中に該グルコアミラーゼを蓄積せしめ、菌体
   及び又は培地中から該グルコアミラーゼを回収す
   ることを特徴とする耐熱性グルコアミラーゼの製
   造法。 (1) 作用至適PH：４〜５ (2) 作用至適温度：70℃ (3) 安定PH：4.5〜5.0 (4) PH4.5かつ温度70℃における酵素活性半減期
   が６時間以上 (5) PH4.0かつ温度70℃における酵素活性半減期
   が5.5時間 (6) 分子量：3.8×10⁴ ３ クロスツリジウム属に属するグルコアミラー
   ゼ生産菌がクロスツリジウム・エスピーＧ−0005
   であることを特徴とする特許請求の範囲第２項記
   載の耐熱性グルコアミラーゼの製造法。