JPS5840469B2 - コレステロ−ル定量用酵素剤の製造法 - Google Patents
コレステロ−ル定量用酵素剤の製造法Info
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- JPS5840469B2 JPS5840469B2 JP53019721A JP1972178A JPS5840469B2 JP S5840469 B2 JPS5840469 B2 JP S5840469B2 JP 53019721 A JP53019721 A JP 53019721A JP 1972178 A JP1972178 A JP 1972178A JP S5840469 B2 JPS5840469 B2 JP S5840469B2
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- oxidase
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- cholesterol oxidase
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、コレステロール定量用酵素剤の製造法に関す
るものであり、更に詳しくは、シュードモナス属ニ属シ
、コレステロールエステラーゼ、及びコレステロールオ
キシダーゼ両酵素の生産能を有する菌株を用いて、培養
するに際し、培地の炭素源を限定することにより、コレ
ステロールオキシダーゼを単独に、或はコレステロール
エステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを同時に
生産せしめることを特徴とするコレステロール定量用酵
素剤の製造法に関するものである。
るものであり、更に詳しくは、シュードモナス属ニ属シ
、コレステロールエステラーゼ、及びコレステロールオ
キシダーゼ両酵素の生産能を有する菌株を用いて、培養
するに際し、培地の炭素源を限定することにより、コレ
ステロールオキシダーゼを単独に、或はコレステロール
エステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを同時に
生産せしめることを特徴とするコレステロール定量用酵
素剤の製造法に関するものである。
コレステロールは、ヒト体液特に血清中でハ遊離もしく
は脂肪酸エステルの形で存在しており、これら血清中の
遊離コレステロールおよび総コレステロールを定量する
ことにより、高血圧症、動脈硬化症等を臨床的に診断す
るのに役立つ。
は脂肪酸エステルの形で存在しており、これら血清中の
遊離コレステロールおよび総コレステロールを定量する
ことにより、高血圧症、動脈硬化症等を臨床的に診断す
るのに役立つ。
従来コレステロールの定量は化学的な方法で行われてい
たが、近年酵素法によるコレステロールの定量法が確立
され、盛んに使用されるに至っている。
たが、近年酵素法によるコレステロールの定量法が確立
され、盛んに使用されるに至っている。
酵素法によりコレステロールを定量する場合、遊離型の
コレステロールを定量するにはコレステロールオキシダ
ーゼが用いられるが、脂肪酸エステル型コレステロール
をも定量する（云わゆる総コレステロール）には、コレ
ステロールオキシダーゼのみでは十分でなく、あらかじ
めコレステロールニステラーセラ使用して、エステル型
コレステロールを遊離型にする必要がある。
コレステロールを定量するにはコレステロールオキシダ
ーゼが用いられるが、脂肪酸エステル型コレステロール
をも定量する（云わゆる総コレステロール）には、コレ
ステロールオキシダーゼのみでは十分でなく、あらかじ
めコレステロールニステラーセラ使用して、エステル型
コレステロールを遊離型にする必要がある。
また、臨床的診断用として、コレステロールの定量を行
うには、血清中の遊離及び総コレステロール値を求めル
必要があり、ゴレステロールオキシダーゼ単独もしくは
コレステロールエステラーゼの併用により、実際に定量
が行われている。
うには、血清中の遊離及び総コレステロール値を求めル
必要があり、ゴレステロールオキシダーゼ単独もしくは
コレステロールエステラーゼの併用により、実際に定量
が行われている。
従ってコレステロール定量用酵素剤としてのコレステロ
ールオキシダーゼ、及ヒコレステロールエステラーゼを
同一の微生物で、しかも高収率に生産する菌株が見い出
されるならば非常に有益なこととなり得るものである。
ールオキシダーゼ、及ヒコレステロールエステラーゼを
同一の微生物で、しかも高収率に生産する菌株が見い出
されるならば非常に有益なこととなり得るものである。
こレマで、コレステロールオキシダーセラ生産する菌株
として、各種ノカルディア属（特開昭５１−８２７８５
、特開昭５２−６１２８８）、フレビバクテリウム属（
特開昭５Ｏ−６７７３）、アースロバフタ−属（特開昭
５ｌ−６７７８６）、コリネバクテリウム属（特開昭５
２−７４８４）、シゾフィラム属（特開昭５ｌ−７９７
８１）等が報告されており、一方コレスチロールエステ
ラーゼ生産能を有する微生物として、シュードモナス・
フルオレッセンスＫＹ ３９５５ （特開昭５０−１５
７５８８）、シュードモナス・ノブエスピーＡ １０９
（％開昭５２−７４８３）が報告されている。
として、各種ノカルディア属（特開昭５１−８２７８５
、特開昭５２−６１２８８）、フレビバクテリウム属（
特開昭５Ｏ−６７７３）、アースロバフタ−属（特開昭
５ｌ−６７７８６）、コリネバクテリウム属（特開昭５
２−７４８４）、シゾフィラム属（特開昭５ｌ−７９７
８１）等が報告されており、一方コレスチロールエステ
ラーゼ生産能を有する微生物として、シュードモナス・
フルオレッセンスＫＹ ３９５５ （特開昭５０−１５
７５８８）、シュードモナス・ノブエスピーＡ １０９
（％開昭５２−７４８３）が報告されている。
しかしながらこれらの報告は全て当該各酵素を単独のみ
生産する報告であり、同一菌株により、当該両酵素を同
時に多量生産する方法は報告されていない。
生産する報告であり、同一菌株により、当該両酵素を同
時に多量生産する方法は報告されていない。
本発明者等は、安価に工業的規模で、コレステロールエ
ステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを得るため
、−菌株でこれら両酵素を同時に多量産生する微生物を
広く自然界に求め、検索した結果、シュードモナス属の
一菌株が特に強力なコレステロールオキシダーゼ及びコ
レステロールエステラーゼを同時に多量産生することを
見い出したものである。
ステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを得るため
、−菌株でこれら両酵素を同時に多量産生する微生物を
広く自然界に求め、検索した結果、シュードモナス属の
一菌株が特に強力なコレステロールオキシダーゼ及びコ
レステロールエステラーゼを同時に多量産生することを
見い出したものである。
そして、更に意外な事には、培地の炭素源が脂肪酸又は
エステルの場合にはこれら酵素を同時に生産するが、一
般炭素源培地ではコレステロールオキシダーゼのみ産出
することを知り、本発明を完成するに至った。
エステルの場合にはこれら酵素を同時に生産するが、一
般炭素源培地ではコレステロールオキシダーゼのみ産出
することを知り、本発明を完成するに至った。
本発明に使用する菌株としては、シュードモナス属ＫＡ
し、コレステロールオキシダーゼ、及ヒコレステロール
エステラーゼ生産性を有する菌株であれば、いずれにし
ても使用出来るが、具体例としては本発明者が、新たに
自然界から分離した菌株が好適な１例としてあげられる
。
し、コレステロールオキシダーゼ、及ヒコレステロール
エステラーゼ生産性を有する菌株であれば、いずれにし
ても使用出来るが、具体例としては本発明者が、新たに
自然界から分離した菌株が好適な１例としてあげられる
。
次に本菌株の菌学的性質を示す。
（ａ） 形態
（１）桿菌（０，５〜１．ＯＸ２〜３）μ（２）単独ま
たは単連銀 （３）運動性あり、一本の極鞭毛 （４）胞子・・・・・・なし く５）ダラム染色：陰性 （６）抗酸性：陰性 （７）多形性：なし くｂ） 生育状態 （１）肉汁寒天斜面培養二円形、凸円状、表面はなめら
かで薄い黄褐色、半透明 （２）肉汁寒天斜面培養：糸状、周縁はなめらかで生育
は普通、凸円状、黄褐色、やや光沢あり （３）肉汁液体培養：生育は普通、表面に薄膜形成、や
や濁りあり （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は普通、液化は漏斗
状 （５） リドマスミルク：ややアルカリ性、リドマス
を還元する。
たは単連銀 （３）運動性あり、一本の極鞭毛 （４）胞子・・・・・・なし く５）ダラム染色：陰性 （６）抗酸性：陰性 （７）多形性：なし くｂ） 生育状態 （１）肉汁寒天斜面培養二円形、凸円状、表面はなめら
かで薄い黄褐色、半透明 （２）肉汁寒天斜面培養：糸状、周縁はなめらかで生育
は普通、凸円状、黄褐色、やや光沢あり （３）肉汁液体培養：生育は普通、表面に薄膜形成、や
や濁りあり （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は普通、液化は漏斗
状 （５） リドマスミルク：ややアルカリ性、リドマス
を還元する。
液化するがわずかに沈澱を形成する。
（ｃ） 生理的性質
硝酸塩の還元：陽性
脱窒反応：陰性
ＭＲテスト：陰性
ｖｐテスト：陰性
インドールの生成：陰性
硫化水素の生成：陽性
デンプンの加水分解：陰性
クエン酸の利用：陰性
無機窒素源の利用：硝酸塩は利用されないが、アンモニ
ウム塩を利用する。
ウム塩を利用する。
００）色素の生成：キングの培地で淡褐色の螢光性色素
生産 ウレアーゼ：陽性 オキシダーセ：陽性 カタラーゼ：陽性 生育ｐＨ： ５〜９ 生育温度：３７℃で生育しない 酸素に対する態度：好気性 ０−Ｆテスト：酸化的 糖類からガスの生成：陰性 糖類からの酸の生成 Ｌ−アラビノース（−１−１Ｄ−ンルビトール（＠Ｄ−
キシロース（−ＨＤ−マンニトーノ■ｌＤ−マンノース
（川 イノシトール（＠Ｄ−フラクトース（＠ グリ
セリン（＠ Ｄ−ガラクト−ス（１）デンプン（］ マルトース（−１−） グルコース（−＋−１
シュークロース（＠ トレハロース（−＋−） 以上の諸性質を「バーシス・マニュアル・オブ・デイタ
ミネイティブ・バクテリオロジー （Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｎａｌｏｆ Ｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）第８版
の記載と対比すると形態において、桿菌であること、一
本の極鞭毛を有すること、ダラム陰性であること、運動
性であること、カタラーゼ陽性であること等から、シュ
ードモナス属に属していることがわかり、さらに、本菌
株は螢光色素を発すること、３７℃で生育しなイコト等
カラシュードモナス・フルオレッセンスに属するものと
同定し、車両をシュードモナス・フルオレッセンス＆、
０３−１９と命名し、微生物工業技術研究所へ寄託した
。
生産 ウレアーゼ：陽性 オキシダーセ：陽性 カタラーゼ：陽性 生育ｐＨ： ５〜９ 生育温度：３７℃で生育しない 酸素に対する態度：好気性 ０−Ｆテスト：酸化的 糖類からガスの生成：陰性 糖類からの酸の生成 Ｌ−アラビノース（−１−１Ｄ−ンルビトール（＠Ｄ−
キシロース（−ＨＤ−マンニトーノ■ｌＤ−マンノース
（川 イノシトール（＠Ｄ−フラクトース（＠ グリ
セリン（＠ Ｄ−ガラクト−ス（１）デンプン（］ マルトース（−１−） グルコース（−＋−１
シュークロース（＠ トレハロース（−＋−） 以上の諸性質を「バーシス・マニュアル・オブ・デイタ
ミネイティブ・バクテリオロジー （Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｎａｌｏｆ Ｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）第８版
の記載と対比すると形態において、桿菌であること、一
本の極鞭毛を有すること、ダラム陰性であること、運動
性であること、カタラーゼ陽性であること等から、シュ
ードモナス属に属していることがわかり、さらに、本菌
株は螢光色素を発すること、３７℃で生育しなイコト等
カラシュードモナス・フルオレッセンスに属するものと
同定し、車両をシュードモナス・フルオレッセンス＆、
０３−１９と命名し、微生物工業技術研究所へ寄託した
。
（Ｆ Ｅ ＲＭ−Ｐ Ａ４３６７）
本発明で使用する培地は、炭素源、窒素源、無機物、そ
の他の栄養源を加えた合成培地または天然培地のいずれ
でも使用可能である。
の他の栄養源を加えた合成培地または天然培地のいずれ
でも使用可能である。
窒素源としてはアンモニア又は、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、燐酸アンモニウム等の無機化合物、或
いは尿素、グルタミン酸、グリシン、ペプトン、肉エキ
ス、Ｃ８Ｌ、酵母エキス等の窒素性有機化合物の単独あ
るいはその組合せで使用可能である。
酸アンモニウム、燐酸アンモニウム等の無機化合物、或
いは尿素、グルタミン酸、グリシン、ペプトン、肉エキ
ス、Ｃ８Ｌ、酵母エキス等の窒素性有機化合物の単独あ
るいはその組合せで使用可能である。
無機物として、リン酸１カリウム、硫酸マグネシウムの
添加は効果的であり、その他鉄、マンガン、亜鉛等の微
量金属イオンの共存は効果的な場合もある。
添加は効果的であり、その他鉄、マンガン、亜鉛等の微
量金属イオンの共存は効果的な場合もある。
炭素源を除いた場合の本発明に好適な培地成分を一例と
してあげると、尿素０．５％、肉エキス０．２％、リン
酸１カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％で
ある。
してあげると、尿素０．５％、肉エキス０．２％、リン
酸１カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％で
ある。
本発明においては炭素源を使い分けることによって、コ
レステロールオキシダーゼのみを生産さセル場合トコレ
スチロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼ
を同時に生産させる場合とがある。
レステロールオキシダーゼのみを生産さセル場合トコレ
スチロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼ
を同時に生産させる場合とがある。
即ち、グルコース、フラクトース、キシロース、クリセ
リン、ガラクトース、マンニトール、ソルビトールなど
の一般培地に使用される炭素源を添加した培地であると
コレステロールオキシダーゼのみが生産される。
リン、ガラクトース、マンニトール、ソルビトールなど
の一般培地に使用される炭素源を添加した培地であると
コレステロールオキシダーゼのみが生産される。
しかし、オレイン酸、リノール酸などの有機酸又はオレ
イン酸メチル、リノール酸メチル、オリーブ油、大豆油
、米油、綿実油などの脂肪酸エステルを炭素源として培
地に添加したときはコレステロールエステラーゼ及びコ
レステロールオキシダーゼが同時に生産される。
イン酸メチル、リノール酸メチル、オリーブ油、大豆油
、米油、綿実油などの脂肪酸エステルを炭素源として培
地に添加したときはコレステロールエステラーゼ及びコ
レステロールオキシダーゼが同時に生産される。
これら炭素源は培地中に０．５〜２％程度添加される。
培養は２５〜４０℃で好気的に２０〜４０時間培養され
る。
る。
かくして得られた培養物から両酵素を回収するにあたっ
ては、培養液を遠心分離機により除菌したのち、除菌液
からアセトン或いはエタノール等の有機溶媒による沈澱
法、或いは硫安、その他塩類での塩析法等の通常用いら
れる酵素精製法が用いられる。
ては、培養液を遠心分離機により除菌したのち、除菌液
からアセトン或いはエタノール等の有機溶媒による沈澱
法、或いは硫安、その他塩類での塩析法等の通常用いら
れる酵素精製法が用いられる。
次に、本発明に用いるコレステロールオキシダーゼ、及
びコレステロールエステラーゼの活性測定法を示す。
びコレステロールエステラーゼの活性測定法を示す。
コレステロールオキシダーゼの場合はコレステロールと
反応によって生成した△４−コレステノン、または過酸
化水素を定量することによって測定することが出来る。
反応によって生成した△４−コレステノン、または過酸
化水素を定量することによって測定することが出来る。
本酵素の活性の表示を説明すると、コレステロール、オ
キシダーゼ１単位はｐＨ７，０，３０℃の条件で、１分
間に１マイクロモルの△４−コレステノン、または過酸
化水素な生成するに要する酵素量を示す。
キシダーゼ１単位はｐＨ７，０，３０℃の条件で、１分
間に１マイクロモルの△４−コレステノン、または過酸
化水素な生成するに要する酵素量を示す。
△４−コレステノンの量はその２４５ｍμの吸光度を測
定することによって求めることが出来、また過酸化水素
の量は例えばパーオキシダーゼと色原体を組み合わせた
試薬と反応させることによって測定することが出来る。
定することによって求めることが出来、また過酸化水素
の量は例えばパーオキシダーゼと色原体を組み合わせた
試薬と反応させることによって測定することが出来る。
コレステロールエステラーゼの酵素活性は、例えばコレ
ステロールリル−トとの反応によって生成した遊離型コ
レステロール量を定量することによって測定できる。
ステロールリル−トとの反応によって生成した遊離型コ
レステロール量を定量することによって測定できる。
本発明におけるコレステロール・エステラーゼの活性の
表示を説明すると、コレステロール・エステラーゼ１単
位は、コレステロールリル−トを基質として、ｐＨ７，
０，３７℃の条件で、１分間に１マイクロモルの遊離コ
レステロールを生成するに要する酵素量とした。
表示を説明すると、コレステロール・エステラーゼ１単
位は、コレステロールリル−トを基質として、ｐＨ７，
０，３７℃の条件で、１分間に１マイクロモルの遊離コ
レステロールを生成するに要する酵素量とした。
次に本発明の試験例及び実施例を示す。
試験例 １
尿素０．５％、肉エキス０．２％、リン酸ｌカリウム０
．１％、硫酸マグネシウム０．０５％からなる基本培地
組成に各種炭素源を１％となるように添加した培地に、
シュードモナス・フルオレッセンスＡＯ３−１９、ＦＥ
ＲＭ−Ｐ４３６７を２８℃にて４０時間振盪培養したの
ち、培養液中に蓄積し☆☆たコレステロールオキシダー
ゼ、及ヒコレステロールエステラーゼ活性を測定した。
．１％、硫酸マグネシウム０．０５％からなる基本培地
組成に各種炭素源を１％となるように添加した培地に、
シュードモナス・フルオレッセンスＡＯ３−１９、ＦＥ
ＲＭ−Ｐ４３６７を２８℃にて４０時間振盪培養したの
ち、培養液中に蓄積し☆☆たコレステロールオキシダー
ゼ、及ヒコレステロールエステラーゼ活性を測定した。
その結果は第１表に示される。
第１表より明らかな如く、菌の増殖可能な炭素源であれ
ば、コレステロールオキシダーゼ生産は認められるので
あるが、コレステロールエステラーゼの方はオレイン酸
、リノール酸、及びそれらのエステル、或いはオリーブ
油、大豆油等の脂肪酸、及びそのエステル類の組合せの
場合のみに生産される。
ば、コレステロールオキシダーゼ生産は認められるので
あるが、コレステロールエステラーゼの方はオレイン酸
、リノール酸、及びそれらのエステル、或いはオリーブ
油、大豆油等の脂肪酸、及びそのエステル類の組合せの
場合のみに生産される。
以上の結果より、本発明者等は総コレステロール測定に
必要とするコレステロールオキシダーゼコレステロール
エステラーゼを同時に生産可能ならしめる培地成分とし
て、脂肪酸及びそのエステルの単独或いはそれらの組合
せが有効であり、遊離型コレステロールのみを測定する
場合に必要とするコレステロールオキシダーゼを生産さ
せる場合には、グルコース、フラクトース、キシロース
、グリセリン、カラクトース、マンニトール、ソルビト
ール等の単独或いは、その組合せが有効であることか判
明したものである。
必要とするコレステロールオキシダーゼコレステロール
エステラーゼを同時に生産可能ならしめる培地成分とし
て、脂肪酸及びそのエステルの単独或いはそれらの組合
せが有効であり、遊離型コレステロールのみを測定する
場合に必要とするコレステロールオキシダーゼを生産さ
せる場合には、グルコース、フラクトース、キシロース
、グリセリン、カラクトース、マンニトール、ソルビト
ール等の単独或いは、その組合せが有効であることか判
明したものである。
実施例 １
２１容坂ロフラスコにオレイン酸１１、尿素０．５％、
グルタミン酸ナトリウム０．５％、肉エキス０．２％、
ＫＨ２ＰＯ４０，１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５
％（ｐＨ５，０）の組成を有する培地５００献を容れ、
常法により１２０℃２０分間加熱滅菌シタ後、シュード
モナス・フルオレッセンス煮０３−１９、ＦＥＲＭ
ＰＩ６４３６７を１白金耳接種し、２８℃で４０時間盪
培養した。
グルタミン酸ナトリウム０．５％、肉エキス０．２％、
ＫＨ２ＰＯ４０，１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５
％（ｐＨ５，０）の組成を有する培地５００献を容れ、
常法により１２０℃２０分間加熱滅菌シタ後、シュード
モナス・フルオレッセンス煮０３−１９、ＦＥＲＭ
ＰＩ６４３６７を１白金耳接種し、２８℃で４０時間盪
培養した。
得られた培養液に含まれるコレステロールエステラーゼ
の総活性は１１０単位、コレステロールオキシダーゼの
総活性は７６単位であった。
の総活性は１１０単位、コレステロールオキシダーゼの
総活性は７６単位であった。
実施例 ２
２１容坂ロフラスコにグリセリン１％、尿素０．５％、
肉エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２００，０５％（ｐＨ４，５）の組成を有する培
地５００ｍ１を容れ、常法により１２０℃、２０分間加
熱滅菌した後、シュードモナス・フルオレッセンスＡＯ
３−１９、ＦＥＲＭ−Ｐ蔦４３６７を１白金４接種し、
２８℃で３０時間振盪培養した。
肉エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２００，０５％（ｐＨ４，５）の組成を有する培
地５００ｍ１を容れ、常法により１２０℃、２０分間加
熱滅菌した後、シュードモナス・フルオレッセンスＡＯ
３−１９、ＦＥＲＭ−Ｐ蔦４３６７を１白金４接種し、
２８℃で３０時間振盪培養した。
得られた培養液に含まれるコレステロールオキシダーゼ
の総活性は１３６単位であり、コレステロールエステラ
ーゼ活性は認められなかった。
の総活性は１３６単位であり、コレステロールエステラ
ーゼ活性は認められなかった。
実施例 ３
１０００１！容発酵槽に大豆白絞油２％、尿素０．５％
、グルタミン酸ナトリウム０．５％、肉エキス０．２％
、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，０
５％よりなる培地（ｐＨ７，２）５００１を容れ、実施
例２で培養した培養液５００ｍ１を接種する。
、グルタミン酸ナトリウム０．５％、肉エキス０．２％
、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，０
５％よりなる培地（ｐＨ７，２）５００１を容れ、実施
例２で培養した培養液５００ｍ１を接種する。
培養温度２８℃、攪拌数３００ 通気量ｒｐｍ。
０、４ ｗｍの条件下で４０時間培養する。
培養液をドラパル型遠心分離機にて除菌し、除菌液とし
て４２０１を得た。
て４２０１を得た。
除菌液のコレステロールエステラーゼ活性は２６５単位
／ｌであり、コレステロールオキシダーゼ活性は２８０
単位／ｌであった。
／ｌであり、コレステロールオキシダーゼ活性は２８０
単位／ｌであった。
実施例 ４
１０００１容発酵槽にグルコース２％、尿素０．５％、
肉エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２００，０５％よりなる培地（ｐＨ７，２）５０
０７を容れ、実施例２で培養した培養液５００ｍ１を接
種する。
肉エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２００，０５％よりなる培地（ｐＨ７，２）５０
０７を容れ、実施例２で培養した培養液５００ｍ１を接
種する。
培養温度２８℃、攪拌数３００ ｒｐｍ、通気量０．４
ｖｖｍの条件下で２４時間培養する。
ｖｖｍの条件下で２４時間培養する。
培養液をドラパル型遠心分離機にて除菌し、除菌液４５
０１を得た。
０１を得た。
除菌液のコレステロールオキシダーゼ活性は４２０単位
／ｌであり、コレステロールエステラーゼ活性は認めら
れなかった。
／ｌであり、コレステロールエステラーゼ活性は認めら
れなかった。
実施例 ５
実施例３と同様な方法で得られた除菌液４００１を３５
℃以下で減圧濃縮し、２０１の濃縮液を得た。
℃以下で減圧濃縮し、２０１の濃縮液を得た。
この濃縮液を５℃に冷却した後、−１０’Ｃに冷却した
アセトン２０１を加えた後、生ずる沈澱物をＰ別し、ア
セトン前処理１液３８１を得た。
アセトン２０１を加えた後、生ずる沈澱物をＰ別し、ア
セトン前処理１液３８１を得た。
このアセトン前処理１液に−ｌｏ℃に冷却したアセトン
４０１を加え、生じた沈澱物を冷アセトンにて洗浄、脱
水した沈澱物を１取して真空乾燥し、７５′？の酵素粉
末を得た。
４０１を加え、生じた沈澱物を冷アセトンにて洗浄、脱
水した沈澱物を１取して真空乾燥し、７５′？の酵素粉
末を得た。
この酵素剤のコレステロールエステラーゼは１２００単
位／１であり、コレステロールオキシダーゼは８６０単
位／りであった。
位／１であり、コレステロールオキシダーゼは８６０単
位／りであった。
実施例 ６
実施例４と同様な方法で得られた除菌液４４０１を３５
℃以下で減圧濃縮し２０Ｊの濃縮液を得た。
℃以下で減圧濃縮し２０Ｊの濃縮液を得た。
この濃縮液に３ｋｇの硫安を加え２時間放置する。
生ずる粗酵素の沈澱を１過助剤（セライト４３９）３０
０Ｓ’を加え、１別し、得られた固型物を２１の燐酸緩
衝液（０，０２Ｍ、 ｐＨ７，０）に溶解し、１過して
１過助剤を除く、Ｐ液を限外沢過膜（ロミコン社製）に
よって５００ｍ１まで脱塩濃縮し、凍結乾燥してコレス
テロールオキシダーゼ２４００単位／グのものを２６１
得た。
０Ｓ’を加え、１別し、得られた固型物を２１の燐酸緩
衝液（０，０２Ｍ、 ｐＨ７，０）に溶解し、１過して
１過助剤を除く、Ｐ液を限外沢過膜（ロミコン社製）に
よって５００ｍ１まで脱塩濃縮し、凍結乾燥してコレス
テロールオキシダーゼ２４００単位／グのものを２６１
得た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ シュードモナス属ニ属し、コレステロールニス−ｒ
ラーゼ、及びコレステロールオキシダーゼ両酵素の生産
能を有する微生物を炭素・源として一般炭素源を添加し
た培地で培養し、培養物からコレステロールオキシダー
ゼを採取することを特徴とするコレステロール定量用酵
素剤の製造法。 ２ シュードモナス属に属し、コレステロールエステラ
ーゼ及びコレステロールオキシダーゼ両酵素の生産能を
有する微生物を、炭素源として脂肪酸及びそのエステル
の単独或いはその組合せを添加した培地にて培養し、培
養物よりコレステロールエステラーゼ及びコレステロー
ルオキシダーゼを同時に採取することを特徴とするコレ
ステロール定量用酵素剤の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53019721A JPS5840469B2 (ja) | 1978-02-24 | 1978-02-24 | コレステロ−ル定量用酵素剤の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53019721A JPS5840469B2 (ja) | 1978-02-24 | 1978-02-24 | コレステロ−ル定量用酵素剤の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS54113493A JPS54113493A (en) | 1979-09-05 |
| JPS5840469B2 true JPS5840469B2 (ja) | 1983-09-06 |
Family
ID=12007156
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53019721A Expired JPS5840469B2 (ja) | 1978-02-24 | 1978-02-24 | コレステロ−ル定量用酵素剤の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5840469B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3340950A1 (de) * | 1983-11-11 | 1985-05-23 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur gewinnung von cholesterinesterase |
| WO1999045106A1 (fr) * | 1998-03-03 | 1999-09-10 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Oxydase du cholesterol |
-
1978
- 1978-02-24 JP JP53019721A patent/JPS5840469B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS54113493A (en) | 1979-09-05 |
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