JPS59179075A - ペルオキシダ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はオイデイオデンドロン属に属する、ペルオキシ
ダーゼ生産菌を用いてペルオキシダーゼを製造する方法
に関する。

ベルオキシダーしは過酸化水素の存在下で種々の化合物
を酸化÷６酵素であり、近年臨床診断試薬としてグルコ
　ス、総コレステロール、遊離型コレステロール、リン
脂質および尿酸の定量に種々のオキシダーゼと共に使用
されるほかに、酵素免疫試験法における標識酵素として
も使用されている。

従来これら試薬に配合されるペルオキシダーゼどしでは
、専らその給源として大根、西洋ワサビ等の植物が用い
られている。微生物起源のペルオキシダーゼも一部知ら
れてはいるが、これらは植物起源のものにみられるよう
な非特異的なペルオキシダーゼではなく、特定の水素供
与体にのみ作用するペルオキシダーゼである。即ちこれ
らは細菌および糸状菌の生産するチトクロームＣペルオ
キシダーゼやＮＡＤＨ−ペルオキシダーゼであり、その
特異性からみて臨床診断試薬として利用するには不適当
である。又、近年０−ジアニシジンを水素供与体とする
ペルオキシダーゼが大腸菌及びミロセシウム属に属する
微生物から生産されたが、０−ジアニシジンは発癌性作
用を有するため労働衛生上その臨床的使用は回避される
傾向にあり、やはり上記診断試薬としての使用には適し
ていない。

本発明者らは、上記現状に鑑み臨床診断試薬および酵素
免疫試験法に供し得る性質・を有するペルオキシダーゼ
を、増殖が速く、植物に比し大９生産が可能な微生物中
に見出し得るならば、産業上有益であるとの見地から、
該ペルオキシダーゼを安定かつ高力価で生産する菌株を
広く微生物界より検索してきた。その結果光にアルタナ
リア属、コクリオボラス属、ペルキュラリア属及びカー
ブラリア属に属する微生物の培養物中に上記ペルオキシ
ダーゼが生成蓄積されることを発見し、これらの微生物
を利用したペルオキシダーゼの製造方法を確立したく特
公昭５８−５０３５号参照）。

本発明者らは引き続きペルオキシダーゼ生産菌の検索を
進めた結果、新たにオイデイオデンドロン馬に属する菌
株が所望のペルオキシダーゼを安定してかつ大量に生産
することを発見し、しかも、このペルオキシダーゼは臨
床診断試薬に多く用いられている４−アミノアンチピリ
ン（以降４−ＡＡと記す）−フェノール系及び３−メチ
ル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（以降ＭＢＴＩ
−（と記す）−ジメチルアニリン系などを水素供与体と
て発色するペルオキシダーゼであり、診１ｌｌｉ試薬等
としての利用に非常に好適であることを発見した。本発
明は上記の新しい知見に基づいて完成されたものである
。

即ち本発明はオイデイオデンドロン属に属し、ペルオキ
シダーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に培養し、培
養物中にペルオキシダーゼを生成蓄積せしめ、これを採
取することを特徴とするペルオキシダーゼ製造法に係る
。

本発明に利用するペルオキシダーゼ生産能を有する微生
物は、オイデイオデンドロン属に属するものより選択さ
れる。該オイデイオデンドロン属に属する微生物として
は、例えばオイデイオデンドロン　アムビグウム（Ｏ１
ｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎａＲＩｂｉｑＬＩＬＩＩｆｉ）　
、オイデイオデンドロン　セレアリス（Ｏ１ｄｉｏｄｅ
ｎｄｒｏｎ　　ｃｅｒｅａ！ｉｓ）　、オイデイオデン
ドＤ：／　　工ｔｌ：二１ラタム（○ｉｄ　ｔｏｄｅｎ
ｄｒｏｎｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ　）　、オイデイオデ
ンドロン　グリセラム（Ｏ１ｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　　
ｇｒｉｓｅｕｍ　）　、オイデイオデンドロン　カーラ
イ（Ｏ１ｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　ｋａｌｒａｉ　）、オ
イデイオデンドロン　ビリコラ （Ｏ１ｄｉｏｃｌｅｎｄｒｏｎ　　ｐｉｌｉｃｏｌａ）
　、オイデイオデンドロン　シタロイデス（Ｑ　１ｄｉ
ｏｄｅｎｄｒｏｎｓｃｙｔａ＋ｏ＋ｄｅｓ　）　、オイ
デイオデンドロン　シンデニア＜　Ｏ１ｄｉｏｄｅｎｄ
ｒｏｎ　　５ｉｎｄｅｎｉａ）　、オイデイオデンドロ
ン　トルンクタム（Ｏ１ｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎｔｒｕｎ
ｃａｔｕｉｏ　）　、オイデイオデンドロン　クラミド
スポリウム（Ｏ１ｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　ｃｈｌａｍｙ
ｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　）、オイデイオデンドロン　シト
リナム （Ｏ１ｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　　ｃｉｔｒｉｎｕｍ）　
、オイデイオデンドロン　フラブム（Ｏ１ｄｉｏｄｅｎ
ｄｒｏｎ　　ｆｌａｖｕｍ）、オイデイオデンドロン　
マイウス （Ｑ　１ｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　　ｍａｉｕｓ　）　、
オイデイオデンドロン　ベリコニオイデス（Ｏ１ｄｉｏ
ｄｅｎｄｒｏｎｐｅｒｉｃ＊ｎ１ｏｉｄｅｓ　）　、オ
イデイオデンドロン　ロドゲナム（Ｑ　１ｄｉｏｄｅｎ
ｄｒｏｎ　ｒｈｏｄｏｇｅｎｕｍ）　、オイデイオデン
ドロン　テヌウイシマム（Ｏ１ｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎｔ
ｅｎｕｒｓｓ＋ｍｕ＋ｎ　）等を例示することができる
。これらのうちで特にオイデイオデンドロン　セレアリ
ス及びオイデイオデンドロン　エヒニュラタムに属する
微生物は好適である。好ましい代表的微生物を後記第１
表に示す。尚第１表に示す各菌株は、いずれもアメリカ
ン　タイプ　カルチャー　コレクション（Ａ　ｍｅｒｉ
ｃａｎ　　Ｔ　ｙｐｅ　　ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ　＞のカタログ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　　ｏｆ
ｓｔｒａｉｎｓ　　Ｉ、１９８２）に収載された公知の
寄託菌であり、該コレクションより入手することができ
る。

また第１表には該表記載の各菌株につき、そのペルオキ
シダーゼ生産能を、以下の通り検討した結果を併記する
。即ちグルコース、ペプトン又はカゼイン消化物、を主
栄養源とした培養液（その組成は後記する実施例２と同
一である）を坂ロコルベンに入れ加圧殺菌後、これに各
菌株より１白金耳量を植菌し、２６〜２８℃で５〜９日
間振盪培養し、その上清液又は炉液を試験液とし、その
各１１１Ｑを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ５，６）１
観、０．０８％４−ＡＡ溶液０．５鵬、０．４％フェノ
ール溶液０．５ＴＩＩＱ及び０．０３％過酸化水素溶８
！１戒の混合液に加え３０℃で作用させ、１５分後の発
色度合を、光電比色計を用いて波長５１０１１での吸光
度（０，Ｄ、）を測定することにより検討した。尚発色
度合における評価は、上記吸光度測定値に従い以下の通
り表示する。

発色度合 一・・・吸光度が０．０１に満たないもの＋・・・吸光
度が０．０１以上、０．１未渦のもの拝・・・吸光度が
０．１以上、２未満のもの■・・−吸光度が２以上のも
の 第　　１　　表 菌　　株　　名　　　　　　　　　　菌　株　番　号　
　発色度合オイデイオデンドロン　アムヒグウム Ｑｉｄｉｏｄｅ＋ｘｌｒｏｎ　　　　　ａｍｂｉｇｕｕ
ｍ　　　　　ＡＴＣＣ３６２５６＋オイデイオデンドロ
ン　セレアリス Ｑｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　　　　　ｃｅｒｅａｌｉｓ
　　　　　ＡＴＣＣ２４４０３＋＋＋オイデイオデンド
ロン　エヒニュラタム０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　　　
　　ｅｃｈｉｎｕｌａｔｕＩＩＩＡＴＣＣ１６２８７ｍ
オイデイオデンドロン　エヒニュラタム０ｉｄｉｏｄｅ
ｎｄｒｏｎ　　　　　ｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ　　　Ａ
ＴＣＣ３２４２４−Ｈ−オイデイオデンドロン　グリセ
ラム ０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　　　　　ａｒｉｓｅｕｍ　
　　　　ＡＴＣＣ６７２６−Ｈ−オイデイオデンドロン
　グリセラム ０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　　　　　ｇｒｉｓｅｕｍ　
　　　　ＡＴＣＣ２６１４７＋オイデイオデンドロン　
カーライ Ｑｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　　　　　ｋａｌｒａｉ　　
　　　　ＡＴＣＣ１８４３４＋オイデイオデンドロン　
ビリコラ ０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　　　　　ｐｉｌｉｃｏｌａ
　　　　　ＡＴＣＣ３８２０９＋オイデイオデンドロン
　シンデニア ０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　　　　　５ｉｎｄｅｎｉａ
　　　　　ＡＴＣＣ３６０７４＋オイデイオデンドロン
　トルンクタム ０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　　　　　ｔｒｕｎｃａｔｕ
ｍ　　　　ＡＴＣＣ１６２８６＋オイデイオデンドロン
　シトリナム ０ｉｄｉｏｄｅｎｃｌｒｏｎ　　　　　ｃｉｔｒｉｎｕ
ｍ　　　　　ＡＴＣＣ３８２０７＋ｌ−オイデイオデン
ドロン　マイウス ０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　　ｍａｉｕｓ　　ＡＴＣＣ
３８２０８妊オイデイオデンドロン　テヌウイシマムＱ
ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　　　　　ｔｅｎｕｉｓｓｔＩ
ｌｌｕｍ　　　ＡＴＣＣ２４４０５−Ｈ−上記第１表に
示す通り、オイデイオデンドロン属に属する公知の微生
物に目的とする発色が認められ、特にオイデイオデンド
ロン　セレアリスＡＴＣＣ２４４０３及びオイデイオデ
ンドロンエヒニュラタム　ＡＴＣＣ１６２８７の発色は
著しく、従って優れたペルオキシダーゼ生産能を有する
ことが判る。またオイデイオデンドロン属に属する寄託
菌としては、上記第１表に示すほかにも例えばオイデイ
オデンドロン　シタロイデス　ＡＴＣＣ３８２１０、オ
イデイオデンドロン　クラミドスポリウム　ＡＴＣＣ１
８４４８、オイデイオデンドロン　フラブム　ＡＴＣＣ
３２３５０、オイデイオデンドロン　ペリコニオイデス
　ＡＴＣｏ　　１８４４９、オイデイオデンドロン　ロ
ドゲナム　ＡＴＣＣ２４４０４、オイデイオデンドロン
　シトリナム　ＩＦｏ９３３８、オイデイオデンドロン
　テヌウイシマム　ＩＦＯ６７９８、オイデイオデンド
ロントルンクタム　ＩＦｏ　　９９５１等が知られてい
る。

本発明は上記各菌株又はそれらの変異株を利用して以下
の通り実施される。即ち、まず上記微生物を栄養培地に
培養する。培養は通常の栄養物及び添加物を含有する合
成培地又は天然培地で行ない得る。

炭素源としてはグルコース、マルトース、サッカローズ
、ガラクトース、フラクトース、キシロース、マンノー
ズ、ラフィノース、可溶性澱粉、液化澱粉、糖蜜、グリ
ヒロール、ソルビトール、クエン酸、コハク酸等の一般
的に使用されるものをいずれも使用できる。窒素源とし
てはペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、カゼイン、肉エ
キス、カザミノ酸、コーンスチープリカー等の天然窒素
源の他更に硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、尿素等の無機窒素を使
用できる。この他必要に応じリン酸塩、炭酸塩、硫酸マ
グネシウム、硫酸鉄、Ｔａ酸銅、硫酸亜鉛、塩化カルシ
ウム、塩化鉄、塩化コバルト、塩化マンガン等の無機塩
およびビタミン等も微量栄養源として使用できる。これ
らの培地成分は培養すべき各微生物の生育を阻害しない
濃度で用いられる。

本発明方法は、好ましくは通常の振盪培養又は通気撹拌
培養により実施される。これらの培養にあっては一般的
に炭素源は０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜８
重量％、窒素源はｏ、ｏｉ〜８重量％、好ましくは０．
１〜５重但％の濃度とするのがよい。また培地のｐＨは
２〜９、好ましくは４〜７とし、培養温度は１５〜３５
°Ｃ１好ましくは２０〜３３℃とするのがよく、培養は
通常２〜１０日間で行なわれる。

上記培養により培養物中に所望のペルオキシダーゼが産
生蓄積される。液体培養における培養物とは、生産され
た菌体及び培養上澄液もしくは培養か液を意味する。こ
れら培養物からペルオキシダーゼを採取する方法は、常
法に従えばよく、例えば培養終了後の培養液より遠心分
離および濾過などにより菌体および不溶物を除去するこ
とにより粗酵素液を得る。更に菌体中に含まれるペルオ
キシダーゼは磨砕又は超音波等の手段により菌体を破壊
後酵素を抽出することによっても粗酵素液として収得で
きる。更に菌体を含む培養液をそのまま超音波処理する
ことにより菌体を破壊したのち不溶物を除去することに
よっても粗酵素液を得ることが可能である。

本発明方法はまた通常の固体培養によっても行ない得る
ものであり、この場合常法に従い固体培地に菌体を繁殖
させたのち、所望酵素を水で抽出することにより粗酵素
液（抽出液）を得ることができる。

これらの方法により得られた粗酵素液の精製操作は通常
の方法に従って行なうことができる。該操作としては例
えば硫酸アンモニウム分画沈澱法、透析、吸着剤による
分別法、有機溶媒分別法、等電点沈澱法および各種イオ
ン交換体によるカラムクロマトグラフィーなどを単独に
或いは組合せて利用する操作を例示できる。かくして精
製されたペルオキシダーゼを収得する。

本発明におけるペルオキシダーゼ活性の測定は、水素供
与体として臨床診断試薬に用いられる４−ΔＡ−フェノ
ール系を使用して行なった。すなわち０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐ　）１５．６）　１ＴＩＩＱに０．０８％４−
ＡＡ溶？１１２０．５ｍＧ、０．４％フェノール溶液０
．５ｍ１２及び０．０３％過酸化水素溶液１ｍＧを加え
３０℃に予熱後、これに酵素液１鵬を加えて１５分間反
応させ、直ちに５１０ｎｍの波長でその吸光度を測定す
る。別に対照として過酸化水素溶液の代りに水を１鵬加
え同様の操作によって吸光度を測定する。上記対照試験
と本試験とにおける吸光度の差が１．０増加する場合を
１単位とした。

次に本発明で得られたペルオキシダーゼの酵素化学的性
質を示す。

（１）　作用特異性； 本酵素は過酸化水素に極めて特異的に作用し、過酸化水
素の存在下で種々の水素供与体として機能する化合物の
酸化を触媒する。その作用機構は次式に示す通りである
。

ペルオキシダーゼ Ｈ２０２＋ＡＨ２２Ｈ２０＋Ａ 〔但し式中Ａ　Ｈ２は水素供与体を、またＡは酸化され
た水素供与体を示す。〕 （２）　水素供与体に対する特異性 各種水素供与体に対する作用の強さを第２表に、また、
臨床診断試薬用として使用されている発色剤系における
発色度を第３表に示した。

第　　２　　表 水素供与体　　　　　作用の強さ フェノール　　　　　　　１００ フェノールナトリウム　　　７８ ハイドロキノン　　　　　　１４ カテコール　　　　　　　１１５ ピロガロール　　　　　　　１４ α−ナフトール　　　　　　１３ ０−ジアニシジン　　　　　　８ ０−トリジン　　　　　　　　６ グアヤコール　　　　　　　１８ チロシン　　　　　　　　　　６ レゾルシノール　　　　　　　２ 但し第２表中作用の強さは、それぞれ０．０１濃度にお
ける発色で、フェノールの値を１００とした場合の発色
度の相対値を示す。

第３表 発色剤組成　　　　測定波長　　　発色度（ｒｕｎ）　
　　　　（吸光度） ４−ＡＡ−フェノ ール系　　　　　　　５１０　　０．４３８４−ＡＡ−
ジメチ ルアニリン系　　　　５６０　　０．０２０８−ハイド
ロキノ リンーｐ−アニシ ジン系　　　　　　　６００　　０．０２６ＭＢＴＨ−
ジメチ ルアニリン系　　　　５９０　　０．１７４但し第３表
中発色度は、発色剤および測定波長として表記したもの
を利用し、前記ペルオキシダーゼ活性の測定法と同一条
件下に測定された吸光度＜０．０．）にて表示する。

（３）　作用至適Ｃ１−（ 本酵素はｏ　）−１３，５〜８で作用し、その作用至適
＋１８は５〜６付近にある。

（４）　至適作用温度 本酵素は２０〜６０℃で作用し、その至適作用温度は３
５〜４５℃である。

（５）　　Ｉ）ｌ−（安定性 本酵素はｐＨ３，５〜７．５の範囲で安定であり、特に
ｐ　ｔ−１５，０〜７の範囲で安定である。

（６）　温度安定性 本酵素は０．１Ｍリン酸緩衝液（１）８５．６）溶液中
では４５℃で３Ｑ分間完全に安定である。

（７）　分子量 食塩０．１Ｍ濃度を含む０．０２Ｍ酢酸緩衝液（１）８
５．６）で平衡化したトヨパールトＩＷ−５５８（東洋
曹達工業社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーに
より分子量を測定した。分子量測定用標準蛋白質キット
（スウェーデン、ファルマシア社製）で得られた分子量
検量線にあてはめて、本酵素の分子量は約４００００で
あった。

（８）　活性の測定法 前述した通りである。

尚、上記（１）〜（７）に示す酵素化学的性質のうち（
１）は本発明で得られる各菌体の産生ずるペルオキシダ
ーゼに共通の性質であるが、（２）以降の各項の性質は
利用する各菌体により若干相違しており、上記（２）〜
（７）に示す性質は実施例５で得られたペルオキシダー
ゼについて示したものである。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ １１　ｏｇに水道水１０ｍＧを加えよく混合したものを
２００鵬容三角フラスコに入れて１２０℃で３０分間殺
菌後、オイデイオデンドロン　セレアリス（Ｏｉｄｉｏ
ｄｅｎｄｒｏｎ　　ｃｅｒｅａｌｉｓ）ＡＴＣＣ２４４
０３の１白金耳闇を植菌し、２４℃で８日間培養を行な
う。培養終了後、水を加え時々撹拌しながら３０℃でｉ
ｇ間抽出を行ない、濾紙で濾過し粗酵素液を得る。この
場合ペルオキシダーゼの活性は麩１ｇ当り１．５単位で
あった。

実施例２ グルコース６％、ペプトン３％、尿素０．３％、コーン
ステイブリカー０．２５％、リン酸第−カリウム０．１
％、硫酸マグネシウム０．０５％、硫酸第二鉄２ｐｐｍ
、炭酸カルシウム１％の組成の液体培養液（Ｄ　Ｈ６，
０）を５００ｍＱ容坂口氏コルベンに５０鵬入れ、１２
０℃３０分間殺菌後、オイデイオデンドロン　エヒニュ
ラタム（Ｏ１ｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　　ｅｃｈｉｎｕｌ
ａｔｕｍ　）　Ａ　Ｔ　ＣＣ１６２８７の１白金耳量を
植菌し、２４〜２６℃で７日間振盪培養した後、濾紙で
濾過し粗酵素液を得た。この場合のペルオキシダーゼ活
性は５８．４単位／鶴であった。

実施例３ グルコース６％、カゼイン（プロテアーゼ消化物）３％
、尿素０．３３％、コーンステイブリカー０．２５％、
酵母エキス０．１％、リン酸第−カリウム０．１％、硫
酸マグネシウム０．０５％、塩化カリウム０．０２５％
、硫酸第二鉄２ｐｐｍ。

炭酸カルシウム１％の組成の液体培養液（ｐＨ６，０）
を５００鵬容坂口氏コルベンに５０謡宛入れ、１２０℃
４０分間蒸気殺菌した。これに下記オイデイオデンドロ
ン属Ｖ体の１白金耳量を植菌し、２４〜２６℃で６日間
振盪培養した後、濾紙で濾過し粗酵素液を得た。このも
ののペルオキシダーゼ活性を測定し下記第４表の結果を
得た。

第　　４　　表 菌　株　名　　　　菌株番号　　　活　　性（単位／鵬
） オイデイオデンドロン　ＡＴＣＣ セレアリス　　　　　２４４０３　　　５．１オイデイ
オデンドロン　ＡＴＣＣ エヒニュラタム　　　１６２８７　１６４．０オイデイ
オデンドロン　ＡＴＣＣ エヒニュラタム　　　３２４２４　　　１．８オイデイ
オデンドロン　ＡＴＣＣ シトリナム　　　　　３８２０７　　　１．２オイデイ
オデンドロン　ＡＴＣＣ マイウス　　　　　　３Ｂ２０８　　　１．４実施例４ 実施例２と同組成の液体培養液（１）Ｈ６，０＞１２９
を３０Ｑ容ジャーファーメンタ−に仕込み、１２０℃４
０分間殺菌後、オイデイオデンドロンエヒニュラタム　
ＡＴＣｏ　　１６２８７の前培養液３００話を植菌し、
２６℃通気Ｎｏ、２５ｖ、ｖ、ＩＩｌ、の条件で３日間
通気撹拌培養を行なった。

培養液を吸引濾過し、菌体と炉液に分ける。菌体は水洗
後よくしほり、その一部１（Ｍをとって０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐ　Ｈ５，６＞２０鵬と海砂とを加え冷却下で
磨砕した後、同緩衝液を加え全容１００域とし、１００
００ｒ、ｐ、ｍ、１５分間の遠心分離を行なって上澄液
を得た。この場合ペルオキシダーゼ活性は使用国体１ｇ
当り２．７単位であった。一方炉液のペルオキシダーゼ
活性は、７７単位／鶴であった。

実施例５ 実施例４と同様にして１０Ｑの培養炉液を得た。

この炉液をダイアフィルターＧ−１０Ｔ！＜バイオエン
ジニアリング社製）を使用して限外濾過を行ない２Ｑに
濃縮した後、硫酸アンモニウム５０（Ｗ／Ｖ）％を加え
て生ずる塩析物を集め、０．０５Ｍ酢酸Ｍ衝ＦＦｉ　（
ｐ　Ｈ３，６’）６００鶴に溶解した。この溶液をセロ
ファンチューブを用い、冷室中で同組成緩衝液を外液と
して透析し硫酸アンモニウムを除去する。この透析内液
を予め０．０５Ｍ酢酸Ｍ衝液（ｐ　Ｈ３，６）で平衡化
したＳＰ−セファデックス　Ｃ−５０（スウェーデン、
ファルマシア社製）のカラムに通じペルオキシダーゼを
吸着せしめ、同緩衝液で洗浄した後、食塩濃度Ｏ〜１．
０Ｍの範囲でイオン強度を連続的に変化させて溶出させ
ペルオキシダーゼ活性の強い両分を集めた。この両分に
硫酸アンモニウム６０（Ｗ／Ｖ）％を加え生じた沈澱を
１００００ｒ、ｐ−ｍ、３０分間遠心分離して集め少量
の０．０２Ｍ酢酸緩衝液に溶解した。次いでトヨパール
ＨＷ５５８のカラム（２，２Ｘ１００Ｃｔｆｉ）に負荷
し展開溶媒として食塩０．１Ｍを含む０．０２Ｍ酢酸緩
衝液（ｐ）１５．６）を用いてゲル濾過を行なった。ゲ
ル濾過分画液の内ペルオキシダーゼ活性の強い両分を集
めセロファンチューブとポリエチレングリコール２００
００　（和光純薬工業製）を用いて濃縮し、再びゲル濾
過操作を行なう。上記ゲル濾過操作を３回くり返した後
、ペルオキシダーゼ活性の強い濃縮液９６−を得、これ
をセロファンチューブを用いて純水に対し透析した。透
析内液を凍結乾燥しペルオキシダーゼ粉末を得た。培養
炉液からの活性収率は４５％であり、粉末１ｍｇ当り４
２８単位であった。

（以　上） 代理人　弁理士　三　枝　英　二　　　−７手　続　ン
市　正　書（自発） 昭和５８年１０月ｔ９ＪＢ 特許庁長官　　若　杉　和　夫　殿 １　事件の表示 昭和５８年特許願第５３４０４号 ２　発明の名称 ペルオキシダーゼの製造法 ３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 木本相欠　（ほか４名） ４代理人 ５　補正命令の日付 自発 ６　補正の対象 明細書中「発明の詳細な説明」の項 ７　補正の内容 別組添付の通り 補　　正　　の　　内　　容 １　明細書第１５頁下がら第３行に「それぞれ０、ＯＩ
Ｊ　、！：あるを［［ぞｈＯ，ＯＩＭＪと訂正する。

２　明細書第１８頁第２行及び同頁第４行に「菌体」と
あるをそれぞれ「菌株」と訂正する。

３　明細書第１８頁第１０行及び同頁第１８行に１麩」
とあるを「苑」と訂正する。

４　明細書第２０頁第１行に「菌体」とあるを「菌株」
と訂正する。

５　明細書第２２頁第１６行に「酢酸緩衝液」とあるを
「酢酸緩衝液（ｐ８５．６）Ｊと訂正する。

（以　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ■　オイデイオデンドロン（□　１ｄｉｏｄｅｎｄｒｏ
   ｎ　）　ｍに属し、ペルオキシダーゼ生産能を有する微
   生物を栄養培地に培養し、培養物中にペルオキシダーゼ
   を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするペ
   ルオキシダーゼの製造法。