JPS60149382A - アスパラギン酸アミノトランスフエラ−ゼアイソザイム阻害活性を有するプロテア−ゼの製造法 - Google Patents
アスパラギン酸アミノトランスフエラ−ゼアイソザイム阻害活性を有するプロテア−ゼの製造法Info
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- JPS60149382A JPS60149382A JP59004494A JP449484A JPS60149382A JP S60149382 A JPS60149382 A JP S60149382A JP 59004494 A JP59004494 A JP 59004494A JP 449484 A JP449484 A JP 449484A JP S60149382 A JPS60149382 A JP S60149382A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はストレプトミセス属に属する菌株を培養して、
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２，６
，１，１、系統名＝Ｌ−八５ｐａｒｔａｔｅ ： ２−
ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅ
ｒａｓｅ 、別名＝Ｇｌｕｔａｍｉｃ−ｏｘａｌｏａｃ
ｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、以下「ＡＳＴＪ
という）アイソザイムを阻害する活性を有するプロテア
ーゼを製造する方法に関する。さらに詳しくは、細胞質
性のＡＳＴアイソザイムのみを特異的に阻害するプロテ
アーゼの製造法に関する。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２，６
，１，１、系統名＝Ｌ−八５ｐａｒｔａｔｅ ： ２−
ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅ
ｒａｓｅ 、別名＝Ｇｌｕｔａｍｉｃ−ｏｘａｌｏａｃ
ｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、以下「ＡＳＴＪ
という）アイソザイムを阻害する活性を有するプロテア
ーゼを製造する方法に関する。さらに詳しくは、細胞質
性のＡＳＴアイソザイムのみを特異的に阻害するプロテ
アーゼの製造法に関する。
ＡＳＴアイソザイムは肝臓、心筋、脳、骨格筋、腎臓な
どに存在し、次の反応を触媒する酵素として知られてい
る。
どに存在し、次の反応を触媒する酵素として知られてい
る。
Ｌ−アスパラギン酸＋２−オキソグルタル酸＝オキザロ
酢酸＋Ｌ−グルタミン酸 ＡＳＴアイソザイムには、局在性を異にする細胞質性の
ＡＳＴアイソザイム（以下ｒｓ−ＡＳＴｊという）とミ
トコンドリア性のＡＳＴアイソザイム（以下ｒ ｍ −
Ａ Ｓ Ｔ ｊという）の二種類のアイソザイムが存在
し、これらの分別定量は肝炎、心筋梗塞などの臨床診断
法として有用である。
酢酸＋Ｌ−グルタミン酸 ＡＳＴアイソザイムには、局在性を異にする細胞質性の
ＡＳＴアイソザイム（以下ｒｓ−ＡＳＴｊという）とミ
トコンドリア性のＡＳＴアイソザイム（以下ｒ ｍ −
Ａ Ｓ Ｔ ｊという）の二種類のアイソザイムが存在
し、これらの分別定量は肝炎、心筋梗塞などの臨床診断
法として有用である。
本発明者らはＡＳＴアイソザイムの分別定量を目的とし
て、これらアイソザイムの阻害物質を検索したところ、
本発明者らが土壌よりスクリーニングして見いだしたス
トレプトミセス属に属する菌株が、５−ＡＳＴば阻害す
るがｍ−ＡＳＴを全く阻害しない物質を生産することを
知った。さらにこの物質を精製単離してその理化学的性
質を検討したところ、意外にもセリンプロテアーゼに分
類される酵素であることが分かった。従来ＡＳＴアイソ
ザイムのプロテアーゼによる感受性の差異を明確にした
例はなく、本発明者らの報告が最初である。本発明は上
記知見により完成されたもので、本発明の方法により得
られた物質（以下単に「プロテアーゼ」という）はＡＳ
Ｔアイソザイムの分別定量に有用であることを確認した
。
て、これらアイソザイムの阻害物質を検索したところ、
本発明者らが土壌よりスクリーニングして見いだしたス
トレプトミセス属に属する菌株が、５−ＡＳＴば阻害す
るがｍ−ＡＳＴを全く阻害しない物質を生産することを
知った。さらにこの物質を精製単離してその理化学的性
質を検討したところ、意外にもセリンプロテアーゼに分
類される酵素であることが分かった。従来ＡＳＴアイソ
ザイムのプロテアーゼによる感受性の差異を明確にした
例はなく、本発明者らの報告が最初である。本発明は上
記知見により完成されたもので、本発明の方法により得
られた物質（以下単に「プロテアーゼ」という）はＡＳ
Ｔアイソザイムの分別定量に有用であることを確認した
。
本発明に用いる微生物としてはＡＳＴアイソザイム阻害
活性を有するプロテアーゼを産生ずる能力のあるストレ
プトミセス属に属する菌株であれば何れでもよいが、好
適には本発明者らが土壌よリスクリーニングして見いだ
したストレプトミセス属に属するＩｌｈ ９７２２株が
示される。歯、９７２２株は次の菌学的性質を有する。
活性を有するプロテアーゼを産生ずる能力のあるストレ
プトミセス属に属する菌株であれば何れでもよいが、好
適には本発明者らが土壌よリスクリーニングして見いだ
したストレプトミセス属に属するＩｌｈ ９７２２株が
示される。歯、９７２２株は次の菌学的性質を有する。
（ａ）形態
基生菌糸から１μ内外の気菌糸を伸張しその先端に開放
型らせん状胞子の連鎖がみられる。
型らせん状胞子の連鎖がみられる。
気菌糸は単純分枝で車軸分枝はみられない。胞子の形態
は楕円形ないし円筒形で表面構造は平滑であり、その連
鎖数は１０胞子以上である。胞子の大きさは０．６〜１
．２μ×０．７〜１．８μである。鞭毛胞子、菌核、胞
子のうは認められない。
は楕円形ないし円筒形で表面構造は平滑であり、その連
鎖数は１０胞子以上である。胞子の大きさは０．６〜１
．２μ×０．７〜１．８μである。鞭毛胞子、菌核、胞
子のうは認められない。
（ｂ）各培地における生育状態
第１表に示す（培養期間１４〜２１日）。
（Ｃ１生理的性質
■生育温度範囲
Ｂｅｎｎｅｔｉｓ ｂｒｏｔｈを用いた温度勾配培養装
置での生育試験の結果、１０〜３６℃で生育した。
置での生育試験の結果、１０〜３６℃で生育した。
−■ゼラチンの液化：陽性
■スターチの加水分解：陽性
■脱脂牛乳の凝固：陰性
■脱脂牛乳のペプトン化：陽性
■メラニン様色素の生成：陽性
ｔｄｌ炭素源の同化性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培
地上） Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、
Ｌ−ラムノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース
、Ｄ−マンニット、サリシン、シ・ニークロースを利用
する。イノシラ１−、ラフィノースを利用しない。
地上） Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、
Ｌ−ラムノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース
、Ｄ−マンニット、サリシン、シ・ニークロースを利用
する。イノシラ１−、ラフィノースを利用しない。
以上か一９Ｎｏ、９７２２株の性状を要約すると、気菌
糸はらせん糸を形成し、胞子表面構造は平滑である。
糸はらせん糸を形成し、胞子表面構造は平滑である。
気菌糸の色は茶灰色から灰味オリーブである。メラニン
様色素の産生は陽性で一部の培地で赤紫色の可溶性色素
を生産する。以上の菌学的性質を示す菌種について、パ
ージエイズ・マニュアル・オブ・デイターミネイティブ
・バタテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉ
−ｏｌｏｇｙ ）第７版（１９５７年）、同第８版（１
９７４年）、シャーリングとゴドリーブのｌ５Ｐ（イン
ターナショナル・ストレゾ１ヘミセス・プロジェクト）
報告（１９６８年、１９６９年および１９７２年）およ
びワックスマン著、シ・アクチノミセテス（Ｔｈｅ Ａ
ｃｔｉｎｏ−ｍｙｃｅｔｅｓ ）第２巻（１９６１年）
を参考に検索すると、Ｎｏ、９７２２株に最も近縁する
ものとしてストレプトミセス・ヒオラセオクロモゲネス
（Ｓ ｔｒｅｐ ｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｃｈ
ｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）が挙げられる。即ち、気菌糸の色
調か灰色でらせん糸を形成すること、赤紫色の可溶性色
素を生産すること、胞子表面が平滑であること、メラニ
ン様色素の生成が陽性であること（ペプトン・イースト
・軟寒天培地で陽性、チロシン寒天培地で陰性）などの
点がよく一致している。糖の利用性については、イノジ
ットとラフィノースを利用しない点が異なっている。
様色素の産生は陽性で一部の培地で赤紫色の可溶性色素
を生産する。以上の菌学的性質を示す菌種について、パ
ージエイズ・マニュアル・オブ・デイターミネイティブ
・バタテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉ
−ｏｌｏｇｙ ）第７版（１９５７年）、同第８版（１
９７４年）、シャーリングとゴドリーブのｌ５Ｐ（イン
ターナショナル・ストレゾ１ヘミセス・プロジェクト）
報告（１９６８年、１９６９年および１９７２年）およ
びワックスマン著、シ・アクチノミセテス（Ｔｈｅ Ａ
ｃｔｉｎｏ−ｍｙｃｅｔｅｓ ）第２巻（１９６１年）
を参考に検索すると、Ｎｏ、９７２２株に最も近縁する
ものとしてストレプトミセス・ヒオラセオクロモゲネス
（Ｓ ｔｒｅｐ ｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｃｈ
ｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）が挙げられる。即ち、気菌糸の色
調か灰色でらせん糸を形成すること、赤紫色の可溶性色
素を生産すること、胞子表面が平滑であること、メラニ
ン様色素の生成が陽性であること（ペプトン・イースト
・軟寒天培地で陽性、チロシン寒天培地で陰性）などの
点がよく一致している。糖の利用性については、イノジ
ットとラフィノースを利用しない点が異なっている。
以上のように、Ｉ’ｈ ９７２２株はストレプトミセス
・ビオラセオクロモゲネスと糖の利用性について若干の
相違があるものの異なる菌種と考えられる程の相違では
なく、ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネズと種
を同じくするものと判断し、ストレプトミセス・ビオラ
セオクロモゲネスｔｋ ９７２２と命名した。本菌株は
、通産省工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第７３６２号（ＦＥＲＭ Ｐ−７３６２）として寄託さ
れている。
・ビオラセオクロモゲネスと糖の利用性について若干の
相違があるものの異なる菌種と考えられる程の相違では
なく、ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネズと種
を同じくするものと判断し、ストレプトミセス・ビオラ
セオクロモゲネスｔｋ ９７２２と命名した。本菌株は
、通産省工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第７３６２号（ＦＥＲＭ Ｐ−７３６２）として寄託さ
れている。
本発明法によ゛リプロチアーゼを製造するには、まずス
トレプトミセス属に属するプロテアーゼ生産菌株を栄養
培地に培養して、培養物中にプロテアーゼを蓄積せしめ
る。培養方法は、放線菌の一般的な培養方法が用いられ
る。例えば、使用する栄養培地としては、微生物が資化
し得る炭素源、窒素源および無機物などを含む合成培地
または天。
トレプトミセス属に属するプロテアーゼ生産菌株を栄養
培地に培養して、培養物中にプロテアーゼを蓄積せしめ
る。培養方法は、放線菌の一般的な培養方法が用いられ
る。例えば、使用する栄養培地としては、微生物が資化
し得る炭素源、窒素源および無機物などを含む合成培地
または天。
然培地が用いられる。炭素源としてはグルコース、フラ
クトース、マルトース、シュクロース、糖蜜、澱粉、デ
キストリン、有機酸およびグリセリンなどが使用される
。窒素源としては麦芽エキス、ペプトン、酵母エキス、
乾燥酵母、肉エキス、コーンスチープリカー、カゼイン
、アミノ酸などの有機窒素源、および硝酸塩、アンモニ
ウム塩などの無機窒素源が使用される。無機物としては
カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、亜
鉛、鉄などの無機塩が必要に応じて使用される。
クトース、マルトース、シュクロース、糖蜜、澱粉、デ
キストリン、有機酸およびグリセリンなどが使用される
。窒素源としては麦芽エキス、ペプトン、酵母エキス、
乾燥酵母、肉エキス、コーンスチープリカー、カゼイン
、アミノ酸などの有機窒素源、および硝酸塩、アンモニ
ウム塩などの無機窒素源が使用される。無機物としては
カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、亜
鉛、鉄などの無機塩が必要に応じて使用される。
培養中の発泡を抑えるために、界面活性剤、シリコン、
植物油などの消泡剤を添加することもできる。
植物油などの消泡剤を添加することもできる。
培養は、通常振盪または通気攪拌下好気的条件のもとに
おこなうのがよい。培養温度は菌が生育しプロテアーゼ
が生産される範囲内であればいずれの温度でもよいが、
好ましくは２０〜３５°Ｃである。
おこなうのがよい。培養温度は菌が生育しプロテアーゼ
が生産される範囲内であればいずれの温度でもよいが、
好ましくは２０〜３５°Ｃである。
培地のｐＨは通禽６〜９の範囲が好ましい。培養時間は
プロテアーゼの生産が最大に達する時間を選べばよく、
通常３０〜５０時間である。
プロテアーゼの生産が最大に達する時間を選べばよく、
通常３０〜５０時間である。
以上のようにして得られた培養物から本発明のプロテア
ーゼを採取するには、その理化学的性質を利用して、公
知の蛋白質の精製法を適宜組み合わせて行うことができ
る。例えば、培養物をろ過もしくは遠心分離して菌体を
除いたのち、硫安、硫酸ナトリウムなどを用いた塩析、
エタノール、メタノール、アセトンなどを用いた有機溶
媒沈澱、活性炭、シリカゲル、アルミナ、ヒドロキシア
パタイト、セルロースなどを用いた吸着クロマトグラフ
ィー、イオン交換樹脂、イオン交換セルロース、イオン
交換セファデックスなどを用いたイオン交換クロマトグ
ラフィー、セファデックス、バイオゲルなどを用いたゲ
ルろ過および電気泳動、限外ろ過、透析などの公知の方
法を任意の順序で適宜組み合せ、または繰り返すことに
より精製する。
ーゼを採取するには、その理化学的性質を利用して、公
知の蛋白質の精製法を適宜組み合わせて行うことができ
る。例えば、培養物をろ過もしくは遠心分離して菌体を
除いたのち、硫安、硫酸ナトリウムなどを用いた塩析、
エタノール、メタノール、アセトンなどを用いた有機溶
媒沈澱、活性炭、シリカゲル、アルミナ、ヒドロキシア
パタイト、セルロースなどを用いた吸着クロマトグラフ
ィー、イオン交換樹脂、イオン交換セルロース、イオン
交換セファデックスなどを用いたイオン交換クロマトグ
ラフィー、セファデックス、バイオゲルなどを用いたゲ
ルろ過および電気泳動、限外ろ過、透析などの公知の方
法を任意の順序で適宜組み合せ、または繰り返すことに
より精製する。
本発明のプロテアーゼは次の理化学的性質を有する。
■作用：５−ＡＳＴを阻害するがｍ −Ａ Ｓ Ｔは阻
害しない。カゼイン等の蛋白質の氷解反応を触媒する。
害しない。カゼイン等の蛋白質の氷解反応を触媒する。
■基質特異性：カゼイン、ヘモグロビン、アゾコール、
アルブミンに作用する。
アルブミンに作用する。
■至適ｐｉｔ：）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）および
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨｌ。
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨｌ。
〜１２）に熔解したカゼイン（１，３３％）を基質とし
て測定したところ、至ＪｐＨは１１．６付近であった。
て測定したところ、至ＪｐＨは１１．６付近であった。
■安定ｐｌ（：３７°Ｃ１１４時間処理したところ、ｐ
Ｈ５〜６の範囲で安定であった。
Ｈ５〜６の範囲で安定であった。
■至適温度： ｐＨ９，５で１０分間反応したところ、
至適温度は７５℃であった。
至適温度は７５℃であった。
■温度安定性： ｐＨ８，５において、各温度で１０分
間処理したところ、５５°Ｃで１００％、６５℃で８５
％の活性が残存していた。
間処理したところ、５５°Ｃで１００％、６５℃で８５
％の活性が残存していた。
■分子量： １７，５００〜１８．０００ （Ｓ Ｄ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動法による。） ■等電点：９．８（焦点電気泳動法による。）■阻害剤
：フェニルメチルスルボニルフルオライドにより阻害さ
れる。ＥＤＴＡでは阻害されない。
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動法による。） ■等電点：９．８（焦点電気泳動法による。）■阻害剤
：フェニルメチルスルボニルフルオライドにより阻害さ
れる。ＥＤＴＡでは阻害されない。
［相］物質の色、形：白色、菱面体結晶上述のように、
本発明の物質はプロテアーゼであり、より詳しくはセリ
ンプロテアーゼに分類されるプロテアーゼである。
本発明の物質はプロテアーゼであり、より詳しくはセリ
ンプロテアーゼに分類されるプロテアーゼである。
次に本発明のプロテアーゼのＡＳＴアイソザイム阻害活
性の測定法を説明する。０．１■／−牛血清アルブミン
および４μＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ ）
リス塩酸緩−衝液（ｐＨ８，５）に、５−ＡＳＴ （ブ
タ心臓起源、Ｙ、 Ｍｏｒｉｎｏら、Ｊ、Ｂｉｏ−ｃｈ
ｅｍ、 、第８２巻８４７−８５２頁、 １９７７年、
の方法に準じ調製）を溶解した溶液０．５ｍ （ｓ −
ＡＳＴを５０ Ｋａｒｍｅｎ単位含む）とプロテアーゼ
の溶液０．５−を混合して、あらかじめ２５℃、１５分
間予熱したのち、２０ｍＭ アスパラギン酸、ｌＱｍＭ
２−オキソグルタル酸、０．２ｍＭ ＮＡＤＨおよび
リンゴ酸脱水素酵素（オリエンタル酵母社製） ０．５
ｐＩ！を含む５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ）１８．
０） ３．０−と混合して２５℃にて反応せしめ、３４
０ｎｍにおける吸光度の１分間当りの減少を測定する。
性の測定法を説明する。０．１■／−牛血清アルブミン
および４μＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ ）
リス塩酸緩−衝液（ｐＨ８，５）に、５−ＡＳＴ （ブ
タ心臓起源、Ｙ、 Ｍｏｒｉｎｏら、Ｊ、Ｂｉｏ−ｃｈ
ｅｍ、 、第８２巻８４７−８５２頁、 １９７７年、
の方法に準じ調製）を溶解した溶液０．５ｍ （ｓ −
ＡＳＴを５０ Ｋａｒｍｅｎ単位含む）とプロテアーゼ
の溶液０．５−を混合して、あらかじめ２５℃、１５分
間予熱したのち、２０ｍＭ アスパラギン酸、ｌＱｍＭ
２−オキソグルタル酸、０．２ｍＭ ＮＡＤＨおよび
リンゴ酸脱水素酵素（オリエンタル酵母社製） ０．５
ｐＩ！を含む５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ）１８．
０） ３．０−と混合して２５℃にて反応せしめ、３４
０ｎｍにおける吸光度の１分間当りの減少を測定する。
この測定値と、プロテアーゼを除いて、上記と同じ方法
で操作したときの吸光度を比較したとき、後者の値を５
０％不活性化せしめるプロテアーゼの量を１単位とした
。
で操作したときの吸光度を比較したとき、後者の値を５
０％不活性化せしめるプロテアーゼの量を１単位とした
。
次ぎに、本発明のプロテアーゼが有するＡＳＴアイソザ
イム阻害活性の試験例を説明する。即ち、上述の阻害活
性の測定法において、プロテアーゼの重量およびプロテ
アーゼ活性を種々変化させてＡＳＴアイソザイムの残存
活性を測定した。但し、５−ＡＳＴに代えてｍ’−ＡＳ
Ｔ（前記５−ＡＳＴの調製法の項の文献に準じてｍ製し
た）を使用した場合の試験も同時に実施した。ここにお
いて、プロテアーゼ活性とは、基質カゼインとプロテア
ーゼを３７℃、１０分間反応せしめた後、トリクロロ酢
酸可溶性画分にフォーリン試薬を加えて、生じた青色の
６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、そのＯＤ値を活性
単位として表したものである。結果は、第１図および第
２図に示すように、本発明のプロテアーゼは５−ＡＳＴ
は阻害するもののｍ−ＡｓＴは全く阻害しないことがわ
かる。
イム阻害活性の試験例を説明する。即ち、上述の阻害活
性の測定法において、プロテアーゼの重量およびプロテ
アーゼ活性を種々変化させてＡＳＴアイソザイムの残存
活性を測定した。但し、５−ＡＳＴに代えてｍ’−ＡＳ
Ｔ（前記５−ＡＳＴの調製法の項の文献に準じてｍ製し
た）を使用した場合の試験も同時に実施した。ここにお
いて、プロテアーゼ活性とは、基質カゼインとプロテア
ーゼを３７℃、１０分間反応せしめた後、トリクロロ酢
酸可溶性画分にフォーリン試薬を加えて、生じた青色の
６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、そのＯＤ値を活性
単位として表したものである。結果は、第１図および第
２図に示すように、本発明のプロテアーゼは５−ＡＳＴ
は阻害するもののｍ−ＡｓＴは全く阻害しないことがわ
かる。
以下実施例を以て本発明の詳細な説明する。
実施例１
グルコース１．０％、ポリペプトン１．０％、肉エキス
１．０％、塩化ナトリウム０．３％、アデカノール（消
泡剤、旭電化社商標） ０．０２％から成る組成の培地
（ｐＨ７，０）、１００ｎ＋ｆを５００ｍＱ容の坂ロフ
ラスコに入れ、ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲ
ネス魚’１７２２ （ＦＥＩＩＭ Ｐ−７３６２）の斜
面寒天培養株を１白金耳接種して、３０°Ｃで４０時間
往復振盪培養し種培養液とした。上記と同じ組成の培地
１８ｎを３０β容のジャーファーメンタ−に入れ、種培
養液を接種して、通気量９β／分、攪拌回転数３０゜ｒ
ｐｍ、内圧０ 、５ｋｇ ／ ｃｔ、温度２８℃で４０
時間培養した。
１．０％、塩化ナトリウム０．３％、アデカノール（消
泡剤、旭電化社商標） ０．０２％から成る組成の培地
（ｐＨ７，０）、１００ｎ＋ｆを５００ｍＱ容の坂ロフ
ラスコに入れ、ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲ
ネス魚’１７２２ （ＦＥＩＩＭ Ｐ−７３６２）の斜
面寒天培養株を１白金耳接種して、３０°Ｃで４０時間
往復振盪培養し種培養液とした。上記と同じ組成の培地
１８ｎを３０β容のジャーファーメンタ−に入れ、種培
養液を接種して、通気量９β／分、攪拌回転数３０゜ｒ
ｐｍ、内圧０ 、５ｋｇ ／ ｃｔ、温度２８℃で４０
時間培養した。
培養液をろ過して菌体を除き、得られたろ液に硫安を８
０％飽和となるように加え、−晩装置した。
０％飽和となるように加え、−晩装置した。
遠心分離により沈澱を集め、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
４，０）に溶解した後、セロファンチューブを用いて同
緩衝液に透析した。次に同じ緩衝液で平衡化したＳＰ−
セファデックス（、−５０（ファルマシア社製）カラム
（４，８ｃｍφｘ ２８ｃｍ Ｌ ）に吸着させた後、
０〜０．６Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配により溶出した
。０．２５〜０．３Ｍの塩化ナトリウムで溶出された活
性画分を集め、硫安を８０％飽和となるように加え、生
成した沈澱を遠心分離により集めた。
４，０）に溶解した後、セロファンチューブを用いて同
緩衝液に透析した。次に同じ緩衝液で平衡化したＳＰ−
セファデックス（、−５０（ファルマシア社製）カラム
（４，８ｃｍφｘ ２８ｃｍ Ｌ ）に吸着させた後、
０〜０．６Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配により溶出した
。０．２５〜０．３Ｍの塩化ナトリウムで溶出された活
性画分を集め、硫安を８０％飽和となるように加え、生
成した沈澱を遠心分離により集めた。
沈澱を４０ｍＭホウ酸−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ９
，７）に溶解して、同緩衝液に透析した後、同じ緩衝液
で平衡化したＤＥＡＥ−セファデックス＾−２５（ファ
ルマシア社製）カラム（２，０ｃｍφｘｌＱｃｍＬ）に
吸着させた。プロテアーゼはこの樹脂に弱い吸着能を示
すだけで、引続き同じ緩衝液を流すことにより溶出され
た。溶出液に硫安を８０％飽和となるように加えた後、
生成した沈澱を遠心分離により集めた。沈澱を４０ｍＭ
ホウ酸−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ９，７）に溶解し
て、同緩衝液に透析し、透析中に生した沈澱は遠心によ
り除いた後、得られた酵素液を低温で放置することによ
りプロテアーゼの結晶を析出させた。上記各精製のステ
ップにおけるＡＳＴアイソザイム阻害活性、蛋白量（２
８０重ｍにおける吸光度で表す）、比活性（阻害活性／
蛋白量）およびＡＳＴアイソザイム阻害活性の収率を第
２表に示す。
，７）に溶解して、同緩衝液に透析した後、同じ緩衝液
で平衡化したＤＥＡＥ−セファデックス＾−２５（ファ
ルマシア社製）カラム（２，０ｃｍφｘｌＱｃｍＬ）に
吸着させた。プロテアーゼはこの樹脂に弱い吸着能を示
すだけで、引続き同じ緩衝液を流すことにより溶出され
た。溶出液に硫安を８０％飽和となるように加えた後、
生成した沈澱を遠心分離により集めた。沈澱を４０ｍＭ
ホウ酸−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ９，７）に溶解し
て、同緩衝液に透析し、透析中に生した沈澱は遠心によ
り除いた後、得られた酵素液を低温で放置することによ
りプロテアーゼの結晶を析出させた。上記各精製のステ
ップにおけるＡＳＴアイソザイム阻害活性、蛋白量（２
８０重ｍにおける吸光度で表す）、比活性（阻害活性／
蛋白量）およびＡＳＴアイソザイム阻害活性の収率を第
２表に示す。
第２表
第１図は本発明のプロテアーゼの使用量（重量）とＡＳ
Ｔアイソザイム阻害活性の関係を表す図であり、第２図
は同じくプロテアーゼ活性とＡＳＴアイソザイム阻害活
性の関係を表す図である。 第 １ 図 ； ０．２ １ １０ １００ 重 風 （μｇ） 第 ２ 図 ０．００１ ０．０１ ０．１ １．０プロテアーゼ活
性（００１ 手続補正書く自発） ｌ８和５９年り月１１日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第４４９４号 ２、発明の名称 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソザイム
阻害活性を有するプロテアーゼの製造法３、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪府堺市堀上縁町２Ｔ−８−１２５、補正によ
り増加する発明の数 なし６、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄および発明の詳細な説明の
欄 ７、補正の内容 （１）明細書の特許請求の範囲の欄を別紙のとおり補正
する。 （２）明細書第８頁９行目にｒ寄８Ｌされている。」と
ある後に以下の記載を挿入する。 「なお本寄託菌株はブダペスト条約に基づく寄託に移管
され、受託番号ＦＥ［１Ｍ ＢＰ−６４６として同寄託
機関に寄託されている。」 （３）明細書箱１４頁３行目に’ ＦＥＲＭ Ｐ −７
３６２Ｊとあ。るをｒＦＩＥＲに ＢＰ６４６１と？１
（ｉ正する。 ２、特許請求の範囲 ■ ストレプトミセス属に属しアスパラギン酸アミノト
ランスフェラーゼアイソザイム阻害活性を有するプロテ
アーゼを生産する能力のある菌株を栄養培地に培養して
アスパラギン酸アミノトランスフエラーゼーセアイソザ
イム阻害活性を有するプロテアーゼを生成蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とするアスパラギン酸アミノ
トランスフェラーゼアイソザイム阻害活性を有するプロ
テアーゼの製造法。 ２ ストレプトミセス属に属する菌株がストレゾ１−ミ
セス・ビオラセオクロモゲネスである特許請求の範囲第
１項記載のアスパラギン酸アミノトランスフ厚ラーゼア
イソザイム阻害活性を有するプロテアーゼの製造法。 ３ ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネスがスト
レプトミセス・ビオラセオクロモゲネスＮｏ、 ９７２
２ （ＦＩＥＲＭ １３Ｐ −６４６）である特許請求
の範囲第２項記載のアスパラギン酸アミノトランスフェ
ラーゼアイソザイム阻害活性を有するプロテアーゼの製
造法。 受託番号変更届 昭和５９年１１月１９日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第４４９４号 ２、発明の名称 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソザイム
阻害活性を有するプロテアーゼの製造法３、手続きをす
る者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪府堺市堀上縁町２丁８−１２通産省工業技術
院微生物工業技術研究所５、旧受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−７３６２ ６、新寄託機関の名称 通産省工業技術院微生物工業技術研究所７、新受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６４６ ８、添付書類の目録 新受託番号を証明する書面 １通 手 続 補 正 １（自発） 昭和６０年２月２０日 特許庁長官 志 賀 学 殿 １、事件の表示 特 願 昭５９−４．４．９４ 号 ２発明の名称 アスパラギン酸アミントランスフェラーゼアイソザイム
阻害活性を有するプロテアーゼの製造法３、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 村 尾 澤 夫 ４代理人 東京都港区虎ノ門１−１−１２．虎ノ門ピル５０５号明
細書の特許請求の範囲及び憚１、明の詳細な説特願昭５
９−４，４９４号７手続補正書（１１明細書の特許請求
の範囲を別紙のように補正します。 （２） 明細書第４頁第４行の、「とじては」のあとに
。 「細胞質性の」を挿入します。 一以上一 特許請求の範囲 １ ストレプトミセス属に属し＃Ｉ胞質性のアスパラギ
ン酸アミントランスフェラーゼアイソザイム阻害活性を
有するプロテアーゼを生産する能力のある菌株を栄養培
地に培養して細胞質性のアスパラギン酸アミントランス
フェラーゼアイソザイム阻害活性を有するプロテアーゼ
を生成蓄積せしめ。 これを採取することを特徴とするアスパラギン酸アミノ
トランスフェラーゼアイソザイム阻害活性を有するプロ
テアーゼの製造法。 ２ ストレプトミセス属に属する菌株がストレプトミセ
ス・ビオラセオクロモゲネスである特許請求のね四第１
項記載のアスパラギン酸アミノトランスフエラーゼアイ
ンザイム阻害活性を有するプロテアーゼの製造法。 ３ ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネスがスト
レプトミセス・ビオラセオクロモゲネスＮα９７２２
（ｌｉ’ｌ引（八・＋ｕｐ−６４６）である育寺許言青
求の範囲第２項記載のアスパラギン酸アミノトランスフ
エラーゼアイソサイム阻害活性を有するプロテアーゼの
製造法。
Ｔアイソザイム阻害活性の関係を表す図であり、第２図
は同じくプロテアーゼ活性とＡＳＴアイソザイム阻害活
性の関係を表す図である。 第 １ 図 ； ０．２ １ １０ １００ 重 風 （μｇ） 第 ２ 図 ０．００１ ０．０１ ０．１ １．０プロテアーゼ活
性（００１ 手続補正書く自発） ｌ８和５９年り月１１日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第４４９４号 ２、発明の名称 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソザイム
阻害活性を有するプロテアーゼの製造法３、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪府堺市堀上縁町２Ｔ−８−１２５、補正によ
り増加する発明の数 なし６、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄および発明の詳細な説明の
欄 ７、補正の内容 （１）明細書の特許請求の範囲の欄を別紙のとおり補正
する。 （２）明細書第８頁９行目にｒ寄８Ｌされている。」と
ある後に以下の記載を挿入する。 「なお本寄託菌株はブダペスト条約に基づく寄託に移管
され、受託番号ＦＥ［１Ｍ ＢＰ−６４６として同寄託
機関に寄託されている。」 （３）明細書箱１４頁３行目に’ ＦＥＲＭ Ｐ −７
３６２Ｊとあ。るをｒＦＩＥＲに ＢＰ６４６１と？１
（ｉ正する。 ２、特許請求の範囲 ■ ストレプトミセス属に属しアスパラギン酸アミノト
ランスフェラーゼアイソザイム阻害活性を有するプロテ
アーゼを生産する能力のある菌株を栄養培地に培養して
アスパラギン酸アミノトランスフエラーゼーセアイソザ
イム阻害活性を有するプロテアーゼを生成蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とするアスパラギン酸アミノ
トランスフェラーゼアイソザイム阻害活性を有するプロ
テアーゼの製造法。 ２ ストレプトミセス属に属する菌株がストレゾ１−ミ
セス・ビオラセオクロモゲネスである特許請求の範囲第
１項記載のアスパラギン酸アミノトランスフ厚ラーゼア
イソザイム阻害活性を有するプロテアーゼの製造法。 ３ ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネスがスト
レプトミセス・ビオラセオクロモゲネスＮｏ、 ９７２
２ （ＦＩＥＲＭ １３Ｐ −６４６）である特許請求
の範囲第２項記載のアスパラギン酸アミノトランスフェ
ラーゼアイソザイム阻害活性を有するプロテアーゼの製
造法。 受託番号変更届 昭和５９年１１月１９日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第４４９４号 ２、発明の名称 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソザイム
阻害活性を有するプロテアーゼの製造法３、手続きをす
る者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪府堺市堀上縁町２丁８−１２通産省工業技術
院微生物工業技術研究所５、旧受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−７３６２ ６、新寄託機関の名称 通産省工業技術院微生物工業技術研究所７、新受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６４６ ８、添付書類の目録 新受託番号を証明する書面 １通 手 続 補 正 １（自発） 昭和６０年２月２０日 特許庁長官 志 賀 学 殿 １、事件の表示 特 願 昭５９−４．４．９４ 号 ２発明の名称 アスパラギン酸アミントランスフェラーゼアイソザイム
阻害活性を有するプロテアーゼの製造法３、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 村 尾 澤 夫 ４代理人 東京都港区虎ノ門１−１−１２．虎ノ門ピル５０５号明
細書の特許請求の範囲及び憚１、明の詳細な説特願昭５
９−４，４９４号７手続補正書（１１明細書の特許請求
の範囲を別紙のように補正します。 （２） 明細書第４頁第４行の、「とじては」のあとに
。 「細胞質性の」を挿入します。 一以上一 特許請求の範囲 １ ストレプトミセス属に属し＃Ｉ胞質性のアスパラギ
ン酸アミントランスフェラーゼアイソザイム阻害活性を
有するプロテアーゼを生産する能力のある菌株を栄養培
地に培養して細胞質性のアスパラギン酸アミントランス
フェラーゼアイソザイム阻害活性を有するプロテアーゼ
を生成蓄積せしめ。 これを採取することを特徴とするアスパラギン酸アミノ
トランスフェラーゼアイソザイム阻害活性を有するプロ
テアーゼの製造法。 ２ ストレプトミセス属に属する菌株がストレプトミセ
ス・ビオラセオクロモゲネスである特許請求のね四第１
項記載のアスパラギン酸アミノトランスフエラーゼアイ
ンザイム阻害活性を有するプロテアーゼの製造法。 ３ ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネスがスト
レプトミセス・ビオラセオクロモゲネスＮα９７２２
（ｌｉ’ｌ引（八・＋ｕｐ−６４６）である育寺許言青
求の範囲第２項記載のアスパラギン酸アミノトランスフ
エラーゼアイソサイム阻害活性を有するプロテアーゼの
製造法。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ストレプトミセス属に属しアスパラギン酸アミント
ランスフェラーゼアイソザイム阻害活性を有するプロテ
アーゼを生産する能力のある菌株を栄養培地に培養して
アスパラギン酸アミノトランスフエラーゼーゼアイソザ
イム阻害活性を有するプロテアーゼを生成Ｎ８せしめ、
これを採取することを特徴とするアスパラギン酸アミノ
トランスフェラーゼアイソザイム阻害活性を有するプロ
テアーゼの製造法。 ２ ストレプトミセス属に属する菌株がストレプトミセ
ス・ビオラセオクロモゲネスである特許請求の範囲第１
項記載のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイ
ソザイム阻害活性を有スるプロテアーゼの製造法。 ３ ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネスがスト
レプトミセス・ビオラセオクロモゲネスＴｈ９７２２（
微工研菌寄第７３６２号）である特許請求の範囲第２項
記載のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソ
ザイム阻害活性を有するプロテアーゼの製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59004494A JPS60149382A (ja) | 1984-01-12 | 1984-01-12 | アスパラギン酸アミノトランスフエラ−ゼアイソザイム阻害活性を有するプロテア−ゼの製造法 |
| US06/688,251 US4732857A (en) | 1984-01-12 | 1985-01-02 | Process for producing enzyme capable of inactivating cytosolic aspartate aminotransferase isozyme |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59004494A JPS60149382A (ja) | 1984-01-12 | 1984-01-12 | アスパラギン酸アミノトランスフエラ−ゼアイソザイム阻害活性を有するプロテア−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60149382A true JPS60149382A (ja) | 1985-08-06 |
| JPH0516831B2 JPH0516831B2 (ja) | 1993-03-05 |
Family
ID=11585625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59004494A Granted JPS60149382A (ja) | 1984-01-12 | 1984-01-12 | アスパラギン酸アミノトランスフエラ−ゼアイソザイム阻害活性を有するプロテア−ゼの製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4732857A (ja) |
| JP (1) | JPS60149382A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110018305B (zh) * | 2019-05-12 | 2020-12-08 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒及应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1171257B (it) * | 1981-05-28 | 1987-06-10 | Biodata Spa | Metodo per la determinazione della attivita' degli isoenzimi citoplasmatico e mitocondriale della glutammico ossalacetico transaminasi nel siero o plasma umano |
-
1984
- 1984-01-12 JP JP59004494A patent/JPS60149382A/ja active Granted
-
1985
- 1985-01-02 US US06/688,251 patent/US4732857A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0516831B2 (ja) | 1993-03-05 |
| US4732857A (en) | 1988-03-22 |
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