JP2799621B2 - ホスホリパーゼｄの製造法 - Google Patents
ホスホリパーゼｄの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、水中または各種有機溶媒を含有する反応系
において高いホスファチジル基転移活性を有するホスホ
リパーゼＤの製造法に関するものである。
において高いホスファチジル基転移活性を有するホスホ
リパーゼＤの製造法に関するものである。
ホスホリパーゼＤは、大豆や卵黄等に含まれるホスフ
ァチジルコリンやホスファチジルエタノールアミン等の
リン脂質と各種アルコール性水酸基を有する化合物か
ら、乳化剤、分散剤、農薬、医薬、工業用試薬等に有用
な、リン脂質誘導体を製造するのに使われる。また血清
中に含まれるリン脂質の定量用試薬にも利用される。
ァチジルコリンやホスファチジルエタノールアミン等の
リン脂質と各種アルコール性水酸基を有する化合物か
ら、乳化剤、分散剤、農薬、医薬、工業用試薬等に有用
な、リン脂質誘導体を製造するのに使われる。また血清
中に含まれるリン脂質の定量用試薬にも利用される。
従来の技術 ホスホリパーゼＤ（EC3.1.4.4）は、グリセロリン脂
質のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加
水分解してホスファチジン酸および塩基を遊離される酵
素であるが、その起源によって加水分解反応以外に、グ
リセロース、セリン、エタノーロ等のアルコール性水酸
基を有する化合物の共存下でグリセロリン脂質のホスフ
ァチジル基を上記アルコール性水酸基を有する化合物に
転移させ、新たなリン酸エステルを生成する反応（ホス
ファチジル基転移反応）を生起させる。
質のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加
水分解してホスファチジン酸および塩基を遊離される酵
素であるが、その起源によって加水分解反応以外に、グ
リセロース、セリン、エタノーロ等のアルコール性水酸
基を有する化合物の共存下でグリセロリン脂質のホスフ
ァチジル基を上記アルコール性水酸基を有する化合物に
転移させ、新たなリン酸エステルを生成する反応（ホス
ファチジル基転移反応）を生起させる。
この酵素は、キャベツ、ニンジン、ホウレンソウ、綿
実等の植物体からの抽出あるいはストレプトマイセス
属、ミクロノスポラ属、ノルカディオプシス属、アクチ
ノマデューラ属、ノカルディア属等の微生物を用いた発
酵法により製造できる（特公昭52−39918号、特公昭58
−52633号、特開昭58−63388号、特開昭58−67183号、
特開昭60−164483号）。また市販品では、植物起源のも
のとしてキャベツ、ピーナッツ、微生物起源のものとし
てStreptomyces chromofuscus等がある。
実等の植物体からの抽出あるいはストレプトマイセス
属、ミクロノスポラ属、ノルカディオプシス属、アクチ
ノマデューラ属、ノカルディア属等の微生物を用いた発
酵法により製造できる（特公昭52−39918号、特公昭58
−52633号、特開昭58−63388号、特開昭58−67183号、
特開昭60−164483号）。また市販品では、植物起源のも
のとしてキャベツ、ピーナッツ、微生物起源のものとし
てStreptomyces chromofuscus等がある。
しかしながら、これら従来の製造法により得られるホ
スホリパーゼＤはホスファチジル基転移活性が低く、ま
た加水分解反応も速やかに進行し、ホスファチジン酸が
生成するため、効率よく転移反応を行わせることができ
ないという問題点があった。
スホリパーゼＤはホスファチジル基転移活性が低く、ま
た加水分解反応も速やかに進行し、ホスファチジン酸が
生成するため、効率よく転移反応を行わせることができ
ないという問題点があった。
最近、ホスホリパーゼＤは微生物利用製造法で、酵素
の安定性、生産性などに関しては改良が試みられている
例もあるが、高いホスファチジル基転移活性を有するホ
スホリパーゼＤの製造法の開発については未だ満足でき
るものが無いのが現状である。
の安定性、生産性などに関しては改良が試みられている
例もあるが、高いホスファチジル基転移活性を有するホ
スホリパーゼＤの製造法の開発については未だ満足でき
るものが無いのが現状である。
発明が解決しようとする問題点 本発明は、ホスファチジル基転移活性を有する従来の
ホスホリパーゼＤが上述のような欠点を持つことに鑑
み、高いホスファチジル基転移活性を示し、反応生成物
中にホスファチジン酸が全く無いかあるいは簡単な精製
操作で除去できる程度しか生成しないホスホリパーゼＤ
の効率良い製造法を提供しようとするものである。
ホスホリパーゼＤが上述のような欠点を持つことに鑑
み、高いホスファチジル基転移活性を示し、反応生成物
中にホスファチジン酸が全く無いかあるいは簡単な精製
操作で除去できる程度しか生成しないホスホリパーゼＤ
の効率良い製造法を提供しようとするものである。
問題を解決するための手段 本発明者らは、自然界中の土壌より広く微生物を分離
し、多数のホスホリパーゼＤ生産菌を得た。更に、それ
らの生産するホスホリパーゼＤについて精査し、高いホ
スファチジル基転移活性を示すホスホリパーゼＤを生産
する菌株を探索した。その結果、神奈川県横浜市で採取
した土壌から分離されたストレプトマイセス属に属する
菌株（ストレプトマイセス属Ｄ−121株と称する）がす
ぐれた性能を有することを知り本発明を完成するに至っ
た。
し、多数のホスホリパーゼＤ生産菌を得た。更に、それ
らの生産するホスホリパーゼＤについて精査し、高いホ
スファチジル基転移活性を示すホスホリパーゼＤを生産
する菌株を探索した。その結果、神奈川県横浜市で採取
した土壌から分離されたストレプトマイセス属に属する
菌株（ストレプトマイセス属Ｄ−121株と称する）がす
ぐれた性能を有することを知り本発明を完成するに至っ
た。
すなわち本発明は上記ストレプトマイセス属Ｄ−121
株を用いるホスホリパーゼＤの製造法およびそれにより
得られる高いホスファチジル基転移活性を有するホスホ
リパーゼＤの製造方法を提供するものである。
株を用いるホスホリパーゼＤの製造法およびそれにより
得られる高いホスファチジル基転移活性を有するホスホ
リパーゼＤの製造方法を提供するものである。
本発明の製造において使われるストレプトマイセス属
Ｄ−121株は、次のような菌学的性質を示す。
Ｄ−121株は、次のような菌学的性質を示す。
細胞壁成分 a.アミノ酸:LL−ジアミノピメリン酸を含有する。
b.脂肪酸組成：イソＣ15:0、アンテイソＣ15:0、イソＣ
17:0、アンテイソＣ17:0が主である。
17:0、アンテイソＣ17:0が主である。
ミコール酸の生成：なし 胞子鎖（spore chain）の形態：直鎖状が主であ
る。
る。
色調 a.気菌糸：灰色 b.基生菌糸：赤／オレンジ c.可溶性色素の生産：なし 窒素源の利用性： DL−α−アミノ−酪酸 − Ｌ−フェニルアラニン ＋ Ｌ−システィン − Ｌ−ヒスチジン ＋ Ｌ−バリン − Ｌ−ヒドロキシプロリン ＋ 炭素源の利用性： スクロール − ラフィノース ＋ アドニトール − マンニトール ＋ キシリトール − Ｌ−ラムノース − メソ−イノシトール ＋ 各種物質に対する性質： キサンチン 分解する アルブチン 分解する ペクチン 分解しない エラスチン 分解しない 脂肪分解活性 あり レシチナーゼ活性 あり 硝酸の還元 なし 硫化水素の生成 なし 生育阻害： 45℃培養 ＋ アジ化ナトリウム（0.01％W/V） ± NaCl（７％W/V） ＋ フェノール（0.1％W/V） − ネオマイシン（50μg/ml） ＋ リファンピシリン（50μg/ml） − オレアンドマイシン（100μg/ml） ＋ ペニシリンＧ（10i.u.） − 他の微生物に対する抗生： Bacillus subtilis NCIB 3610 ＋ Micrococcus luteus NCIB 169 − Candida albicans CBS 562 ＋ Saccharomyces cerevisvae CBS 1171 ＋ Streptomyces murinus ISP 5091 − Aspergillus niger LIV 131 ＋ この菌株がストレプトマイセス属に属することは、上
述の性質をBergey's Manual第８版、第657〜659頁、Pro
ceedings of the 1st International Conference on Cu
ltere Collections、第457〜475頁等の各記載と照合す
ることにより確認された。また、上述〜の性質はS.
T.Williamsらの数値分類法［J.Gen.Microbiol.129,1815
（1983）］に従い試験したが、その結果によればWillco
x probability 0.999でストレプトマイセス・リディカ
ス（streptomyces lydicus）に分類されるものである。
述の性質をBergey's Manual第８版、第657〜659頁、Pro
ceedings of the 1st International Conference on Cu
ltere Collections、第457〜475頁等の各記載と照合す
ることにより確認された。また、上述〜の性質はS.
T.Williamsらの数値分類法［J.Gen.Microbiol.129,1815
（1983）］に従い試験したが、その結果によればWillco
x probability 0.999でストレプトマイセス・リディカ
ス（streptomyces lydicus）に分類されるものである。
ストレプトマイセス属Ｄ−121株は、工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託されており、その寄託番号は、
11423号である。
物工業技術研究所に寄託されており、その寄託番号は、
11423号である。
本発明のホスホリパーゼＤを製造するための上記スト
レプトマイセス属Ｄ−121株の培養は放線菌一般の培養
に通常採用される方法に従って行うことができる。すな
わち、培地には炭素源として、例えばブドウ等，果糖，
デンプン，糖蜜，グリセリン等を単独で、または組み合
わせて適宜用いることができる。また窒素源として、例
えば硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，尿素，ペプ
トン，肉エキス，酵母エキス，コーンスチープリカー，
脱脂大豆粉，大豆蛋白等を用いることができる。培地に
は、ほかにリン酸，マグネシウム，カリウム，鉄，アル
ミニウム，カルシウム等の塩類や、各種ビタミン類，消
泡剤等、菌の生育やホスホリパーゼＤの生産促進に有効
な物質を適宜添加することができる。好ましい培地pHは
５〜８で、特に好ましくは６〜８である。培養法として
は通常液体培養で行うが、工業的には深部撹拌通気培養
で行うのが有利である。培養温度は、菌が生育し、ホス
ホリパーゼＤを生産する温度範囲で適宜変更できるが、
特に好ましいのは25〜35℃である。培養時間は条件によ
り異なるが、ホスホリパーゼＤの生産が最大になるまで
培養すればよい。液体培養では通常１〜５日程度であ
る。
レプトマイセス属Ｄ−121株の培養は放線菌一般の培養
に通常採用される方法に従って行うことができる。すな
わち、培地には炭素源として、例えばブドウ等，果糖，
デンプン，糖蜜，グリセリン等を単独で、または組み合
わせて適宜用いることができる。また窒素源として、例
えば硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，尿素，ペプ
トン，肉エキス，酵母エキス，コーンスチープリカー，
脱脂大豆粉，大豆蛋白等を用いることができる。培地に
は、ほかにリン酸，マグネシウム，カリウム，鉄，アル
ミニウム，カルシウム等の塩類や、各種ビタミン類，消
泡剤等、菌の生育やホスホリパーゼＤの生産促進に有効
な物質を適宜添加することができる。好ましい培地pHは
５〜８で、特に好ましくは６〜８である。培養法として
は通常液体培養で行うが、工業的には深部撹拌通気培養
で行うのが有利である。培養温度は、菌が生育し、ホス
ホリパーゼＤを生産する温度範囲で適宜変更できるが、
特に好ましいのは25〜35℃である。培養時間は条件によ
り異なるが、ホスホリパーゼＤの生産が最大になるまで
培養すればよい。液体培養では通常１〜５日程度であ
る。
培養物中に生成したホスホリパーゼＤは、液体培養で
は主として培養液中に存在するので培養終了液から固形
物を濾別し、ホスホリパーゼＤを採取する。
は主として培養液中に存在するので培養終了液から固形
物を濾別し、ホスホリパーゼＤを採取する。
濾液からさらにホスホリパーゼＤを濃縮するにあたっ
ては、各種酵素の分離精製に通常採用される方法を適宜
組み合わせて使用できる。例えば、塩析、有機溶媒沈
殿、透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、
吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過、凍結乾燥、等電点
電気泳動等の方法を、後述する本発明のホスホリパーゼ
Ｄの理化学的性質を考慮した条件下で採用すればよい。
ては、各種酵素の分離精製に通常採用される方法を適宜
組み合わせて使用できる。例えば、塩析、有機溶媒沈
殿、透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、
吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過、凍結乾燥、等電点
電気泳動等の方法を、後述する本発明のホスホリパーゼ
Ｄの理化学的性質を考慮した条件下で採用すればよい。
ストレプトマイセス属Ｄ−121株の生産する本発明の
ホスホリパーゼＤは、次のような理化学的性質を有する
ものである。
ホスホリパーゼＤは、次のような理化学的性質を有する
ものである。
（ａ）作用 加水分解反応 下記一般式［Ｉ］ （但し、式中R1,R2はアシル基またはアルキル基、Ｘは
水酸基を含有する塩基の水酸基１個を除いた後に残る有
機基を示す）で表されるリン脂質を加水分解し、ホスフ
ァチジン酸と塩基とを遊離させる。
水酸基を含有する塩基の水酸基１個を除いた後に残る有
機基を示す）で表されるリン脂質を加水分解し、ホスフ
ァチジン酸と塩基とを遊離させる。
ホスファチジル基転移反応 上記一般式［Ｉ］で表されるリン脂質のホスファチジ
ル基を下記一般式［II］ R3−OH ………［II］ （但し、R3はアルコール性水酸基に結合した有機基を示
す）で表されるグリセロール、セリン、エタノール等の
アルコール性水酸基を有する化合物の共存下、アルコー
ル性水酸基にホスファチジル基を転移させ、 下記一般式［III］ （但し、R1,R2,R3は前記と同様の基を示す）で表される
リン脂質誘導体を生成する。
ル基を下記一般式［II］ R3−OH ………［II］ （但し、R3はアルコール性水酸基に結合した有機基を示
す）で表されるグリセロール、セリン、エタノール等の
アルコール性水酸基を有する化合物の共存下、アルコー
ル性水酸基にホスファチジル基を転移させ、 下記一般式［III］ （但し、R1,R2,R3は前記と同様の基を示す）で表される
リン脂質誘導体を生成する。
（ｂ）基質特異性 ホスファチジルコリンに対する加水分解活性を100と
した場合の相対活性は、リゾホスファチジルコリンに対
し1.5、スフィンゴミエリンに対しては0.8である。
した場合の相対活性は、リゾホスファチジルコリンに対
し1.5、スフィンゴミエリンに対しては0.8である。
（ｃ）至適pH:約6.0 （ｄ）pH安定性:pH4〜８で安定 （ｅ）至適温度：約55℃ （ｆ）熱安定性 pH6.0において60℃、30分間の熱処理で全く失活せ
ず、70℃、30分間でも約50％の活性が残存する。
ず、70℃、30分間でも約50％の活性が残存する。
（ｇ）種々の物質の影響 濃度1mMの種々の物質を共存させた場合、加水分解活
性は塩化セチルピリジニウムのとき約40％阻害される
が、CaCl2,FeCl3,FeSO4,BaCl2,MnCl2,MgCl2,CuCl2,ZnCl
2,SnCl2,AlCl3,CoCl2,CdCl2,LiCl,KCl,NiCl,コール酸ナ
トリウム，デオキシコール酸ナトリウム，エチレンジア
ミン四酢酸・二ナトリウムのときは阻害されない。
性は塩化セチルピリジニウムのとき約40％阻害される
が、CaCl2,FeCl3,FeSO4,BaCl2,MnCl2,MgCl2,CuCl2,ZnCl
2,SnCl2,AlCl3,CoCl2,CdCl2,LiCl,KCl,NiCl,コール酸ナ
トリウム，デオキシコール酸ナトリウム，エチレンジア
ミン四酢酸・二ナトリウムのときは阻害されない。
（ｈ）分子量 5.6万（SDS・PAGE法による）。
（ｉ）等電点 pH7.4〜7.5（等電点電気泳動法による）。
なお、ホスホリパーゼＤの酵素活性は基質であるリン
脂質に作用してリン酸と塩基との間のエステル結合を分
解したときに生じる塩基を定量することによって求め
る。この明細書に記載した酵素活性は、ホスファチジル
コリンを基質として用いる下記の方法により測定された
ものであって、１分間に１μmolのコリンを遊離する酵
素活性を１ユニット（Ｕ）としている。
脂質に作用してリン酸と塩基との間のエステル結合を分
解したときに生じる塩基を定量することによって求め
る。この明細書に記載した酵素活性は、ホスファチジル
コリンを基質として用いる下記の方法により測定された
ものであって、１分間に１μmolのコリンを遊離する酵
素活性を１ユニット（Ｕ）としている。
［ホスファチジルコリン分解活性測定法］ ホスファチジルコリン0.5gに対してジエチルエーテル
1ml、蒸留水10mlを添加し、超音波処理によって得られ
たエマルジョン100μｌと、0.1M塩化カルシウム溶液50
μｌ、0.1Mトリス−マレイン酸−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH5.5）100μｌ、7.5％W/VトリトンＸ−100水溶液1
50μｌとの混合液に酵素溶液100μｌを加え、37℃で10
分間反応させる。その後、0.05Mエチレンジアミン四酢
酸・二ナトリウムを含む1.0Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.
0）200μｌを添加し、直ちに100℃で５分間煮沸して完
全に反応を停止させる。室温まで冷却した後、コリン測
定用試薬（コリンオキシダーゼ100U、パーオキシダーゼ
100U、４−アミノアンチピリン50mg、フェノール25mg、
トリトンＸ−100 500mgをpH8.0の0.01Mトリス−塩酸緩
衝液100mlに溶解したもの）4mlを添加し、37℃で20分間
反応させた後、あらかじめ熱失活させた酵素を用いて同
様に反応させたものを対照とし、500nmの吸光度を測定
する。
1ml、蒸留水10mlを添加し、超音波処理によって得られ
たエマルジョン100μｌと、0.1M塩化カルシウム溶液50
μｌ、0.1Mトリス−マレイン酸−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH5.5）100μｌ、7.5％W/VトリトンＸ−100水溶液1
50μｌとの混合液に酵素溶液100μｌを加え、37℃で10
分間反応させる。その後、0.05Mエチレンジアミン四酢
酸・二ナトリウムを含む1.0Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.
0）200μｌを添加し、直ちに100℃で５分間煮沸して完
全に反応を停止させる。室温まで冷却した後、コリン測
定用試薬（コリンオキシダーゼ100U、パーオキシダーゼ
100U、４−アミノアンチピリン50mg、フェノール25mg、
トリトンＸ−100 500mgをpH8.0の0.01Mトリス−塩酸緩
衝液100mlに溶解したもの）4mlを添加し、37℃で20分間
反応させた後、あらかじめ熱失活させた酵素を用いて同
様に反応させたものを対照とし、500nmの吸光度を測定
する。
実 施 例 次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、
本発明はこれによって制限されるものではない。
本発明はこれによって制限されるものではない。
実施例 １ 培地として、ブドウ等0.5％、酵母エキス0.5％、コー
ンスチープリカー溶液（10％W/Vコーンスチープリカー
懸濁液をpH7.0に調整し不純物を濾別したもの）20％を
含むpH7.0のものを用意し、その100mlを500ml容の坂口
フラスコに入れ、上記滅菌後Ｄ−121株の前培養液5mlを
植菌し、30℃で３日間振とう培養した。
ンスチープリカー溶液（10％W/Vコーンスチープリカー
懸濁液をpH7.0に調整し不純物を濾別したもの）20％を
含むpH7.0のものを用意し、その100mlを500ml容の坂口
フラスコに入れ、上記滅菌後Ｄ−121株の前培養液5mlを
植菌し、30℃で３日間振とう培養した。
培養終了後菌体を濾別し、酵素活性が9.8U/mlの培養
濾液100mlを得た。これを蒸留水で２倍に希釈し、酢酸
でpH4.0とし、陽イオン交換体CM−トヨパール650M［東
ソー（株）製］を加えて撹拌することによりホスホリパ
ーゼＤをCM−トヨパールに吸着させた。CM−トヨパール
を回収し、0.3M NaClを含む0.01M酢酸緩衝液（pH4.0）
により活性画分を溶出し、凍結乾燥して茶褐色のホスホ
リパーゼD47mg、617Uを得た。培養濾液からのホスホリ
パーゼＤの活性回収率は63％であった。
濾液100mlを得た。これを蒸留水で２倍に希釈し、酢酸
でpH4.0とし、陽イオン交換体CM−トヨパール650M［東
ソー（株）製］を加えて撹拌することによりホスホリパ
ーゼＤをCM−トヨパールに吸着させた。CM−トヨパール
を回収し、0.3M NaClを含む0.01M酢酸緩衝液（pH4.0）
により活性画分を溶出し、凍結乾燥して茶褐色のホスホ
リパーゼD47mg、617Uを得た。培養濾液からのホスホリ
パーゼＤの活性回収率は63％であった。
実施例 ２ 実施例１で用いた倍地51で、実施例１と同様の操作を
経てCM−トヨパールから活性画分を溶出した。
経てCM−トヨパールから活性画分を溶出した。
この溶出液に10％飽和となるように硫酸アンモニウム
を加え、同じく10％飽和とした0.01M酢酸緩衝液（pH4.
0）で平衡化した疎水性クロマト用担体ブチル−トヨパ
ール650M［東ソー（株）製］のカラムに通液し、ホスホ
リパーゼＤを吸着させた。
を加え、同じく10％飽和とした0.01M酢酸緩衝液（pH4.
0）で平衡化した疎水性クロマト用担体ブチル−トヨパ
ール650M［東ソー（株）製］のカラムに通液し、ホスホ
リパーゼＤを吸着させた。
0.01Mリン酸緩衝液（pH6.8）で活性画分を溶出し、限
外濾過膜（10 PM10）［アミコン社製］により同緩衝液
に置換した。次に、同緩衝液で平衡化した陰イオン交換
体DEAE−トヨパール650M［東ソー（株）製］のカラムに
通し、非吸着部を回収した。これを、同緩衝液で平衡化
したハイドロキシアパタイトHA−ウルトロゲル［ファル
マシア・ファインケミカルス社製］のカルムに通し、0.
05Mリン酸緩衝液（pH6.8）で活性画分を溶出した。
外濾過膜（10 PM10）［アミコン社製］により同緩衝液
に置換した。次に、同緩衝液で平衡化した陰イオン交換
体DEAE−トヨパール650M［東ソー（株）製］のカラムに
通し、非吸着部を回収した。これを、同緩衝液で平衡化
したハイドロキシアパタイトHA−ウルトロゲル［ファル
マシア・ファインケミカルス社製］のカルムに通し、0.
05Mリン酸緩衝液（pH6.8）で活性画分を溶出した。
この溶出液を0.025Mイミダゾール−酢酸緩衝液（pH7.
4）に置換後、ポリブッファ交換体PBETM94［ファルマシ
ア・ファインケミカルス社製］のカラムに通し、同社製
ポリバッファ（pH6.0）を用いpH勾配により溶出した。
4）に置換後、ポリブッファ交換体PBETM94［ファルマシ
ア・ファインケミカルス社製］のカラムに通し、同社製
ポリバッファ（pH6.0）を用いpH勾配により溶出した。
さらに活性画分をゲル濾過用担体トヨパールHW−55F
［東ソー（株）製］のカラムに通し、活性画分を回収し
た。
［東ソー（株）製］のカラムに通し、活性画分を回収し
た。
かくしてSDS電気泳動で単一なホスホリパーゼD1150U
を得た。上記精製操作におけるホスホリパーゼＤの活性
回収率は約５％で、得られた精製品の比活性は958U/mg
タンパクであった。
を得た。上記精製操作におけるホスホリパーゼＤの活性
回収率は約５％で、得られた精製品の比活性は958U/mg
タンパクであった。
次に、精製品について下記のような理化学的性質の試
験を行った。
験を行った。
至適pH 前述の酵素活性測定法における緩衝液を、他の種々の
緩衝液にかえて酵素活性を測定することにより、本酵素
のpH依存性を調べた。その結果は第１図のとおりであ
り、至適pHは6.0付近にある。
緩衝液にかえて酵素活性を測定することにより、本酵素
のpH依存性を調べた。その結果は第１図のとおりであ
り、至適pHは6.0付近にある。
pH安定性 本酵素を0.1M濃度の種々pHの緩衝液に溶解し、37℃で
２時間静置した。その後、各pHの試料に対して20倍容の
0.1トリス−マレイン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
5.6）を加え、酵素活性を測定した。結果は第２図のと
おりであり、本酵素はpH4〜８で安定であることがわか
る。
２時間静置した。その後、各pHの試料に対して20倍容の
0.1トリス−マレイン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
5.6）を加え、酵素活性を測定した。結果は第２図のと
おりであり、本酵素はpH4〜８で安定であることがわか
る。
至適温度 前述の酵素活性測定法における酵素反応の温度を種々
に変更して酵素活性を測定することにより、本酵素の温
度依存性を調べた。その結果は第３図のとうりであり、
至適温度は55℃付近にある。
に変更して酵素活性を測定することにより、本酵素の温
度依存性を調べた。その結果は第３図のとうりであり、
至適温度は55℃付近にある。
熱安定性 本酵素を0.05Mクエン酸緩衝液（pH6.0）中で、25〜75
℃で30分間静置した後、共存する酵素活性を測定した。
その結果は第４図のとうりであり、55℃まで安定である
ことがわかる。
℃で30分間静置した後、共存する酵素活性を測定した。
その結果は第４図のとうりであり、55℃まで安定である
ことがわかる。
種々の物質の影響 前述の酵素活性測定法において、塩化カルシウム溶液
を他の金属塩等の各種の水溶液にかえて、酵素反応系中
の物質濃度が1mMになるようにして、酵素活性を測定し
た。各種物質無添加のときの活性と比較すると、CaCl2,
FeCl3,FeSO4,BaCl2,MnCl2,MgCl2,CuCl2,ZnCl2,SnCl2,Al
Cl3,CoCl2,CdCl2,LiCl,KCl,NaCl,コール酸ナトリムウ，
デオキシコール酸ナトリウム，エチレンジアミン四酢酸
・二ナトリウムでは、活性の変化は認められなかった。
塩化セチルピリジニウムでは、約40％の活性が阻害され
た。
を他の金属塩等の各種の水溶液にかえて、酵素反応系中
の物質濃度が1mMになるようにして、酵素活性を測定し
た。各種物質無添加のときの活性と比較すると、CaCl2,
FeCl3,FeSO4,BaCl2,MnCl2,MgCl2,CuCl2,ZnCl2,SnCl2,Al
Cl3,CoCl2,CdCl2,LiCl,KCl,NaCl,コール酸ナトリムウ，
デオキシコール酸ナトリウム，エチレンジアミン四酢酸
・二ナトリウムでは、活性の変化は認められなかった。
塩化セチルピリジニウムでは、約40％の活性が阻害され
た。
分子量 濃縮ゲル4.5％Ｔ、分離ゲル10％ＴのSDS−ポリアクリ
ルアミドで電気泳動をおこなった。分子量マーカーとし
てAlbumin（bovine）,Catalase,Ovalbumin,Glyceraldeh
yde−３−phosphate dehydrogenase,Lactete dehydro−
genaseも同時に泳動し、Coomssie Brilliant Blue G−2
5により染色した。各分子量マーカーの移動度と分子量
の関係から算出した結果、本酵素の分子量は5.6万であ
った。
ルアミドで電気泳動をおこなった。分子量マーカーとし
てAlbumin（bovine）,Catalase,Ovalbumin,Glyceraldeh
yde−３−phosphate dehydrogenase,Lactete dehydro−
genaseも同時に泳動し、Coomssie Brilliant Blue G−2
5により染色した。各分子量マーカーの移動度と分子量
の関係から算出した結果、本酵素の分子量は5.6万であ
った。
等電点 本酵素を、『蛋白質・酵素の基礎実験法』（南江堂）
III.3.7に従いゲル等電点電気泳動にかけ泳動終了後デ
ィスクを等間隔に切断し、得られた切片の蒸留水による
抽出液について、pHおよび酵素活性を測定した。その結
果、本酵素の等電点はpH7.4〜7.5であった。
III.3.7に従いゲル等電点電気泳動にかけ泳動終了後デ
ィスクを等間隔に切断し、得られた切片の蒸留水による
抽出液について、pHおよび酵素活性を測定した。その結
果、本酵素の等電点はpH7.4〜7.5であった。
実施例 ３ 大豆製ホスファチジルエタノールアミン2.5mg、ジエ
チルエーテル170μｌ、グリセロール79mg、1M CaCl26.8
μｌ、0.8M酢酸緩衝液（pH5.6）17μｌ、実施例１で得
たホスホリパーゼＤ 1Uを含む0.1％牛血清アルブミン
（BSA）溶液83.5μｌを混合し、室温で撹拌しながら12
時間反応した。ジエチルエーテル：エタノール（3:2）2
10μｌを添加してよく混合し、上層中のリン脂質組成を
日本油化学協会編基準油脂分析試験法2.2.8.4a−86に従
い分析した。その結果は第１表のとおりで、97.3％のホ
スファチジルグリセロールを生成した。
チルエーテル170μｌ、グリセロール79mg、1M CaCl26.8
μｌ、0.8M酢酸緩衝液（pH5.6）17μｌ、実施例１で得
たホスホリパーゼＤ 1Uを含む0.1％牛血清アルブミン
（BSA）溶液83.5μｌを混合し、室温で撹拌しながら12
時間反応した。ジエチルエーテル：エタノール（3:2）2
10μｌを添加してよく混合し、上層中のリン脂質組成を
日本油化学協会編基準油脂分析試験法2.2.8.4a−86に従
い分析した。その結果は第１表のとおりで、97.3％のホ
スファチジルグリセロールを生成した。
また第１表には、キャベツ,Streptomyces chromofusc
us（S.C.）,Streptomyces hachijoensis（S.H.）を起源
とするホスホリパーゼＤを同条件下で用いたときの分析
値も合わせて示した。
us（S.C.）,Streptomyces hachijoensis（S.H.）を起源
とするホスホリパーゼＤを同条件下で用いたときの分析
値も合わせて示した。
実施例 ４ 大豆製ホスファチジルコリン2.5mg、ジエチルエーテ
ル163μｌ、グリセロール79mg、1M CaCl26.5μｌ、0.8M
酢酸緩衝液（pH5.5）16.1μｌ、実施例１で得たホスホ
リパーゼＤ 1Uを含む0.1％BSA溶液81.2μｌを混合し、
撹拌しながら３時間反応した。以下、実施例３と同様に
リン脂質組成を分析した。その結果、95.8％のホスファ
チジルグリセロールが生成し、ホスファチジン酸は0.4
％以下であった。
ル163μｌ、グリセロール79mg、1M CaCl26.5μｌ、0.8M
酢酸緩衝液（pH5.5）16.1μｌ、実施例１で得たホスホ
リパーゼＤ 1Uを含む0.1％BSA溶液81.2μｌを混合し、
撹拌しながら３時間反応した。以下、実施例３と同様に
リン脂質組成を分析した。その結果、95.8％のホスファ
チジルグリセロールが生成し、ホスファチジン酸は0.4
％以下であった。
発明の効果 本発明の製造法により得られたホスホリパーゼＤは、
上述のように従来の製造法により得られるものと比較し
て、高いホスファチジル基転移活性を有している。また
本酵素によるホスファチジル基転移反応では、ホスファ
チジン酸とはほとんど生成せず、リン脂質誘導体を効率
よく製造することができる。本酵素を使用してホスファ
チジル基転移反応を行えば、目的のリン脂質誘導体を、
従来よりはるかに高い収率で製造でき、極めて簡易な精
製操作で製品の純度を向上させることができるという利
点がある。
上述のように従来の製造法により得られるものと比較し
て、高いホスファチジル基転移活性を有している。また
本酵素によるホスファチジル基転移反応では、ホスファ
チジン酸とはほとんど生成せず、リン脂質誘導体を効率
よく製造することができる。本酵素を使用してホスファ
チジル基転移反応を行えば、目的のリン脂質誘導体を、
従来よりはるかに高い収率で製造でき、極めて簡易な精
製操作で製品の純度を向上させることができるという利
点がある。
本発明に使用されるストレプトマイセス属Ｄ−121株
は、安価な倍地成分で十分量の本酵素を生産することが
でき、培養物から、本酵素を簡単に採取することができ
る。また、本酵素は特に精製を必要とせず、培養濾液そ
のままでもよいし、必要に応じて、単に濃縮するだけで
も使用できる。すなわち、低コストで、高いホスファチ
ジル基転移活性を有する本酵素を生産することが可能で
ある。
は、安価な倍地成分で十分量の本酵素を生産することが
でき、培養物から、本酵素を簡単に採取することができ
る。また、本酵素は特に精製を必要とせず、培養濾液そ
のままでもよいし、必要に応じて、単に濃縮するだけで
も使用できる。すなわち、低コストで、高いホスファチ
ジル基転移活性を有する本酵素を生産することが可能で
ある。
また、本酵素はpH、温度等に対する安定性が良好で、
工業的な利用に有利である。
工業的な利用に有利である。
以上のように、本発明は、ホスファチジル基転移反応
でリン脂質誘導体を従来より効率的に、しかも低コスト
で製造できるようにする優れたものである。
でリン脂質誘導体を従来より効率的に、しかも低コスト
で製造できるようにする優れたものである。
第１図：本発明の酵素のホスファチジルコリン分解活性
のpH依存性を示すグラフ。 第２図：本発明の酵素の安定性に及ぼすpHの影響を示す
グラフ。 第３図：本発明の酵素のホスファチジルコリン分解活性
の温度依存性を示すグラフ。 第４図：本発明の酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示
すグラフ。
のpH依存性を示すグラフ。 第２図：本発明の酵素の安定性に及ぼすpHの影響を示す
グラフ。 第３図：本発明の酵素のホスファチジルコリン分解活性
の温度依存性を示すグラフ。 第４図：本発明の酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示
すグラフ。
Claims (1)
- 【請求項１】ストレプトマイセス属に属するＤ−121株
を培養し、培養物からホスホリパーゼＤを採取すること
を特徴とする下記の理化学的性質を有するホスホリパー
ゼＤの製造法： （ａ）作用 加水分解反応 下記一般式［Ｉ］ （但し、式中R1、R2はアシル基またはアルキル基、Ｘは
水酸基を含有する塩基の水酸基１個を除いた後に残る有
機基を示す）で表わされるリン脂質を加水分解し、ホス
ファチジン酸と塩基とを遊離させる； ホスファチルジン基転移反応 上記一般式［Ｉ］で表されるリン脂質のホスファチジル
基を下記一般式［II］ R3−OH ・・・・・・［II］ （但し、R3はアルコール性水酸基に結合した有機基を示
す）で表されるグリセロール、セリン、エタノール等の
アルコール性水酸基を有する化合物の共存下、アルコー
ル性水酸基にホスファチジル基を転移させ、下記一般式
［III］ （但し、R1、R2、R3は前記と同様の基を示す）で表され
るリン脂質誘導体を生成する； （ｂ）基質特異性 ホスファチジルコリンに対する加水分解活性を100とし
た場合の相対活性は、リゾホスファチジルコリンに対し
1.5、スフィンゴミエリンに対しては0.8である； （ｃ）至適pH:約6.0 （ｄ）pH安定性:pH4〜８で安定 （ｅ）至適温度：約55℃ （ｆ）熱安定性 pH6.0において60℃、30分間の熱処理で全く失活せず、7
0℃30分間でも約50％の活性が残存する； （ｇ）種々の物質の影響 濃度1mMの種々の物質を共存させた場合、加水分解活性
は塩化セチルビリジニウムのとき約40％阻害されるが、 CaCl2,FeCl3,FeSO4,BaCl2,MnCl2,MgCl2,CuCl2,ZnCl2,Sn
Cl2,AlCl3,CoCl2,CdCl2,LiCl,KCl,NaCl,コール酸ナトリ
ウム，デオキシコール酸ナトリウム，エチデンジアミン
四酢酸・ニナトリウムのときは阻害されない； （ｈ）分子量 5.6万（SDS・PAG法による）。 （ｉ）等電点 pH7.4〜7.5（等電点電気泳動法による）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2118050A JP2799621B2 (ja) | 1990-05-08 | 1990-05-08 | ホスホリパーゼｄの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2118050A JP2799621B2 (ja) | 1990-05-08 | 1990-05-08 | ホスホリパーゼｄの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04166083A JPH04166083A (ja) | 1992-06-11 |
| JP2799621B2 true JP2799621B2 (ja) | 1998-09-21 |
Family
ID=14726784
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2118050A Expired - Fee Related JP2799621B2 (ja) | 1990-05-08 | 1990-05-08 | ホスホリパーゼｄの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2799621B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112831446A (zh) * | 2021-03-09 | 2021-05-25 | 河南省商业科学研究所有限责任公司 | 一种利用基因工程链霉菌发酵获取磷脂酶d的制备方法 |
-
1990
- 1990-05-08 JP JP2118050A patent/JP2799621B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04166083A (ja) | 1992-06-11 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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