JP2690227B2 - クロノスタキス・コンパクチウスクラから得た酵素を使用した、ロバスタチン酸の酵素加水分解による６（Ｒ）−〔２−（８（Ｓ）−ヒドロキシ−２（Ｓ），６（Ｒ）−ジメチル−１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒドロナフチル）−エチル〕−４（Ｒ）−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン・トリオール酸の生合成的製造方法 - Google Patents
クロノスタキス・コンパクチウスクラから得た酵素を使用した、ロバスタチン酸の酵素加水分解による６（Ｒ）−〔２−（８（Ｓ）−ヒドロキシ−２（Ｓ），６（Ｒ）−ジメチル−１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒドロナフチル）−エチル〕−４（Ｒ）−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン・トリオール酸の生合成的製造方法Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
【０００１】本発明は、クロノスタキス・コンパクチウ
スクラ(Clonostachys compactiuscula) 、又はそれから
得られた加水分解酵素を使用して、発酵生成物であるロ
バスタチン酸の微生物学的加水分解による、６（Ｒ）−
〔２−（８（Ｓ）−ヒドロキシ−２（Ｓ），６（Ｒ）−
ジメチル−１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒ
ドロナフチル）−エチル〕−４（Ｒ）−ヒドロキシ−
３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オ
ン・トリオール酸（２）の生合成的製造に関するもので
ある。トリオール酸及びそのラクトン型は古い化合物、
即ち、技術面では既知のものであり、これらはコレステ
ロール生合成に含まれる酸素である３−ヒドロキシ−３
−メチルグルタリル−コエンザイムＡ（ＨＭＧ−Ｃｏ
Ａ）還元酵素のインヒビターである。この酵素のインヒ
ビターとして、これらは抗高コレステロール血症剤とし
て有用である。更にこれらはその他の抗高コレステロー
ル血症剤、特に８番目の位置に種々の側鎖を持つものの
調製用の中間物として有用なものである。例えば、８番
目の位置に２，２−ジメチルブチリルオキシ側鎖を持つ
シンバスタチンは、既知の手順によりトリオール酸のラ
クトン型を出発物質として使用し、調製することができ
る。
スクラ(Clonostachys compactiuscula) 、又はそれから
得られた加水分解酵素を使用して、発酵生成物であるロ
バスタチン酸の微生物学的加水分解による、６（Ｒ）−
〔２−（８（Ｓ）−ヒドロキシ−２（Ｓ），６（Ｒ）−
ジメチル−１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒ
ドロナフチル）−エチル〕−４（Ｒ）−ヒドロキシ−
３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オ
ン・トリオール酸（２）の生合成的製造に関するもので
ある。トリオール酸及びそのラクトン型は古い化合物、
即ち、技術面では既知のものであり、これらはコレステ
ロール生合成に含まれる酸素である３−ヒドロキシ−３
−メチルグルタリル−コエンザイムＡ（ＨＭＧ−Ｃｏ
Ａ）還元酵素のインヒビターである。この酵素のインヒ
ビターとして、これらは抗高コレステロール血症剤とし
て有用である。更にこれらはその他の抗高コレステロー
ル血症剤、特に８番目の位置に種々の側鎖を持つものの
調製用の中間物として有用なものである。例えば、８番
目の位置に２，２−ジメチルブチリルオキシ側鎖を持つ
シンバスタチンは、既知の手順によりトリオール酸のラ
クトン型を出発物質として使用し、調製することができ
る。
【０００２】この発明は、同時に、クロノスタキス・コ
ンパクチウスクラＡＴＣＣ ３８００９、またはその変
異株により作られる加水分解酵素の本質的に純粋な形に
関するものであり、この酵素はこの発明の方法によりロ
バスタチン酸又はその塩をトリオール酸に変換させ得る
ものである。この発明は、更にロバスタチン酸又はその
塩をトリオール酸に変換できる加水分解酵素の生成が可
能なクロノスタキス・コンパクチウスクラＡＴＣＣ ３
８００９の変異株に関するものである。この発明は、更
にロバスタチン酸又はその塩をクロノスタキス・コンパ
クチウスクラＡＴＣＣ ３８００９、又はその変異株、
又はそれらから得られる加水分解酵素で処理することに
より生成したトリオール酸を、引き続いて技術上既知で
ある従来の手順に従い、そのラクトン型に変換させる方
法に関するものである。この発明は抗高コレステロール
血症剤として有効なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のインヒビ
ターの分野に於けるものである。高コレステロール血症
は心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症の進行にお
いて重要な危険な要素であることが現在十分に確認され
ている。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害する化合物は、
コレステロールの生合成を妨害し、制限する。そして、
この方式により抗高コレステロール血症剤として機能す
る。このような化合物、特に天然発酵生成物であるコン
パクチン及びメビロニンは現在良く知られている。しか
しながら、抗高コレステロール血症の作用を改善できる
他の半合成的類似化合物の探索が継続されている。この
発明の生合成的方法により、クロノスタキス・コンパク
チウスクラから得られた酵素を使用してロバスタチン酸
を酵素加水分解することにより生成されたトリオール酸
はこのような半合成の類似化合物の調製と製造のための
出発物質を多量に供給する。
ンパクチウスクラＡＴＣＣ ３８００９、またはその変
異株により作られる加水分解酵素の本質的に純粋な形に
関するものであり、この酵素はこの発明の方法によりロ
バスタチン酸又はその塩をトリオール酸に変換させ得る
ものである。この発明は、更にロバスタチン酸又はその
塩をトリオール酸に変換できる加水分解酵素の生成が可
能なクロノスタキス・コンパクチウスクラＡＴＣＣ ３
８００９の変異株に関するものである。この発明は、更
にロバスタチン酸又はその塩をクロノスタキス・コンパ
クチウスクラＡＴＣＣ ３８００９、又はその変異株、
又はそれらから得られる加水分解酵素で処理することに
より生成したトリオール酸を、引き続いて技術上既知で
ある従来の手順に従い、そのラクトン型に変換させる方
法に関するものである。この発明は抗高コレステロール
血症剤として有効なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のインヒビ
ターの分野に於けるものである。高コレステロール血症
は心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症の進行にお
いて重要な危険な要素であることが現在十分に確認され
ている。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害する化合物は、
コレステロールの生合成を妨害し、制限する。そして、
この方式により抗高コレステロール血症剤として機能す
る。このような化合物、特に天然発酵生成物であるコン
パクチン及びメビロニンは現在良く知られている。しか
しながら、抗高コレステロール血症の作用を改善できる
他の半合成的類似化合物の探索が継続されている。この
発明の生合成的方法により、クロノスタキス・コンパク
チウスクラから得られた酵素を使用してロバスタチン酸
を酵素加水分解することにより生成されたトリオール酸
はこのような半合成の類似化合物の調製と製造のための
出発物質を多量に供給する。
【０００３】既に上述したように、トリオール酸及びそ
のラクトン型は古くから知られた化合物である。例え
ば、ラクトン型のトリオール酸はエンドー(Endo)、日本
特許出願公告８６−１３７９８（１９８６年）に記述さ
れており、この中で、モナスカス・ルーバー（Ｍonascu
s ruber)の発酵によるこの物質の生産と血中コレステロ
ールレベルを下げるその能力の実証も述べられている。
ラクトン型のトリオール酸も、トリオール酸それ自身と
同様に、ウイラード(Willard）、アメリカ合衆国特許N
o. ４，２９３，４９６（１９８１年）に記述されてい
る。然しながら、そこにおいてこの化合物はアスペルギ
ルス・テレウス(Aspergillus terreus）の所定の菌株に
よる発酵生成物を出発物質として、これの８−（α−メ
チルブチリルオキシ）エステル側鎖を除去するのに化学
的加水分解を用いて調製されたものである。このような
加水分解が微生物学的に実施できるという指摘は全く無
い。
のラクトン型は古くから知られた化合物である。例え
ば、ラクトン型のトリオール酸はエンドー(Endo)、日本
特許出願公告８６−１３７９８（１９８６年）に記述さ
れており、この中で、モナスカス・ルーバー（Ｍonascu
s ruber)の発酵によるこの物質の生産と血中コレステロ
ールレベルを下げるその能力の実証も述べられている。
ラクトン型のトリオール酸も、トリオール酸それ自身と
同様に、ウイラード(Willard）、アメリカ合衆国特許N
o. ４，２９３，４９６（１９８１年）に記述されてい
る。然しながら、そこにおいてこの化合物はアスペルギ
ルス・テレウス(Aspergillus terreus）の所定の菌株に
よる発酵生成物を出発物質として、これの８−（α−メ
チルブチリルオキシ）エステル側鎖を除去するのに化学
的加水分解を用いて調製されたものである。このような
加水分解が微生物学的に実施できるという指摘は全く無
い。
【０００４】コマガタ（Komagata) 等、ジャーナル・オ
ブ・アンティバイオティクス(J. Antibiotics)、３９
巻、１５７４−７７頁（１９８６年）は、本発明と同じ
側鎖が除去される、ＭＬ−２３６ＢのＭＬ−２３６Ａへ
の酵素加水分解変換を記述している。調査した１６００
の真菌類の株の中から、５９株が加水分解反応を触媒す
るのに効果的であることが判明し、エメリセラ・ウング
イス(Emericella unguis) が最も強い活性を示した。然
しながら、Ｃ．コンパクチウスクラは記述されていな
い。エンドー（Endo) 、日本国特許出願公告番号８５−
１７６５９５号（１９８５年）は、上述のコマガタ（Ko
magata）等と同一の変換を記述しているが、更に、この
発明におけるロバスタチン酸のトリオール酸への転換と
同一である“モナコリンＫ(Monacolin K)"の“モナコリ
ンＪ(Monacolin J)"への転換を含んでいる。特に有効と
言われているのは糸状菌のモルチエレラ・イサベリナ(M
ortierellaisabellina)、エメリセラ・ウングイス(Emer
icellaunguis）、ジヘテロスポラ・クラミドスポリア(D
iheterospora chlamydosporia)、ヒューミコーラ・ファ
スコアトラ(Humicola fuscoatra)、ジコトモミセス・セ
ジピー（Dichotomomyces cejpii)、ネオコスモスポーラ
・アフリカナ(Neocosmospora africana)、キシロゴネ・
スファエロスポラ(Xylogone sphaerospora) 、トルロミ
セス・ラゲナ（Torulomyces ragena）、及びシーラビア
・フィメチ（Thielavia fimeti) である。しかし、最高
の転換率は０．５mg／mlの出発物質濃度の７８％である
のに較べて、本発明での転換率は８０−９０％である。
そして、コマガタ（Komagata) 等の関連報告には、この
発明で使用した２．５mg／mlのようなより高い濃度では
酵素の効率に著しい低下あるという指摘がある。このよ
うに、クロノスタキス・コンパクチウスクラを使用して
達成された、改良された微生物学的加水分解について先
行技術面での示唆は存在しない。
ブ・アンティバイオティクス(J. Antibiotics)、３９
巻、１５７４−７７頁（１９８６年）は、本発明と同じ
側鎖が除去される、ＭＬ−２３６ＢのＭＬ−２３６Ａへ
の酵素加水分解変換を記述している。調査した１６００
の真菌類の株の中から、５９株が加水分解反応を触媒す
るのに効果的であることが判明し、エメリセラ・ウング
イス(Emericella unguis) が最も強い活性を示した。然
しながら、Ｃ．コンパクチウスクラは記述されていな
い。エンドー（Endo) 、日本国特許出願公告番号８５−
１７６５９５号（１９８５年）は、上述のコマガタ（Ko
magata）等と同一の変換を記述しているが、更に、この
発明におけるロバスタチン酸のトリオール酸への転換と
同一である“モナコリンＫ(Monacolin K)"の“モナコリ
ンＪ(Monacolin J)"への転換を含んでいる。特に有効と
言われているのは糸状菌のモルチエレラ・イサベリナ(M
ortierellaisabellina)、エメリセラ・ウングイス(Emer
icellaunguis）、ジヘテロスポラ・クラミドスポリア(D
iheterospora chlamydosporia)、ヒューミコーラ・ファ
スコアトラ(Humicola fuscoatra)、ジコトモミセス・セ
ジピー（Dichotomomyces cejpii)、ネオコスモスポーラ
・アフリカナ(Neocosmospora africana)、キシロゴネ・
スファエロスポラ(Xylogone sphaerospora) 、トルロミ
セス・ラゲナ（Torulomyces ragena）、及びシーラビア
・フィメチ（Thielavia fimeti) である。しかし、最高
の転換率は０．５mg／mlの出発物質濃度の７８％である
のに較べて、本発明での転換率は８０−９０％である。
そして、コマガタ（Komagata) 等の関連報告には、この
発明で使用した２．５mg／mlのようなより高い濃度では
酵素の効率に著しい低下あるという指摘がある。このよ
うに、クロノスタキス・コンパクチウスクラを使用して
達成された、改良された微生物学的加水分解について先
行技術面での示唆は存在しない。
【０００５】以下本発明を詳細に説明する。本発明は、
ロバスタチン酸（１）又はその塩をクロノスタキス・コ
ンパクチウスクラ、又はその変異株、又はそれらから得
られた加水分解酵素で処理することによる、６（Ｒ）−
〔２−（８（Ｓ）−ヒドロキシ−２（Ｓ），６（Ｒ）−
ジメチル−１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒ
ドロナフチル）−エチル〕−４（Ｒ）−ヒドロキシ−
３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オ
ン・トリオール酸の生合成的製造に関するものである。
続いて、トリオール酸は既知の化学作用によりそのラク
トン型に変換されても良い。この発明の方法にとっての
出発物質はロバスタチン酸（１）、ロバスタチンの開環
型、又はそれらの塩である。酸型の物質は、技術面で既
知の培養方法によりアスペルギルス・テレウスの発酵に
よって製造される。ロバスタチン自身は水系に極めて不
溶性なので、この発明の方法に於いては有益な出発物質
ではない。そして、この物質が可溶性であるような溶剤
類は一般にこの発明の方法とは馴染まない。
ロバスタチン酸（１）又はその塩をクロノスタキス・コ
ンパクチウスクラ、又はその変異株、又はそれらから得
られた加水分解酵素で処理することによる、６（Ｒ）−
〔２−（８（Ｓ）−ヒドロキシ−２（Ｓ），６（Ｒ）−
ジメチル−１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒ
ドロナフチル）−エチル〕−４（Ｒ）−ヒドロキシ−
３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オ
ン・トリオール酸の生合成的製造に関するものである。
続いて、トリオール酸は既知の化学作用によりそのラク
トン型に変換されても良い。この発明の方法にとっての
出発物質はロバスタチン酸（１）、ロバスタチンの開環
型、又はそれらの塩である。酸型の物質は、技術面で既
知の培養方法によりアスペルギルス・テレウスの発酵に
よって製造される。ロバスタチン自身は水系に極めて不
溶性なので、この発明の方法に於いては有益な出発物質
ではない。そして、この物質が可溶性であるような溶剤
類は一般にこの発明の方法とは馴染まない。
【０００６】ロバスタチン酸出発物質は通常塩の型で使
用される。そして、“ロバスタチン酸”という術語は、
特記されない限り、全てのそれの適切な塩の型を同様に
含むことを意味する。溶解性が良好であり、かつ本発明
の方法を実施してゆく中で起る他の状況を妨害しないよ
うな塩は全て差し支えない。例えば、Na及びＫのような
アルカリ金属塩類は使用される。アンモニウム塩の型の
ものも使用可能であり、むしろこの方が望ましい。
用される。そして、“ロバスタチン酸”という術語は、
特記されない限り、全てのそれの適切な塩の型を同様に
含むことを意味する。溶解性が良好であり、かつ本発明
の方法を実施してゆく中で起る他の状況を妨害しないよ
うな塩は全て差し支えない。例えば、Na及びＫのような
アルカリ金属塩類は使用される。アンモニウム塩の型の
ものも使用可能であり、むしろこの方が望ましい。
【０００７】便宜上、ロバスタチン酸、トリオール酸、
及びそのラクトン型の構造式を下記に構造式１、２、及
び３としてそれぞれ示した：
及びそのラクトン型の構造式を下記に構造式１、２、及
び３としてそれぞれ示した：
【化４】
【０００８】本発明によるトリオール酸の生合成的製造
の基本的メカニズムはロバスタチン酸の酵素加水分解で
あると考えられ、この場合にクロノスタキス・コンパク
チウスクラＡＴＣＣ ３８００９、又はその変異株が、
ロバスタチン酸の８−（α−メチルブチリルオキシ）エ
ステル側鎖の除去を触媒としてトリオール酸を生成す
る。既に説明したように、水系での溶解性の理由から、
ロバスタチン出発物質をその開環の型、又は酸の型で使
用することが最も望ましいことであると判明しており、
この目的のためにロバスタチン酸のアンモニウム塩の型
がより望ましい。クロノスタキス・コンパクチウスクラ
により生成される酵素はどのような方法でロバスタチン
酸出発物質と接触させても良く、これ等の方法は全て、
この技術分野で通常の技能を持つ人に明白であろう。こ
れは、“処理”という用語を最も広く定義するものであ
る。例えば、完全細胞を使用しても良いしこの方法では
クロノスタキス・コンパクチウスクラの発酵培養物を製
造し、これにロバスタチン酸出発物質を単に添加して、
トリオール酸最終製品を回収する。この完全細胞を使う
方法の変法は、上述した様なクロノスタキス・コンパク
チウスクラの発酵培養物を製造するが、加水分解活性を
誘発させる目的でより低濃度のロバスタチン酸を添加す
るものである。次に、菌体を採取して、直ちに使用して
もよいし、又は後の使用のために凍結してもよいペレッ
トとして回収する。これらをアスペルギルス・テレウス
により生成された発酵培養物中に存在するロバスタチン
酸出発物質に添加しても良いし、あるいはロバスタチン
酸をその培養基から分離し、次に上述のクロノスタキス
・コンパクチウスクラの凍結ペレットと接触させても良
い。クロノスタキス・コンパクチウスクラの完全細胞が
上述したように生きている必要はない。例えば、アセト
ン乾燥した、死んだ細胞の使用も可能である。完全細胞
の代替として、これらの完全細胞培養物から得た粗製の
ホモジェネートの使用が可能である。粗製のホモジェネ
ートから加水分解酵素自身を分離してそれを使用するこ
とも可能である。
の基本的メカニズムはロバスタチン酸の酵素加水分解で
あると考えられ、この場合にクロノスタキス・コンパク
チウスクラＡＴＣＣ ３８００９、又はその変異株が、
ロバスタチン酸の８−（α−メチルブチリルオキシ）エ
ステル側鎖の除去を触媒としてトリオール酸を生成す
る。既に説明したように、水系での溶解性の理由から、
ロバスタチン出発物質をその開環の型、又は酸の型で使
用することが最も望ましいことであると判明しており、
この目的のためにロバスタチン酸のアンモニウム塩の型
がより望ましい。クロノスタキス・コンパクチウスクラ
により生成される酵素はどのような方法でロバスタチン
酸出発物質と接触させても良く、これ等の方法は全て、
この技術分野で通常の技能を持つ人に明白であろう。こ
れは、“処理”という用語を最も広く定義するものであ
る。例えば、完全細胞を使用しても良いしこの方法では
クロノスタキス・コンパクチウスクラの発酵培養物を製
造し、これにロバスタチン酸出発物質を単に添加して、
トリオール酸最終製品を回収する。この完全細胞を使う
方法の変法は、上述した様なクロノスタキス・コンパク
チウスクラの発酵培養物を製造するが、加水分解活性を
誘発させる目的でより低濃度のロバスタチン酸を添加す
るものである。次に、菌体を採取して、直ちに使用して
もよいし、又は後の使用のために凍結してもよいペレッ
トとして回収する。これらをアスペルギルス・テレウス
により生成された発酵培養物中に存在するロバスタチン
酸出発物質に添加しても良いし、あるいはロバスタチン
酸をその培養基から分離し、次に上述のクロノスタキス
・コンパクチウスクラの凍結ペレットと接触させても良
い。クロノスタキス・コンパクチウスクラの完全細胞が
上述したように生きている必要はない。例えば、アセト
ン乾燥した、死んだ細胞の使用も可能である。完全細胞
の代替として、これらの完全細胞培養物から得た粗製の
ホモジェネートの使用が可能である。粗製のホモジェネ
ートから加水分解酵素自身を分離してそれを使用するこ
とも可能である。
【０００９】クロノスタキス・コンパクチウスクラ酵素
をロバスタチン酸出発物質と接触させる方法はバッチ方
式で実施しても良く、又は連続法で実施しても良い。こ
れらの反応物自身の接触はプロセス技術の進歩に相応し
た種々の方法に変更しても良い。従って、固定化酵素カ
ラムを用い、そのカラムにロバスタチン酸出発物質を通
して、クロノスタキス・コンパクチウスクラ酵素と接触
させることができる。この様なプロセス技術のもう一つ
の例は、膜リアクターに関するものである。反応物の接
触に関連した他の代替方法は、クロノスタキス・コンパ
クチウスクラＡＴＣＣ ３８００９、又は変異株をロバ
スタチンの製造に使用した同じ発酵ブロスで培養するこ
とである。培養基成分を加え、次にクロノスタキス・コ
ンパクチウスクラＡＴＣＣ ３８００９、又は変異株を
入れ、トリオール酸を生成させるためにそれを培養する
という方法で、一旦、ロバスタチン酸が生成された後ク
ロノスタキス・コンパクチウスクラの発育を維持するた
めに、必要ならば発酵ブロスを一部変更することも可能
である。しかし、この取組み方は最適収量が得られない
ようである。反応物を接触させるのに、より好ましい方
法は上述の固定化酵素カラムの方法によるものである。
をロバスタチン酸出発物質と接触させる方法はバッチ方
式で実施しても良く、又は連続法で実施しても良い。こ
れらの反応物自身の接触はプロセス技術の進歩に相応し
た種々の方法に変更しても良い。従って、固定化酵素カ
ラムを用い、そのカラムにロバスタチン酸出発物質を通
して、クロノスタキス・コンパクチウスクラ酵素と接触
させることができる。この様なプロセス技術のもう一つ
の例は、膜リアクターに関するものである。反応物の接
触に関連した他の代替方法は、クロノスタキス・コンパ
クチウスクラＡＴＣＣ ３８００９、又は変異株をロバ
スタチンの製造に使用した同じ発酵ブロスで培養するこ
とである。培養基成分を加え、次にクロノスタキス・コ
ンパクチウスクラＡＴＣＣ ３８００９、又は変異株を
入れ、トリオール酸を生成させるためにそれを培養する
という方法で、一旦、ロバスタチン酸が生成された後ク
ロノスタキス・コンパクチウスクラの発育を維持するた
めに、必要ならば発酵ブロスを一部変更することも可能
である。しかし、この取組み方は最適収量が得られない
ようである。反応物を接触させるのに、より好ましい方
法は上述の固定化酵素カラムの方法によるものである。
【００１０】更に下記に述べる実施例はロバスタチン酸
の酵素加水分解は説明するために現在使用している方法
を記述した。しかし、これらの実施例に於ける方法は必
ずしも商業的製造に利用される方法を示唆するものでは
ない。
の酵素加水分解は説明するために現在使用している方法
を記述した。しかし、これらの実施例に於ける方法は必
ずしも商業的製造に利用される方法を示唆するものでは
ない。
【００１１】本発明はロバスタチン酸をトリオール酸に
変換させうるクロノスタキス・コンパクチウスクラの特
別の菌株であるＡＴＣＣ ３８００９の変異株も指名し
ている。微生物の種々の菌株により製造される望ましい
生成物の収量を改善するための発酵技術に於ける良く知
られたテクニックがある。例えば、所定の生産用菌株
を、その微生物の遺伝物質で進行する突然変異を大いに
増加させることが知られている放射線照射又は他の刺激
にさらしても良い。感度の良いスクリーニングを使用す
ることにより、この様にして製造された多くの突然変異
体から望ましい生成物の生産増加をもたらす菌株のみを
選択することが可能である。この方法で、生産用菌株の
産出はその種々の選択された子孫を通して継続して改善
することが通常可能である。この発明に関して、クロノ
スタキス・コンパクチウスクラＡＴＣＣ ３８００９の
選択された変異株によるロバスタチン酸加水分解酵素の
生産量についても同様な改善が成されても良い。この目
的を充分に満たすような選別法は高速液体クロマトグラ
フィ（ＨＰＬＣ）の使用であり、この装置は極めて低濃
度の酵素的開裂精製物の検出が可能でありそれにより研
究課題である、どの特殊な変異株によりトリオール酸が
製造されたかを明白に確認出来る。
変換させうるクロノスタキス・コンパクチウスクラの特
別の菌株であるＡＴＣＣ ３８００９の変異株も指名し
ている。微生物の種々の菌株により製造される望ましい
生成物の収量を改善するための発酵技術に於ける良く知
られたテクニックがある。例えば、所定の生産用菌株
を、その微生物の遺伝物質で進行する突然変異を大いに
増加させることが知られている放射線照射又は他の刺激
にさらしても良い。感度の良いスクリーニングを使用す
ることにより、この様にして製造された多くの突然変異
体から望ましい生成物の生産増加をもたらす菌株のみを
選択することが可能である。この方法で、生産用菌株の
産出はその種々の選択された子孫を通して継続して改善
することが通常可能である。この発明に関して、クロノ
スタキス・コンパクチウスクラＡＴＣＣ ３８００９の
選択された変異株によるロバスタチン酸加水分解酵素の
生産量についても同様な改善が成されても良い。この目
的を充分に満たすような選別法は高速液体クロマトグラ
フィ（ＨＰＬＣ）の使用であり、この装置は極めて低濃
度の酵素的開裂精製物の検出が可能でありそれにより研
究課題である、どの特殊な変異株によりトリオール酸が
製造されたかを明白に確認出来る。
【００１２】培養培地 クロノスタキス・コンパクチウスクラの発酵は他の発酵
生成物の製造に使用されるような液体培地で実施され
る。このような培地は微生物によって資化される炭素、
窒素及び無機塩類の供給源を含む。一般に、糖類のよう
な炭水化物、例えば、乳糖、ブドウ糖、果糖、マルトー
ス、蔗糖、キシロース、マンニトール及び類似のもの、
及び穀類のような澱粉、例えば、オート麦、ライ麦、コ
ーンスターチ、コーンミール及び類似のもの、は栄養培
地中での資化可能な炭素の供給源としてそれぞれ単独で
又は組み合わせて使用できる。培地中で利用される炭水
化物供給源又は供給源類の正確な量は一部で、培地の他
の成分に依存するが、一般に炭水化物の量は通常、培地
の重量比で約１％から６％の間で変動する。これらの炭
素供給源は個々に使用することが出来るし、又はこれら
の炭素供給源の幾つかを培地中で組み合わせても良い。
一般に、多くの蛋白質物質を発酵プロセスに於いて窒素
源として使用しても良い。適切な窒素供給源としては例
えば、酵母加水分解物、プライマリーイースト（Primar
y Yeast)、大豆粉、綿実粉、カゼインの加水分解物、コ
ーン・スチープ・リカー、ジスチラーズソリュブル又は
トマトペースト及び類似のものが含まれる。窒素供給源
はそれぞれ単独で又は組み合わせて、液体培地の重量比
で約０．２％から６％までの範囲の量で使用される。
生成物の製造に使用されるような液体培地で実施され
る。このような培地は微生物によって資化される炭素、
窒素及び無機塩類の供給源を含む。一般に、糖類のよう
な炭水化物、例えば、乳糖、ブドウ糖、果糖、マルトー
ス、蔗糖、キシロース、マンニトール及び類似のもの、
及び穀類のような澱粉、例えば、オート麦、ライ麦、コ
ーンスターチ、コーンミール及び類似のもの、は栄養培
地中での資化可能な炭素の供給源としてそれぞれ単独で
又は組み合わせて使用できる。培地中で利用される炭水
化物供給源又は供給源類の正確な量は一部で、培地の他
の成分に依存するが、一般に炭水化物の量は通常、培地
の重量比で約１％から６％の間で変動する。これらの炭
素供給源は個々に使用することが出来るし、又はこれら
の炭素供給源の幾つかを培地中で組み合わせても良い。
一般に、多くの蛋白質物質を発酵プロセスに於いて窒素
源として使用しても良い。適切な窒素供給源としては例
えば、酵母加水分解物、プライマリーイースト（Primar
y Yeast)、大豆粉、綿実粉、カゼインの加水分解物、コ
ーン・スチープ・リカー、ジスチラーズソリュブル又は
トマトペースト及び類似のものが含まれる。窒素供給源
はそれぞれ単独で又は組み合わせて、液体培地の重量比
で約０．２％から６％までの範囲の量で使用される。
【００１３】培地に混合できる栄養無機塩類は、ナトリ
ウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸
塩、硫酸塩、塩素、炭酸塩、及び類似のイオンを生ずる
ことが出来る通常の塩類である。同様に、コバルト、マ
ンガン、鉄及びマグネシウムのような微量金属が含まれ
る。実施例に記述した培地は使用できる広範な培地の種
類の単なる実例であり、限定するものでないことに留意
すべきである。特に、トリオール酸を製造するための培
地で使用される炭素供給源はデキストロース、デキスト
リン、オート麦粉、オートミール、糖蜜、クエン酸塩、
大豆油、グリセロール、麦芽エキス、鱈肝油、澱粉、エ
タノール、イチジク、アスコルビン酸塩及びラード油を
含む。窒素供給源としてはペプトン化乳、自己消化酵
母、酵母ＲＮＡ、トマトペースト、カゼイン、プライマ
リイースト、ピーナッツミール、ジスチラーズソリュブ
ル、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、ＮＺアミン、
豆抽出物、アスパラギン、綿実ミール及び硫酸アンモニ
ウムが含まれた。主なイオン性化合物はCaCO3 、KH2P
O4、MgSO4 ・7H2O及びNaCl及び少量のCoCl2・6H2Oであ
り、そして微量のFe、Mn、Mo、Ｂ、Co及びCuも存在し
た。
ウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸
塩、硫酸塩、塩素、炭酸塩、及び類似のイオンを生ずる
ことが出来る通常の塩類である。同様に、コバルト、マ
ンガン、鉄及びマグネシウムのような微量金属が含まれ
る。実施例に記述した培地は使用できる広範な培地の種
類の単なる実例であり、限定するものでないことに留意
すべきである。特に、トリオール酸を製造するための培
地で使用される炭素供給源はデキストロース、デキスト
リン、オート麦粉、オートミール、糖蜜、クエン酸塩、
大豆油、グリセロール、麦芽エキス、鱈肝油、澱粉、エ
タノール、イチジク、アスコルビン酸塩及びラード油を
含む。窒素供給源としてはペプトン化乳、自己消化酵
母、酵母ＲＮＡ、トマトペースト、カゼイン、プライマ
リイースト、ピーナッツミール、ジスチラーズソリュブ
ル、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、ＮＺアミン、
豆抽出物、アスパラギン、綿実ミール及び硫酸アンモニ
ウムが含まれた。主なイオン性化合物はCaCO3 、KH2P
O4、MgSO4 ・7H2O及びNaCl及び少量のCoCl2・6H2Oであ
り、そして微量のFe、Mn、Mo、Ｂ、Co及びCuも存在し
た。
【００１４】ラクトン化 本発明の方法により、クロノスタキス・コンパクチウス
クラＡＴＣＣ ３８００９、又はその変異株、又はそれ
らから得られた加水分解酵素でロバスタチン酸を処理す
ると、優占的な生成物としてトリオール酸が供給され
る。しかし、この化合物のラクトン型を得ることも望ま
しい。と言うのは、ラクトン型も抗高コレステロール血
症剤として又はこのような物質を調製するための中間物
質として有効であるからである。トリオール酸のラクト
ン化は標準的な手法、即ち、加熱又は酸触媒ラクトン化
のどちらかで行われる。ロバスタチン酸関連化合物の酸
触媒ラクトン化の手順はアメリカ合衆国特許第４，９１
６，２３９号に記述されている。トリオール酸について
は、ラクトン化は７mMのメタン・スルホン酸を含有する
イソプロピル酢酸塩中で、室温で２時間、攪拌すること
により行われている。
クラＡＴＣＣ ３８００９、又はその変異株、又はそれ
らから得られた加水分解酵素でロバスタチン酸を処理す
ると、優占的な生成物としてトリオール酸が供給され
る。しかし、この化合物のラクトン型を得ることも望ま
しい。と言うのは、ラクトン型も抗高コレステロール血
症剤として又はこのような物質を調製するための中間物
質として有効であるからである。トリオール酸のラクト
ン化は標準的な手法、即ち、加熱又は酸触媒ラクトン化
のどちらかで行われる。ロバスタチン酸関連化合物の酸
触媒ラクトン化の手順はアメリカ合衆国特許第４，９１
６，２３９号に記述されている。トリオール酸について
は、ラクトン化は７mMのメタン・スルホン酸を含有する
イソプロピル酢酸塩中で、室温で２時間、攪拌すること
により行われている。
【００１５】
【実施例１】クロノスタキス・コンパクチウスクラの完
全細胞によるロバスタチン酸のトリオール酸への生化学
的変換 ─────────────────────────
───────────クロノスタキス・コンパクチウ
スクラＡＴＣＣ ３８００９は、ＥＮ培地（ブドウ糖
１％；ペプトン ０．２％；ビーフ・エキス ０．１
％；イーストエキス０．１％及びコーン・スチープ・リ
カー ０．３％）中、実容量１．８Ｌの２Ｌエアリフト
発酵槽で、２９℃、エアレイション率１．２５ｖｖｍ
で、４８−７２時間生育させた。加水分解活性を誘導す
るために、ロバスタチン酸アンモニウム塩を加えた
（０．５ｇ／Ｌ最終濃度）。この発酵物は、ロバスタチ
ン酸アンモニウム塩の添加後２４−７２時間で、篩で濾
過して緩衝液（２０mM トリス、pH８．５）でペレット
を洗浄して採取した。この細胞ペレットは使用時まで冷
凍しておいた。生化学的変換のために、エアリフト発酵
から得られたクロノスタキス・コンパクチウスクラのペ
レット（湿重量１７ｇ）を、アスペルギルス・テレウス
発酵から採取した炭酸塩緩衝液中の粗製ロバスタチン酸
（２０ｇ／Ｌ）の２０mlと接触させた。この生化学的変
換は２５０mlのエーレンマイヤー・フラスコ中で、２７
℃で１６０rpm で行われた。１７時間後に、約６０％の
ロバスタチン酸がトリオール酸に変換した。追加実験
で、エアリフト発酵から得たクロノスタキス・コンパク
チウスクラ（５ｇ湿重量）を、アスペルギルス・テレウ
ス発酵からメタノールで抽出した１０mlの粗製のロバス
タチン酸（３．５ｇ／Ｌ）と接触させた。生物変換混合
物中のメタノールの最終濃度は２５％であった。この生
物反応は２５０mlのエーレンマイヤー・フラスコ中で、
２９℃、１６０rpm で行われた。２時間後に、クロノス
タキス・コンパクチウスクラを使用した生物変換は、薄
層クロマトグラフィーによる測定では、ほぼ１００％の
ロバスタチン酸をトリオール酸に転換した。
全細胞によるロバスタチン酸のトリオール酸への生化学
的変換 ─────────────────────────
───────────クロノスタキス・コンパクチウ
スクラＡＴＣＣ ３８００９は、ＥＮ培地（ブドウ糖
１％；ペプトン ０．２％；ビーフ・エキス ０．１
％；イーストエキス０．１％及びコーン・スチープ・リ
カー ０．３％）中、実容量１．８Ｌの２Ｌエアリフト
発酵槽で、２９℃、エアレイション率１．２５ｖｖｍ
で、４８−７２時間生育させた。加水分解活性を誘導す
るために、ロバスタチン酸アンモニウム塩を加えた
（０．５ｇ／Ｌ最終濃度）。この発酵物は、ロバスタチ
ン酸アンモニウム塩の添加後２４−７２時間で、篩で濾
過して緩衝液（２０mM トリス、pH８．５）でペレット
を洗浄して採取した。この細胞ペレットは使用時まで冷
凍しておいた。生化学的変換のために、エアリフト発酵
から得られたクロノスタキス・コンパクチウスクラのペ
レット（湿重量１７ｇ）を、アスペルギルス・テレウス
発酵から採取した炭酸塩緩衝液中の粗製ロバスタチン酸
（２０ｇ／Ｌ）の２０mlと接触させた。この生化学的変
換は２５０mlのエーレンマイヤー・フラスコ中で、２７
℃で１６０rpm で行われた。１７時間後に、約６０％の
ロバスタチン酸がトリオール酸に変換した。追加実験
で、エアリフト発酵から得たクロノスタキス・コンパク
チウスクラ（５ｇ湿重量）を、アスペルギルス・テレウ
ス発酵からメタノールで抽出した１０mlの粗製のロバス
タチン酸（３．５ｇ／Ｌ）と接触させた。生物変換混合
物中のメタノールの最終濃度は２５％であった。この生
物反応は２５０mlのエーレンマイヤー・フラスコ中で、
２９℃、１６０rpm で行われた。２時間後に、クロノス
タキス・コンパクチウスクラを使用した生物変換は、薄
層クロマトグラフィーによる測定では、ほぼ１００％の
ロバスタチン酸をトリオール酸に転換した。
【００１６】
【実施例２】クロノスタキス・コンパクチウスクラの粗
製ホモジェネートによる、ロバスタチン酸のトリオール
酸への生化学的物変換 ─────────────────────────
───────────クロノスタキス・コンパクチウ
スクラＡＴＣＣ ３８００９は、１２mlのＥＮ培地を含
有する２５０mlの振盪フラスコ中で、２９℃、３日間発
育させた。ロバスタチン酸アンモニウム塩を、０．５ｇ
／Ｌの濃度となるように添加し、発酵はさらに２日間継
続した。粗製ホモジェネートを準備するために、培養物
を３，０００rpm 、１０分間遠心分離して採取した。こ
の後、これを５０mMのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）
メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝液
pH７．７で洗浄した。この培養基を再度遠心分離し、菌
体を氷で冷やした後に、ガラス片とドライアイスの粉末
を入れた乳鉢の中に入れ、すり鉢ですりつぶした。細胞
残渣とガラス片を除去するために、１個の振盪フラスコ
の内容物を２．０mlの５０mMテス・バッファー中で再懸
濁させ、２，０００rpm で１０分間遠心分離を行った。
上澄は約０．５mg／mlの蛋白質濃度で粗製ホモジェネー
トの供給源として使用した。このバイオ変換を実施する
ために、粗製のホモジェネートの一定容量を等量のロバ
スタチン酸アンモニウム塩（５ｇ／Ｌ）と組み合わせ、
混合物を２９℃でインキュベートした。この方法を使用
して、２時間以内に８０−９０％のロバスタチン酸がト
リオール酸に転換することが認められた。
製ホモジェネートによる、ロバスタチン酸のトリオール
酸への生化学的物変換 ─────────────────────────
───────────クロノスタキス・コンパクチウ
スクラＡＴＣＣ ３８００９は、１２mlのＥＮ培地を含
有する２５０mlの振盪フラスコ中で、２９℃、３日間発
育させた。ロバスタチン酸アンモニウム塩を、０．５ｇ
／Ｌの濃度となるように添加し、発酵はさらに２日間継
続した。粗製ホモジェネートを準備するために、培養物
を３，０００rpm 、１０分間遠心分離して採取した。こ
の後、これを５０mMのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）
メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝液
pH７．７で洗浄した。この培養基を再度遠心分離し、菌
体を氷で冷やした後に、ガラス片とドライアイスの粉末
を入れた乳鉢の中に入れ、すり鉢ですりつぶした。細胞
残渣とガラス片を除去するために、１個の振盪フラスコ
の内容物を２．０mlの５０mMテス・バッファー中で再懸
濁させ、２，０００rpm で１０分間遠心分離を行った。
上澄は約０．５mg／mlの蛋白質濃度で粗製ホモジェネー
トの供給源として使用した。このバイオ変換を実施する
ために、粗製のホモジェネートの一定容量を等量のロバ
スタチン酸アンモニウム塩（５ｇ／Ｌ）と組み合わせ、
混合物を２９℃でインキュベートした。この方法を使用
して、２時間以内に８０−９０％のロバスタチン酸がト
リオール酸に転換することが認められた。
【００１７】
【実施例３】クロノスタキス・コンパクチウスクラから
精製した加水分解酵素によるロバスタチン酸のトリオー
ル酸への生化学的変換 ─────────────────────────
───────────ロバスタチン酸をトリオール酸
に生化学的変換を行う加水分解酵素は、モノＱ陰イオン
交換カラムを使用した高速蛋白質液体クロマトグラフィ
（ＦＰＬＣ（登録商標））により、以下に記述した手順
を使用したクロノスタキス・コンパクチウスクラのホモ
ジェネートからほぼ均一なものに精製した。上記の実施
例２に示した２，０００rpm の遠心分離から後に上澄、
但し、この場合には２０mMのトロメタミン（トリス）緩
衝液を５０mMのテス緩衝液のかわりに用い、１５，００
０rpm で遠心分離し、得られた上澄を０．４５μｍのフ
ィルターで濾過した。蛋白質を０．３−０．５mg／ml含
有する濾過物の各バッチ（１０ml）をファルマシア高速
液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）システムに結合させ
たファルマシア・モノＱ陰イオン交換カラムにかけた。
陰イオン蛋白質をカラム・マトリックスへ結合させた
後、塩化ナトリウムのリニア・グラジエント（０−５０
０mM）により加水分解酵素が特異的に溶出された。溶出
した蛋白質は１mlのフラクションで集めて、ロバスタチ
ン酸アンモニウム塩（この場合に、加水分解のパーセン
トはＴＬＣとデンシトメトリー又はＨＰＬＣで測定され
た）、或いはこの酵素がそれに対して加水分解活性を有
するかを示す比色用基質（オルト−ニトロフェニル・ブ
チレート ｏ−ＮＰＢ）の何れかを使用して評価した。
後者の基質を使用した場合、加水分解反応は、本来、ロ
ーレンス、アール．シー．（Lawrence, R.C.）等、ジャ
ーナル・オブ・ジェネティック・マイクロバイオロジー
（J. Gen. Microbiol.) （１９６７年）４８巻、４０１
−４１８頁に記述されているように、４１０nmで分光光
度計的にモニターした。両方の評価方法が、NaCl濃度が
３００mMに近づいた時に、この加水分解酵素が溶出する
ことを示した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミド・ゲル電気泳動は、ロバスタチン酸加水分解酵素
含有ピークフラクションが分子量が約４５，０００ダル
トンの突出したバンドを含むことを示した。
精製した加水分解酵素によるロバスタチン酸のトリオー
ル酸への生化学的変換 ─────────────────────────
───────────ロバスタチン酸をトリオール酸
に生化学的変換を行う加水分解酵素は、モノＱ陰イオン
交換カラムを使用した高速蛋白質液体クロマトグラフィ
（ＦＰＬＣ（登録商標））により、以下に記述した手順
を使用したクロノスタキス・コンパクチウスクラのホモ
ジェネートからほぼ均一なものに精製した。上記の実施
例２に示した２，０００rpm の遠心分離から後に上澄、
但し、この場合には２０mMのトロメタミン（トリス）緩
衝液を５０mMのテス緩衝液のかわりに用い、１５，００
０rpm で遠心分離し、得られた上澄を０．４５μｍのフ
ィルターで濾過した。蛋白質を０．３−０．５mg／ml含
有する濾過物の各バッチ（１０ml）をファルマシア高速
液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）システムに結合させ
たファルマシア・モノＱ陰イオン交換カラムにかけた。
陰イオン蛋白質をカラム・マトリックスへ結合させた
後、塩化ナトリウムのリニア・グラジエント（０−５０
０mM）により加水分解酵素が特異的に溶出された。溶出
した蛋白質は１mlのフラクションで集めて、ロバスタチ
ン酸アンモニウム塩（この場合に、加水分解のパーセン
トはＴＬＣとデンシトメトリー又はＨＰＬＣで測定され
た）、或いはこの酵素がそれに対して加水分解活性を有
するかを示す比色用基質（オルト−ニトロフェニル・ブ
チレート ｏ−ＮＰＢ）の何れかを使用して評価した。
後者の基質を使用した場合、加水分解反応は、本来、ロ
ーレンス、アール．シー．（Lawrence, R.C.）等、ジャ
ーナル・オブ・ジェネティック・マイクロバイオロジー
（J. Gen. Microbiol.) （１９６７年）４８巻、４０１
−４１８頁に記述されているように、４１０nmで分光光
度計的にモニターした。両方の評価方法が、NaCl濃度が
３００mMに近づいた時に、この加水分解酵素が溶出する
ことを示した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミド・ゲル電気泳動は、ロバスタチン酸加水分解酵素
含有ピークフラクションが分子量が約４５，０００ダル
トンの突出したバンドを含むことを示した。
【００１８】精製した酵素標品を使用して、実施例１及
び２に上述した手順に従って生化学的変換を実施し、基
質としてのロバスタチン酸アンモニウム塩を用い、この
加水分解酵素のＫｍ及び比活性の評価を行った。得られ
たＫｍの値は４．１４mMであり、飽和した基質条件下
で、この酵素は時間当り０．１１mmolのロバスタチン酸
アンニモウム塩／mg蛋白質の比活性を持つことが判明し
た。
び２に上述した手順に従って生化学的変換を実施し、基
質としてのロバスタチン酸アンモニウム塩を用い、この
加水分解酵素のＫｍ及び比活性の評価を行った。得られ
たＫｍの値は４．１４mMであり、飽和した基質条件下
で、この酵素は時間当り０．１１mmolのロバスタチン酸
アンニモウム塩／mg蛋白質の比活性を持つことが判明し
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/365 Ａ６１Ｋ 31/365 (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ウィリアム エッチ．カヴァー アメリカ合衆国，22840 ヴァージニア, マクガヘイスヴィル，ルート ２，ボッ クス 729 (72)発明者 レベッカ エル．ダボラ アメリカ合衆国，22901 ヴァージニア, シャーロッツヴィル，チャサム リッジ 1225 (72)発明者 ロバート ダブリュ．スティーバー アメリカ合衆国，22801 ヴァージニア, ハリソンバーグ，マウンテン ヴュー ドライヴ 535 (72)発明者 ボグダン テーレウィッツ アメリカ合衆国，22840 ヴァージニア, マクガヘイスヴィル，ルート 647，ピ ー．オー．ボックス 191 (54)【発明の名称】 クロノスタキス・コンパクチウスクラから得た酵素を使用した、ロバスタチン酸の酵素加水分解 による６（Ｒ）−〔２−（８（Ｓ）−ヒドロキシ−２（Ｓ），６（Ｒ）−ジメチル−１，２, ６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒドロナフチル）−エチル〕−４（Ｒ）−ヒドロキシ−３, ４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン・トリオール酸の生合成的製造方法
Claims (6)
- 【請求項１】 構造式１の化合物又はその塩を、クロノ
スタキス・コンパクチウスクラ(Clonostachys compacti
uscula) ＡＴＣＣ ３８００９、 【化１】 又はその変異株、又はそれらから得られる加水分解酵素
を用いて処理し、その生成物を回収することを特徴とす
る、構造式２の化合物又はその塩を 【化２】 回収可能量で製造するための方法。 - 【請求項２】 その塩がアンモニウム塩である、請求項
１による方法。 - 【請求項３】 加水分解酵素が精製された形であり、カ
ラムに固定化され、構造式１の化合物がこのカラムを通
過することにより、それと接触するようになっている、
請求項１による方法。 - 【請求項４】 式１のロバスタチン酸又はその塩 【化３】 を式２のトリオール酸又はその塩 【化４】 に変換でき、至適温度２７〜２９o Ｃ、分子量約４５，
０００Ｄａであり、かつクロノスタキス・コンパクチウ
スクラ(Clonostachys compactiuscula) ＡＴＣＣ３８０
０９又はその変異株から分離・精製することにより得ら
れることを特徴とする実質的に純粋な加水分解酵素。 - 【請求項５】 該分離・精製手段が陰イオン交換カラム
を使用した高速蛋白質液体クロマトグラフィーであるこ
とを特徴とする請求項４記載の加水分解酵素。 - 【請求項６】 構造式３のジオールラクトンを製造する
方法において、 【化５】 構造式１の化合物又はその塩を、 【化６】 クロノスタキス・コンパクチウスクラ（Clonostachys c
ompactiuscula） ＡＴＣＣ３８００９又はそれらから得
られる加水分解酵素を用いて処理して構造式２のトリオ
ール酸を生成し、 【化７】 次いで、該トリオール酸をラクトン化して構造式３のジ
オールラクトンを生成することを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US59764390A | 1990-10-15 | 1990-10-15 | |
| US597643 | 1990-10-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04321680A JPH04321680A (ja) | 1992-11-11 |
| JP2690227B2 true JP2690227B2 (ja) | 1997-12-10 |
Family
ID=24392363
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3263735A Expired - Fee Related JP2690227B2 (ja) | 1990-10-15 | 1991-10-11 | クロノスタキス・コンパクチウスクラから得た酵素を使用した、ロバスタチン酸の酵素加水分解による６（Ｒ）−〔２−（８（Ｓ）−ヒドロキシ−２（Ｓ），６（Ｒ）−ジメチル−１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒドロナフチル）−エチル〕−４（Ｒ）−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン・トリオール酸の生合成的製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0486153B1 (ja) |
| JP (1) | JP2690227B2 (ja) |
| CA (1) | CA2053000C (ja) |
| DE (1) | DE69116107T2 (ja) |
Families Citing this family (14)
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