JPH04321680A - クロノスタキス・コンパクチウスクラから得た酵素を使用した、ロバスタチン酸の酵素加水分解による６（Ｒ）−〔２−（８（Ｓ）−ヒドロキシ−２（Ｓ），６（Ｒ）−ジメチル−１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒドロナフチル）−エチル〕−４（Ｒ）−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン・トリオール酸の生合成的製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、クロノスタキス・コンパクチウ
スクラ（Ｃｌｏｎｏｓｔａｃｈｙｓ　ｃｏｍｐａｃｔｉ
ｕｓｃｕｌａ）　、又はそれから得られた加水分解酵素
を使用して、発酵生成物であるロバスタチン酸の微生物
学的加水分解による、６（Ｒ）−〔２−（８（Ｓ）−ヒ
ドロキシ−２（Ｓ），６（Ｒ）−ジメチル−１，２，６
，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒドロナフチル）−エチ
ル〕−４（Ｒ）−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラ
ヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン・トリオール酸（２）
の生合成的製造に関するものである。トリオール酸及び
そのラクトン型は古い化合物、即ち、技術面では既知の
ものであり、これらはコレステロール生合成に含まれる
酸素である３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コ
エンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素のインヒビタ
ーである。この酵素のインヒビターとして、これらは抗
高コレステロール血症剤として有用である。更にこれら
はその他の抗高コレステロール血症剤、特に８番目の位
置に種々の側鎖を持つものの調製用の中間物として有用
なものである。例えば、８番目の位置に２，２−ジメチ
ルブチリルオキシ側鎖を持つシンバスタチンは、既知の
手順によりトリオール酸のラクトン型を出発物質として
使用し、調製することができる。

【０００２】この発明は、同時に、クロノスタキス・コ
ンパクチウスクラＡＴＣＣ　　３８００９、またはその
変異株により作られる加水分解酵素の本質的に純粋な形
に関するものであり、この酵素はこの発明の方法により
ロバスタチン酸又はその塩をトリオール酸に変換させ得
るものである。この発明は、更にロバスタチン酸又はそ
の塩をトリオール酸に変換できる加水分解酵素の生成が
可能なクロノスタキス・コンパクチウスクラＡＴＣＣ　
　３８００９の変異株に関するものである。この発明は
、更にロバスタチン酸又はその塩をクロノスタキス・コ
ンパクチウスクラＡＴＣＣ　　３８００９、又はその変
異株、又はそれらから得られる加水分解酵素で処理する
ことにより生成したトリオール酸を、引き続いて技術上
既知である従来の手順に従い、そのラクトン型に変換さ
せる方法に関するものである。この発明は抗高コレステ
ロール血症剤として有効なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のイ
ンヒビターの分野に於けるものである。高コレステロー
ル血症は心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症の進
行において重要な危険な要素であることが現在十分に確
認されている。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害する化合
物は、コレステロールの生合成を妨害し、制限する。そ
して、この方式により抗高コレステロール血症剤として
機能する。このような化合物、特に天然発酵生成物であ
るコンパクチン及びメビロニンは現在良く知られている
。しかしながら、抗高コレステロール血症の作用を改善
できる他の半合成的類似化合物の探索が継続されている
。この発明の生合成的方法により、クロノスタキス・コ
ンパクチウスクラから得られた酵素を使用してロバスタ
チン酸を酵素加水分解することにより生成されたトリオ
ール酸はこのような半合成の類似化合物の調製と製造の
ための出発物質を多量に供給する。

【０００３】既に上述したように、トリオール酸及びそ
のラクトン型は古くから知られた化合物である。例えば
、ラクトン型のトリオール酸はエンドー（Ｅｎｄｏ）、
日本特許出願公告８６−１３７９８（１９８６年）に記
述されており、この中で、モナスカス・ルーバー（Ｍｏ
ｎａｓｃｕｓ　ｒｕｂｅｒ）の発酵によるこの物質の生
産と血中コレステロールレベルを下げるその能力の実証
も述べられている。 ラクトン型のトリオール酸も、トリオール酸それ自身と
同様に、ウイラード（Ｗｉｌｌａｒｄ）、アメリカ合衆
国特許Ｎｏ．　４，２９３，４９６（１９８１年）に記
述されている。然しながら、そこにおいてこの化合物は
アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　
ｔｅｒｒｅｕｓ）の所定の菌株による発酵生成物を出発
物質として、これの８−（α−メチルブチリルオキシ）
エステル側鎖を除去するのに化学的加水分解を用いて調
製されたものである。このような加水分解が微生物学的
に実施できるという指摘は全く無い。

【０００４】コマガタ（Ｋｏｍａｇａｔａ）　等、ジャ
ーナル・オブ・アンティバイオティクス（Ｊ．　Ａｎｔ
ｉｂｉｏｔｉｃｓ）、３９巻、１５７４−７７頁（１９
８６年）は、本発明と同じ側鎖が除去される、ＭＬ−２
３６ＢのＭＬ−２３６Ａへの酵素加水分解変換を記述し
ている。調査した１６００の真菌類の株の中から、５９
株が加水分解反応を触媒するのに効果的であることが判
明し、エメリセラ・ウングイス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ
　ｕｎｇｕｉｓ）　が最も強い活性を示した。然しなが
ら、Ｃ．コンパクチウスクラは記述されていない。エン
ドー（Ｅｎｄｏ）　、日本国特許出願公告番号８５−１
７６５９５号（１９８５年）は、上述のコマガタ（Ｋｏ
ｍａｇａｔａ）等と同一の変換を記述しているが、更に
、この発明におけるロバスタチン酸のトリオール酸への
転換と同一である“モナコリンＫ（Ｍｏｎａｃｏｌｉｎ
　Ｋ）”の“モナコリンＪ（Ｍｏｎａｃｏｌｉｎ　Ｊ）
”への転換を含んでいる。特に有効と言われているのは
糸状菌のモルチエレラ・イサベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅ
ｌｌａｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、エメリセラ・ウングイ
ス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａｕｎｇｕｉｓ）、ジヘテロス
ポラ・クラミドスポリア（Ｄｉｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒａ
　ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ）、ヒューミコーラ・
ファスコアトラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｆｕｓｃｏａｔｒ
ａ）、ジコトモミセス・セジピー（Ｄｉｃｈｏｔｏｍｏ
ｍｙｃｅｓ　ｃｅｊｐｉｉ）、ネオコスモスポーラ・ア
フリカナ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ　ａｆｒｉｃａ
ｎａ）、キシロゴネ・スファエロスポラ（Ｘｙｌｏｇｏ
ｎｅ　ｓｐｈａｅｒｏｓｐｏｒａ）　、トルロミセス・
ラゲナ（Ｔｏｒｕｌｏｍｙｃｅｓ　ｒａｇｅｎａ）、及
びシーラビア・フィメチ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ　ｆｉｍ
ｅｔｉ）　である。しかし、最高の転換率は０．５ｍｇ
／ｍｌの出発物質濃度の７８％であるのに較べて、本発
明での転換率は８０−９０％である。 そして、コマガタ（Ｋｏｍａｇａｔａ）　等の関連報告
には、この発明で使用した２．５ｍｇ／ｍｌのようなよ
り高い濃度では酵素の効率に著しい低下あるという指摘
がある。このように、クロノスタキス・コンパクチウス
クラを使用して達成された、改良された微生物学的加水
分解について先行技術面での示唆は存在しない。

【０００５】以下本発明を詳細に説明する。本発明は、
ロバスタチン酸（１）又はその塩をクロノスタキス・コ
ンパクチウスクラ、又はその変異株、又はそれらから得
られた加水分解酵素で処理することによる、６（Ｒ）−
〔２−（８（Ｓ）−ヒドロキシ−２（Ｓ），６（Ｒ）−
ジメチル−１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒ
ドロナフチル）−エチル〕−４（Ｒ）−ヒドロキシ−３
，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン
・トリオール酸の生合成的製造に関するものである。 続いて、トリオール酸は既知の化学作用によりそのラク
トン型に変換されても良い。この発明の方法にとっての
出発物質はロバスタチン酸（１）、ロバスタチンの開環
型、又はそれらの塩である。酸型の物質は、技術面で既
知の培養方法によりアスペルギルス・テレウスの発酵に
よって製造される。ロバスタチン自身は水系に極めて不
溶性なので、この発明の方法に於いては有益な出発物質
ではない。そして、この物質が可溶性であるような溶剤
類は一般にこの発明の方法とは馴染まない。

【０００６】ロバスタチン酸出発物質は通常塩の型で使
用される。そして、“ロバスタチン酸”という術語は、
特記されない限り、全てのそれの適切な塩の型を同様に
含むことを意味する。溶解性が良好であり、かつ本発明
の方法を実施してゆく中で起る他の状況を妨害しないよ
うな塩は全て差し支えない。例えば、Ｎａ及びＫのよう
なアルカリ金属塩類は使用される。アンモニウム塩の型
のものも使用可能であり、むしろこの方が望ましい。

【０００７】便宜上、ロバスタチン酸、トリオール酸、
及びそのラクトン型の構造式を下記に構造式１、２、及
び３としてそれぞれ示した：

【化４】

【０００８】本発明によるトリオール酸の生合成的製造
の基本的メカニズムはロバスタチン酸の酵素加水分解で
あると考えられ、この場合にクロノスタキス・コンパク
チウスクラＡＴＣＣ　　３８００９、又はその変異株が
、ロバスタチン酸の８−（α−メチルブチリルオキシ）
エステル側鎖の除去を触媒としてトリオール酸を生成す
る。既に説明したように、水系での溶解性の理由から、
ロバスタチン出発物質をその開環の型、又は酸の型で使
用することが最も望ましいことであると判明しており、
この目的のためにロバスタチン酸のアンモニウム塩の型
がより望ましい。クロノスタキス・コンパクチウスクラ
により生成される酵素はどのような方法でロバスタチン
酸出発物質と接触させても良く、これ等の方法は全て、
この技術分野で通常の技能を持つ人に明白であろう。こ
れは、“処理”という用語を最も広く定義するものであ
る。例えば、完全細胞を使用しても良いしこの方法では
クロノスタキス・コンパクチウスクラの発酵培養物を製
造し、これにロバスタチン酸出発物質を単に添加して、
トリオール酸最終製品を回収する。この完全細胞を使う
方法の変法は、上述した様なクロノスタキス・コンパク
チウスクラの発酵培養物を製造するが、加水分解活性を
誘発させる目的でより低濃度のロバスタチン酸を添加す
るものである。次に、菌体を採取して、直ちに使用して
もよいし、又は後の使用のために凍結してもよいペレッ
トとして回収する。これらをアスペルギルス・テレウス
により生成された発酵培養物中に存在するロバスタチン
酸出発物質に添加しても良いし、あるいはロバスタチン
酸をその培養基から分離し、次に上述のクロノスタキス
・コンパクチウスクラの凍結ペレットと接触させても良
い。クロノスタキス・コンパクチウスクラの完全細胞が
上述したように生きている必要はない。例えば、アセト
ン乾燥した、死んだ細胞の使用も可能である。完全細胞
の代替として、これらの完全細胞培養物から得た粗製の
ホモジェネートの使用が可能である。粗製のホモジェネ
ートから加水分解酵素自身を分離してそれを使用するこ
とも可能である。

【０００９】クロノスタキス・コンパクチウスクラ酵素
をロバスタチン酸出発物質と接触させる方法はバッチ方
式で実施しても良く、又は連続法で実施しても良い。こ
れらの反応物自身の接触はプロセス技術の進歩に相応し
た種々の方法に変更しても良い。従って、固定化酵素カ
ラムを用い、そのカラムにロバスタチン酸出発物質を通
して、クロノスタキス・コンパクチウスクラ酵素と接触
させることができる。この様なプロセス技術のもう一つ
の例は、膜リアクターに関するものである。反応物の接
触に関連した他の代替方法は、クロノスタキス・コンパ
クチウスクラＡＴＣＣ　　３８００９、又は変異株をロ
バスタチンの製造に使用した同じ発酵ブロスで培養する
ことである。培養基成分を加え、次にクロノスタキス・
コンパクチウスクラＡＴＣＣ　　３８００９、又は変異
株を入れ、トリオール酸を生成させるためにそれを培養
するという方法で、一旦、ロバスタチン酸が生成された
後クロノスタキス・コンパクチウスクラの発育を維持す
るために、必要ならば発酵ブロスを一部変更することも
可能である。しかし、この取組み方は最適収量が得られ
ないようである。反応物を接触させるのに、より好まし
い方法は上述の固定化酵素カラムの方法によるものであ
る。

【００１０】更に下記に述べる実施例はロバスタチン酸
の酵素加水分解は説明するために現在使用している方法
を記述した。しかし、これらの実施例に於ける方法は必
ずしも商業的製造に利用される方法を示唆するものでは
ない。

【００１１】本発明はロバスタチン酸をトリオール酸に
変換させうるクロノスタキス・コンパクチウスクラの特
別の菌株であるＡＴＣＣ　　３８００９の変異株も指名
している。微生物の種々の菌株により製造される望まし
い生成物の収量を改善するための発酵技術に於ける良く
知られたテクニックがある。例えば、所定の生産用菌株
を、その微生物の遺伝物質で進行する突然変異を大いに
増加させることが知られている放射線照射又は他の刺激
にさらしても良い。感度の良いスクリーニングを使用す
ることにより、この様にして製造された多くの突然変異
体から望ましい生成物の生産増加をもたらす菌株のみを
選択することが可能である。この方法で、生産用菌株の
産出はその種々の選択された子孫を通して継続して改善
することが通常可能である。この発明に関して、クロノ
スタキス・コンパクチウスクラＡＴＣＣ　　３８００９
の選択された変異株によるロバスタチン酸加水分解酵素
の生産量についても同様な改善が成されても良い。この
目的を充分に満たすような選別法は高速液体クロマトグ
ラフィ（ＨＰＬＣ）の使用であり、この装置は極めて低
濃度の酵素的開裂精製物の検出が可能でありそれにより
研究課題である、どの特殊な変異株によりトリオール酸
が製造されたかを明白に確認出来る。

【００１２】培養培地 クロノスタキス・コンパクチウスクラの発酵は他の発酵
生成物の製造に使用されるような液体培地で実施される
。このような培地は微生物によって資化される炭素、窒
素及び無機塩類の供給源を含む。一般に、糖類のような
炭水化物、例えば、乳糖、ブドウ糖、果糖、マルトース
、蔗糖、キシロース、マンニトール及び類似のもの、及
び穀類のような澱粉、例えば、オート麦、ライ麦、コー
ンスターチ、コーンミール及び類似のもの、は栄養培地
中での資化可能な炭素の供給源としてそれぞれ単独で又
は組み合わせて使用できる。培地中で利用される炭水化
物供給源又は供給源類の正確な量は一部で、培地の他の
成分に依存するが、一般に炭水化物の量は通常、培地の
重量比で約１％から６％の間で変動する。これらの炭素
供給源は個々に使用することが出来るし、又はこれらの
炭素供給源の幾つかを培地中で組み合わせても良い。 一般に、多くの蛋白質物質を発酵プロセスに於いて窒素
源として使用しても良い。適切な窒素供給源としては例
えば、酵母加水分解物、プライマリーイースト（Ｐｒｉ
ｍａｒｙ　Ｙｅａｓｔ）、大豆粉、綿実粉、カゼインの
加水分解物、コーン・スチープ・リカー、ジスチラーズ
ソリュブル又はトマトペースト及び類似のものが含まれ
る。窒素供給源はそれぞれ単独で又は組み合わせて、液
体培地の重量比で約０．２％から６％までの範囲の量で
使用される。

【００１３】培地に混合できる栄養無機塩類は、ナトリ
ウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸塩
、硫酸塩、塩素、炭酸塩、及び類似のイオンを生ずるこ
とが出来る通常の塩類である。同様に、コバルト、マン
ガン、鉄及びマグネシウムのような微量金属が含まれる
。実施例に記述した培地は使用できる広範な培地の種類
の単なる実例であり、限定するものでないことに留意す
べきである。特に、トリオール酸を製造するための培地
で使用される炭素供給源はデキストロース、デキストリ
ン、オート麦粉、オートミール、糖蜜、クエン酸塩、大
豆油、グリセロール、麦芽エキス、鱈肝油、澱粉、エタ
ノール、イチジク、アスコルビン酸塩及びラード油を含
む。窒素供給源としてはペプトン化乳、自己消化酵母、
酵母ＲＮＡ、トマトペースト、カゼイン、プライマリイ
ースト、ピーナッツミール、ジスチラーズソリュブル、
コーン・スチープ・リカー、大豆粉、ＮＺアミン、豆抽
出物、アスパラギン、綿実ミール及び硫酸アンモニウム
が含まれた。主なイオン性化合物はＣａＣＯ３　、ＫＨ
２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２Ｏ及びＮａＣｌ及び少
量のＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏであり、そして微量のＦｅ、
Ｍｎ、Ｍｏ、Ｂ、Ｃｏ及びＣｕも存在した。

【００１４】ラクトン化 本発明の方法により、クロノスタキス・コンパクチウス
クラＡＴＣＣ　　３８００９、又はその変異株、又はそ
れらから得られた加水分解酵素でロバスタチン酸を処理
すると、優占的な生成物としてトリオール酸が供給され
る。しかし、この化合物のラクトン型を得ることも望ま
しい。と言うのは、ラクトン型も抗高コレステロール血
症剤として又はこのような物質を調製するための中間物
質として有効であるからである。トリオール酸のラクト
ン化は標準的な手法、即ち、加熱又は酸触媒ラクトン化
のどちらかで行われる。ロバスタチン酸関連化合物の酸
触媒ラクトン化の手順はアメリカ合衆国特許第４，９１
６，２３９号に記述されている。トリオール酸について
は、ラクトン化は７ｍＭのメタン・スルホン酸を含有す
るイソプロピル酢酸塩中で、室温で２時間、攪拌するこ
とにより行われている。

【００１５】

【実施例１】クロノスタキス・コンパクチウスクラの完
全細胞によるロバスタチン酸のトリオール酸への生化学
的変換 ─────────────────────────
───────────クロノスタキス・コンパクチウ
スクラＡＴＣＣ　　３８００９は、ＥＮ培地（ブドウ糖
　　１％；ペプトン　　０．２％；ビーフ・エキス　　
０．１％；イーストエキス０．１％及びコーン・スチー
プ・リカー　　０．３％）中、実容量１．８Ｌの２Ｌエ
アリフト発酵槽で、２９℃、エアレイション率１．２５
ｖｖｍで、４８−７２時間生育させた。加水分解活性を
誘導するために、ロバスタチン酸アンモニウム塩を加え
た（０．５ｇ／Ｌ最終濃度）。この発酵物は、ロバスタ
チン酸アンモニウム塩の添加後２４−７２時間で、篩で
濾過して緩衝液（２０ｍＭ　　トリス、ｐＨ８．５）で
ペレットを洗浄して採取した。この細胞ペレットは使用
時まで冷凍しておいた。生化学的変換のために、エアリ
フト発酵から得られたクロノスタキス・コンパクチウス
クラのペレット（湿重量１７ｇ）を、アスペルギルス・
テレウス発酵から採取した炭酸塩緩衝液中の粗製ロバス
タチン酸（２０ｇ／Ｌ）の２０ｍｌと接触させた。この
生化学的変換は２５０ｍｌのエーレンマイヤー・フラス
コ中で、２７℃で１６０ｒｐｍ　で行われた。１７時間
後に、約６０％のロバスタチン酸がトリオール酸に変換
した。追加実験で、エアリフト発酵から得たクロノスタ
キス・コンパクチウスクラ（５ｇ湿重量）を、アスペル
ギルス・テレウス発酵からメタノールで抽出した１０ｍ
ｌの粗製のロバスタチン酸（３．５ｇ／Ｌ）と接触させ
た。生物変換混合物中のメタノールの最終濃度は２５％
であった。この生物反応は２５０ｍｌのエーレンマイヤ
ー・フラスコ中で、２９℃、１６０ｒｐｍ　で行われた
。２時間後に、クロノスタキス・コンパクチウスクラを
使用した生物変換は、薄層クロマトグラフィーによる測
定では、ほぼ１００％のロバスタチン酸をトリオール酸
に転換した。

【００１６】

【実施例２】クロノスタキス・コンパクチウスクラの粗
製ホモジェネートによる、ロバスタチン酸のトリオール
酸への生化学的物変換 ─────────────────────────
───────────クロノスタキス・コンパクチウ
スクラＡＴＣＣ　　３８００９は、１２ｍｌのＥＮ培地
を含有する２５０ｍｌの振盪フラスコ中で、２９℃、３
日間発育させた。ロバスタチン酸アンモニウム塩を、０
．５ｇ／Ｌの濃度となるように添加し、発酵はさらに２
日間継続した。粗製ホモジェネートを準備するために、
培養物を３，０００ｒｐｍ　、１０分間遠心分離して採
取した。この後、これを５０ｍＭのＮ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｔ
ＥＳ）緩衝液ｐＨ７．７で洗浄した。この培養基を再度
遠心分離し、菌体を氷で冷やした後に、ガラス片とドラ
イアイスの粉末を入れた乳鉢の中に入れ、すり鉢ですり
つぶした。細胞残渣とガラス片を除去するために、１個
の振盪フラスコの内容物を２．０ｍｌの５０ｍＭテス・
バッファー中で再懸濁させ、２，０００ｒｐｍ　で１０
分間遠心分離を行った。 上澄は約０．５ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度で粗製ホモジェ
ネートの供給源として使用した。このバイオ変換を実施
するために、粗製のホモジェネートの一定容量を等量の
ロバスタチン酸アンモニウム塩（５ｇ／Ｌ）と組み合わ
せ、混合物を２９℃でインキュベートした。この方法を
使用して、２時間以内に８０−９０％のロバスタチン酸
がトリオール酸に転換することが認められた。

【００１７】

【実施例３】クロノスタキス・コンパクチウスクラから
精製した加水分解酵素によるロバスタチン酸のトリオー
ル酸への生化学的変換 ─────────────────────────
───────────ロバスタチン酸をトリオール酸
に生化学的変換を行う加水分解酵素は、モノＱ陰イオン
交換カラムを使用した高速蛋白質液体クロマトグラフィ
（ＦＰＬＣ（登録商標））により、以下に記述した手順
を使用したクロノスタキス・コンパクチウスクラのホモ
ジェネートからほぼ均一なものに精製した。上記の実施
例２に示した２，０００ｒｐｍ　の遠心分離から後に上
澄、但し、この場合には２０ｍＭのトロメタミン（トリ
ス）緩衝液を５０ｍＭのテス緩衝液のかわりに用い、１
５，０００ｒｐｍ　で遠心分離し、得られた上澄を０．
４５μｍのフィルターで濾過した。蛋白質を０．３−０
．５ｍｇ／ｍｌ含有する濾過物の各バッチ（１０ｍｌ）
をファルマシア高速液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）
システムに結合させたファルマシア・モノＱ陰イオン交
換カラムにかけた。 陰イオン蛋白質をカラム・マトリックスへ結合させた後
、塩化ナトリウムのリニア・グラジエント（０−５００
ｍＭ）により加水分解酵素が特異的に溶出された。溶出
した蛋白質は１ｍｌのフラクションで集めて、ロバスタ
チン酸アンモニウム塩（この場合に、加水分解のパーセ
ントはＴＬＣとデンシトメトリー又はＨＰＬＣで測定さ
れた）、或いはこの酵素がそれに対して加水分解活性を
有するかを示す比色用基質（オルト−ニトロフェニル・
ブチレート　　ｏ−ＮＰＢ）の何れかを使用して評価し
た。 後者の基質を使用した場合、加水分解反応は、本来、ロ
ーレンス、アール．シー．（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，　Ｒ．
Ｃ．）等、ジャーナル・オブ・ジェネティック・マイク
ロバイオロジー（Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．）　（１９６７年）４８巻、４０１−４１８頁に記述
されているように、４１０ｎｍで分光光度計的にモニタ
ーした。両方の評価方法が、ＮａＣｌ濃度が３００ｍＭ
に近づいた時に、この加水分解酵素が溶出することを示
した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・
ゲル電気泳動は、ロバスタチン酸加水分解酵素含有ピー
クフラクションが分子量が約４５，０００ダルトンの突
出したバンドを含むことを示した。

【００１８】精製した酵素標品を使用して、実施例１及
び２に上述した手順に従って生化学的変換を実施し、基
質としてのロバスタチン酸アンモニウム塩を用い、この
加水分解酵素のＫｍ及び比活性の評価を行った。得られ
たＫｍの値は４．１４ｍＭであり、飽和した基質条件下
で、この酵素は時間当り０．１１ｍｍｏｌのロバスタチ
ン酸アンニモウム塩／ｍｇ蛋白質の比活性を持つことが
判明した。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　構造式１の化合物又はその塩を、クロ
   ノスタキス・コンパクチウスクラ（Ｃｌｏｎｏｓｔａｃ
   ｈｙｓ　ｃｏｍｐａｃｔｉｕｓｃｕｌａ）　ＡＴＣＣ　
   　３８００９、【化１】 又はその変異株、又はそれらから得られる加水分解酵素
   を用いて処理し、その生成物を回収することを特徴とす
   る、構造式２の化合物又はその塩を 【化２】 回収可能量で製造するための方法。
2. 【請求項２】　　その塩がアンモニウム塩である、請求
   項１による方法。
3. 【請求項３】　　加水分解酵素が精製された形であり、
   カラムに固定化され、構造式１の化合物がこのカラムを
   通過することにより、それと接触するようになっている
   、請求項１による方法。
4. 【請求項４】　　請求項１による方法を実施できる、ク
   ロノスタキス・コンパクチウスクラ（Ｃｌｏｎｏｓｔａ
   ｃｈｙｓ　ｃｏｍｐａｃｔｉｕｓｃｕｌａ）　ＡＴＣＣ
   　　３８００９、またはその変異株により生成された加
   水分解酵素の実質的な純品。
5. 【請求項５】　　更に構造式３のジオールラクトンを製
   造するために構造式２のトリオール酸をラクトン化する
   ことを含む、請求項１の方法。 【化３】