DE69116107T2 - Enzymatische Hydrolyse der Lovalovastatinsäure durch ein von Clonostachys compactiuscula stammendes Enzym - Google Patents
Enzymatische Hydrolyse der Lovalovastatinsäure durch ein von Clonostachys compactiuscula stammendes EnzymInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft die biosynthetische Herstellung von 6(R)-[2-(8(S)-Hydroxy-2(S),6(R)-dimethyl- 1,2,6,7,8,8a(R)-hexahydronaphthyl)ethyl]-4(R)-hydroxy-3,4,5,6- tetrahydro-2H-pyran-2-on-triolsäure (2) durch mikrobiologische Hydrolyse von Lovastatinsäure, einem Fermentationsprodukt, unter Verwendung von Clonostachys compactiuscula oder einer davon abstammenden Hydrolase.
- Die Triolsäure und deren Lactonform sind alte Verbindung, d.h. in der Fachwelt bekannte Verbindungen, und sie sind Inhibitoren für 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A (HMG-CoA)- Reduktase, ein Enzym, das an der Cholesterinbiosynthese beteiligt ist. Als Inhibitoren dieses Enzyms sind sie als antihypercholesterinämische Mittel brauchbar. Sie sind weiter als Zwischenprodukte zur Herstellung anderer antihypercholesten nämischer Mittel brauchbar, insbesondere solcher mit verschiedenen Seitenketten in der 8-Stellung. Zum Beispiel kann Simvastatin, das eine 2,2-Dimethylbutyryloxy-Seitenkette in der 8-Stellung hat, unter Verwendung der Lactonform der Triolsäure als Ausgangsmaterial gemäß bekannten Verfahren hergestellt werden.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine im wesentlichen reine Form des Hydrolaseenzyms, das durch Clonostachys compactiuscula ATCC 38009 und Mutanten davon hergestellt wurde, das in der Lage ist, Lovastatinsäure oder ein Salz davon zu Triolsäure gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung umzuwandeln.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, worin die Triolsäure, die durch Behandlung von Lovastatinsäure oder einem Salz davon mit Clonostachys compactiuscula ATCC 38009 oder Mutanten davon oder einer davon abstammenden Hydrolase hergestellt wurde, danach in ihre Lactonform gemäß herkömmlichen, in der Fachwelt gutbekannten Verfahren umgewandelt wird. ATCC 38009 wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA am 1. Dezember 1978 hinterlegt.
- Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Inhibitoren der HMG-CoA-Reduktase, die als antihypercholesterinämische Mittel brauchbar sind. Es ist nun gut belegt, daß Hypercholesterinämie ein beträchtlicher Risikofaktor bei der Entwicklung von Herz-Kreislaufkrankheiten, insbesondere der Arteriosklerose ist. Verbindungen, die in der Lage sind, das HMG-CoA-Reduktaseenzym zu inhibi eren, stören und schränken die Cholesterin-Biosynthese ein und wirken auf diese Weise als antihypercholesterinämische Mittel. Solche Verbindungen, insbesondere die natürlichen Fermentationsprodukte Compactin und Mevinolin, sind nun gutbekannt. Nichtsdestotrotz wird beständig nach zusätzlichen halbsynthetischen Analoga geforscht, die verbessertes antihypercholesterinämisches Verhalten ergeben. Die Triolsäure, die durch enzymatische Hydrolyse der Lovastatinsäure unter Verwendung eines Enzyms, das von Clonostachys compactiuscula abstammt, gemäß dem biosynthetischen Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, ergibt Mengen eines Ausgangsmaterials zur Herstellung und Produktion solcher halbsynthetischer Analoga.
- Wie schon oben beschrieben sind die Triolsäure und deren Lactonform alte Verbindungen. Die Triolsäure in ihrer Lactonform ist zum Beispiel in Endo, veröffentlichte Japanische Patentanmeldung 86-13798 (1986) beschrieben, worin ihre Herstellung durch Fermentation von Monascus ruber und eine Darstellung ihrer Fähigkeit, die Blutcholesteringehalte zu vermindern, ebenfalls angegeben ist. Die Triolsäure in ihrer Lactonform ebenso wie die Triolsäure selber sind auch in Willard, US-Patent mit der Nr. 4 293 496 (1981) beschrieben. Jedoch werden dort diese Verbindungen durch chemische Hydrolyse hergestellt, um die 8-(α-Methylbutyryloxy)ester- Seitenkette eines Ausgangsmaterials zu entfernen, das ein Fermentationsprodukt eines bestimmten Stammes von Aspergillus terreus ist. Es wird dort nicht vorgeschlagen, daß diese Hydrolyse mikrobiologisch ausgeführt werden könnte.
- Komagata et al., J. Antibiotics, 39, 1574-77 (1986) beschreibt die enzymatische Hydrolyseumwandlung von ML-2368 zu ML-236A, wobei dieselbe Seitenkette wie in der vorliegenden Erfindung entfernt wird. Für 59 von 1600 untersuchten Pilzstämmen wurde gefunden, daß sie wirksam sind, die Hydrolysereaktion zu katalysieren, und Emericella unquis zeigte die stärkste Wirksamkeit. Jedoch ist C. compactiuscula nicht offenbart.
- Endo, veröffentlichte Japanische Patentanmeldung 85-176595 (1985), beschreibt dieselbe Umwandlung wie Komagata et al. oben, nimmt aber zusätzlich die Umwandlung von "Monacolin K" zu "Monacolin J" auf, was dasselbe ist wie die Umwandlung von Lovastatin zur Triolsäure in der vorliegenden Erfindung. Besonders brauchbar sollen die Schimmelpilze Mortierella isabellina, Emericella unquis, Diheterospora chlamydosporia, Humicola fuscoatra, Dichotomomyces cejpii, Neocosmospora africana, Xylocrone sphaerospora, Torulomyces ragena und Thielavia fimeti sein. Jedoch ist die höchste Umwandlungsrate 78% für eine Ausgangsmaterialkonzentration von 0,5 mg/ml, verglichen mit 80-90% bei der vorliegenden Erfindung. Und es gibt einen Hinweis in der eynschlägigen Veröffentlichung von Komagata at al., daß bei höheren Konzentrationen, wie bei den 2,5 mg/ml, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sich ein beträchtlicher Abfall der Wirksamkeit des Enzyms ergibt. So gibt es keinen Vorschlag im Stand der Technik über die verbesserte mikrobiologische Hydrolyse, die unter Verwendung von Clonostachys comnactiuscula erreicht werden kann.
- Die vorliegende Erfindung betrifft die biosynthetische Herstellung von 6(R)-[2-(8(S)-Hydroxy-2(S),6(R)-dimethyl- 1,2,6,7,8,8a(R)-hexahydronaphthyl)ethyl]-4(R)-hydroxy-3,4,5,6- tetrahydro-2H-pyran-2-on-triolsäure durch Behandlung von Lovastatinsäure (1) oder einem Salz davon mit Clonostachys compactiuscula oder Mutanten davon oder einer davon abstammenden Hydrolase. Die Triolsäure kann anschließend durch bekannte Chemie in deren Lactonform umgewandelt werden.
- Das Ausgangsmaterial für das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist Lovastatinsäure (1), die offene Ringform von Lovastatin, oder ein Salz davon. Die Säureform ist das Material, das durch Fermentation von Aspergillus terreus gemäß in der Fachwelt bekannten Zuchtverfahren hergestellt wird. Lovastatin selber ist in wäßrigen Systemen zu unlöslich, um ein brauchbares Ausgangsmaterial für das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu sein; und diejenigen Lösungsmittel, in denen es löslich ist, sind im allgemeinen mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht kompatibel.
- Das Lovastatinsäure-Ausgangsmaterial wird typischerweise in der Salzform verwendet und der Ausdruck "Lovastatinsäure" soll, außer es ist anders angegeben, u.a. ebenso jegliche geeignete Salzform davon bedeuten. Irgendein Salz, das gute Löslichkeit ermöglicht und nicht die anderen bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angetroffenen Bedingungen stören wird, ist zulässig. Zum Beispiel können die Alkalimetallsalze, wie Na und K, verwendet werden. Die Ammoniumsalzform kann verwendet werden und ist bevorzugt.
- Geeigneterweise sind die Strukturformeln für Lovastatinsäure, die Triolsäure und deren Lactonform unten als Formeln 1, 2 bzw. 3 angegeben: 1 Lovastatinsäure 2 Triolsäure 3 Diollacton
- Es wird angenommen, daß der Grundmechanismus der biosynthetischen Herstellung der Triolsäure gemäß der vorliegenden Erfindung die enzymatische Hydrolyse von Lovastatinsaure ist, wobei ein Enzym, das durch Clonostachys compactiuscula ATCC 38009 oder Mutanten davon hergestellt wird, die Entfernung der 8-(α-Methylbutyryloxy)ester-Seitenkette der Lovastatinsäure katalysiert, um die Triolsäure zu ergeben. Wie schon erklärt, ist aus Gründen der Löslichkeit in wäßrigen Systemen gefunden worden, daß es am wünschenswertesten ist, das Lovastatin-Ausgangsmaterial in seiner offenen Ringform oder Säureform zu verwenden, und zu diesem Zweck ist die Ammoniumsalzform der Lovastatinsäure bevorzugt.
- Das durch Clonostachys compactiuscula hergestellte Enzym kann mit dem Lovastatinsäure-Ausgangsmaterial auf eine beliebige Anzahl von Weisen, die alle dem Durchschnittsfachmann bekannt sein werden, in Kontakt gebracht werden. Dies ist die Definition des Ausdrucks "Behandlung" in seinem breitesten Sinn. Zum Beispiel können ganze Zellen verwendet werden und gemäß diesem Verfahren wird eine Fermentationskultur von Clonostachys compactiuscula hergestellt, zu der das Lovastatinsäure- Ausgangsmaterial einfach zugegeben und das Triolsäure-Endprodukt gewonnen wird.
- Eine Variation dieses Verfahrens mit ganzen Zellen ist ein Verfahren, bei dem eine Fermentationskultur von Clonostachys compactiuscula wie oben beschrieben hergestellt wird, aber eine geringere Lovastatinsäure-Konzentration zum Zweck der Induzierung hydrolytischer Aktivität zugegeben wird. Die Zellmasse wird dann geerntet und als Pellets gewonnen, die unmittelbar oder gefroren zur späteren Verwendung verwendet werden können. Diese können zu dem Lovastatinsäure-Ausgangsmaterial zugegeben werden, wobei das letztere in der Fermentationskultur, in der es erzeugt worden ist, z.B. durch Fermentation von Aspergillus terreus, vorhanden ist. Alternativ kann die Lovastatinsäure von ihrem Kulturmedium abgetrennt und dann mit den gefrorenen Clonostachys compactiuscula-Pellets, die oben beschrieben sind, in Kontakt gebracht werden.
- Es ist nicht notwendig, daß die ganzen Clonostachys compactiuscula-Zellen wie oben beschrieben am Leben sind. Es ist auch möglich tote Zellen zu verwenden, z.B. diejenigen, die mit Aceton getrocknet worden sind.
- Als eine Alternative zu ganzen Zellen ist es möglich, rohe Homogenate zu verwenden, die von diesen Kulturen ganzer Zellen erhalten wurden. Es ist auch möglich, das Hydrolase-Enzym selber aus den rohen Homogenaten zu isolieren und zu verwenden.
- Das Verfahren, das Clonostachys compactiuscula-Enzym mit dem Lovastatinsäure-Ausgangsmaterial in Kontakt zu bringen, kann chargenweise oder auf eine kontinuierliche Weise durchgeführt werden. Das Inkontaktbringen dieser Reaktanten selber kann auf verschiedene Weisen in Übereinstimmung mit den Fortschritten der Verfahrenstechnologie modifiziert werden. So kann eine Säule mit immobilisiertem Enzym für das Clonostachys compactiscula-Enzym verwendet Werden, wobei das Lovastatinsäure-Ausgangsmaterial durch die Säule geführt wird. Ein -anderes Beispiel solch einer Verfahrenstechnologie betrifft Membranreaktoren. Ein anderes alternatives Verfahren für das Inkontaktbringen der Reaktanten würde sein, Clonostachys compactiuscula ATCC 38009 oder Mutanten in derselben Fermentationsbrühe, die zur Herstellung des Lovastatins verwendet wird, zu züchten. Es würde auch möglich sein, diese Fermentationsbrühe wenn nötig zu modifizieren, um das Wachstum von Clonostachys compactiuscula, sobald die Lovastatinsäure hergestellt wird, zu unterstützen durch Zugabe von Kulturmedienelementen und anschließende Einführung des Clonostachys compactiuscula ATCC 38009 oder Mutanten, und sie zu kultivieren, um die Triolsäure herzustellen. Es ist jedoch nicht wahrscheinlich, daß dieser Weg optimale Ausbeuten erzeugt. Das bevorzugte Verfahren, die Reaktanten in Kontakt zu bringen, ist mittels der oben beschriebenen Säule mit immobilisiertem Enzym.
- Arbeitsbeispiele, die weiter unten angeben sind, beschreiben das derzeit verwendete Verfahren, um die enzymatische Hydrolyse von Lovastatinsäure darzustellen. Jedoch würden die Verfahren in diesen Arbeitsbeispielen nicht notwendigerweise Verfahren, die zur kommerziellen Herstellung verwendet würden, nahelegen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von Mutanten des spezifischen Stamms von Clonostachys compactiuscula, ATCC 38009, die in der Lage sind, Lovastatin säure in Triolsäure umzuwandeln. Es gibt gutbekannte Verfahren der Fermentationstechnik zur Verbesserung der Ausbeuten erwünschter Produkte, die durch verschiedene Mikroorganismenstämme hergestellt werden. Zum Beispiel kann ein gegebener Zuchtstamm bestrahlt oder anderen Anregungen ausgesetzt werden, von denen bekannt ist, daß sie die beginnende Mutation des genetischen Materials des Mikroorganismus stark steigern. Durch Verwendung eines empfindlichen Siebs, ist es dann möglich, aus den vielen so erzeugten Mutationen nur die auszuwählen, die zu einer erhöhten Produktion des erwünschten Produkts führen. Auf diese Weise ist es üblicherweise möglich, den Ertrag eines Zuchtstammes kontinuierlich durch seine verschiedenen ausgewählten Abkömmlinge zu verbessern. In Hinblick auf die vorliegende Erfindung können ähnliche Verbesserungen des Ertrags an Lovastatinsäure-Hydrolase durch ausgewählte Mutanten von Clonostachys compatiuscula ATCC 38009 erreicht werden. Ein zufriedenstellendes Sieb für diesen Zweck ist die Verwendung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), die die enzymatischen Spaltprodukte bei sehr niedrigen Konzentrationen nachweisen und daher klar bestimmen kann, daß Triolsäure durch irgendeinen bestimmten Mutanten erzeugt worden ist.
- Die Fermentation von Clonostachys compactiuscula wird in wäßrigen Medien, wie denjenigen, die zur Herstellung anderer Fermentationsprodukte verwendet werden, ausgeführt. Solche Medien enthalten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Quellen anorganischer Salze, die durch Mikroorganismen assimilierbar sind.
- Im allgemeinen können Kohlenhydrate, wie Zucker, zum Beispiel Lactose, Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Mannitol und dergleichen, und Stärken, wie Getreide, zum Beispiel Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl und dergleichen, entweder alleine oder in Kombination als Quellen des assimilierbaren Kohlenstoffs im Nährmedium verwendet werden. Die exakte Menge der Kohlenhydratguelle oder Quellen, die in dem Medium verwendet wird, hängt zum Teil von den anderen Bestandteilen des Mediums ab, aber im allgemeinen variiert die Menge des Kohlenhydrats üblicherweise zwischen etwa 1 und 6 Gew.-% des Mediums. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden, oder mehrere solcher Kohlenstoffquellen können in dem Medium vereinigt werden. Im allgemeinen können viele proteinhaltige Materialien als Stickstoffquellen in dem Fermentationsprozeß verwendet werden. Geeignete Stickstoffquellen sind zum Beispiel Hefehydrolysate, Primärhefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Kasein-Hydrolysate, Maisquellwasser, lösliche Schlempeanteile oder Tomatenpaste und dergleichen. Die Stickstoffquellen werden entweder alleine oder in Kombination in Mengen, die von etwa 0,2 bis 6 Gew.-% des wäßrigen Mediums reichen, verwendet.
- Unter den anorganischen Nährsalzen, die in die Kulturmedien aufgenommen werden können, befinden sich die üblichen Salze, die in der Lage sind, Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Carbonat- und dergleichen Ionen zu ergeben. Darunter befinden sich ebenfalls Spurenmetalle, wie Cobalt, Mangan, Eisen und Magnesium.
- Es sollte angemerkt werden, daß die Medien, die in den Beispielen beschrieben werden, lediglich für die große Vielzahl der Medien, die verwendet werden können, beispielhaft sind und daher nicht beschränkend sein sollen. Insbesondere die Kohlenstoffquellen, die in den Kulturmedien verwendet wurden, um Triolsäure herzustellen, sind u.a. Dextrose, Dextrin, feines Hafermehl, Hafermehl, Melassen, Citrat, Sojabohnenöl, Glycerin, Malzextrakt, Lebertranöl, Stärke, Ethanol, Feigen, Natriumascorbat und Schweineschmalzöl. Stickstoffquellen waren u.a. peptonisierte Milch, autolysierte Hefe, Hefe-RNA, Tomatenpaste, Kasein, Primärhefe, Erdnußmehl, lösliche Schlempeanteile, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Maismehl, NZ-Amin, Bohnenextrakt, Asparagin, Baumwollsamenmehl und ein Ammoniumsulfat. Die ionischen Hauptkomponenten sind CaCO&sub3;, KH&sub2;PO&sub4;, MgSo&sub4; 7H&sub2;) und NaCl und geringe Mengen CoCl&sub2; 6H&sub2;O, und Spuren von Fe, Mn, Mo, B, Co und Cu waren ebenso vorhanden.
- Behandlung von Lovastatinsäure mit Clonostachys compactiuscula ATCC 38009 oder Mutanten davon oder einer davon abstammenden Hydrolase gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ergibt die Triolsäure als Hauptprodukt. Es ist jedoch auch erwünscht, die Lactonform dieser Verbindung zu erhalten, da sie ebenfalls als ein antihypercholesterinämisches Mittel oder als ein Zwischenprodukt zur Herstellung solcher Mittel brauchbar ist. Lactonisierung der Triolsäure wird unter Verwendung von Standardverfahren ausgeführt, d.h. entweder hitze- oder säurekatalysierte Lactonisierung. Verfahren zur säurekatalysierten Lactonisierung von mit Lovastatinsäure verwandten Verbindungen sind in US-Patent 4 916 239 beschrieben. Für Triolsäure ist die Lactonisierung durch Rühren in Isopropylacetat, das 7 mM Methansulfonsäure enthält, für 2 Std. bei Raumtemperatur ausgeführt worden.
- Clonostachys compactiuscula ATCC 38009 wurde in einem 2-Liter- Druckluftfermentor mit 1,8 1 Arbeitsvolumen in EN-Medium (Glucose 1%, Pepton 0,2%, Rinderextrakt 0,1%, Hefeextrakt 0,1% und Maisquellwasser 0,3%) bei 29ºC mit einer Belüftungsrate von 1,25 vvm für 48-72 Std. gezüchtet. Lovastatinammoniumsalz wurde zugegeben (0,5 g/l Endkonzentration), um die hydrolytische Aktivität zu induzieren. Die Fermentation wurde 24-72 Std. nach der Zugabe des Lovastatinammoniumsalzes durch w Pressen durch ein Sieb und Waschen der Pellets mit Puffer (20 mM Tris, pH-Wert 8,5) geerntet. Die Zellenpellets wurden, bis sie zum Gebrauch fertig waren, eingefroren.
- Für die Biotransformation wurden Clonostachys compactiuscula- Pellets (17 g Naßgewicht) aus einer Druckluftfermentation mit 20 ml roher Lovastatinsäure (20 gil) in Carbonatpuffer, die aus einer Aspergillus terreus-Fermentation geerntet wurden, in Kontakt gebracht. Die Biotransformation wurde in einem 250-ml- Erlenmeyerkolben bei 27ºC und 160 Umdrehungen pro Minute ausgeführt.
- Nach 17 Std. waren annähernd 60% der Lovastatinsäure in Triolsäure umgewandelt.
- In einem zusätzlichen Experiment wurden Clonostachys compactiuscula-Pellets aus einer Druckluftfermentation (5 g Naßgewicht) mit 10 ml roher Lovastatinsäure (3,5 g/l) in Kontakt gebracht, die aus einer A. terreus-Fermentation durch Methanol extrahiert worden waren. Die Endkonzentration des Methanols in der Biotransformationsmischung war 25%. Die Bioreaktion wurde in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben bei 27ºC und 160 Umdrehungen pro Minute ausgeführt. Nach 2 Std. hatte die Biotransformation unter Verwendung von Clonostachys compactiuscula annähernd 100% der Lovastatinsäure in Triolsäure umgewandelt, wie durch Dünnschichtchromatographie gemessen wurde.
- Clonostachys compactiuscula ATCC 38009 wurde in 250-ml- Schüttelkolben, die 12 ml EN-Medium enthielten, bei 29ºC für 3 Tage gezüchtet. Lovastatinammoniumsalz wurde zugegeben, um eine Konzentration von 0,5 g/l zu ergeben, und die Fermentation wurde für zwei weitere Tage fortgesetzt. Um das rohe Homogenat herzustellen, wurde die Kultur durch Zentrifugation mit 3000 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten geerntet, wonach sie mit 50 mM N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure(TES)-Puffer, pH-Wert 7,7, gewaschen wurde.
- Das Kulturmedium wurde wieder zentrifugiert und die Zellmasse auf Eis abgeschreckt und dann in einem Mörser mit Pistill gemahlen, der Glasbruchstücke und gepulvertes Trockeneis enthielt. Die Inhalte eines Schüttelkolbens wurden in 2,0 ml 50 mM TES-Puffer erneut suspendiert und bei 2000 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten zentrifugiert, um Zelltrümmer und Glasfragmente zu entfernen. Der Überstand wurde als die Quelle des rohen Homogenats mit einer Proteinkonzentration von annähernd 0,5 mg/ml verwendet.
- Um die Biotransformation auszuführen, wurde ein Volumen des rohen Homogenats mit einem gleichen Volumen Lovastatinsäureammoniumsalz (5 g/l) kombiniert, und die Mischung wurde bei 29ºC inkubiert. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde 80- 90%ige Umwandlung von Lovastatinsäure zu Triolsäure innerhalb von 2 Std. beobachtet.
- Ein Hydrolaseenzym, das die Biotransformation von Lovastatinsäure zu Triolsäure durchführt, wurde durch schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC ) unter Verwendung einer Mono Q -Anionenaustauschersäule bis nahe zur Homogenität aus Homogenaten von Clonostachys compactiuscula unter Verwendung der unten beschriebenen Verfahren gereinigt.
- Ein Überstand aus der Zentrifugation bei 2000 Umdrehungen pro Minute wie in Beispiel 2 oben, wobei jedoch die 50 mM TES- Puffer durch 20 mM Tromethamin(TRIS)-Puffer ersetzt wurden, wurde bei 15 000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert und der resultierende Überstand durch einen 0,45-µm-Filter filtriert.
- Filtratchargen (10 ml), die 0,3-0,5 mg/ml Protein enthielten, wurden dann auf eine Pharmacia-Mono-Q -Anionenaustauschersäule gegeben, die mit einem System zur schnellen Pharmacia-Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC ) verbunden war.
- Nachdem man die anionischen Proteine sich an die Säulenmatrix binden gelassen hatte, wurde die Hydrolase durch die Aufbringung eines linearen Natriumchlorid-Gradienten (0-500mM) spezifisch eluiert. Eluiertes Protein wurde in 1-ml-Fraktionen gesammelt und unter Verwendung von entweder Lovastatinammoniumsalz (wobei die Hydrolyse in Prozent durch DSC und Densitometrie oder HPLC bestimmt wurde) oder eines kalorimetrischen Substrats (ortho-Nitrophenylbutyrat, o-NPB), gegen das das Enzym hydrolytische Aktivität gezeigt hatte, untersucht. Wenn das letztere Substrat verwendet wurde, wurde die hydrolytische Reaktion spektrophotometrisch bei 410 nm im wesentlichen wie von Lawrence, R.C. et al. in J. Gen. Microbiol. (1967) 48, 401-418 beschrieben überwacht. Beide Untersuchungsmethoden zeigten, daß die Hydrolase eluiert wurde, wenn die NaCl-Konzentration sich 300 mM näherte.
- Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese zeigte, daß der Peak der Lovastatinsäurehydrolase enthaltenden Fraktionen eine vorherrschende Bande mit einem Molekulargewicht von ungefähr 45 000 Dalton enthielt.
- Unter Verwendung des gereinigten Enzympräparats wurde die Biotransformation gemäß den oben in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt, und eine Schätzung wurde durchgeführt zum Km-Wert der Hydrolase und zur spezifischen Aktivität mit Lovastatinammoniumsalz als Substrat. Der erhaltene Km-Wert war 4,14 mM und unter sättigenden Substratbedingungen wurde gefunden, daß das Enzym eine spezifische Aktivität von 0,11 mmol Lovastatinammoniumsalz/mg Protein pro Stunde hat.
Claims (5)
1. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 2
2 Triolsäure
oder eines Salzes davon in gewinnbaren Mengen davon, das die Behandlung
einer Verbindung der Formel 1
1 Lovastatinsäure
oder eines Salzes davon mit Clonostachys compactiuscula ATCC 38009 oder
Mutanten davon oder einer davon abstammenden Hydrolase und die Gewinnung
des Produkts umfaßt.
2. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das Salz das Ammoniumsalz ist.
3. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Hydrolase in gereinigter Form
und auf einer Säule immobilisiert vorliegt, und die Verbindung der Formel 1 mit
ihr durch Durchfluß durch die Säule in Kontakt gebracht wird.
4. Eine im wesentlichen reine Form des Hydrolaseenzyms, hergestellt durch
Clonostachys compactiuscula ATCC 38009 und Mutanten davon und in der
Lage, ein Verfahren nach Anspruch 1 auszuführen.
5. Das Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Lactonisierung der
Triolsäure der Formel 2 umfaßt, um ein Diollacton der Strukturformel 3:
3 Diollacton
zu ergeben.
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