DE3829005A1

DE3829005A1 - Gangliosidceramidase und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE3829005A1
Application number: DE3829005A
Authority: DE
Inventors: Yoshio Hirabayashi; Tatsurokuro Tochikura; Setsu Kadowaki; Kenji Yamamoto
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1987-08-28
Filing date: 1988-08-26
Publication date: 1989-03-16
Also published as: US4997760A; JPS6460379A

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Gangliosidceramidase und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Ganglioside werden in den Zelloberflächenmembranen von Säugetieren und -organen, in größeren Mengen vor allem in Nervengeweben, gefunden. Es sind Sphingolipide, gebildet durch Bindung von Ceramiden an Oligosaccharide, die mindestens einen sauren Saccharidrest, z. B. einen N-Acetylneuraminsäurerest, enthalten. Als diese Ganglioside sind z. B. GD1a, GM1, GM2 und GM3 bekannt.

Ein GM2-Gangliosid wird durch die Struktur GalNAc 1-4 (NeuAc 2-3) Gal 1-4Glc 1-1′ cer dargestellt, worin Gal Galaktose, GalNAc N-Acetylgalactosamin, Glc Glucose, NeuAc N-Acetylneuraminsäure und cer einen Ceramidrest bedeuten. Das GM2-Gangliosid sammelt sich bei der lysosomalen Speicherkrankheit, der sogenannten Tay-Sachs- Krankheit an und wird in dem Lysosom durch eine Reihe von Enzymen abgebaut, wobei am nichtreduzierenden Ende des Moleküls begonnen wird. Es ist jedoch bekannt, daß ein spezifischer Aktivator beim Stoffwechselabbau von GM2-Gangliosid mit β-Hexosaminidase A erforderlich ist (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Band 75 (1978), Seiten 3979 bis 3983; Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., Band 360 (1979), S. 1837 bis 1849; J. Biol. Chem., Band 256 (1981), Seiten 6234 bis 6240). Das GM2-Gangliosid wird nicht von einer aus Schimmelpilzen, wie Aspergillus niger (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., Band 364 (1983), Seiten 821 bis 829), Penicillium oxalicum (Agric. Biol. Chem., Band 49 (1985), Seiten 611 bis 619) und Mucor fragilis (Applied Environ. Microbiol., Band 51 (1986), Seiten 1019 bis 1023) isolierten exo-β- N-Acetylhexosaminidase abgebaut.

Ein Enzym, welches die Bindung zwischen Sphingosin als Base und einer Fettsäure eines Ceramids hydrolysiert, bezeichnet man als Ceramidase, z. B. EC 3.5.1.23 (J. Biol. Chem., Band 241 (1966), Seiten 3731 bis 3737; Biochemistry, Band 8 (1969), Seiten 1692 bis 1698; Biochim. Biophys. Acta, Band 176 (1969), Seiten 339 bis 347; Science, Band 178 (1972), Seiten 1100 bis 1102). Aber diese Ceramidase hydrolisiert nicht die Bindung zwischen Sphingosin als Base und einer Fettsäure eines Glycolipids wie eines Gangliosids.

Wie oben erwähnt, baut eine aus Schimmelpilzen isolierte exo-N-Acetylhexosaminidase das GM2-Gangliosid nicht ab. Ein Enzym, welches das GM2-Gangliosid abbaut, ist nicht bekannt.

Die Erfindung stellt eine neue Gangliosidceramidase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften zur Verfügung:

a) Eine Substratspezifität für mindestens GD1a, GM1, GM2 und GM3;
b) Eine Enzymwirkung in der Form, daß eine Einwirkung auf mindestens GD1a, GM1, GM2 und GM3 erfolgt sowie die Hydrolyse eines Gangliosids in Lysogangliosid und Fettsäure katalysiert wird.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Gangliosidceramidase bereit, das gekennzeichnet ist durch Züchten eines Gangliosidceramidase erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Nocardia in einem Kulturmedium und Isolieren der Gangliosidceramidase aus der Kultur.

Es ist nun gelungen, ein Enzym zu isolieren und zu reinigen, welches das Lysogangliosid GM2 und eine Fettsäure durch Hydrolyse eines als Substrat dienenden GM2-Gangliosids erzeugt, wobei das Enzym aus einer Kultur des Mikroorganismus N282, der ein Stamm der Gattung Nocardia ist und aus einem Waldboden in Himeji-shi in Hyogo-ken, Japan, stammt und daraus isoliert worden ist. Dieses Enzym ist neu und weist besondere physikalisch- chemische Eigenschaften sowie eine neue Enzymwirkung auf, indem es nicht Gal-cer, Glc-cer, Lac-cer, Gb3-cer und Asialo-GM1, sondern mindestens GD1a, GM1, GM2 und GM3 als Substrat verwendet. Es hydrolisiert Ceramid in diesem Gangliosidmolekül zu Sphingosin als Base und Fettsäure unter Bildung eines Lysogangliosids und Fettsäure. Dieses Enzym wurde "Gangliosid ceramidase" genannt.

Die Merkmale einer Kultur des obengenannten Stammes N285 der Gattung Nocardia in verschiedenen Kulturmedien mittels visueller und mikroskopischer Betrachtung sind folgende:

A. Mikroskopische Betrachtung

Kurze Hyphen von 5 bis 10 µm werden in ruhender Kultur in einem Fleischextrakt-, einem Pepton- oder einem Glucose-Pepton-Hefeextrakt-Medium gebildet. Einfach verzweigt. Gerade oder gekrümmte, aber kurze Stäbchenform und bereit zur Aggregation in einer flüssigen Schüttelkultur.

B. Wachstum

1. Medium: Saccharose-Nitrat-Agar
Wachstum: Gut
Farbe der Kolonien: Weiß bis pfirsichfarben
Form der Kolonien: Konvex-kreisförmig oder kreisförmig
Hyphen: Kurz
2. Medium: Glucose-Asparagin-Agar
Wachstum: Ziemlich gut
Farbe der Kolonien: Bräunlich-weiß
Form der Kolonien: Amorphe Randform
3. Medium: Stärke-Agar
Wachstum: Ziemlich gut
Farbe der Kolonien: Bräunlich-weiß
Form der Kolonien: Große Kreise
4. Medium: Tyrosin-Agar
Wachstum: Ziemlich gut
Farbe der Kolonien: Bräunlich-weiß
Form der Kolonien: Amorph, granulatartig, konvex- kreisförmig
Hyphen: Lang.
5. Medium: Hefe-Malz-Agar
Wachstum: Ziemlich gut
Farbe der Kolonien: Milchig-weiß
Form der Kolonien: Ziemlich groß, konvex-kreisförmig

In den Medien 1 bis 5 ist keine Pigmentbildung auf der Hyphenrückseite feststellbar.

C. Physiologische Eigenschaften

Nicht freibewegliche Aerobier
Wachstumstemperatur: 15 bis 30°C
Gelatinverflüssigung: Negativ
Stärkehydrolyse: Negativ
Produktion von melaninartigem Pigment (Medium: Tryrosin-Agar): Negativ
Nitratreduktionsvermögen: Positiv
Denitrifizierungsreaktion: Negativ
MR-Test (Test auf Bildung von Säure in einem Glucose-Phosphat- Medium, das Methylrot enthält), VP-Test (Voges-Proskauer-Test auf Bildung von Acetoin), Indolbildung: Negativ
Verwertung anorganischer Stickstoffquellen: Möglich (Wachstum ist möglich in allen Medien, außer denen der Bernsteinsäure oder Glutaminsäure).
Säurebildung aus Zucker: Negativ mit Glucose, Galaktose, Mannose und Saccharose.
Katalase: Positiv
Kohlenstoffassimilation (auf Pridham-Gottlieb-Agar):

1. L-Arabinose: Negativ
2. D-Xylose: Negativ
3. D-Glucose: Positiv
4. D-Fructose: Positiv
5. Saccharose: Positiv
6. L-Rhamnose: Negativ
7. Raffinose: Negativ
8. Mannit: Negativ

Der Stamm N285 wurde aufgrund von Merkmalen, wie Kolonieform und einfacher Hyphenverzweigung, als der Gattung Nocardia identifiziert und "Nocardia sp. N285" genannt. Der Stamm wurde am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, unter der Nr. FERM P-9540 und dann gemäß dem Budapester Vertrag unter der Nr. FERM BP-1830 hinterlegt.

Die Zeichnungen erläutern die Erfindung. In ihnen zeigen:

Fig. 1 die Ergebnisse von Untersuchungen der Abbauprodukte, welche durch Einwirken von Gangliosid ceramidase auf GM2 als Substrat mittels hochauflösender Dünnschichtchromatographie (nachfolgend abgekürzt "HPTLC") erhalten wurden;

Fig. 2 die Fettsäurefreisetzung durch Gangliosidceramidase in Abhängigkeit vom pH-Wert;

Fig. 3 die Restaktivität bzw. Stabilität der Gangliosid ceramidase in Abhängigkeit vom pH-Wert;

Fig. 4 den Einfluß der Reaktionstemperatur auf die Fettsäurefreisetzung durch Gangliosidceramidase (Temperaturoptimum); und

Fig. 5 die Restaktivität in Abhängigkeit von der Behandlungstemperatur (thermische Stabilität) der Gangliosidceramidase.

Die erfindungsgemäße Gangliosidceramidase weist mindestens die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften und Enzymwirkungen auf:

1. Substratspezifität für mindestens GD1a, GM1, GM2 und GM3,
2. Enzymwirkung auf mindestens GD1a, GM1, GM2 und GM3 und Katalyse der Hydrolyse von Gangliosid in Lysogangliosid und Fettsäure.

Beispielsweise wird als der Gangliosidceramidase erzeugende Mikroorganismus der Erfindung der oben erwähnte Stamm N285 der Gattung Nocardia genannt. Aber alle anderen Gangliosidceramidase erzeugenden Mikroorganismen der Gattung Nocardia können erfindungsgemäß verwendet werden. Natürlich sind Mikroorganismen leicht auf natürliche oder künstliche Weise mutierbar. Auch eine Genmanipulation kann als künstlicher Weg des Mutierens angewandt werden. Diese Mutanten können auch in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, soweit sie die Bildung von Gangliosidceramidase beibehalten.

Zur Ausführung der Erfindung wird zuerst der Gangliosid ceramidase erzeugende Mikroorganismus der Gattung Nocardia nach einem herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Enzymen oder Antibiotika gezüchtet. Die Züchtung kann entweder in flüssiger oder fester Kultur durchgeführt werden.

Die Nährstoffe des Kulturmediums können solche sein, wie sie üblicherweise für eine Mikroorganismuskultur verwendet werden. Die Stickstoffquelle können beliebige Stickstoffverbindungen sein, z. B. in Form von Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenpulver, Pepton, verschiedenen Fleischextrakten, Hefeextrakten, Ammoniumsulfat oder Ammoniumnitrat. Die Kohlenstoffquelle kann eine assimilierbare Kohlenstoffverbindung sein, z. B. in Form von Glucose, Melasse, Glyzerin oder Saccharose. Wenn nötig, können auch Salze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat sowie ein- und zweibasisches Kaliumphosphat verwendet werden. Vorzugsweise werden dem Kulturmedium von 0,01 bis 0,5% eines Gangliosids, wie GM1, GM2 oder GM3 zugesetzt, um die Bildung an Gangliosidceramidase zu erhöhen.

Die Züchtungstemperatur beträgt gewöhnlich von 26 bis 30°C und kann gegebenenfalls innerhalb des Bereiches geändert werden, in dem Mikroorganismen wachsen und Gangliosidceramidase erzeugen können. Die Züchtungszeit ändert sich in Abhängigkeit von den Bedingungen, beträgt aber gewöhnlich etwa 50 bis 100 h. Das Züchten kann zu einem geeigneten Zeitpunkt beendet werden, nämlich dann, wenn die Gangliosidceramidase den höchsten Titer erreicht hat. In der auf diese Weise erhaltenen Kultur ist die Gangliosidceramidase in dem Mikroorganismus enthalten und gespeichert.

Dann wird aus der so erhaltenen Kultur die Gangliosid ceramidase extrahiert, wobei eine rohe Gangliosidceramidase enthaltende Lösung anfällt. Diese kann beispielsweise nach dem folgenden Verfahren aufgearbeitet werden. Zuerst wird die Kultur in den festen und den flüssigen Teil getrennt. Der erhaltene nasse Mikroorganismus wird, wenn nötig, in einer Phosphat- oder einer Tris- HCl-Pufferlösung suspendiert. Dann wird er einer fakultativen Kombination von Zellzerstörungsbehandlungen, wie einer Lysozym-, Ultraschall- oder French-press-Behandlung unterworfen, um auf diese Weise die Gangliosid ceramidase aus den Zellen zu extrahieren und eine rohe Gangliosidceramidase enthaltende Lösung zu gewinnen.

Dann wird diese Lösung nach bekannten Methoden zum Isolieren und Reinigen von Proteinen und Enzymen behandelt, um eine gereinigte Gangliosidceramidase zu erhalten. Beispielsweise wird eine wäßrige Protaminsulfatlösung nach Bedarf der rohen Gangliosidceramidase enthaltenden Lösung zugesetzt, um Nucleinsäure abzutrennen. Dann wird zu der Lösung ein organisches Lösungsmittel wie Aceton, Methanol, Ethanol oder Isopropanol, gegeben, um die Gangliosidceramidase fraktioniert auszufällen, oder zu der Lösung wird Ammoniumsulfat oder Aluminiumchlorid gegeben, um die Gangliosidceramidase auszusalzen, und anschließend wird die die Gangliosidceramidase enthaltende Fraktion aus der wäßrigen Lösung ausgefällt und gewonnen.

Dieses Präzipitat der die Gangliosidceramidase enthaltenden Fraktion kann beispielsweise durch Elektrophorese gereinigt werden, bis ein einziger Fleck auftritt. Das Reinigungsverfahren umfaßt z. B. das Lösen des die Gangliosidceramidase enthaltenden Präzipitats in einer geeigneten Pufferlösung. Anschließend wird diese Lösung einer Chromatographie an einem Anionenaustauscher, wie Diethylaminoethyl-Cellulose oder vernetztem Diethylaminoethyl-Dextran-Gel oder einem Gelfiltrationsmittel, wie einem Dextran- oder Polyacrylamidgel, unterworfen. Diese Mittel können zur Reinigung entsprechend kombiniert werden. Wenn nötig, werden zu der erhaltenen gereinigten Gangliosidceramidase ein oder mehrere Stabilisatoren, wie Rinderserumalbumin (BSA), N,O-Bis(trimethylsilyl)-acetamid, Gelatine, Aminosäure, Saccharose, Glyzerin oder Ethylenglykol, gegeben, um nach entsprechender Behandlung ein lyophilisiertes Pulver der Gangliosidceramidase zu erhalten.

Die Enzymaktivität der Gangliosidceramidase der vorliegenden Erfindung sowie die physikalisch-chemischen Eigenschaften, wie Substratspezifität und Enzymwirkung, werden nach den folgenden Verfahren bestimmt.

1. Verfahren zum Bestimmen der Enzymaktivität

Die Aktivität der erfindungsgemäßen Gangliosidceramidase wird unter Verwendung eines mit ¹⁴C-Stearinsäure markierten GM2 als Substrat bestimmt. 5 µg eines ¹⁴C-markierten GM2 (2,6 × 10⁴ cpm), 100 µg Taurodesoxycholinsäure und eine vorgegebene Menge an Enzym werden mit einer 0,2-molaren Natriumacetatpufferlösung (pH 5,8) auf 100 µl aufgefüllt. Diese Reaktionslösung wird bei 37°C während 1 bis 24 h geschüttelt, und anschließend wird Methanol in der fünffachen Menge der Reaktionsmischung zugegeben, um die Reaktion zu beenden.

Die Reaktionslösung wird in Gegenwart von Stickstoffgas zur Trockene eingedampft, dann das Produkt mit Chloroform-Methanol (9 : 1) extrahiert und auf eine kleine Säule mit 0,5 g Silicagel (Iatrobeads der Fa. Iatron Co.) gegeben. Die durch die Enzymreaktion freigesetzte ¹⁴C-Stearinsäure wird mit 1,0 ml desselben Lösungsmittels eluiert und ihre Radioaktivität in einem Flüssigszintillationzähler (Aloka, Model 661) bestimmt.

Eine Einheit der Enzymaktivität wird als die Menge Enzym definiert, die 1 pmol GM2-Ganliosid pro h hydrolysiert.

Das mit ¹⁴C-Stearinsäure markierte GM2-Gangliosid wird dadurch hergestellt, daß man zuerst ¹⁴C-Stearinsäureanhydrid gemäß dem Verfahren, wie es in J. Lipid Res., Band 7 (1966), Seiten 174 bis 175, beschrieben ist, herstellt. Es werden 5 mg des Anhydrids zu 2 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (2 : 1 Volumteile) gegeben, das synthetisches Lysogangliosid GM2 (von Dr. K. Sandhoff der Universität Bonn zur Verfügung gestellt) enthält, um es zu acylieren, und anschließend wird durch Dünnschichtchromatographie (nachfolgend abgekürzt "TLC") gereinigt.

2. Substratspezifität

Jeweils 10 nmol der in der Tabelle I angegebenen Glykolipide mit einem Gehalt an Gangliosid werden mit 100 µl einer 0,05-molaren Natriumacetatpufferlösung (pH-Wert 5,8), welche 90 Einheiten einer Gangliosidceramidase und 50 µg Taurodesoxycholinsäure enthält, bei 37°C während 12 h umgesetzt. Dann wird die Umsetzung durch Zugabe von 0,5 ml Methanol beendet. Die Reaktionsmischung wird in Gegenwart von Stickstoffgas zur Trockene eingedampft und durch HPTLC analysiert.

Die Abbaugeschwindigkeit jedes Glykolipids wird bei einer Wellenlänge von 580 nm für das Gangliosid und bei 720 nm für neutrales Glykolipid mittels einer Zweiwellenlängen-TLC-Abtastvorrichtung (910, von der Fa. Shimadzu Seisakusho Co.) bestimmt.

Das Hydrolyseverhältnis wird nach der folgenden Gleichung berechnet:

Hydrolyseverhältnis (%) = (Peakfläche der Lysogangliosidbildung) × 100/(Peakfläche des verbleibenden Glykolipids + Peakfläche des gebildeten Lysogangliosids).

Die Ergebnisse sind in der Tabelle I angegeben.

Tabelle I

In den Formeln bedeuten Gal Galaktose GalNAc N-Acetylgalaktosamin, Glc Glucose, NeuAc N-Acetylneuraminsäure und cer einen Ceramidrest.

Aus den oben genannten Ergebnissen ergibt sich, daß die Gangliosidceramidase der vorliegenden Erfindung eine Substratspezifität für mindestens GD1a, GM1, GM2 und GM3 aufweist.

3. Enzymwirkung

Die Gangliosidceramidase der vorliegenden Erfindung wirkt auf mindestens GD1a, GM1, GM2 sowie GM3 und katalysiert die Hydrolyse des Gangliosids zum Lysogangliosid und Fettsäure.

4. Bestätigung der Enzymwirkung

Man läßt Gangliosidceramidase auf GM2 als Substrat einwirken, und das Abbauprodukt wird identifiziert.

Zuerst läßt man Gangliosidceramidase auf GM2 einwirken und das Abbauprodukt Lyso-GM2 wird durch Iatrobeads- Säulenchromatographie gemäß Biochim. Biophys. Acta, Band 441 (1976), Seiten 488 bis 497 mit einem Adsorptionsmittel auf der Basis von Silicagel (Iatribeads) gereinigt. Die Reinheit wird mittels HPTLC (von der Fa. Merck) überprüft. Die verwendeten Lösungsmittelsysteme sind Chloroform : Methanol : Wasser = 5 : 4 : 1 (System A) und Chloroform : Methanol : Ammoniak : Wasser = 60 : 40 : 2 : 8 (System B). Resorcin-Salzsäure und Ninhydrinreagens werden zum Anfärben des Gangliosids und des Lysogangliosids sowie α-Naphthol-Schwefelsäurereagens zum Anfärben des neutralen Glycolipids verwendet.

Die Ergebnisse der HPTLC sind in der Fig. 1A (System A; worin 1 GM2, 2 das Abbauprodukt und 3 synthetisches Lyso-GM2 bedeuten) und der Fig. 1B (System B; worin die Zahlen die vorgenannte Bedeutung haben) dargestellt.

Es zeigt sich, daß bei Verwendung von zwei verschiedenen Lösungsmitteln das Verhalten des Abbauprodukts von GM2 durch Gangliosidceramidase in der TLC völlig dem des synthetischen Lyso-GM2 entspricht.

Dieses Abbauprodukt zeigte sowohl mit dem Ninhydrinreagens als auch mit Resorcin-Salzsäure eine positive Wirkung.

Neutralzucker und Aminozucker in dem Abbauprodukt und dem Substrat GM2 wurden durch Gaschromatographie nach einer Methanolyse, N-Acetylierung und Trimethylsilylierung gemäß Biochim. Biophys. Acta, Band 222 (1970), Seiten 339 bis 347, analysiert. Fettsäuremethylester wurden durch Gaschromatographie gemäß den Bedingungen in Biochim. Biophys. Acta, Band 529 (1978), Seiten 96 bis 195, analysiert.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Aus den obengenannten Ergebnissen zeigt sich, daß das Abbauprodukt und GM2 Glucose, Galaktose, N-Acetylgalaktosamin und N-Acetylneuraminsäure in äquimolaren Konzentrationen enthalten. Darüber hinaus war keine Fettsäure in dem Abbauprodukt nachweisbar. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß das Abbauprodukt eine Verbindung ist, die als Ergebnis der Freisetzung von Fettsäure aus dem Substrat GM2 durch Hydrolyse gebildet wird.

In Verbindung mit den Ergebnissen der HPTLC ist es daher eindeutig, daß das Abbauprodukt Lyso-GM2 ist.

Daß das Abbauprodukt die Struktur des Lyso-GM2 aufweist, wurde auch durch ein FAB- (Fast Atom Bombardement) Massenspektrum bestätigt. Der Molekularionen-Peak (M-H)^- des Substrats GM2 wurde einem m/z-Verhältnis von 1382 gefunden. Für das Abbauprodukt wurde ein stark negativer Ionen-Peak bei einem m/z-Verhältnis von 1116, der dem Fehlen eines Fettsäurerestes (hauptsächlich Stearinsäure) zuzuschreiben ist, gefunden. Keine Änderung war sowohl bei seinen Kohlenhydrat- als auch Sphingosinanteilen festzustellen.

Wenn ein anderes Gangliosid anstelle von GM2 als Substrat verwendet wurde, wurde das Abbauprodukt ebenfalls als Lysogangliosid identifiziert, das Fettsäure abspaltete.

Die obengenannten Ergebnisse bestätigen, daß die Gangliosidceramidase der vorliegenden Erfindung die erwähnte neue Enzymwirkung zeigt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Nocardia sp. N285 (FERM P-9540, FERM BP-1830) wurde in 4000 ml eines hitzesterilisierten, flüssigen Kulturmediums, das 0,2% Polypepton sowie 0,1% Gangliosid GM2 enthielt sowie einen pH-Wert von 7,6 aufwies, eingeimpft und während 96 h bei 30°C kultiviert. Danach wurde die Kultur zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die Zellen wurden in einer Phosphatpufferlösung (pH 7,2) suspendiert und in einer handelsüblichen Vorrichtung (Sonifier Cell Disruptor 200 der Fa. Branson Co.) einer Ultraschallbehandlung in Intervallen von 30 s während insgesamt 2 min unterworfen. Das erhaltene Homogenat wurde bei 1800 g während 5 min zentrifugiert, um Zelldebris zu entfernen. Der Überstand wurde bei 68 000 g während 60 min zentrifugiert, das Präzipitat gewonnen und zu einer Phosphatpufferlösung (pH 7,2) gegeben. Die spezifische Aktivität der Gangliosidceramidase der Lösung war 1,7 × 10⁴ Einheiten/mg Protein.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der erhaltenen Gangliosidceramidase waren folgende:

1. Substratspezifität für mindestens GD1a, GM1, GM2 und GM3.
2. Enzymwirkung auf mindestens GD1a, GM1, GM2 und GM3 und Katalyse der Hydrolyse von Gangliosid zu Lysogangliosid und Fettsäure.
3. pH-Optimum von 5,8 ± 0,5.
Verfahren zur Bestimmung des pH-Optimums: Die Bestimmung wird auf die gleiche Weise ausgeführt wie die Bestimmung der Enzymaktivität, wobei nur der pH-Wert der Reaktionslösung, wie sie bei der Bestimmung der Enzymwirkung benutzt wird, geändert wird.
Die Ergebnisse sind in der Fig. 2 dargestellt, worin ○-○ den Fall der Verwendung eines Natriumacetatpuffers und ○-○ den Fall der Verwendung eines MES-Puffers (2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure) betrifft.
4. Stabilität im pH-Bereich von 6 bis 8,5.
Bestimmungsverfahren: Das Enzym wird in 10 mmol MES-Pufferlösung gelöst. Die Lösung wird bei 37°C während 60 min erwärmt. Die Enzymaktivität wird gemäß dem Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der Fig. 3 dargestellt, welche die pH-Stabilitätskurve zeigt.
5. Temperaturoptimum von 35 ± 2°C.
Bestimmungsverfahren: Die Bestimmung wird gemäß dem Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität durchgeführt, wobei nur die Reaktionstemperatur geändert wird.
Die Ergebnisse sind in der Fig. 4 dargestellt, die sich auf eine Natriumacetatpufferlösung bezieht.
6. Wärmestabilität von annähernd 45°C (pH 7,2; 30 min).
Bestimmungsverfahren: Das Enzym wird in einer Phosphatpufferlösung (10 mmol; pH 7,2) gelöst. Die Lösung wird bei jeder Temperatur während 30 min erhitzt und mit Eis abgekühlt. Die Aktivität dieser Enzymlösung wird gemäß dem Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der Fig. 5 dargestellt.
7. Eine Inhibierung und Aktivierung mit EDTA und Ionen.
Bestimmungsverfahren: Zu der Reaktionslösung gemäß der Bestimmung der Enzymaktivität werden EDTA und Metallionen, wie sie in der Tabelle III angegeben sind, in einer Konzentration von 10 mmol zugesetzt, und die Aktivität gemäß dem Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität wird bestimmt.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle III zusammengefaßt.

EDTA und zugesetzte Ionen
relative Aktivität (%)
keine Zugabe
100
10 mmol EDTA	29,9
10 mmol BA⁺⁺	123,6
10 mmol Mg⁺⁺	115,3
10 mmol Fe⁺⁺	95,1
10 mmol Ca⁺⁺	88,2
10 mmol Mn⁺⁺	35,4
10 mmol Sn⁺⁺	16,0
10 mmol Cu⁺⁺	13,2
10 mmol Hg⁺⁺	10,4
10 mmol Zn⁺⁺	5,6

Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Gangliosidceramidase bereit, welche als Enzymreagens zur Analyse verschiedener Ganglioside und diagnostischer Reagenzien wertvoll ist. Durch die Wirkung dieser Gangliosidceramidase kann Lysogangliosid aus Gangliosid gebildet werden. Überdies kann man aus dem so erhaltenen Lysogangliosid ein markiertes Gangliosid erhalten, z. B: durch Wiedereinführung einer markierten Fettsäure. Außerdem kann der Gehalt an Glycolipid durch Dansylierung mit einer fluorenszenzmarkierten Verbindung, z. B. Dansylchlorid, bestimmt werden. Zusätzlich kann das fluoreszenzmarkierte Gangliosid als ein Substrat zur Bestimmung der Enzymaktivität von z. B. Sialidase verwendet werden. Die freie Aminogruppe des Lysogangliosids wird an eine carboxylgruppenhaltige Proteinverbindung, wie Albumin, durch herkömmliche Verfahren gebunden, und das erhaltene Produkt kann als Antigen oder zur Produktion von Antikörpern verwendet werden. Wenn es an einen unlöslichen, carboxylgruppenhaltigen Träger gebunden ist, kann das Produkt als ein immobilisiertes Antigen benutzt werden. Auf diese Weise werden neue diagnostische Reagenzien bereitgestellt.

Claims

1. Gangliosidceramidase, gekennzeichnet durch mindestens die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
Eine Substratspezifität für mindestens GD1a, GM1, GM2 und GM3, sowie eine Enzymwirkung in der Form, daß eine Einwirkung auf mindestens GD1a, GM1, GM2 und GM3 erfolgt sowie die Hydrolyse eines Gangliosids zu einem Lysogangliosid und einer Fettsäure katalysiert wird.

2. Gangliosidceramidase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein pH-Optimum von 5,8 ± 0,5, eine Stabilität im pH-Bereich von 6 bis 8,5 und ein Temperaturoptimum von 35 ± 2°C aufweist sowie bei 45°C und einem pH-Wert von 7,2 während 30 min im wesentlichen stabil ist.

3. Verfahren zum Herstellen einer Gangliosidceramidase, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gangliosidceramidase erzeugender Stamm der Gattung Nocardia in einem Kulturmedium gezüchtet und die Gangliosidceramidase aus der Kultur gewonnen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Gangliosidceramidase gewonnen wird, die mindestens die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist:
Eine Substratspezifität für mindestens GD1a, GM1, GM2 und GM3, sowie eine Enzymwirkung in der Form, daß eine Einwirkung auf mindestens GD1a, GM1, GM2 und GM3 erfolgt sowie die Hydrolyse eines Gangliosids zu einem Lysogangliosid und einer Fettsäure katalysiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Gangliosidceramidase gewonnen wird, die ein pH-Optimum von 5,8 ± 0,5, eine Stabilität im pH-Bereich von 6 bis 8,5 und ein Temperaturoptimum von 35 ± 2°C aufweist und bei 45°C und einem pH-Wert von 7,2 während 30 min im wesentlichen stabil ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als der zu der Gattung Nocardia gehörende, Gangliosidceramidase erzeugende Stamm Nocardia sp. N285 (FERM P-9540, FERM BP-1830) eingesetzt wird.