DE2500597A1

DE2500597A1 - Verfahren zur gleichzeitigen herstellung von beta-amylase und alpha-1,6-glucosidase

Info

Publication number: DE2500597A1
Application number: DE19752500597
Authority: DE
Inventors: Yoshimasa Takahara; Yoshiyuki Takasaki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1974-01-11
Filing date: 1975-01-09
Publication date: 1975-07-17
Also published as: FR2257683B1; DE2500597C2; US3992261A; GB1466009A; NL7500283A; YU323780A; SE7500274L; NL180021C; FR2257683A1; DD116853A5; CS203974B2; SU611596A3; JPS536232B2; BE828972A; JPS50100287A; BR7500131A; IT1026306B; NL180021B; PL96758B1; HU173275B

Description

DR. MÜLLER-BORE · DIPL.-ING. GROENIJMG

I)IPL₁-CHEM. DR. DEUFEL · DIPL.-CIIEM. DR. SCHÖN

DIPL.-PHYS. IIERTEL

PATENTANWALTK

- 9. JAN. 1975

A 2410 - tM/th

AGENCY OF INDUSTRIAL SCIENCE & TECHNOLOGY, 3-1 Kasumigaseki 1 chome, Chiyoda-ku>

Tokyo / Japan

Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von ß-Amylase und OC-1, 6-Glucosidase.

Unionspriorität: 11. Januar 1974

Japan Nr. 6465/74

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von ß-Amylase und O(-1,6-Glucosidase mit Hilfe eines Mikroorganismus und die Verwendung dieser Enzyme zur Herstellung von Maltose aus Stärke.

Bislang ist ß-Amylase ( oC-1,4-Glucan-maltohydrqlase) überwiegend in Malz und Sojabohnen gefunden worden. In kommerziellem Maßstab werden diese Materialien heutzutage als Quellen für das Enzym verwendet. Weiterhin ist es bekannt, daß Mikroorganismen des Genus Bacillus in der Lage sind, ein ähnliches Enzym zu bilden. Beispielsweise entdeckten Kneen et al. 1946, daß Bacillus polymyxa ß-Amylase produziert (Archives of Biochemistry, Vol. 10 (1946) Seite 41) und 1948 berichtete Rose genauer über die enzymatischen Eigenschaften von ß-Amylase, die durch diesen Mikroorganismenstamm produziert wurde (Archives of Biochemistry, Vol.16 (1948) Seite 349). Später berichteten Higashihara et. al., daß Bacillus megaterium ß-Amylase liefert (Japan Agricultural Chemical Society, Abstracts of Lectures at the 1971 Annual Meeting, Seite 212 und Amylase Symposium, Vol. 6 (1971), Seite 39). Es wird angegeben, daß dieses Enzym identisch ist mit der von Bacillus polymyxa gebildeten ß-Amylase (Japan Agricultural Chemical Society, Abstracts of Lectures at the 1972 Annual Meeting, Seite 86).

Andererseits behandeln viele Veröffentlichungen die O( -1,6-Glucosidase der Stärke als Isoamylase oder Pullulanase. Genauer wurde Isoamylase zuerst von Maruo, Kobayashi et al. in Hefen festgestellt (Bunji Maruo und Tsuneo Kobayashi, Journal of Japan Agricultural Chemical Society, Vol. 23 (1949) Seiten und 120). Seitdem ist dieses Enzym auch in höheren Pflanzen (wobei das aus diesen Quellen stammende Enzym als R-Enzym bezeichnet wird) und in Mikroorganismen des Genus Pseudomonas aufgefunden worden (veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 16788/1970). In jüngster Zeit wurde berichtet, daß der thermophile Bacillus stearothermophilas eine thermophile Isoamylase bildet, deren optimale Arbeitstemperatur 65⁰C bis 67,5⁰C beträgt (Japan Agricultural Chemical Society, Abstracts

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of Lectures at the 1972 Annual Meeting, Seite 88 und veröffentlichte Unterlagen der japanischen Patentanmeldung Nr. 91272/1973)

1959 wurde von Bender gezeigt, daß Pullulanase in Aerobacter aerogenes als ein Enzym auftritt, das in der Lage ist, das von Pullularia pullulan gebildete Polysaccharid Pullulan zu hydrolysieren. Dieses Enzym hydrolysiert die oC-1,6-Glucosidbindung des Pullulans und ergibt Maltotriose (Biochem. Biophys. Acta, Vol. 36 (1959) Seite 309 und veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 7559/1971). Dieses Enzym hydrolysiert auch die O^ -1,6-Glykosidbindung von Amylopektin und Glykogen. Es ist seitdem berichtet worden, daß Enzyme dieser Art ebenfalls durch andere Mikroorganismen, wie Escherichia intermedia (Ueda et al"., Applied Microbiology, Vol. 15.(1967) Seite 492) und Streptomyces mites (Ueda et al.,Journal of Fermentation Technology, Vol. 49 (1971) Seite 552) gebildet werden.

Wie aus den obigen Ausführungen hervorgeht, ist in einer Vielzahl von Veröffentlichungen die unabhängige Bildung von ß-Amylase und oC-1,6-Glucosidase berichtet worden. Es findet sich jedoch keine Veröffentlichung, die sich mit einem Mikroorganismus befaßt, der gleichzeitig sowohl ß-Amylase als auch oC-1,6-Glucosidase synthetisiert.

Es ist daher bisher notwendig gewesen, beide Enzyme dadurch herzustellen, daß man zwei verschiedene Mikroorganismen getrennt züchtet. Neben dem Unterschied in dem Reaktions-pH-Wert und der Reaktionstemperatur der beiden Enzyme ist es schwierig, die Enzyme gleichzeitig auf Stärke einwirken zu lassen. Daher wurde die Herstellung von Maltose bislang mit Hilfe eines Zweistufenverfahrens bewirkt, das im allgemeinen darin besteht, daß man zunächst oC-1,6-Glucosidase auf Stärke einwirken läßt, wodurch sich eine geradkettige, amyloseartige Substanz bildet und diese anschließend mit ß-Amylase umsetzt, wodurch die Umwandlung zu Maltose erreicht wird.

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Die Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem man direkt und in hohen Ausbeuten Maltose mit Hilfe eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, gleichzeitig ß-Amylase und <*-1,6-Glucosidase zu bilden, aus Stärke herstellen kann.

Die Erfindung betrifft somit einerseits ein Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von ß-Amylase und o(-1,6-Glucosidase mit Hilfe eines Mikroorganismus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus des Genus Bacillus, der in der Lage ist, gleichzeitig ß-Amylase und o(-1,6-Glucosidase zu bilden, in einem Kulturmedium unter Bedingungen züchtet, die die Bildung von ß-Amylase und G<-1,6-Glucosidase ermöglichen, und ß-Amylase und o(-1,6-Glucosidase aus der Kulturbrühe isoliert.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Maltose, das darin besteht, daß man eine Bakterie des Genus Bacillus, die in der Lage ist, sowohl ß-Amylase als auch

0(-1,6-Glucosidase gleichzeitig zu bilden, unter Bedingungen züchtet, die die Bildung dieser Enzyme ermöglichen, aus der erhaltenen Kultur die gebildete ß-Amylase und die o(.-1,6-Glucosidase gewinnt, die in dieser Weise gewonnene ß-Amylase und

O(-1,6-Glucosidase zu Stärke oder einem Stärkederivat (löslich gemachte Stärke, Dextrin etc.), die im folgenden gemeinsam als "Stärke" bezeichnet werden, zusetzt, und das System unter solchen Bedingungen beläßt, die eine Hydrolyse der Stärke durch diese Enzyme erlauben.

Wenn Stärke oder ein Stärkederivat mit der Kombination aus ß-Amylase und 0(-1,6-Glucosidase behandelt wird, dient die ß-Amylase dazu, Maltose-Einheiten des in der Stärke vorhandenen Amylopektins von den nicht-reduzierenden Enden der Kette aus abzuspalten, bis eine verzweigte Bindung erreicht wird, worauf die C)C-I ,6-Glucosidase die O(-1,6-Glucosidbindung der Verzweigung spaltet, so daß anschließend die ß-Amylase erneut ihre Wirkung ausüben kann. Da die beiden Enzyme, das heißt

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ß-Amylase und oC-1,6-Glucosidase alternierend Maltose-Einheiten des Amylopektins von den nicht-reduzierenden Enden der Kette aus hydrolisieren, wird Maltose direkt mit Hilfe eines Einstufenverfahrens aus Stärke in Ausbeuten gebildet, die höher liegen als die mit herkömmlichen Verfahren erreichbaren.

Anhand der beigefügten Zeichnungen sei die Erfindung im folgenden beispielsweise näher erläutert.

Die Fig. 1 zeigt in Form von Kurven das Verhältnis zwischen dem pH-Wert und der Aktivität von ß-Amylase und o(-1,6-Glucosidase, die von dem Bacillus cereus var. mycoides gebildet wurden.

In der Fig. 2 sind Kurven wiedergegeben, die das Verhältnis zwischen der Temperatur und der Aktivität dieser beiden Enzyme verdeut1ichen.

Die Fig. 3 verdeutlicht mit Hilfe von Kurven die pH-Stabilitäten der beiden Enzyme.

Die in der Fig. 4 wiedergegebenen Kurven verdeutlichen die Wärmestabilität der beiden Enzyme.

In der Fig. 5 sind Kurven dargestellt, die das Verhältnis zwischen der Reaktionszeit und dem Hydrolysegrad (als Maltose gerechnet) wiedergeben, der dadurch ermittelt wird, daß man die Kulturbrühe des Mikroorganismus auf Amylose, Amylopektin, Kartoffelstärke, Glykoxjen und Dextrin einwirken läßt.

Es wurden nun überraschenderwexse drei Mikroorganismenstäinme gefunden, die in der Lage sind', gleichzeitig ß-Amylase und *<-1,6-Glucosidase zu bilden, die in Form eines Enzym-Kombinationspräparats isoliert werden können und in äußerst vorteilhafter Weise für die Herstellung von Maltose eingesetzt werden können.

Diese drei Bakterienstämme gehören zu dem Genus Bacillus und werden als Bacillus cereus var. mycoides. Bacillus sp. YT 1002 und Bacillus sp. YT 1003 bezeichnet.

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Die Erfindung beruht nun auf dieser Tatsache und erlaubt die
direkte Herstellung von Maltose aus Stärke und Derivaten davon mit Hilfe eines Verfahrens, das darin besteht, daß man Bakterien des Genus Bacillus, die in der Lage sind, sowohl ß-Amylase als auch o(-1,6-Glucosidase gleichzeitig zu bilden, züchtet, aus
dem erhaltenen Kulturmedium die beiden darin gebildeten Enzyme gewinnt und die Stärke oder deren Derivate mit den gesammelten Enzymen behandelt. Es sind bislang keine anderen Mikroorganismen bekannt geworden, die ebenso wie die erfindungsgemäß eingesetzten Bakterien in der Lage sind, sowohl ß-Amylase als auch oC-1,6-Glucosidase gleichzeitig zu produzieren.

Bacillus cereus var. mycoides wurde am 20. Dezember 1973 unter der Bezeichnung FERM Nr. 2391 bei dem Fermentation Research
Institute of Chiba-shi, Japan hinterlegt, während der Bacillus sp. YT 1002 und der Bacillus sp. YT 1003 am 12. Dezember 1974 unter den Bezeichnungen FERM Nr. 2837 und FERM Nr. 2838 bei dem gleichen Institut hinterlegt wurden.

Die mykologischen Eigenschaften dieser Mikroorganismen sind im folgenden angegeben:

Bacillus cereus var. mycoides (FERM Nr. 2391)

Stäbchenförmig, 1,1 bis 1,4 χ 4,2 bis 7,0 μΐη, tritt üblicherweise in Form von kurzen oder langen Ketten oder als Actinomyces auf. Nicht bewegungsfähig. Grampositiv, das Sporangium ist nicht merklich geschwollen.

Nährmedium: Gutes Wachstum, Sediment,

Geneigtes Agar-Nährmedium: Starkes Wachstum, faserartig, cremig weise Färbung.

Glucose-Asparagin-Agar: Kein gutes Wachstum, faserartig.
Glucose-Nitrat-Agar: Kein Wachstum oder falls überhaupt ein solches nur ein äußerst geringes.

Geneigtes Tyrosin-Agar-Medium; Gutes Wachstum, faserartig,
schwach braun.
Citrat-Verwertung: Positiv
Milch: Peptonisierung
Kartoffel; Gutes Wachstum, cremig weiß oder schwach braun.

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Gelatine: Verflüssigung

Bildung von Ammoniak: Positiv

Bildung von Acetylmethylcarbinol: Positiv Reduktion von Nitrat zu Nitrit: Positiv Katalase: Positiv

Indol-Bildung: Negativ

Stärkehydrolyse: Positiv

NaCl-Brühe: Kein Wachstum in einer 4%igen NaCl-Brühe.

Bacillus sp. YT 1002 (FERM Nr. 2837) Stäbchenförmig 1 bis 1,2 χ 5 bis 6 μπι, nicht bewegungsfähig, grampositiv, tritt üblicherweise in Form von kurzen bis langen Ketten auf.

Nährmedium: Sediment

Geneigtes Agar-Nährmedium: Gutes Wachstum, breitet sich aus Glucose-Asparagin-Agar: Schwaches Wachstum Geneigtes Glucose-Nitrat-Agar-Medium: Schwaches Wachstum Milch: Langsame Peptonisierung

Kartoffel: Gutes Wachstum, breitet sich aus, cremig weiß Gelatine: Verflüssigung

Ammoniakbildung: Positiv

Reduktion von Nitrat zu Nitrit: Positiv Katalase: Positiv

Acetylmethylcarbinol-Bildung: Positiv Citrat-Agar: Schwaches Wachstum

Organische Stickstoffquelle: Für das Wachstum erforderlich Kohlenhydrate: Es wird Säure, jedoch kein Gas aus Glucose, Fructose, Galaktose _t Mannose, Lactose, Maltose, Trehalose, Sorbit, Glycerin, Stärke und Glykogen gebildet Wachstumstemperatur: Wächst bis etwa 50°C. Optimale Temperatur:

30°C bis 35°C

Quelle: Aus dem Boden isoliert.

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Bacillus sp. YT 1003 (FERM Nr. 2838)

Stäbchenförmig, 1 bis 1,6 χ 2 bis 7 μΐη, tritt üblicherweise in Form von kurzen bis langen Ketten auf, nicht bewegungsfähig, grampositiv.

Nährbrühe: Gutes Wachstum, Sediment.

Geneigtes Agar-Nährmedium; Gutes Wachstum, sich ausbreitend, cremig weiß

Glucose-Asparagin-Agar: Schwaches Wachstum Milch: Peptonisierung ohne Koagulation Gelatine: Langsame Verflüssigung

Ammoniakbildung: Positiv

Reduktion von Nitrat zu Nitrit: Positiv Katalase: Positiv

Acetylmethylcarbinolbildung: Positiv

Citrat: Wird als Kohlenstoffquelle verwendet Kohlenhydrate: Ohne Gasbildung werden verwertet Glucose, Fructose, Galaktose, Mannose, L-Arabinose, D-Xylose, Saccharose, Lactose, Maltose, Trehalose, Raffinose, Mannit, Sorbit, Glycerin und Inulin.

Wachstumstemperatur: Optimale Wachstumstemperatur: 30°C bis 35°C.

Maximale Temperatur: 45⁰C

Quelle·: Aus dem Boden isoliert.

Die erfindungsgemäß verwendeten Bakterienarten bilden sowohl ß-Amylase als auch o(-1,6-Glucosidase, wenn sie in einem Medium gezüchtet werden, das Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen derart enthält, wie sie üblicherweise für das Züchten von Mikroorganismen verwendet werden. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Maltose, Stärke, Teilhydrolysate der Stärke, wie Dextrin, und andere Stärkeformen. Beispiele für Stickstoffquellen sind Pepton, Kasein, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maiswasser, Sojabohnen und Sojakuchen. Erforderlichenfalls können zur Ergänzung der Stickstoffquellen anorganische Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalze, Bariumsalze und Galciumsalze und anorganische Stickstoffquellen in das Medium eingebracht werden. Wenn Mais- - wasser als Rohmaterial für das Medium verwendet wird, wird es am besten zuvor auf einen pH-Wert von 6 bis 9 eingestellt, so daß

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der sich ergebende Niederschlag, nämlich eine Substanz, die ein Material enthält, das die Bildung von ß-Amylase inhibiert, vor der Verwendung abgetrennt werden kann. Aus der folgenden Tabelle I ist deutlich zu erkennen, daß, wenn diese Abtrennung durchgeführt wird, die Menge der gebildeten ß-Amylase um den Paktor 10 größer ist, als wenn diese Abtrennung nicht erfolgt und daß diese Abtrennung die Bildung von Q(-1,6-Glucosidase nur sehr wenig beeinflußt.

Tabelle I

pH-Wert der Behandlung des Maiswassers	ß-Amylase (Einheiten/ml Brühe)	o( -1,6-Glucosidase (Einheiten/ml Brühe)
Nicht eingestellt	40-	35,4
pH 5,1 1 0,1	121	40,6
pH 6,0 ± 0,1	420	39,1
pH 7,1 + 0,1	516	41,3
pH 8,1 + 0,1	525	35,9
pH 9,1 ί 0,1	460	35,1
pH 10,0 + 0,1	352	25,0

Mit dem Ziel, die beiden Enzyme in höheren Ausbeuten zu produzieren, wurden umfangreiche Untersuchungen hinsichtlich der Kulturbedingungen durchgeführt. Es wurde schließlich gefunden, daß man die Bildung von o(-1 ,6-Glucosidase durch Einführen von Mangan- · ionen in das Medium merklich steigern kann. Die Anwesenheit von Manganionen übt jedoch eine inhibierende Wirkung auf die Bildung von ß-Amylase aus. Durch entsprechende Auswahl der Zeit der Zugabe urd der Menge der Zugabe der Manganionen zu dem Medium kann die Züchtung derart geführt werden, daß ß-Amylase und ctf-1,6-Glucosidase in den gewünschten Konzentrationen gebildet werden.

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Als Mangansalze kann man verschiedene Manganverbxndungen verwenden. Beispiele hierfür sind Mangansulfat, Manganchlorid, Manganphosphat und Manganacetat. Diese Mangansalze werden dem

—R Medium im allgemeinen in einer Menge von 1 χ 10 bis

— "? —6

1 x 10 Mol, vorzugsweise in einer Menge von 1 χ 10 bis 1 χ 1O~ Mol zugesetzt. Wenn die Kultur in einem Medium erfolgt, das beispielsweise 1 χ 10~ Mol Mangansulfat enthält, zeigt es sich, daß die gebildete Menge an o(-1,6-Glucosidase 3- bis 6mal größer ist, verglichen mit dem Fall, daß kein Mangan zugeführt wird. Wenn die Bildung der beiden Enzyme in einem Kulturmedium erfolgt, das Citrat und/oder Tartrat enthält, werden sowohl ß-Amylase als auch 0(-1 ,6-Glucosidase in erhöhten Mengen gebildet. Das Citrat oder das Tartrat wird im allgemeinen in einer Menge von 0,01% bis 1%, vorzugsweise in einer Menge von O,O5% bis 0,2%, bezogen auf das Medium, dem Medium zugesetzt. Wenn die Züchtung in einem Medium erfolgt, das Natriumeitrat oder Natriumtartrat in einer Menge von 0,1%, bezogen auf das Medium, enthält, ist die gebildete ß-Amylase-Menge um das 1,5- bis 2-fache größer und die gebildete oC-1 ,6-Glucosidase-Menge um das 1,3- bis 1,5-fache größer, verglichen mit dem Fall, daß dieses Salz nicht zugesetzt wird.

Weiterhin hat es sich gezeigt, daß, wenn die Züchtung in einem Medium erfolgt, das Rapssamen, Rapssamenkuchen oder einen Extrakt (das heißt eine Substanz, die man dadurch erhält, daß man Rapssamen in Wasser oder einer Flüssigkeit mit einer Alkalinität, die einem pH-Wert von 9 bis 10 entspricht, erhitzt) enthält, die Menge, in der </.-1,6-Glucosidase gebildet wird, in besonders starker Weise auf ein merkliches Ausmaß gesteigert wird. Wenn das Medium beispielsweise 4% Rapssamenkuchen enthält, ist die Menge, in der die OC-1 ,6-Glucosidase gebildet wird, um das 2- bis 3-fache größer, verglichen mit dem Fall, daß dieses Material nicht zugegeben wird.

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Die Züchtung der Bakterien erfolgt unter Belüftung bei 2O°C bis 4O°C während 24 bis 72 Stunden. Während der-Züchtung variiert der pH-Wert des Mediums im Bereich von 5,5 bis 9,5. Wünschenswerterweise wird der pH-Wert des Mediums während des gesamten Züchtungsvorganges in einem Bereich von 6 bis 8 gehalten.

Sowohl ß-Amylase als auch o(.-1,6-Glucosidase werden extracellular gebildet. Die in dieser Weise in dem Kulturmedium gebildeten Enzyme können dadurch gewonnen werden, daß man die Kulturbrühe filtriert, um die Mikroorganismen abzutrennen, das Filtrat einengt und eine weitere Aufkonzentrierung dadurch erreicht, daß man beispielsweise das konzentrierte Piltrat mit einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Äthanol, Methanol oder Isopropanol, versetzt, um eine Ausfällung zu bewirken oder ein Ausfällungsmittel, wie Ammoniumsulfat, zusetzt, um eine Fällung zu verursachen. Wenn die Ausfällung des Enzyms durch Verdrängung unter Anwendung von Ammoniumsulfat erfolgt, kann man mit einer 70- bis 75%igen Ammoniumsulfatsättigung 60% bis 100% ß-Amylase und OC-1,6-Glucosidase in Form einer Mischung als Niederschlag erhalten.

Da jedes der beiden Enzyme in wirksamer Weise von Stärke, Aktivkohle, verschiedenen Diatomeenerden,wie Celit, Hyfro-Supercel oder Perlit, verschiedenen Tonen, wie Bentonit, saure Tone, Fullererde, Kaolin oder Talkum oder Calciumphosphat adsorbiert wird, können sie mit Hilfe eines derartigen Adsorptionsmittels gewonnen werden. Beispielsweise wird ß-Amylase wirksam von Stärke adsorbiert, insbesondere wenn die Stärke einer thermischen Behandlung bei 40⁰C bis 65°C unterzogen worden ist. Wenn man der Kulturbrühe Maisstärke zusetzt, adsorbiert sie, wenn sie bei Temperaturen im Bereich von 40⁰C bis 65°C vorbehandelt worden ist, pro Gramm 3000 bis 8000 Einheiten ß-Amylase. Dies geht aus der folgenden Tabelle II hervor. Auch gelatinisierte Stärke stellt ein wirksames Adsorptionsmittel für das Enzym dar.

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-Vf--

Tabelle II

Aktivität der adsorbierten ß-Amylase (Einheiten/Graitm Stärke)

Behandlungstemperatur der Zeit
Stärke (⁰C) (Min.)

40	10	elatinisiert)	3,O1O
50	10	5,930
55	10	6,890
60	10	7,650
65	10	8,130
80	10 (c	7,890

Keine Behandlung

1,020

Die adsorbierte ß-Amylase kann vollständig mit einer Lösung eluiert werden, die 1% bis 10%, vorzugsweise 5% bis 10% Maltose oder die lösliche Stärke, Dextrin oder Maltose enthält. Weiterhin werden sowohl ß-Amylase als auch c^-1,6-Glucosidase in zufriedenstellender Weise von Aktivkohle adsorbiert. Die erhaltenen adsorbierten Enzyme besitzen eine starke Enzymaktivität und können daher als immobilisiertes Enzym verwendet werden. Beispielsweise werden pro Gramm Aktivkohle 8000 bis 12000 Einheiten ß-Amylase bzw. 500 bis 1000 Λ-1,6-Glucosidase gebunden. Von den in dieser Weise erhaltenen adsorbierten Enzymen behält ß-Amylase ihre ursprüngliche enzymatische Aktivität zu 90% bei, während

Cj^ -1 ,6-Glucosidase ihre ursprüngliche enzymatische Aktivität zu 100% beibehält.

Weiterhin wird oC-1,6-Glucosidase in ausreichendem Ausmaß (500 bis 800 Einheiten pro Gramm) von Diatomeenerden adsorbiert, wie Celite, Perlit etc., die sxliciumdioxidhaltige Substanzen darstellen, oder durch Tone, wie Bentonit, sauren Ton oder

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Kaolinit, die überwiegend aus Siliciumdioxid-Aluminiumoxid bestehen, gebunden, wobei das adsorbierte Enzym vollständig mit Hilfe einer 5- bis iO%igen wässrigen Natriumchloridlösung eluiert werden kann. Selbst in diesem adsorbierten Zustand besitzt das Enzym eine Enzymaktivität, die etwa 50% bis 70% der ursprünglichen Aktivität entspricht.

Die enzymatischen Eigenschaften von ß-Amylase und 0(,-1,6-GIuCOSidase, die mit Hilfe der erfindungsgemäß verwendeten Bakterien gebildet werden, sind im folgenden angegeben.

ß-Amylase:

(1) Wirkung: Das Enzym bildet aus Stärke, Amylose, Amylopektin, Glykogen, Dextrin etc. Maltose.

(2) Substratspezifität: Der Grad der Hydrolyse zur Maltose beträgt bei Amylose annähernd 100% und bei Stärke annähernd 60%. Das Enzym hydrolisiert die al-1,6-glucosidischen Bindungen nicht, die in Amylopektin, Glykogen, Dextrin, Pullulan etc. vorhanden sind.

(3) pH-Wert, bei dem die Wirkung entfaltet wird: pH 3 bis 10 (Fig. 1)

(4) Optimaler pH-Wert: Etwa pH 7 (Fig. 1)

(5) Temperatur, bei der die Wirkung entfaltet wird: Bis zu etwa 65⁰C (Fig, 2)

(6) Optimale Temperatur: Etwa 50⁰C (Fig. 2)

(7) Inaktivierung: Nach etwa lOminütigem Stehenlassen bei 55°C gehen etwa 20% der Aktivität verloren. Ein im wesentlichen vollständiger Verlust der Aktivität erfolgt nach lOminütigem Stehenlassen bei 70°C (Fig. 4)

(8) pH-Stabilität; Dieses Enzym ist im sauren Bereich bei einem pH-Wert unterhalb 5 instabil und im alkalischen Bereich bei einem pH-Wert von 6 bis 10 stabil (Fig. 3)

• (9) Inhibierung; Dieses Enzym wird durch p-Chlorquecksilberbenzoat inhibiert und durch Monojodacetat in geringem Ausmaßinhibiert, Die durch p-Chlorquecksilberbenzoat inhibierte Aktivität wird durch die Zugabe von Cystein zurückerlangt. Dieses Enzym wird ebenfalls stark inhibiert durch Cu⁺⁺, Hg⁺⁺

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und Ag . Es wird auch durch Fe inhibiert.

(10) Reinigungsmethode: Man fraktioniert das Enzym durch Ausfällen aus der Kulturbrühe, indem man diese zu 30% bis 50% mit

. Ammoniumsulfat sättigt, wonach man das Material in hochreiner Form säulenchromatographisch unter Verwendung eines chemisch vernetzten Dextrans (Sephadex G-100) gewinnt.

(11) Bestimmung der Enzymaktivität: Man gibt eine geeignete Menge der Enzymlösung zu 2 ml einer 0,Im-Phosphatpufferlösung (pH 7,0), die 2% lösliche Stärke enthält, und füllt die erhaltene Mischung mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 4 ml auf. Die Mischung wird bei 4O°C inkubiert. Die Enzymmenge, die unter diesen Bedingungen im Verlaufe von einer Stune 1 mg Maltose bildet, wird als "eine Einheit" definiert.

OC-1 ,6-Glucosidase:

(1) Wirkung: Dieses Enzym hydrolysiert die 0(-1 ,6-glucosidischen Bindungen des Amylopektins, das in gewissem Ausmaß durch die Einwirkung von ß-Amylase hydrolysiert worden ist.

(2) Substratspezifität; Dieses Enzym bildet Maltose durch Hydrolyse der oC-1,6-glucosidischen Bindung von Pullulan. Wenn man dieses Enzym auf Amylopektin' einwirken läßt, wird keine Zunahme des Jodanfärbevermögens beobachtet. Es wird daher angenommen, daß dieses Enzym seine Wirkung gegenüber Amylopekton entfaltet, das in gewissem Ausmaß durch ß-Amylase hydrolysiert worden ist, wodurch die Seitenkette verkürzt worden ist. Das Enzym entfaltet jedoch gegenüber Isomaltose und Paimose keine Wirkung.

(3) pH-Wert, bei dem die Wirkung entfaltet wird: pH 5 bis 10

(Fig. 1)

(4) Optimaler pH-Wert: pH 6 bis 6,5 (Fig. 1)

(5) Temperatur, bei der die Wirkung entfaltet wird; Bis zu etwa 65°C ( Fig. 2 )

(6) Optimale Temperatur; Etwa 50⁰C (Fig. 2)

(7) Inaktivierung; Etwa 50% der Aktivität geht nach lOminütigem Stehenlassen bei 50°C verloren. Ein im wesentlichen voll-

, ständiger Verlust der Aktivität ergibt sich, wenn man das

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Material 10 Minuten bei 65°C stehen läßt (Fig. 4). Jedoch üben Ca⁺⁺ oder Sr⁺⁺ eine starke Schutzwirkung auf die Aktivität aus. In Abwesenheit von Ca gehen etwa 90% der Aktivität nach 30 Minuten bei 50⁰C verloren. In Anwesenheit von 5 χ 10~ m CaCl₂ ist kaum ein Verlust der Aktivität festzustellen.

("8) pH-Wert-Stabilität: Das Enzym ist in einem Bereich von pH 6 bis 9 stabil'. Das Enzym ist auf der sauren Seite instabil und auf der alkalischen Seite relativ stabil (Fig. 3) .

(9) Inhibierung: Dieses Enzym wird in schwachem Ausmaß durch p-Chlorguecksilberbenzoat inhibiert und in sehr geringem Ausmaß durch Monojodacetat inhibiert. Es erfolgt jedoch eine starke Inhibierung durch Hg und Ag . Das Material wird ebenso durch Fe inhibiert.

(10) Reinigungsmethode: Man fraktioniert dieses Enzym durch Ausfällen, indem man die Kulturbrühe mit Ammoniumsulfat zu 60% bis 70% sättigt, wonach man eine säulenchromatographische Hochreinigung mit Hilfe von chemisch vernetztem Dextran (Sephadex G-100) durchführt.

(11) Bestimmung der Enzymaktivität: Die Aktivität dieses Enzyms wird bestimmt, indem man die Reaktion unter Verwendung von Pullulan als Substrat unter den folgenden Bedingungen untersucht. Das Enzym bildet aus Pullulan Maltotriose. Man gibt eine geeignete Menge des Enzyms zu 0,5 ml einer 0,1 m-Phosphatpufferlösung (pH 7,0) zu, die 1% Pullulan enthält. Die erhaltene Mischung wird mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1,0 ml aufgefüllt. Dann inkubiert man die Mischung während einer Stunde bei 40⁰C. Die Enzymmenge, die unter den oben beschriebenen Bedingungen 1 mg Maltotriose bildet, wird als "eine Einheit" definiert.

Aufgrund der oben beschriebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften, insbesondere der Substratspezifität, stellt dieses System eine durch den Genus Bacillus gebildete neue oC-1,6-Glucosidase dar, die nicht in die bisher bekannten Enzyme, Isoamylase und Pullulanase, eingereiht werden kann. Sie kann auch

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als Dextrin-Oi-1,6-glucosidase bezeichnet werden.

Die mit Hilfe herkömmlicher bekannter Mikroorganismen gebildeten 0(-1 ,6-Glucosidasen (Isoamylase und Pullulanase) hydrolysieren in jedem Fall die o(-1,6-glucosidische Bindung der Seitenkette von Amylopektin, wodurch eine amyloseartige Substanz gebildet wird, die bei dem Jodtest eine blaue Färbung zeigt (Biochemische Zeitschrift, Vol. 334, Seiten 79 - 95 (1961), Biochem. J., Vol. 108, Seiten 33 - 40 (1968), Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 212, Seiten 458 - 469 (1970), J.Fermentation of Technology, Vol. 49, Seiten 552 - 559 (1971), etc.). Im allgemeinen erfolgt die Bestimmung dieser Enzyme dadurch, daß man bei der Einwirkung der Enzyme auf Stärke oder Amylopektin die Zunahme des Jod-Färbevermögens mißt.

Die mit Hilfe der erfindungsgemäß verwendeten Bakterien gebildete QC-1,6-Glucosidase bringt kaum irgendeine Zunahme des Jod-Färbevermögens mit sich, wenn man das Enzym auf Stärke oder Amylopektin einwirken läßt. Diese Tatsache weist darauf hin, daß das erfindungsgemäß verwendete Enzym lediglich mit Stärke oder Amylopektin reagiert, deren Seitenketten in gewissem Ausmaß, zum Beispiel durch ß-Amylase, hydrolysiert worden sind und dessen Glucoserest der Seitenkette demzufolge verkürzt ist. Diese Substratspezifität stellt eines der wesentlichen Merkmale dar, das das Enzym von den 0(-1,6-Glucosidasen unterscheidet, die mit Hilfe der üblichen Mikroorganismen gebildet werden.

Somit besitzt die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Stämme des Genus Bacillus gebildete o(-1,6-Glucosidase äußerst vorteilhafte enzymatische Eigenschaften, aufgrund derer das Enzym zusammen mit der gleichzeitig gebildeten ß-Amylase zusammenwirkt und Stärke direkt zu Maltose hydrolysiert. Wie aus den Fig. 1 bis 4 zu ersehen ist, sind die Enzyme einander relativ ähnlich, nicht nur in Bezug auf den pH-Wert, in dem sie ihre Wirkung entfalten, oder den optimalen Wirkungs-pH-Wert, sondern auch in Bezug auf die Temperatur, bei der sie ihre Wirkung entfalten, und. die optimale Temperatur ihrer Wirkung, Sie zeigen

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auch eine deutliche Ähnlichkeit bezüglich des pH-Wert-Bereiches, in dem sie stabil sind und bezüglich der Temperaturbedingungen, gegenüber denen sie ihre Stabilität zeigen. Die Hydrolysewirkung der beiden Enzyme besteht darin, daß die ß-Amyiase das in der Stärke vorhandene Amylopektin von den nicht-reduzierenden Enden der Kette ausgehend in Maltoseeinheiten aufspaltet, wonach die erfindungsgemäße o(-1ι6-Glucosidase, nachdem die Spaltung eine verzweigte Bindung erreicht hat, die o(-1,6-glucosidische Bindung der Verzweigung spaltet. Somit hydrolysieren ß-Amylase und cC-1,6-Glucosidase alternierend Amylopektin ,von den nicht-reduzierenden Enden der Kette ausgehend, zu Maltoseeinheiten. Wie aufgrund des Reaktionsmechanismus ohne weiteres zu erwarten ist, ergibt die Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms zusammen mit ß-Amylase die Maltose in höheren Ausbeuten als es mit irgendwelchen anderen, bisher bekannten OC-1,6-Glucosidasen der Fall ist, wobei diese Ausbeuten die theoretische Ausbeute annähernd erreichen (90% bis 96%).

Wenn man ein bislang bekanntes Enzym, wie Pullulanase oder Isoamylase verwendet, setzt ittan Stärke mit dem Enzym um, wodurch die Amylopektin-Verzweigungen der Stärke gespalten werden und eine geradkettige, amyloseartige Substanz gebildet wird, auf die man dann ß-Amylase einwirken läßt, wodurch Maltose gebildet wird. Es ist angegeben worden, daß man mit Hilfe dieses kontinuierlichen Zweistufenverfahrens Maltose in günstigen Ausbeuten bilden kann. Wenn jedoch die erfindungsgemäßen Enzyme verwendet werden, ist es schwierig, mit Hilfe eines derartigen Zweistufenverfahrens Maltose in den hohen Ausbeuten herzustellen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erreichbar sind. Wie bereits angegeben, reagieren erfindungsgemäß die ß-Amylase und die oC~1 ι6-Glucosidase alternierend unter Bildung von Maltose, wodurch Maltose in bemerkenswert hohen Ausbeuten gewonnen werden kann.

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- Vf-

Anders als die Isoamylasen aus Hefe und Mikroorganismen des Genus Pseudomonas hydrolysieren die erfindungsgemäßen Enzyme die oC,-1,6-glucosidische Bindung von Pullulan und hydrolysieren Pullulan schließlich vollständig zu Maltotriose. Sie können daher ohne weiteres zur Herstellung von Maltotriose aus Pullulan verwendet werden. In dem Endprodukt ist keine Bildung von Glucose, Maltose oder Oligosacchariden festzustellen. Es wird angenommen, daß der Hydrolysemechanismus in diesem Fall ein Mechanismus des Oxo-Typs ist, was durch die Beobachtung gestützt wird, daß während der Anfangsstufe der Reaktion Maltotriose gebildet wird. Es hat sich gezeigt, daß die durch die erfindungsgemäßen Enzyme verursachte Reaktion nicht reversibel ist.

Im Gegensatz dazu wird bei der Hydrolyse von Pullulan mit Hilfe von Pullulanase, die von Mikroorganismen des Genus Aerobacter und des Genus Streptococcus gebildet wurde, die Bildung von Glucose, Maltose, Maltotetraose und noch höheren Oligosacchariden sowie von Maltotriose beobachtet (Biochemische Zeitschrift, Vol. 334 (1961) Seiten 79 bis 95) und es wird auch die umgekehrte Reaktion, die zur Bildung einer G6-Verbindung aus Maltotriose und einer G4-Verbindung aus Maltose führt,, beobachtet (Nature, Vol. 210 (1966) Seite 200, Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 137 (1970) Seiten 483 bis 493, Biochemical J., Vol. 108 (1968) Seiten 33 bis 40, etc.), was darauf hinweist, daß eine vollständige Hydrolyse von Pullulan zu Maltotriose nicht erreicht wird.

Wie bereits erwähnt, besitzen die erfindungsgemäßen Enzyme eine starke Affinität für die Hydrolyse der kurzen Seitenkette des Glucoserestes und sind nicht in der Lage, die 0(-1,6-glucosidische Bindung von Isomaltose, Pannose und Isomaltotriose zu hydrolysieren. Diese Beobachtungen beweisen, daß sich die Enzyme von tierischer Oligo-1,6-glucosidase unterscheiden (J,Biol,Chem.., VoI, 215 (1955) Seiten 723 bis 736).

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Die erfindungsgemäße oC-1# 6-Glucosidase unterscheidet sich erheblich von den bislang bekannten Enzymen Isoamylase und Pullulanase hinsichtlich der Substratspezifität, die eine der wichtigsten Eigenschaften eines Enzyms darstellt. Die erfindungsgemäße oC-1,6-Glucosidase unterscheidet sich von den bisher bekannten Enzymen Pullulanase und Isoamylase dadurch, daß ihre Reaktion irreversibel verläuft. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Enzym durch die Zugabe Ca gegen die thermische Inaktivierung geschützt werden, was im Fall von Pullulanase oder Isoamylase nicht möglich ist. Andererseits beobachtet man das Phänomen der Rückgewinnung der Aktivität nach der thermischen Inaktivierung bei Pullulanase, die man aus Mikroorganismen des Genus Aerobacter und des Genus Streptococcus gewonnen hat, während diese Eigenschaft dem erfindungsgemäßen Enzym nicht eigen ist. Diese Phänomene weisen darauf hin, daß sich das erfindungsgemäße Enzym hinsichtlich der Eiwexßeigenschaften von Pullulanase etc. unterscheidet, die man aus Mikroorganismen des Genus Aerobacter und des Genus Streptococcus gewinnt.

Das erfindungsgemäße Enzym besitzt seinen optimalen pH-Wert der Wirkung in der Nähe des Neutralpunkts, was aus der Fig. 1 hervorgeht und zeigt eine optimale Wirkungstemperatur bei etwa 5O°C, wie es die Fig. 2 verdeutlicht. Hinsichtlich des Verhaltens gegenüber dem pH-Wert und der Temperatur unterscheidet sich dieses Produkt von der durch Mikroorganismen des Genus Aerobacter gebildeten Pullulanase (die einen optimalen pH-Wert der Wirkung von 5,0 und eine optimale Wirkungstemperatur von 47,5°C aufweist, vgl. Biochemische Zeitschrift, Vol. 334 (1961) Seiten bis 95) und von Pullulanase, die von Mikroorganismen des Genus Streptococcus gebildet wird (die einen optimalen pH-Wert der Wirkung von 5,4 bis 5,8 und eine optimale Wirkungstemperatur von 3O°C aufweist, vgl. Biochemical Journal, Vol. 108 (1968), Seiten 33 bis 40) und unterscheidet sich auch von der Isoamylase von Hefe (die einen optimalen pH-Wert der Wirkung von 6,0 bis 6,2 und eine optimale Wirkungstemperatur von 20⁰C besitzt, vgl. Journal of Agricultural Chemical Society, Vol. 23 (1949) Seiten' •115 und 120) und der Isoamylase, die von Mikroorganismen des

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Genus Pseudomonas gebildet wird (die einen optimalen pH-Wert

der Wirkung von 3 bis 4 und eine optimale Wirkungstemperatur

von 52⁰C besitzt, vgl. Biochimica et Biophysica Acta, Vol.

(1970) Seiten 458 bis 469).

Das Filtrat der Kulturbrühe, die man durch das Züchten der erfindungsgemäßen Bakterien erhält, das Konzentrat des Filtrats, der mit dem organischen Lösungsmittel gewonnene Niederschlag und der mit Ammoniumsulfat gebildete Niederschlag enthalten jeweils ß-Amylase und e(-1,6-Glucosidase und können daher als kombiniertes Enzympräparat zur Herstellung von Maltose aus Stärke etc. verwendet werden.

Aus diesem kombinierten Enzympräparat können ß-Amylase und bt-1,6-Glucosidase getrennt voneinander durch fraktionierte Trennung gewonnen werden, indem man die Flüssigkeit zu 30% bis 50% mit Ammoniumsulfat sättigt, um das erstere Enzym auszufällen und die Flüssigkeit dann mit 60% bis 70% der gleichen Verbindung sättigt, um das letztere Enzym auszufällen, Die fraktionierten Produkte ß-Amylase und o(-1,6-Glucosidase können in starkem Ausmaß säulenchromatographisch über ein chemisch vernetztes Dextran (Sephadex) gereinigt werden.

Im folgenden sei eine Methode zur Herstellung von Maltose aus Stärke unter Verwendung des Enzymkomplexes beschrieben, der mit Hilfe der erfindungsgemäßen Bakterien gebildet wird,

Wenn die erfindungsgemäßen Bakterien in der oben beschriebenen Weise gezüchtet werden, werden in der Kulturbrühe sowohl ß-Amylase als auch fl(-1,6-Glucosidase gebildet. Die Kulturbrühe wird zur Entfernung der Mikroorganismenzellen filtriert oder zentrifugiert und, dann zu der gelösten Stärke zugesetzt. Zur Erzielung höherer Maltose-Ausbeuten ist es erwünscht, Stärke oder lösliche Stärke mit einem niedrigen Dextroseäquivalent zu verwenden (Dextroseäquivalent: D.E. =

Reduzierende Zucker, ausgedrückt als Glucose ₁

Trockensubstanz x 100 )

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- 2ßr -

Wenn eine, stark konzentrierte Stärke hydrolysiert werden soll, wird die Stärke durch die Einwirkung von o(-Amylase verflüssigt, wonach die verflüssigte Stärke eingesetzt wird. Als Substrat sind auch Dextrin und andere ähnliche Substanzen geeignet. Die Konzentration des Substrats liegt in einem Bereich von 5% bis 60%, üblicherweise in einem Bereich von 10% bis 40%. Erforderlichenfalls werden Calciumionen zugesetzt. Die Mischung wird bei einem pH-Wert von 5 bis 8, vorzugsweise von 6 bis 7 und bei einer Temperatur im Bereich von 20°C bis 6O°C, vorzugsweise von 40°C bis 55°C gehalten, worauf die KuItürbrühe, in der die beiden Enzyme, das heißt fi-Amylase und 0(-1,6-Glucosidase, enthalten sind, zugesetzt wird. Anstelle der die beiden Enzyme enthaltenden Kulturbrühe kann der die beiden Enzyme enthaltende Niederschlag oder Aktivkohle, auf der die beiden Enzyme adsorbiert sind, zu der Reaktionslösung zugesetzt werden. Es ist auch möglich, die beiden Enzyme adsorptiv oder extraktiv getrennt von der Kulturbrühe abzutrennen und gleichzeitig zu der Reaktionslösung zuzusetzen. Die Menge, in der ß-Amylase zugesetzt wird, erstreckt sich üblicherweise von 200 bis 400 Einheiten, während man die 0(-1,6-Glucosidase in Mengen von 10 bis 50 Einheiten zusetzt, jeweils pro Gramm Stärke auf Trockenbasis gerechnet. Unter diesen Bedingungen wird die Stärke im Verlaufe einer Reaktionszeit von 48 bis 72 Stunden mit einer Ausbeute von 80 bis 90% zu Maltose hydrolysiert. Die Reaktionszeit wird natürlich verkürzt, wenn die zugesetzte Enzymmenge größer ist als der oben angegebene Bereich oder die Substratkonzentration niedriger liegt.

Wie aus der obigen Beschreibung hervorgeht, werden die beiden Enzyme, ß-Amylase und (Λ-1,6-Glucosidase, gleichzeitig dadurch gebildet, daß man einen einzigen Stamm züchtet, so daß, wenn man das kombinierte Enzympräparat auf Stärke oder ein Stärkederivat einwirken läßt, Maltose direkt gebildet wird. Somit zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur durch seine Einfachheit, sondern auch durch die erzielbare Steigerung der Ausbeuten aus, die im Vergleich zu herkömmlichen Reaktionen

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oder der Methode erreicht werden, bei denen zwei Enzyme getrennt voneinander mit Hilfe von zwei verschiedenen Stämmen von Mikroorganismen gebildet und gemeinsam in die Reaktionslösung eingebracht werden.

Weiterhin kann das Verhältnis, in dem die beiden Enzyme in dem Kulturmedium gebildet werden sollen, ohne weiteres dadurch eingestellt werden, daß man Manganionen in gesteuerter Menge zuführt. Weiterhin ist es möglich, die Aktivität der beiden Enzyme in gewünschter Weise durch die Zugabe unterschiedlicher Additive zu steigern. Schließlich können die in der Kulturbrühe gebildeten beiden Enzyme leicht gewonnen und gemeinsam oder getrennt voneinander gereinigt werden. Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren für eine Reihe von verschiedenen industriellen Anwendungszwecken hervorragend geeignet.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern. Beispiel 1 .

Man beschickt einen 200 ml-Erlenmeyer-Kolben mit 50 ml eines Mediums, das 1% Pepton, 0,3% K₃HPO₄, 0,1 %.MgSO₄*7H₂O und 1% Maltose enthält. Man sterilisiert das Medium in üblicher Weise (durch 15minütiges Erhitzen auf 121⁰C), inokuliert das Medium mit Bacillus cereus var. mycoides (FERM Nr. 2391) und züchtet den Mikroorganismus während 2 Tagen bei 30⁰C. Anschließend wird die Kulturbrühe zur Entfernung der Zellen zentrifugiert. Dann wird die erhaltene überstehende Flüssigkeit analysiert, um die Menge der gebildeten Enzyme zu bestimmen. In dem Medium haben sich pro ml 628 Einheiten ß-Amylase und 18 Einheiten o(-1,6-Glucosidase gebildet.

Man führt die Kulturbrühe in einen Zellophanschlauch ein und dialysiert sie gegen destilliertes Wasser, um restlichen Zucker zu entfernen.

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Man setzt einen Teil der dialysierten Enzyme (das heißt 204 Einheiten ß-Amylase und 3,6 Einheiten o(-1,6-Glucosidase) mit Kartoffel-Amylose, Amylopektin, Kartoffelstärke, Glykogen und Dextrin, die jeweils mit einer Konzentration von 0,4%, bei einem pH-Wert von 7 und bei einer Temperatur von 40°C (und einem Gesamtreaktxonsvolumen von 4,3 ml) verwendet werden,

In festgesetzten Intervallen werden im Laufe der Zeit Proben bestimmter Menge aus der Reaktionslösung entnommen, in denen der Gehalt an gebildetem reduziertem Zucker nach der Methode von Somogyi & Nelson bestimmt wird. Die Zucker-Zusammensetzung der Reaktionsmischung wird papierchromatographisch untersucht (wozu man eine Entwicklungsflüssxgkeit aus 4 Teilen Pyridin, 6 Teilen Butanol und 3 Teilen Wasser verwendet). Hierbei zeigt sich, daß bei der Verwendung von Amylose, Amylopektin oder Kartoffelstärke als Substrat der gebildete Zucker fast vollständig (90% bis 96%) aus Maltose besteht und in der restlichen Reaktionslösung nur eine sehr geringe Menge (4% bis 8%) eines Zuckers mit einem der Maltotriose entsprechenden Rf-Wert festgestellt werden kann. Eine Untersuchung mit Hilfe des Glucostats (der von der Firma Worthington Biochemical Corporation, U.S.A. hergestellt wurde) zeigt, daß Glucose nur zu einem sehr geringen Prozentsatz gebildet wird (weniger als 0,1%), Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig, 5 wiedergegeben·. Aus dieser Figur ist zu ersehen, daß die in dieser Weise untersuchten Produkte Kartoffelamylose, Amylopektin, Dextrin und Kartoffelstärke im wesentlichen vollständig na.ch etwa 8 Stunden der Reaktion zu Ma.ltoge hydrolysiert werden, Glykogen wird im Verlaufe von etwa 23 Stunden ebenfalls zu einem Prozentsatz von nicht weniger als 90% zu Maltose hydrolysiert,

Beispiel 2

Man inokuliert ein Medium der gleichen ZusammenSetzung wie der des Mediums von Beispiel 1, mit Bacillus sp, YT-Nr, 1002 (FERM Nr, 2837) und züchtet es unter Schütteln bei 30^eC, Nach einer Züchtungszeit von 48 Stunden wird die Kulturbrühe hinsicht-

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lieh der gebildeten Enzyme bestimmt. Pro ml der Brühe haben sich 121 Einheiten ß-Amylase bzw. 10,5 Einheiten Ot-1,6-Glucosidase gebildet.

Beispiel 3

Man inokuliert ein Medium, das die gleiche Zusammensetzung des Mediums von Beispiel 1 besitzt, mit Bacillus sp, YT-Nr. 1003 (FERM Nr. 2838) und züchtet es unter Schütteln bei 3O°C. Nach einer Züchtungszeit von 48 Stunden wir die Kulturbrühe hinsichtlich der Menge der gebildeten Enzyme untersucht. Es zeigt sich, daß sich pro ml der Brühe 152 Einheiten ß-Amylase und 5,3 Einheiten 0(-1,6-Glucosidase gebildet haben.

Beispiel 4

Man beschickt einen Kolben mit einem Fassungsvermögen von 1 1 mit 250 ml eines Mediums, das 1% Polypepton, 0,3% K₂₄ 0,1% MgSO₄*7H₂O und 1% Dextrin enthält und sterilisiert das Medium in üblicher Weise, Anschließend inokuliert man das Medium mit Bacillus cereus var. mycoides und züchtet es unter Schütteln bei 30°C. Nach einer Züchtungszeit von 48 Stunden wird die Kulturbrühe zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen, und die überstehende Flüssigkeit wird hinsichtlich ihrer enzymatischen Aktivität untersucht.

Die Untersuchung zeigt, daß sich pro ml der Brühe 420 Einheiten ß-Amylase und 7,8 Einheiten o(-1,6-Glucosidase gebildet haben. Man sättigt 200 ml der Kulturbrühe zu 75% mit Ammoniumsulfat, zentrifugiert die ausgefällte Fraktion ab, löst sie in einer geringen Menge Wasser und untersucht die erhaltene Lösung auf ihre enzymatische Aktivität. In dieser Weise gewinnt man 83 000 Einheiten ß-Amylase und 952 Einheiten o(-1,6-Glucosidase,

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Beispiel 5

Man läßt einen Teil der in Beispiel 1 erhaltenen Enzymlösung (die 10 000 Einheiten ß-Amylase und 275 Einheiten o(-1 ,6-Glucosidase enthält) mit etwa 1 g Amylopektin mit einer Konzentration von 1% in Gegenwart von 5 χ 10 m CaCl₂ reagieren. Man läßt die Reaktion bei 40°C ablaufen und stellt den pH-Wert auf etwa 7 ein. Dann wird der in der Reaktionsmischung enthaltene reduzierende Zucker nach der Methode von Somogyi & Nelson bestimmt. Die Untersuchung zeigt, daß sich 972 mg Maltose gebildet haben, Die gebildete Glucosemenge beträgt 3,7 mg. Die papierchromatographische Untersuchung des Produkts zeigt einen Flecken, der der Maltose entspricht, und einen Flecken, der einer sehr geringen Menge Maltotriose zuzuschreiben ist.

Beispiel 6

Dieses Beispiel betrifft eine Untersuchung, die die Herstellung von Maltose unter Einsatz eines stark konzentrierten Substrates umfaßt und die dazu dienen soll, die optimale Rea,ktionstemperatur und den optimalen pH-Wert der Reaktion zu bestimmen.

Die in diesem Fall eingesetzte Reajktionslösung enthält die in der folgenden Tabelle III angegebenen Bestandteile in, den angegebenen Mengen,

Tabelle III

Lösliche Stärke (D,E, =1,5)	ig
Phosphatpdffer (pH 6,5 bis 7) oder Acetatpuffer (pH 5 bis 6)	0,05 m
CaCl₂	0,01 m
ß-Amylase	1016 Einheiten
c(~1,6-Glucosidase	13,1 Einheiten
Gesamtvolumen	10 ml

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- V-r -

Xw

Um die Wirkung des pH-Wertes der Reaktionslösung zu bestimmen, wird die Reaktion bei 5O°C mit pH-Werten von 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 und 7,0 durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Maltoseäqui^	τ j_ ,Reduzierender Zucker (als	8	> Maltose	24	36	48	gerechnet).
Reaktionszeit (Stunden)	/u-Lcnc — ι™	70	Trockensubstanz	73	74	77
PH 5,0 + 0,1	2	77	82	82	83	72
5,5 ί 0,1	49	83	92	94	97	76
6,0 t 0,1	55	79	91	94	96	84
6,5 + 0,1	63	78	89	91	92	100
7,0 ί 0,1	63	100
59	96

Um die Wirkung der Temperatur auf die Reaktion zu bestimmen, wird die Reaktion bei einem pH-Wert von 6 bis 6,5 und bei Reaktionstemperaturen von 40⁰C, 50⁰C, 55⁰C und 60⁰C durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V zusammengefaßt.

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Tabelle V

	Maltoseäquivalent	8	20	30	48	68
Reaktionszeit (Stunden)	2
Temperatur (⁰C)		79	82	87	94	100
40	64	78	85	92	97	100
50	66	78	82	83	87	89
55	70	70	71	72	73	74
60	68

Beispiel 7

Man bereitet ein Medium, das 1% Polypepton, 1% Dextrin, 0,3% K₂HPO₄ und 0,1% MgSO₄·7H₂O enthält und bereitet weitere Medien, die man dadurch herstellt, daß man das genannte Medium mit unterschiedlichen, in der Tabelle VI angegebenen Mengen von Mangansulfat versetzt (die sich von 1 χ 10 Mol bis zu 1x10 Mol erstrecken), Diese Medien bringt man jeweils in einer Menge von 50 ml in 200 ml-Erlenmeyer-Kolben ein und sterilisiert diese in üblicher Weise. Anschließend inokuliert man die Medien mit Bacillus cereus var. mycoides und züchtet die Kultur unter Belüften während 42 Stunden bei 30⁰C,

Nach Ablauf der Züchtungszeit wird die Kulturbrühe zentrifugiert und in der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit werden die gebildete ß-Amylase und die gebildete Ot-1,6-Glucosidase bestimmt. Die in dieser Weise erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI zusammengestellt.

Wie aus dieser Tabelle zu ersehen ist, wird die Menge der gebilde-.ten d(-1 ,6-Glucosidase durch die Zugabe von Mangansulfat auf das

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etwa Dreifache gesteigert.

Tabelle VI

Zugesetzte Menge Mangansulfat (Mol)	Gebildetes Mycel, als opti sche Dichte (bei 660 pm)	Aktivität der gebildeten 0< -1,6-Glucosi- dase (Einheiten/ ml Brühe)	Aktivität der gebilde ten ß-Amylase (Einheiten/ ml Brühe)
O (kein Zusatz)	6,7	11,3	699
1 χ 1O"⁷	6,5	14,2	678
1 χ 1O"⁶	5,8	18,6	166
5 χ 1O"⁶	5,6	23,4	155
1 χ 1O"⁵	5,9	25,0	132
1 χ 1O~⁴ 1 χ 1O~³	5,9 5,8	28,3 25,2	152 153

Beispiel 8

Man beschickt 200 ml-Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 50 ml eines Mediums, das 1% Polypepton, 1% Dextrin, 0,3% K₂HPO₄ und Q,1% MgSO₄'7H₂O enthält und sterilisiert sie in üblicher Weise. Anschließend inokuliert man die Medien mit Bacillus cereus var. mycoides und züchtet es unter Schütteln bei 30°C. Nach einer Züchtungszeit von 24 Stunden, nach der die gebildete ß-Amylase-Menge 237 Einheiten pro ml des Mediums beträgt, setzt man in steriler Weise Mangansulfat zu dem Medium in einer Menge von 1 χ 10 Mol, bezogen auf das Medium, zu und setzt die Züchtung fort.

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Nach einer Züchtungszeit von 42 Stunden wird die Züchtung unterbrochen. Die Kulturbrühe wird zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen, und die erhaltene überstehende Flüssigkeit wird hinsichtlich ihrer ß-Amylase-Aktivität und ihrer <^-1,6-Glucosidase-Aktivität untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der folgenden Tabelle VII zusammengefaßt.

	Züchtungs zeit (Sturäen)	Tabelle	VII	Aktivität der gebildeten oC-1,6-Glucosidase (Einheiten/ ml Brühe)
	42			13,0
MnSO₄	24 42	Gebildetes Mycel als optische Dichte (bei 600 pm)	Aktivität der gebildeten ß-Amylase (Einheiten/ ml Brühe)	12,5 22,2
O (keines)	42	6,7	377,6'	25,0
1 χ 1O~⁴ MdI nach 24 Stun den Züch tungszeit zugesetzt	6,5· 6,6	236,8 244,5
1 χ 1O~⁴ MdI zu Beginn der Züch tung zuge setzt	5,9	28,8

Wie aus der obigen Tabelle zu ersehen ist, steigert das nach Ablauf der halben Züchtungszeit zugesetzte Mangansalz die Menge
der gebildeten txL-1 ,6-Glucosidase um etwa den Faktor 1,7 und
ermöglicht die gleichzeitige Bildung von ß-Amylase. Wenn die
Züchtung in einem Medium erfolgt, das von Beginn an das Mangansalz enthält, so wird die Menge der gebildeten (*-1,6-Glucosidase um etwa den Faktor 2, verglichen mit einem Züchtungsvorgang, der in Abwesenheit des Mangansalzes erfolgt, gesteigert, während die gebildete ß-Amylase-Menge auf lediglich 28,8 Einheiten pro ml
vermindert wird.

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Beispiel 9

Man bereitet ein Medium, das 2% Polypepton, 0,3% K₂HPO₄, 0,1% MgSo.-7H₂O und 5 χ 10 m CaCl₂ enthält und Medien, die man dadurch erhält, daß man diesem Medium Natriumeitrat in Mengen, die Konzentrationen von 0,5% bzw. 1% entsprechen bzw. Natriumtartrat, in Mengen, die 0,25% bzw. 0,5% entsprechen, zusetzt. Dann beschickt man 200 ml-Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 50 ml der Medien und sterilisiert sie in üblicher Weise. Anschließend inokuliert man die Medien mit Bacillus cereus var. mycoides und züchtet die Mikroorganismen unter Schütteln während 4 2 Stunden bei 30°C.

Nach Ablauf der Züchtungszeit wird die Kulturbrühe abzentrifugiert und die erhaltene überstehende Flüssigkeit wird hinsichtlich ihrer ß-Amylase-Aktivität und ihrer of-1,6-Glucosidase-Aktivität untersucht. Die in dieser Weise erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VIII zusammengestellt.

Tabelle VIII

Zugesetzte organische Säure	Zugesetzte Menge (% des Mediums)	Gebildetes Mycel ent sprechend der opti schen Dichte (bei 660 pm)	Aktivität der gebildeten ß-Amylase (Einheiten/ ml Brühe)	Aktivität der gebildeten ot -1,6-Gluco- sidase (Einheiten/ ml Brühe)
Natrium- citrat	0,5	4,9	1 035,0	20,7
Natrium- citrat	1,0	4,8	1 080,0	17,1
Natrium- tartrat	0,25	4,7	1 119,0	18,4
Natrium- tartrat	0,5 .	4,9	1 063,0	16,2
Kontrolle (kein Zusatz)		4,9	588,0	13,0

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Aus der obigen Tabelle geht deutlich hervor, daß die Mengen, in denen ß-Amylase und oC-1,6-Glucosidase gebildet werden, durch die Zugabe von organischen Säuren stark gesteigert werden können.

Beispiel 10

Man beschickt zwei Fermentationsgefäße mit einem Fassungsvermögen von 10 1 mit jeweils' 5 1 eines Mediums, das 4% Milchkasein, 0,3% K₂HPO₄, 0,1% MgSO₄-7H₂O, 5 χ 10~ m CaCl₃ und 0,5%'lösliche Stärke enthält. Dann führt man in eines der Fermentationsgefäße einen Rapssamenkuchen in einer Menge ein, die 4% des Mediums entspricht. Anschließend sterilisiert man die Medien in den beiden Fermentiergefäßen während 30 Minuten bei 121°C. Anschließend inokuliert man mit Bacillus cereus var. mycoides (100 ml) und züchtet die Mikroorganismen unter Belüften bei 30°C, wobei die Luft in einer Fließgeschwindigkeit von 5 l/Min, zugeführt wird und das Kulturmedium mit einer Rührgeschwindigkeit von 250 UpM gerührt wird. Nach einer Züchtungszeit von 24 Stunden wir die Kulturbrühe zentrifugiert und die erhaltene überstehende Flüssigkeit hinsichtlich ihrer enzymatischen Aktivität untersucht. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IX zusammengestellt.

Tabelle IX

Rapssamenkuchen (% des Mediums)	Aktivität der gebildeten ß-Amylase (Einheiten/ ml Brühe)	Aktivität der gebildeten «C -1,6-ducosidase (Einheiten/ml Brühe)
4,0 Kontrolle (kein Zusatz)	2 470,0 2 600,0	106,0 44,4

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Wie aus der obigen Tabelle deutlich hervorgeht, ist die Menge, in der o(.-1,6-Glucosidase gebildet wird, dem Medium, das den Rapssamenkuchen enthält, etwa um das 2,4-fache größer als die Menge, die sich in dem keinen Rapssamenkuchen enthaltenden Medium gebildet hat.

Die mit Hilfe des den Rapssamenkuchen enthaltenden Mediums erhaltene Kulturbrühe wird zur Entfernung der Zellen zentrifugiert. Man kombiniert 2 1 der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit mit 4 1 kaltem Äthanol, um eine Ausfällung der Enzyme zu bewirken. Der in dieser Weise gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Hierdurch erhält man ein pulverförmiges, kombiniertes Enzym, das pro Gramm 115 800 Einheiten ß-Amylase und 4640 Einheiten oC-1,6-Glucosidase enthält, was auf eine Gewinnung der ß-Amylase von 75% und der ^-1,6-Glucosidase von 70% hinweist.

Beispiel 11

Man stellt 8%iges Maiswasser (das einen Peststoffgehalt von etwa 4% aufweist) mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5. Die erhaltene Mischung wird zur Abtrennung des als Folge der Einstellung des pH-Wertes auftretenden Niederschlages zentrifugiert (der eine Substanz enthält, die das Wachstum von ß-Amylase inhibiert). Dann bringt man jeweils 50 ml der überstehenden Flüssigkeit in 200 ml-Erlenmeyer-Kolben ein, die man nach dem Versetzen mit 0,5% Stärke in üblicher Weise sterilisiert, Dann inokuliert man das Medium mit Bacillus cereus var. mycoides und züchtet die Kultur aerob während 42 Stunden bei 30°C. Nach Ablauf der Züchtungszeit wird die Kulturbrühe zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen und die überstehende Flüssigkeit wird hinsichtlich der gebildeten ß-Amylase und t<-1,6-Glucosidase untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle X zusammengestellt.

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Tabelle X

	Aktivität der ge bildeten ß-Amylase (Einheiten/ml Brühe)	Aktivität der gebildeten «^ -1,6-Glucosidase (Einheiten/ml Brühe)
Kontrolle Abtrennung der das Wachs tum von ß-Amylase inhi bierenden Substanz	52,1 592,7	35,3 41,1

Wie die obige Tabelle deutlich erkennen läßt, kann die gebildete ß-Amylase-Menge stark gesteigert werden, wenn man die Züchtung in dem Maiswasser durchführt, das von dem durch die Einstellung des pH-Wertes gebildeten Niederschlag befreit worden ist.

Beispiel 12

Man vermischt eine Mischung aus 10 g löslicher Stärke mit 1 1 einer Enzymlösung, die man durch Züchten von Bacillus cereus var. mycoides erhalten hat, die 572 Einheiten ß-Amylase und 43,5 Einheiten 0(-1,6-Glucosidase enthält, mit 40 g Aktivkohle (Norit, erhältlich von der Firma Vako Pure Chemicals) und rührt, um eine Adsorption der Enzyme an die Aktivkohle zu bewirken. Dann werden die Enzyme durch Filtrieren gewonnen.

Anschließend werden die Enzymaktivitäten des FiItrats und der Aktivkohle, an die die Enzyme adsorbiert sind, bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XI zusammengestellt.

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Tabelle XI

	ß-Amylase	b(-1,6-Glucosidase
(A) Zugesetzte Menge . (B) Nicht-adsorbierte Menge (C) Immobilisierte Enzymaktivität Ausbeute an immobilisier tem Enzym (C/A-B χ 100)	572 000 Einheiten 197 000 Einheiten 338 000 Einheiten 90,1 %	43 500 Einheiten 9 700 Einheiten 33 800 Einheiten 100 %

Aus der obigen Tabelle ist zu ersehen, daß ß-Amylase mit einer Ausbeute von 90,1% und o(-1,6-Glucosidase in einer Ausbeute von fast 100% in Form eines immobilisierten Enzyms gewonnen werden. Wenn jedoch keine Stärke zugesetzt wird, ist die Ausbeute an ß-Amylase in dem immobilisierten Enzym etwa 12,4%.

Ein Teil des immobilisierten Enzyms (3000 Einheiten ß-Amylase und 310 Einheiten 0(-1,6-Glucosidase) wird zu 10 g löslicher Stärke zugesetzt und die erhaltene Mischung wird mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml aufgefüllt. Dann bringt man die Lösung auf 50°C und beläßt sie während der Reaktion bei dieser Temperatur, wobei man einen pH-Wert im Bereich von 6 bis 6,5 einhält. Nach Ablauf dieser Reaktion wird die Lösung auf die Zusammensetzung der darin enthaltenen Zucker untersucht, wobei sich ergibt, daß der Zucker 90,5% Maltose, 7,5% Maltotriose und 2 g Oligosaccharide enthält.

Beispiel 13

Zu 100 ml Wasser gibt man 50 g Maisstärke und 10 g Celite, rührt und unterzieht das Material während 30 Minuten einer Wärmebehandlung bei 60⁰C. Zu der erhaltenen Lösung setzt man 300 ml eines Kulturfiltrats von Bacillus cereus var. mycoides (pH-Wert 7,1, 403 Einheiten ß-Amylase/ml und 28,0 Einheiten 0(-1,6-Gluco-

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sidase/ml} zu, und rührt, um eine Adsorption der beiden Enzyme zu bewirken.

Dann wird die Mischung zur Gewinnung der Enzyme filtriert, die dann auf ihre Aktivität hin untersucht werden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XII zusammengestellt.

Tabelle XII

	ß-Amylase	000 Einheiten	»Μ,	6-Glucosidase
(A) Ursprüngliche Aktivi tät	121	000 Einheiten	8	400 Einheiten
(B) Restliche Aktivität	111	300 Einheiten	1	860 Einheiten
(C) Gebundene Enzym- Aktivität	95	86,7 %	6	220 Einheiten
Ausbeute an gebundenem Enzym (C/A-B χ 1CX))			95,1 %

Die Mischung aus Stärke und Celite, an die beide Enzyme adsorbiert sind, wird dann ζμ einer 10%igen wässrigen Lösung von Dextrin zugesetzt, die 10% Natriumchlorid enthält, wodurch eine Elution der Enzyme von den Adsorbenzien bewirkt wird. In dieser Weise werden ß-Amylase mit einer Ausbeute 100% bzw. Ot-1,6-Glucosidase mit einer Ausbeute von 85% zurückgewonnen.

Beispiel 14

Man vermischt jeweils 100 ml eines Filtrats einer Kultur von Bacillus cereus var. mycoides, das pro ml 758 Einheiten ß-Amylase und 37,1 Einheiten 0(-1,6-Glucosidase enthält, mit jeweils 5 g saurem Ton, Bentonit, Talkum, Celite und Perlit, um eine Adsorption der o(-1,6-Glucosidase zu bewirken.

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It»

Das adsorbierte Enzym wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen, gut mit Wasser gewaschen und dann hinsichtlich seiner Aktivität untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XIII zusammengestellt.

Tabelle XIII

	Adsorbierte «*-1,6-Glücosi- dase (Einheiten/g)	Adsorbierte ß-Amylase (Einheiten (g)
Saurer Ton	612	790
Bentonit	648	694
Talkum	416	200
Celite	492	0
Perlit ·	532	0

Aus der obigen Tabelle ist zu ersehen, daß 0(-1,6-Glucosidase in zufriedenstellender Weise von sämtlichen untersuchten Adsorbenzien in Mengen von 400 bis 700 Einheiten pro Gramm adsorbiert wird.

Beispiel 15

Zu 100 g (Trockengewicht) verflüssigter Stärke mit einem Dextroseäquivalent von 1,5 gibt man 30 000 Einheiten ß-Amylase, 3000 Einheiten b(-1,6-Glucosidase und 0,73% CaCl₂'2H₂O. Man verdünnt die Mischung auf ein Gesamtvolumen von 500 ml, erhitzt sie auf 50°C und hält sie während der Reaktion bei einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 6,5 auf dieser Temperatur. Nach einer Reaktionszeit von 100 Stunden wird.die Zuckerzusammensetzung der erhaltenen Mischung papierchromatographisch ermittelt. Die Zuckerzusammensetzung ergibt sich mit 90,6% Maltose, 7,1% Maltotriose, 0,0% Glucose und 2,3% anderer Saccharide.

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Claims

Patentansprüche

fly Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von ß-Amylase und ö(.-1,6-Glucosidase mit Hilfe eines Mikroorganismus, dadurchgekennz eichnet, daß man einen Mikroorganismus des Genus Bacillus, der in der Lage ist, gleichzeitig ß-Amylase und OC-1,6-Glucosidase zu bilden, in einem Kulturmedium unter Bedingungen züchtet, die die Bildung von ß-Amylase und Ot-1,6-Glucosidase ermöglichen, und ß-Amylase und oC-1,6-Glucosidase aus der Kulturbrühe isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus cereus var. mycoides (FERMNr. 2391) verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus sp. YT 1002 (FERM Nr. 2837) verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus sp. YT 1003 (FERM Nr. 2838) verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus bei einer Temperatur von 2O°C bis 40°C und einem pH-Wert von 5 bis züchtet.
6. Verfahren nach Anspruch 1,d adurch gekennzeichnet, daß man zu Beginn des Züchtungsvorganges oder im Verlaufe der Züchtung Manganionen in das Kulturmedium einführt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus in einem Kultur-

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medium züchtet,das Rapssamen, Rapssamenkuchen oder einen Extrakt davon enthält. _:
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine organische Säure in das
Kulturmedium" einführt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichne t^ daß man als organische Säure ein Citrat zuführt.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als organische Säure ein Tartrat zusetzt.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus in einem
Medium züchtet, das man dadurch erhalten hat, daß man
Maiswasser auf einen pH-Wert von 6 bis 9 einstellt und
den dadurch gebildeten Niederschlag abtrennt.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kulturbrühe zur Gewinnung
von ß-Amylase durch Adsorption mit Stärke bei einer Temperatur zwischen 40⁰C und 65⁰C behandelt.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kulturbrühe mit Aktivkohle behandelt, um gleichzeitig ß-Amylase und (/,-1,6-GIuCOSidase durch Adsorption zu gewinnen.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kulturbrühe mit Diatomeenerde oder Ton behandelt, um die g(-1,6-Glucosidase durch Adsorption zu gewinnen.

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15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kulturbrühe mit Stärke und Diatomeenerde behandelt., um die ß-Amylase bzw. die oC-1,6-Glucosidase durch Adsorption zu gewinnen.
16. Verfahren zur Herstellung von Maltose aus Stärke oder einem Stärkederivat mit Hilfe von Mikroorganismusenzymen, dadurch gekennzeichnet, daß -man einen Mikroorganismus des Genus Bacillus, der in der Lage ist, gleichzeitig ß-Amylase und ^.-1,6-Glucosidase in einem Kulturmedium unter Bedingungen zu bilden, die die Bildung von ß-Amylase und <)(-1,6-Glucosidase ermöglichen, die in dieser Weise gebildeten Enzyme aus der Kulturbrühe gewinnt, diese Enzyme zu Stärke oder einem Stärkederivat zusetzt und die erhaltene Mischung unter enzymatischen Reaktionsbedingungen hält, um die Stärke oder die Stärkederivate mit Hilfe dieser Enzyme zu hydrolysieren.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus cereus var'. mycoides (FERM Nr. 2391) verwendet.
18. Verfahren nach Anspruch ¹6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus sp. YT 1002 (FERM Nr. 2837) verwendet.
19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus sp. YT 1003 (FERM Nr. 2838) verwendet.
20. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennz e ic hnet, daß man den Mikroorganismus bei einer Temperatur von 20°C bis 40°C und bei einem pH-Wert von 5 bis 10 züchtet.

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21. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stärke oder die Stärkederivate in der Mischung in einer Konzentration von 5% bis 60% verwendet .
22. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung bei einer Temperatur von 2O°C bis 6O°C und einem pH-Wert von 5 bis 8 umsetzt.
23. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man ß-Amylase und «Λ—1,6-Glucosidase mit Hilfe eines Adsorptionsmittels aus der Kulturbrühe gewinnt und das Adsorptionsmittel zu der Stärke oder dem Stärkederivat zusetzt.

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