DE2453860C2

DE2453860C2 - Erzeugung von Cyclodextrin

Info

Publication number: DE2453860C2
Application number: DE2453860A
Authority: DE
Inventors: Tadahiko Ando; Koki Horikoshi; Nobuyuki Kunitachi Naka Nakamura; Koichi Tokyo Yoshida
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1973-12-06
Filing date: 1974-11-13
Publication date: 1982-07-01
Also published as: DE2453860A1; FR2253831A1; FR2253831B1; GB1459654A

Description

Dextrin ist ein Abbauprctoikt der Stärke. Es wird bei der Hydrolyse von Stärke mit e.ner Amylase gebildet und allgemein als Substanz mit linearem Molekül bezeichnet Es ist bekannt, daß Cyclodextrin (Schardlinger-Dextrin) von dem Bacillus macerans erzeugt wird (siehe »Enzyme Handbook«, herausgegeben von Shiro Akabori, verlegt 1966 bei Asakura Shoten, Tokio, Japan). Dieses Cyclodextrin ist bisher nach einem Verfahren erzeugt worden, in dem Calciumcarbonat und Wasser zu frischem Kartoffelgut zugesetzt wurden, das Gemisch sterilisiert und mit Bacillus macerans geimpft wurde, der Bacillus gezüchtet wurde, durch Abtrennen von Zellen von dem Nährboden eine Enzymflüssigkeit erhalten wurde, die Enzymflüssigkeit einer durch Dispergieren von Stärke in Wasser gebildeten Stärkeflüssigkeit zugesetzt wurde, so daß das Enzym auf die Stärke einwirkte, und zum Ausfällen des dabei gebildeten Cyclodextrins dem flüssigen Reaktionsgemisch ein organisches Lösungsmittel, wie Tetrachloräthan, Trichlorälhan und Aceton zugesetzt wurde.

Die in diesem üblichen Verfahren zum Erzeugen von Cyclodextrin verwendete Cyclodextrin-glycosyl-Transferase zeichnet sich aus durch einen optimalen pH-Wert von 6,8—7,0 und eine optimale Temperatur von 40⁰C. Sie hat den Nachteil einer relativ geringen Hitzebeständigkeit Zur Erzielung einer hohen Ausbeute an Cyclodextrin ist es in dem genannten Verfahren zweckmäßig, während der Reaktion eine hohe Stärke" konzentration in der Stärkeflüssigkeit aufrechtzuerhalten. Bei hoher Stärkekonzentration kann man jedoch nur schwer eine Stärkeflüssigkeit erhalten, in der die Stärke homogen dispergiert ist, und kann man keine vollständige Enzymwirkung erwarten. Bei Verwendung einer Flüssigkeit mit niedriger Konzentration muß man zum Ausfällen des Cyclodextrins eine komplizierte Einrichtung oder ein teures Reagens verwenden und treten verschiedene wirtschaftliche Nachteile auf. Zum Vermeiden dieser Nachteile ist ein Verfahren vorgeschlagen worden, in dem eine hochkonzentrierte Stärkeflüssigkeit dadurch gebildet wird, daß durch Zusatz einer kleinen Menge von a-Amylase, durch die Wirkung einer Säure oder durch eine andere übliche Maßnahme Stärke in der ursprünglichen Stärkeflüssigkeit verflüssigt wird, und in dem die von deui Bacillus

ίο macerans erzeugte Amylase auf die hochkonzentrierte Stärkeflüssigkeit einwirken gelassen und dadurch Cyclodextrin erzeugt wird (siehe Japanische Auslegeschrift Nr. 2380/71).
Die Anmelderin hat zum Erzeugen von Cyclodextrin

ι" neue Verfahren entwickelt, in denen Amylasen verwendet werden, die einen optimalen pH-Wert im alkalischen Bereich und hohe Temperaturbeständigkeit besitzen. Durch diese Verfahren kann man die Nachteile der üblichen Verfahren vermeiden, in denen die Enzymwirkung des von dem Bacillus macerans erregten Enzyms ausgenutzt wird, und kann man ein sehr hitzebeständiges Cyclodextrin erzeugen. In jedem dieser Verfahren wird jedoch zur Gewinnung des Cyclodextrins dieses mit einem organischen Lösungsmittel ausgefällt, beispielsweise mit Tetrachloräthan, Trichloräthylen und Aceton. Diese Fällmittel sind aber teuer und außerdem giftig und daher ur erwünscht

Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur Erzeugung von Cyclodextrin durch Abbau von Stärke, das ohne Verwendung organischer Lösungsmittel unter Erzielung hoher Ausbeuten durchgeführt werden kann.

Diese Aufgabe wird durch das im Patentanspruch 1 beschriebene Verfahren gelöst, das den Gegenstand der Erfindung darstellt Der Anspruch 2 nennt eine Ausgestaltung dieses Verfahrens.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase hat einen optimalen pH-Wert im alkalischen Bereich Sie ist ein Fermentationsprodukt eines Mikroorganismus, der nur in einem alkalischen Medium wächst und das genannte Enzym erzeugt.

Als derartige Mikroorganismen seien beispielsweise erwähnt die im folgenden als Nr. 38-2, 135 und 169 bezeichneten Bacillus-Arten, die von den Erfindern zuerst aus Böden in Wako, Saitama (Japan) isoliert worden sind, sowie die Bacillus-Arten Nr. 13 und 17-1, die von den Erfindern zuerst aus Böden in Karuizawa, Nagano (Japan) isoliert worden sind. Im Rahmen der Erfindung können jedoch auch andere als die vorgenannten Mikroorganismen verwendet werden, und zwar allgemein jeder Mikroorganismus, der die erfindungsgemäß verwendete alkalische Amylase erzeugen kann, die zur Erzeugung von Cyclodextrin geeignet ist, sowie natürlich oder durch künstliche Einwirkung entstandene Mutanten dieser Mikroorganismen.

Die als Bacillus-Arten Nr. 38-2, 135, 169, 13 und 17-1 bezeichneten Stämme sind in der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockwell, Maryland, 20852, USA unter den ATCC-Nummern 21783, 21595, 21594, 31006 und 31007 deponiert und für die Öffentlichkeit uneingeschränkt zugänglich seit dem 27. März 1972, 19. August 1970, 19.

<>5 August 1970,21. Februar 1974 bzw. 21. Februar 1974.

Wie nachstehend ausführlich erläutert wird, kann man diese Stämme sowohl in festen als auch in flüssigen Nährböden züchten, doch muß der Nährboden alkalisch

sein und ein Carbonat enthalten. Es wird also ein Nährboden verwendet, zu dessen Bildung ein Carbonat einem Nährboden zugesetzt wurde, der für das Wachstum von Mikrooeganismen erforderliche Bestandteile enthält, beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze. Beispielsweise kann man einen geeigneten Nährboden erhalten, indem man ein Carbonat zu einem Nährboden hinzusetzt, der lösliche Stärke, Pepton, Hefeextrakt, K₂HPO,_h MgSO₄ · 7 H₂O usw. enthält.

Die vorgenannten Mikroorganismen werden aerob gezüchtet, wobei die Kultur geschüttelt oder mit einem Luftstrom bewegt wird. Beispielsweise kann der Mikroorganismus 24-96 Stunden lang bei 30—37° C unter Schütteln gezüchtet werden. Nach dem Züchten werden die Zellen entfernt und wird gegebenenfalls das zugesetzte Carbonat mit Essigsäure oder einer ähnlichen Säure neutralisiert und wird das gebildete Enzym durch Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel oder einem Salz, wie Ammoniumsulfat, ausgefällt oder ausgesalzen. Das gewonnene Enzym wird entwässert und getrocknet, wobei man ein Rohenzympulver zum Erzeugen von Cyclodextrin erhält

In der Stufe a) des anspruchsgemäßen Verfahrens arbeitet man zweckmäßig bei einem pH-Wert von 8-10,5,8-10oder9,0-10,5.

Als Glucoamylase in der anspruchsgemäßen Verfahrensstufe d) verwendet man eine handelsübliche Glucoamylase.

Zweckmäßig wird beim erfindungsgemäßen Verfahren das flüssige Reaktionsgemisch dadurch gebildet, daß man eine das Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase enthaltende Flüssigkeit auf die verflüssigte Stärke einwirken läßt. In günstiger Weise wird in diesem Verfahren in der Stufe e) die Lösung unter Bildung eines Konzentrats eingeengt, das mindestens etwa 40% Cyclodextrin

enthält.

In den Zeichnungen zeigt

Fig. 1 in einem Kurvenbild den optimalen pH-Wert einer im Rahmen der Erfindung verwendbaren alkali-ί sehen Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase, die von der Bacillus-Art 38-2 (ATCC 21783) erzeugt wird,

F i g. 2 in einem Kurvenbild den optimalen pH-Wert

jeder der im Rahmen der Erfindung verwendbaren alkalischen Cyclodextrin-Glycosyl-Transferasen, die

ίο von den Bacillus-Arten 135 (ATCC 21595) und 169 (ATCC 21594) erzeugt werden,

Fig.3 in einem Kurvenbild mit der Kurve a die Abhängigkeit der von dem erfindungsgemäß verwendeten Enzym (Fermentationsprodukt der Bacillus-Art 13 — ATCC 31006) erzeugte Cyclodextrinmenge und dem pH-Wert und mit der Kurve h die Abhängigkeit der Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase-Aktivität dieses Enzyms von dem pH-Wert,

F i g. 4 in einem Kurvenbild mit der Kurve a die Abhängigkeit der von dem erfindungsgemäß verwendeten Enzym (Fermentationsprodu'v der Bacillus-Art Nr. 17-1, ATCC 3ί007) erzeugten Cycioäextrinmenge und dem pH-Wert und mit der Kurve b die Abhängigkeit der Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase-Aktivität dieses Enzyms von dem pH-Wert.

Nachstehend werden Eigenschaften der erfindungsgernäß verwendbaren Mikroorganismen angegeben.

Die Anmelderin hat die Eigenschaften der vorstehend

angegebenen Arten mit Hilfe der Verfahren untersucht,

3d die in »Aerobic Spore-forming Bacteria« von Nathan R.

Smith, R. E. Gordon und F. E. Clark (United States Department of Agriculture, November 1952) und »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«

(1957) beschrieben sind. Diese Untersuchungen haben

J5 zu folgenden Ergebnissen geführt:

Tabelle 1

(1) Bacillus-Αrt Nr. 38-2 (ATCC 21783) (a) Wachstum auf verschiedenen Nährböden

Nährboden

Wachstum bei pH-Wert pH-Wert 10

1. Bouillon äußerst gering

2. Bouillon-Agar Agar äußerst gering

3. Glucose-Bouillon gering

4. Glucos-Bouillon-Agar Agar gering

5. Gelatine-Nährboden -

6. Wässeriger Pepton-Nährboden

7. Kartoffel-Nährboden äußerst gering

sehr gering

Trübung, gutes Wachstum

gut

Wachstum, Verflüssigung

positiv

gut

(b) Mikroskopische Morphologie
Die Größe des Mikroorganismus beträgt
0,5—0,6 μΐη χ 2,0-3,0 μηι.

Die im Bereich des Endes der Zelle gebildete Spore ist oval und hat eine Größe von 0,9-1,0 μπι χ 1,2-1,5 μηι. Das Sporangium ist deutlich gequollen. Die Bakterien haben pertrichöse Geißeln; sie sind freibeweglich und bilden freibewegliche Kolonien. Sie sind grampositiv und nicht beständig.

Der Mikroorganismus wächst sehr gut auf einem alkalischen Nährboden, der lösliche Stärke, Hefeextrakt, Pepton, K₂HPO₄ und MgSO₄ · 7 H₇O sowie 1% enthäl.. Dagegen ist das Wacnjtum auf jeden neutralen Medium nur gering.

(c) Physiologische Eigenschaften
1. Optimale vVachstumsbedingungen:

pH-Wert	etwa 10
Temperatur	37 -40⁰C
Aerob
Bedingungen, unter denen der
Mikroorganismus wächst:
pH-Wert	7,5-11
Temperatur	bis zu 45° C
Voges-Proskauer-Reaktion	positiv

4.
5.
6. 7. 8. 9. 10.

Nilrat reduziert

Katalasereaktion positiv

Gelatine, Kasein verflüssigt

Stärkehydrolyse positiv

Verwertung von Citrat gering Verwertung von Ammoniumsalz positiv Wachstum in 7%iger

Natriumchloridlösung gering Wachstum auf Glucosenitrat-

Nährboden positiv

12. Wachstum auf Glucose·
Asparagin-Nährboden
I 3. Erzeugung von Indol

positiv negativ

(d) Verwertung von Kohlenstoffquellen

Glucose, Fructose, Xylose, Rohrzucker, Maltose, Lactose und Arabinose werden verwertet, dagegen werden Galactose, Trehalose und Inulin nicht verwertet. Eine Erzeugung von Säure wird beobachtet.

(2)Bacillus-ArtNr. 135 (ATCC 21595) (a) Wachstum auf verschiedenen Nährböden

Tabelle 2

1 Bouillon

2. Bouillon-Agar Agar

.ΐ Glucose-Bouillon

4 Glucosc-Bouillon-Agar Agar

5 Gelatine-Nährboden

6. Wässeriger Pepion-Niihrhoilen ". Kartoffel-Nährboden

(b) Mikroskopische Morphologie Die Größe des Mikroorganismus beträgt

0.6-0.8 pm χ 2.5-4 pm.

Das Sporangium ist leicht gequollen. Die Spore ist oval und hat eine Größe von

l.0-l.2umx 1,5-1,8 μιτι.

Der Mikroorganismus hat pertrichöse Geißeln und ist freibeweglich.

Der Bacillus wächst sehr gut auf einem alkalischen Nährboden, der lösliche Stärke. Hefeextrakt. Pepton. K₂HPO₁, MgSO₄ · 7 H₂O sowie 1% Na₂COj enthält, und sieht weiß aus. Für diese Bacillusart ist es typisch, daß sie sehr gut auf einem alkalischen Nährboden und ein wenig auf einem neutralen Nährboden wächst.

(c) Physiologische Eigenschaften 1. Optimale Wachstumsbedingungen:

pH-Wert	etwa 10
Temperatur	37-40° C
Aerob
Bedinguntren, unter denen der
Mikroorganismus wächst:
pH-Wert	7-11
Temperatur	bis zu 42° C
Aerob

Wachstum hei
pll-Wcrt -

poring
gering
sehr gering
positiv

positiv

gering ziemlich gut sehr Lui sehr gut positiv positiv gut

3. ,,,-amfärbbarkeit positiv

4. Voges-Proskauer-Reaktion positiv

5. Nitrat reduziert

6. Katalase positiv

7. Gelatine und Kasein verflüssigt

8. Stärkehydrolyse positiv

9. Verwertung von Citrat negativ

10. Verwertung von Ammoniumsalz positiv

11. Wachstum in 7%iger nicht NaCI-Lösung erkannt

12. Wachstum auf Glucose-Nitrat-Nährboden sehr gering

13. Wachstum unter anaeroben Bedingungen erkannt

14. Gaserzeugung in Nitrat-Nährboden unter anaeroben Bedingungen keine

15. Wachstum auf Glucose-Asparagin-Nährboden positiv

(d) Verwertung von Kohlenstoffquellen

Glucose, Mannose, Salicin, Cellobiose, Lactose. Rohrzucker. Arabinose. Mannit und Xylose werden verwertet, doch kann keine Erzeugung von Säure beobachtet werden, weil viel Carbonat verwendet wird.

(3) Bacillus-Art Nr. 169(ATCC 21594) (a) Wachstum auf verschiedenen Nährböden

Tabelle 3

Wachstum bei pH-Wert 7

pH-Wert 10

1. Bouillon

2. Bouillon-Agar Agar
3 Glucose-Bouillon

sehr gering sehr gering sehr gerine

gering

Trübung, gutes Wachstum

4. Glucose-liouillon-Agar Agar

5. Gelatine-Nährboden

6. Wässeriger I'cpton-Nährboden

7. KarlolTel-Nährbodcii

Wachstum lic

pH-Wert

sehr gering gut

gutes Wachstum. Verflüssigung

positiv gering gut

(b) Mikroskopische Morphologie Die Größe des Mikroorganismus beträgt

0,5 — 0,6 lim χ 2 — 3 μηι.
Oil·· Sporangium ist leicht gequollen. Die Spore ist oval

1,0—1.2 μπι χ 1.3—1.7 μΐη.

Der Mikroorganismus hat pertriehöse GeiBeln und ist freibeweglich. Er wächst sehr gut auf einem alkalischen Nährboden, der lösliche Stärke. Hefeextrakt, Pepton. K₂IIPO₄. MgSO₁ ■ 7 H,O sowie 1% Na₂CO₁ enthält, wächst aber kaum auf einem neutralen Nährboden.

(c) Physiologische Eigenschaften 1. Optimale Wachstumsbedingungen:

pH-Wert	8-10
Temperatur	37-40^rC
Aerob
Bedingungen, unter denen der
Mikroorganismus wächst:
pH-Wert	7.5-11
Temperatur	biszu45~C
Aerob
3. Gramfärbbarkeit	positiv.
	veränder
	lich

4. Vogcs-Proskaucr-Reaktion

5. Nitrat

6. Katalasereaktion

7. Hydrolyse von Gelatine und Kasein

8. Stärkehydrolyse

9. Verwertung von Citrat

'0. Wachstum in 7%iger
NaCI-Lösung

11. Wachstum auf Glucose-Nitrat-Nährboden

12. Wachstum unter anaeroben
Bedingungen

13. Gaserzeugung in Nitrat-Nährboden unter anaeroben
Bedingungen

14. Wachstum auf Glucose-Asparagin-Nährboden

15. Erzeugung von Indol

positiv

reduziert

positiv

nicht

verwertet

negativ

sehr gering

positiv

keine

negativ negativ

(d) Verwertung von Kohlenstoffquellen

Glucose, Mannose. Cellobiose, Lactose, Rohrzucker, Mannit und Salicin werden sehr gut verwertet; dagegen werden Arabinose und Xylose nicht verwertet.

Eine Erzeugung von Säure kann nicht festgestellt werden, weil der Nährboden viel Carbonat enthält.

Tabelle 4

(4) Bacillus-Art Nr. 13(ATCC 31006) (a) Wachstum auf verschiedenen Nährböden

Nährboden

Wachstum bei pH-Wert 7 pH-Wert 10*)

1. Bouillon

2. Bouillon-Agar. eben

3. Bouillon-Agar. schräg

4. Bouillon-Gelatine,
mit Verwerfung

sehr gering

sehr geringes Wachstum, keine Verflüssigung der Gelatine

Wachstum; Trübung: Sedimentbildung; Häutchenbildung kreisförmig, eben oder erhaben: vollständig; glatte, glänzende Oberfläche, durchscheinend, milchigweiß
sich ausbreitend mit doppelten Rändern und glänzender Mitte; milchigweiß durchscheinend, kein Pigment
verflüssiete Schicht

*) Durch Zusatz TOn V'·, Na,C0-, wird der pH-Wert des Nährbodens auf 10 eingestellt.

(b) Mikroskopische Morphologie
Die Zelle hat eine Größe von
0,5-0,7 μιη χ 2,0-4.0 μιτι.

Am Ende der Zelle wird eine ovale Spore gebildet, deren Größe

1.3— Ί.4 Jim χ 1,5—1,6 μπι

beträgt. Das Sporangium ist deutlich gequollen. Der Mikroorganismus hat pt-rtrichöse Geißeln und ist freibeweglich. F.r ist positiv gramfärbbar und nicht säurebeständig.

Die vorstehende morphologische Untersuchung wurde auf einem Nährboden durchgeführt, der 10 g Natriumcarbonat, 5 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 20 g Stärke. 1 g K₂HPCh, 0,2 g MgSO₄ ■ 7 H₂O, 15 g Agar Agar und I 1 Wasser enthielt.

(c) Physiologische Eigenschaften

Die nachstehenden Ergebnisse wurden auf einem Nährboden erhalten, der in »Aerobic Spore-forming Bacteria« von N. R. Smith u. a. beschrieben ist und durch Zusatz von 1 % Na₂COs modifiziert worden war.

1. Nitrat

2. Denitrierung

reduziert
negativ

j.	Methylrot-Test	keine Farb
		verände
		rung, weil
		Nährboden
		basisch
4.	Voges-Proskauer-Reaktion	positiv
5.	Erzeugung von Indol	negativ
6.	Erzeugung von Schwefelwasser
	stoff	negativ
7.	Stärkehydrolyse	positiv
8.	Verwertung von Citronensäure	positiv
9.	Verwertung von Nitrat und
	Ammonium	wenig aus
		gewertet
10.	Erzeugung von Pigment	negativ
Ii.	Für Wachstum erforderlicher
	pH-Wert	7,5-11
12.	Für Wachstum erforderliche
	Temperatur	bis zu 42'C
13.	Verhalten gegenüber Sauerstoff	aerob
14.	Wachstum in 5%iger NaCI-Lösung	gering

(d) Verwertung von Kohlenstoffquellen

Lactose. Arabinose. Xylose, Glucose. Mannose. Inosit. Fructose, Galactose. Maltose, Rohrzucker, Trohalose, Mannit, Stärke, Sorbit und Glycerin werden verwertet, und Säuren werden erzeugt.

Eine Gaserzeugung wird nicht beobachtet.

Tabelle

(5)Bacillus-Art Nr. 17-1 (ATCC31007) (a) Wachstum auf verschiedenen Nährböden

Wachstum bei
pH-Wert ⁷ [•.Η-Wert ΙΟΊ

1. Bouillon, flüssig

2. Bouillon-Agar Aga.. eben

3. Bouillon-Agar Agar, eben

4. Bouillon-Gelatine.

mit Verwerfung
*) Durch /usat? von P-

sehr gering

aenng

gering

sehr gering.

Keine Verflüssigung

Na,CO-. wird der ρH-Wert des Nährbodens auf 10.0 eingestel

Wachstum: Trübung: Sedimentbildung; Häutchenbildung

kreisförmig, eben oder erhaben, glatte.

glanzende Oberfläche, durchscheinend milchigweiß

sich ausbreitend, milchigweiß, durchscheinend.

Kein Pigment im Nährboden Verflü feline in Kraterform

(b) Mikroskopische Morphologie Die vegetative Zelle ist ein Stab mit einer Größe von 05—0,7 um χ 2.0—4.0 um.

Fast am unteren Ende bildet sich eine ovale Spore mit einer Größe von

0,8-1,0 μπι χ 1,2-1,5 μπι.

Das Sporangium ist deutlich gequollen. Der Mikroorganismus hat pertrichöse Geißeln und ist freibeweglich. grampositiv und nicht säurebeständig.

Die vorstehenden Beobachtungen wurden auf einem Medium gemacht, der 10 g Natriumcarbonat, 5 k Pepton, 5 g Hefeextrakt 20 g Stärke, 1 g ^₂HPO*, 0,2 g MgSO₄ ■ 7 K₃0,15 g Agar Agar und 1 1 Wasser enthielt

(C) Physiologische Eigenschaften

Die nachstehenden Eigenschaften wurden auf einem Nährboden erhalten, der in »Aerobic Spore-forming Bacteria« von N. R. Smith u. a. beschrieben ist und durch Zusatz von 1 % Na2CO3 modifiziert worden war.

1.	Nitrat	reduziert
2.	Denitrierung	negativ
3.	Methylrotreaktion	keine Farb
		verände
		rung, weil
		Nährboden
		basisch
4.	Voges-Proskauer-Reaktion	negativ
5.	Erzeugung von Indol	negativ

6 Erzeugung von Schwefelwasserstoff

7. Stärkehydrolyse

8. Verwertung von Citronensäure

9. Verwertung von Nitrat und
Ammoniumsalz

10. Erzeugung von Pigment

11. Katalasereaktion

12. Für Wachstum erforderlicher
pH Wert

13. Für Wachstum erforderliche
Temperatur

14. Verhalten gegenüber Sauerstoff

Verwertung

negativ
positiv
sehr gut
verwertet

sehr gut
verwertet
negativ
positiv

7-11

bis zu 42 X' optimal
37-40⁰C
aerob

15. Wachstum in 7%iger NaCl-Lösung gut

Lactose, Arabinose, Xylose, Glucose. Mannose. Inositol, Fructose, Galactose, Maltose, Rohrzucker, Trehalose, Mannit. Stärke, Sorbit und Glycerin werden verwertet, und Säuren werden erzeugt. Es wurde 1 eine Gaserzeugung erkannt.

Aus den vorstehend angegebenen bakteriologischen Eigenschaften geht hervor, daß die Bacillus-Arten Nr. 38-2, 135, 169, 13 und 17-1 zu der Gattung Bacillus gehören, weil es sich um aerobe, sporerbildende Bakterien handelt.

Die Anmelderin hat ferner gefunden, daß der Qacillus polymixa, der Bacillus macerans und der Bacillus circulans als bekannte Arten zum Vergleich mit ucn vorgenannten neuen Mikroorganismen und zu deren Identifikation verwendet werden können, weil bei diesen das Sporangium deutlich gequollen ist. Die neuen Mikroorganismen ähneln in manchen Eigenschaften den bekannten Arten, sind aber in anderen Eigenschaften von ihnen vollkommen verschieden, insbesondere insofern, als der optimale pH-Wert der neuen Mikroorganismen im alkalischen Bereich liegt, während er bei den bekannten Arten neutral ist.

III UtIi 'laCiiSiCm-fiut-n ι uiyvnv \j .,nnj >^u\.iii\,\j\.iiC

charakteristische Eigenschaften des Bacillus polymixa, des Bacillus macerans und des Bacillus circulans (bekannte Arten) sowie der neuen Bacillus-Arten Nr. 38-2.135.169.13 und 17-1 angegeben.

Tabelle 6

Hacilliis-Art	Wachstum	Verwertung	Verwertung	Wachstum	Reduktion
	in 5¹ igem	von Citronen	von Nitrat	unter anaeroben	von Nitrat
	NaCI	säure		Bedingungen
B. polymixa	_	_	+	+	_
B. macerans	-	-		+	+
B. circulans	-	-		+	+ oder -
Nr. 38-;?	-	±	+	++	+
Ni. 135	-	-	-H	-	+
Nr. 169	-	-	■+	-	-
Nr. 13	+	+	■_:	+	-
Nr. 71-1	++	++	++	+	+

Aus der vorstehenden Tabelle geht hervor, daß jede der Bacillus-Arten Nr. 38-2, 135, 169, 13 und 17-1 andere Eigenschaften hat als die drei bekannten Arten und daß sie sich auch voneinander unterscheiden. Die aus der Tabelle hervorgehenden Unterschiede führen zu den Schluß, daß jede der Bacillus-Arten Nr. 38-2,135.169, 13 und 17-1 als eine neue Art anzusehen isi.

Zum Züchten der vorstehend beschriebenen Mikroorganismen benötigt man einen carbonathaltigen, basischen Nährboden, der fest oder flüssig sein kann. Man verwendet daher einen Nährboden, der die für das Wachstum des Mikroorganismus erforderlichen Bestandteile enthält, beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, ein anorganisches Salz und dergleichen, und dem ein Carbonat zugesetzt worden ist Als iCohlenstoffquelle kann man Stärke, lösliche Stärke und dergleichen verwenden. Als Stickstoffquelle verwendet man Hefeextrakt Pepton, Maisquellwasser und dergleichen. Beispielsweise kann man einen Nährboden verwenden, der lösliche Stärke, Pepton, Hefeextrakt K₂HPO₄, MgSO₄ ■ 7 H₂O und ein zugesetztes Carbonat enthält Dabei kann man als Carbonat wasserfreies Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumbicarbonat oder dergleichen verwenden.

Die Anmelderin hat festgestellt daß es sehr wichtig ist durch Zusatz einer genügenden Menge Carbonat zu

den Nährboden diesen auf einen pH-Wert im alkalischen Bereich einzustellen.

Am besten wird dem Nährboden Carbonat in einer Menge νο,ι 0,5—1,5 Gewichtsprozent zugesetzt. Dies wurde durch folgende Versuche festgestellt.

Für die Versuche wurde ein normaler, neutraler Nährboden verwendet, der 5 g Pepton, 5 g Hefeextrakt. 20 g Stärke, 1% K₂HPO,. 0,2 g MgSO, · 7 H.O. 15? Agar Agar und 11 Wasser ent: ielt. Ferner wurden modifizierte Nährboden verwendet, die verschiedene Salze und Carbonate in den in der Tabelle 7 angegebenen Mengen enthielten.

Durch Zusatz von Natriumhydroxid zu dem neutralen Nährboden wurde ein Nährboden mit dem pH-Wert 10 hergestellt.

jeder Nährboden wurde mit der Bacillus-Art Nr. 17-1 geimpft die dann bei einer Temperatur von 37°C unter Schütteln gezüchtet wurde.

Zur Feststellung des Wachstums des Mikroorganismus wurde die Kulturbrühe nach 18 Stunden in eine Küvette von 1 cm eingebracht und die Lichtabsorption bei 660 nm gemessen.

Zur Bestimmung der Cyclodextrinausbeute wurde die Aktivität der Kulturbrühe gemessen, nachdem diese 3 Tage lang den nachstehend beschriebenen Züchtungsbedingungen unterworfen worden war.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 angegeben.

Tabelle 7

Zu dem Nährboden	Na,CO-,	0.5%	K₁CO-,	0,5%	pH-Wert	Wachstum	Aktivität
zugesetztes Salz	1,0%	1.0%	vor der		U/ml
	i_>%	1,5%	Züchtung
normaler Nährboden	2,0%	2.0%	7,0	0,6	<l,0
(ohne Zusatz)	10,0	0,8	<l,0
1% NaCl	7,0	0,8	<l,0
	10.0	0,8	<l,0
1% KCl	7,0	0.8	<l,0
	10,0	1,0	<l,0
NaHCO,
0.5%	9,0	1.0	15
1,0%	92	1.1	18
1.5%	9.3	1,1	21
2,070	9,5	i.O	20

9,6	1.1	16
10,0	1,1	22
10.2	\2	22
10.5	1,0	20

9,8	1,1	14
10,2	1,1	21
10,3	1,0	22
10,5	1,1	20

Aus den in der Tabelle angegebenen Ergebnissen geht hervor, daß für die Erzeugung des erfindungsgemäß verwendeten Enzyms die Anwesenheit einer geeigneten Carbonatmenge unerläßlich ist.

Man kann den vorstehend beschriebenen Mikroorganismus in einer üblichen aeroben Schüttelkultur oder einer Luftblasenkultur züchten. Er wird zweckmäßig 24—96 Stunden lang bei einer Temperatur von 30—37°C gezüchtet

Das gebildete Enzym kann auf jede übliche Weise von der Kulturbrühe abgetrennt werden. Beispielsweise kann man nach beendeter Züchtung den Mikroorganismus aus der Kulturbrühe entfernen und dann die mit Essigsäure oder dergleichen neutralisierte oder die nicht neutralisierte Kulturbrühe mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol oder Ammoniumsulfat, behandeln. Das dadurch ausgefällte Enzym wird von der Flüssigkeit getrennt und entwässert, so daß man ein Rohenzympulver erhält. Dieses Rohenzym kann als solches für die Erzeugung des erfindungsgemäßen Cyclodextrins verwendet werden.

Ein gereinigtes Enzym kann aus dem genannten Rohenzym wie folgt erhalten werden. Man löst das Rohenzympulver in Wasser und dialysiert die so erhaltene Lösung über Nacht gegen Wasser. Die Lösung wird durch eine Kolonne mit Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose) geführt, die mit einer 0,01-molaren Tris-HCI-Pufferlösung mit dem pH-Wert 9,0 gepuffert ist Infolgegedessen wird das in der Lösung enthaltene Enzym von der Cellulose vollständig adsorbiert Durch Erhöhung der NaCI-Konzentration in der Pufferlösung von 0,01-molar auf 0,5-molar wird das adsorbierte Enzym eluiert.

Die wirksamen Fraktionen werden abgetrennt und eingeengt Dann wird die konzentrierte Lösung durch Gelfiltrations-Chromatographie mit Sephadex G-75 und Sephadex G-IOO gereinigt und derso erhaltene Kuchen zu einem gereinigten Enzympulver gefriergetrocknet.

Die Aktivität des erhaltenen Enzyms wird wie folgt bestimmt:

0,05 ml der Enzymlösung von geeigneter Konzentration wird mit 0,5 ml einer l°/oigen Lösung von löslicher in Stärke in einer O.lmolaren Glycin-Pufferlösung (pH-Wert 10,5) gemischt

Das so erhaltene Gemisch wird 2 Stunden lang auf

einer Temperatur von 40⁰C gehalten. Nach vollständig durchgeführter Reaktion wird die Lösung mit Essigsäure neutralisiert und dann 10 min lang auf 100⁰C erhitzt.

Der so erhaltenen Lösung werden 50 μg Glucoamyla¹ se zugesetzt Dann wird die Lösung eine Stunde lang auf einer Temperatur von 40⁰C gehalten, wodurch die restliche Stärke abgebaut wird. Die Menge der in der :o Lösung erzeugten Glucose wird mit Hilfe von Dinitrosalicylsäure bestimmt.

Dieselbe Arbeitsweise wird unter Verwendung von Wasser anstatt der Enzymlösung wiederholt

Die Differenz zwischen den ermittelten Glucosemen- -, gen gibt die Menge des erzeugten Cyclodextrins an.

Als eine Enzymeinheit wird jene Enzymmenge bezeichnet, die in dem vorstehend beschriebenen Verfahren 1 mg Cyclodextrin erzeugt,

Mit Hilfe von Jod kann man die Aktivität des Enzyms jo wie folgt bestimmen.

Die Enzymlösung wird so verdünnt daß die Absorption bei 700 nm von 10% auf 20% herabgesetzt wird. 0,01 ml der Enzymlösung wird mit 0,2 ml einer 2% igen wässerigen Kartoffelstärkelösung und 0,2 ml einer O.lmolaren Essigsäure-Pufferlösung mit dem pH-Wert 4,5 gemischt. Das so erhaltene Gemisch wird 10 min lang auf 40° C erhitzt Nach der Reaktion werden der erhaltenen Lösung 03 ml O^molare Salzsäure und danach 3 ml 0,005%ige Jodlösung beigemischt Das Absorptionsvermögen der Probe bei 700 nm wird gemessen.

Nachstehend werden ausführlich die physikalischchemischen Eigenschaften der Enzyme angegeben, die von den Bacillus-Arten Nr. 38-2 (ATCC 21783), 135 (ATCC 21595), 169 (ATCC 21594), 13 (ATCC 31006) und 17-1 (ATCC 31007) erzeugt werden.

1. Von der Bacillus-Art Nr. 38-2 (ATCC 21783)
erzeugtes Enzym

(1) Wirksamkeit gegenüber einem Substrat

Das durch das Züchten des genannten Mikroorganismus unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen erzeugten Enzym ist wirksam gegenüber Stärke. Es verringert die Stärke-Jod-Reaktion. Dagegen kann eine Erhöhung der reduzierenden Wirkung nicht festgestellt werden. Das Enzym kann als eine verflüssigend wirkende Amylase bezeichnet werden.

(2) Optimaler pH-Wert

Zur Bestimmung des optimalen pH-Werts des Enzyms wurde dessen Wirksamkeit bei verschiedenen pH-Werten nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmt

Zum Einstellen auf verschiedene pH-Werte wurden die nachstehenden Pufferlösungen verwendet:

pH-Wert Pufferlösung

4-5 Acetat

5-8,5 Tris-maleat

9-11 Natriumhydroxid

11-12 Natriumcarbonat und Natriumhydroxid

Tabelle 8

pH-Wert	Pufferlösung	Restaktivität
4	Acetat	0
5	Acetat	12
6	Tris-maleat	100
7	Tris-maleat	100
8	Tris-maleat	100
10	Na₂CO₃-NaHCO₃	70
11	Na₂CO₃	10

Tcmp.	Zeil	Reaktivität
°C	min	""
50	15	100
50	30	100
55	15	80
60	15	10

10

Die Probe des Enzyms wurde voiher mit Sephadex G-25 entsalzt

Die in der vorstehend angegebenen Weise erzielten Ergebnisse sind in der F i g. 1 dargestellt, in der für jeden pH-Wert die Aktivität als relative Aktivität angegeben ist, die auf eine Aktivität 100 bei dem pH-Wert 9,0 bezogen ist. Aus der Zeichnung geht deutlich hervor, daß das Enzym optimale pH-Werte bei 4,5.. 7 und 9, d. h. in einem sehr breiten Bereich hat

(3) pH-Wert-Bereich mit stabiler Aktivität

Die mit Sephadex entsalzte Enzymlösung (0,01 ml) wurde jeweils mit 0,1 ml verschiedener Pufferlösungen gemischt, die jeweils 1 Mikromol CaCb als Stabilisator enthielten. Das so erhaltene Gemisch wurde 30 min lang auf 60° C erhitzt Dann wurden 02 ml einer Pufferlösung mit dem pH-Wert 9,0 und 0,2 ml eines Substrats zu dem Gemisch zugesetzt Danach wurde die Restaktivität bestimmt Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 8 angegeben.

40

Man erkennt deutlich, daß das Enzym im Bereich der pH-Werte von 6-8 stabil ist.

(4) Temperaturbeständigkeit

Die Temperaturbeständigkeit des Enzyms wurde wie folgt untersucht:

Es wurde die auch in dem vorhergehenden Abschnitt (3) angegebenen Enzymlösung in einer Tris-maleat-Pufferlösung mit dem pH-Wert 9 hergestellt, jedoch ohne Ca^{H +} Diese Lösung wurde verschieden lang auf verschiedenen Temperaturen gehalten. Danach wurde 5, die Restaktivität bestimmt.

Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:

Tabelle 9

Restaktivität, %	PH-
pH-Wert 4	100
100	100
100	100
100	100
100	65
61	10
10	0
0

30

(5) Temperaturbedingte Hemmung

Es wurde die in dem vorhergehenden Abschnitt (3) angegebene Enzymlösung mit dem pH-Wert 8 hergestellt und mit 5 Millimol Ca⁺ + versetzt

Die Lösung wurde jeweils 30 min lang auf den in der nachstehenden Tabelle angegebenen Temperaturen gehalten. Danach wurden die Restaktivitäten bestimmt Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

Tabelle 10

Temp. ⁰C

50 55 60 65 70 75 80 Durch diese Untersuchung wurde festgestellt daß der Zusatz von Ca⁺ + nicht zu einer Erhöhung der Aktivität, aber zu einer besseren Temperaturbeständigkeit führt

(6) Reinigung des Enzyms

Der Kulturbrühe der Bacillus-Art Nr. 38-2 (ATCC 21783) wurde zum Einstellen auf den pH-Wert 10 CaCl₂ (5moiar) zugesetzt Der dadurch gebildete Niederschlag wurde abgeschleudert Zur Bildung eines Niederschlages wurde der Kulturbrühe ein halbes Volumen Aceton zugesetzt.

Der gebildete Niederschlag wurde abgetrennt und in Wasser gelöst Die Lösung wurde über Nacht dialysiert und danach mit Polyäthylenglykol konzentriert

Nach der Gelfiltrations-Chromatographie mit Sephadex G-100 wurden die wirksamen Fraktionen abgetrennt

Das Enzym wurde in einer Kolonne auf DEAE-CeIIulose, die mit 10 Millimol einer 1 Millimol CaCl₂ enthaltenden Tris-HCl-Pufferlösung mit dem pH-Wert 8,5 gepuffert war, adsorbiert Dann wurde durch Erhöhung der CaCU-Konzentration von 5-millimolar auf 50-millimolar das adsorbierte Enzym eluiert. Gewöhnlich verwendet man eine etwa 40-millimolare Konzentration.

Zur Gewinnung des Endprodukts wurden die wirksamen Fraktionen abgetrennt und durch Gelfiltration mit Sephadex G-75 gereinigt

Kurven zur Darstellung der Abhängigkeit der Aktivität des Enzyms von dem pH-Wert vor und nach der Reinigung sind einander im wesentlichen gleich.

(7) Homogenität des Enzyms

Die Homogenität dieses Enzyms wurde durch folgende Beobachtungen bestätigt:

(a) Die Analyse mit der Ultrazentrifuge ergab für die Sedimentationskonstante einen einzigen Spitzenwert von etwa 4.

(b) Die Gelfiltrations-Chromatographie ergab einen einzigen Spitzenwert der Aktivität.

(c) Die elektrophoretische Analyse bei dem pH-Wert 83 mit Hilfe einer Scheibe ergab eine monodisperse Verteilung.

(d) Das Verhältnis zwischen den Aktivitäten des Enzyms bei den pH-Werten 4 und 9 wird nicht verändert, auch wenn das Enzym durch Erhitzen teilweise denaturiert wird.

Ein Vergleich der vorstehend angegebenen, physikalisch-chemischen Eigenschaften des Enzyms und der

Tabelle 11

bekannten saccharifizierend und verflüssigend wirkenden Amylasen, die von dem Bacillus subtilis erzeugt werden (siehe »Advances in Applied Microbiology«, Nr. 7, S. 293, 1965) ist in der nachstehenden Tabelle 11 dargestellt.

	Enzym	Amylase von	Amylase von
	Amylase von	B. subtilis	B.-Art Nr. 38-2
	B. subtilis		(ATCC 21783)
		Saccharifizierend	Verflüssigend
	Verflüssigend	55-70°C	60-70°C (in
Temperaturbeständigkeit	65-90°C		Anwensenheit von CsT⁺)
		4,0-7,8	5-10
pH-Wert-Bereich mit stabiler Aktivität	4,8-10,8	4,8-5,2	4,5; 7,0; 9,0
Bereich der optimalen pH-Werte	6,4-6,0	-	+
Stabilisierung durch Ca^T+	+	70%	15%
Stärkehydrolyse	35%

Anmerkung:
+ = stabil
- = unstabil

II. Von den Bacillus-Arten Nr. 135 (ATCC 21595)
und 169 (ATCC 21594) erzeugte Enzyme

(1) Wirksamkeit gegenüber einem Substrat

Die durch das Züchten Jer beiden genannten Mikroorganismen unter rlen vorstehend beschriebenen Bedingungen erzeugten Enzym.' sind wirksam gegenüber Stärke. Sie verringern die Stärke-Jod-Reaktion. Dagegen nimmt die reduzierende Wirkung nur wenig zu.

Durch Papierchromatographie des Produkts wurde eine Reihe von Oligosaccharide^ wie Maltose, Maltotriose, Maltotetraose usw. in kleinen Mengen festgestellt. Daher werden diese Enzyme als verflüssigend wirkende Amylasen gekennzeichnet.

(2) Optimale pH-Werte

Zur Bestimmung der optimalen pH-Werte der von den Bacillus-Arten Nr. 135 und 169 erzeugten Enzyme wurden deren Aktivitäten bei verschiedenen pH-Werten bestimmt.

Das Enzym wurde vorher mit Sephadex G-25 entsalzt. Die anderen Bedingungen waren wie vorstehend angegeben.

Aus der Zeichnung geht deutlich hervor, daß die von jo den Bacillus-Arten Nr. 135 und 169 erzeugten Enzyme optimale pH-Werte bei 10,5 haben.

(3) pH-Wert-Bereich mit stabiler Aktivität

Es wurde untersucht, in welchem pH-Wert-Bereich die Enzyme stabil gehalten werden können.

Das mit Sephadex entsalzte Enzym (0,01 ml) wurde jeweils mit 0,1 ml verschiedener Pufferlösungen gemischt, die jeweils 1,0 Mikrorno! CaCb als Stabilisator enthielten.

Das so erhaltene Gemisch wurde 15 min lang auf 55° C erhitzt Dann wurden 0.2 ml einer Pufferlösung mit dem pH-Wert 10,5 und 0,2 ml eines Substrats zu dem Gemisch zugesetzt. Danach wurde die Restwirksamkeit bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 12 angegeben.

pH-Wert

Pufferlösung

4 und 5 6,7 und 8 9 und 10 10, Il und 12

Acetat

Phosphat

Borat

Glycin-NaOH-NaCI

Die in der vorstehend angegebenen Ergebnisse sind in der F i g. 2 dargestellt, in der für jeden pH-Wert die Aktivität als relative Aktivität angegeben ist, die auf eine Aktivität 100 bei dem pH-Wert 10,5 bezogen ist.

Tabelle 12

pH-Wert

Pu fieri ösung

Restaktivität

Acetat

Tris-maleat

Na₂COj-NaHCOj

Na₂CO₃-NaOH

0
0
25
51
47
10

(4) Temperaturbeständigkeit (Inaktivierung)

Jedes der von den Bacillus-Arten Nr. 135 und 169 erzeugten Enzyme erlitt einen Aktivitätsverlust von etwa 50 -70%, wenn es bei dem pH-Wert 10,0 zehn Minuten lang auf 60°C erhitzt wurde.

Bei einer Erhitzung auf 50° C während eines Zeitraums von 15 min trat kein Aktivitätsverlust ein.

(5) Hemmung, Aktivierung und Stabilisierung

Es wurde die in dem Abschnitt (3) angegebene Enzymlösung mit dem pH-Wert 10 hergestellt und mit verschiedenen Mengen Ca⁺+ versetzt. Die Lösung wurde 15 min lang auf 55° C erhitzt Die danach bestimmte Restaktivität ist in der nachstehenden Tabelle 13 angegeben.

Tabelle 13	Restaklivitat
Ca⁺¹"-Menge
Mikromol	0
O	0
0,15	10
0,25	25
0,5	54
1,0	40
1.5

Durch diese Untersuchung wurde festgestellt, daß der Zusatz von Ca^{+ +} nicht zu einer Erhöhung der Aktivität, aber zu einer besseren Temperaturbeständigkeit führt.

Aus den physikalisch-chemischen Eigenschaften der von den Bacillus-Arten Nr. 135 und 169 erzeugten Enzyme erkennt man, daß diese Enzyme den optimalen pH-Wert 10,5 haben.

Es wurde dadurch bestätigt, daß diese Enzyme neue Amylasen sind.

III. Von der Bacillus-Art Nr. 13 (ATCC 31006)
erzeugtes Enzym

(1) Wirksamkeit gegenüber einem Substrat

Das durch das Züchten des genannten Mikroorganismus unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen erzeugte Enzym ist wirksam gegenüber Stärke. Es verringeu die Stärke-Jod-Reaktion. Dagegen kann bei dem pH-Wert 10,5 eine Erhöhung der reduzierenden Wirkung nicht festgestellt werden. Das Enzym erzeugt Cyclodextrin. Es kann als eine Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase und als verflüssigend wirkende Amylase bezeichnet werden. Die Amylase verringert die Stärke-jod-Reaktion und erhöht bei dem pH-Wert 4,5 die reduzierende Wirkung.

(2) Optimaler pH-Wert

Zur Bestimmung des optimalen pH-Werts des Enzyms wurde dessen Wirksamkeit bei verschiedenen pH-Werten nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmt.

pH-Wert

Pufferlösung

4-5
5-8,5
9-11
11-12

Acetat
Tris-maleat
Glycin-NaOH
NaHCO₃-NaOH

Die in der vorstehend angegebenen Weise erzielten Ergebnisse sind in der Fig.3 dargestellt, in der die Kurve a die Ausbeute an Cyclodextrin bei verschiedenen pH-Werten und die Kurve b die relativen Aktivitäten der Amylase bei verschiedenen pH-Werten darstellt

Aus der Kurve a geht hervor, daß der optimale pH-Wert für die Erzeugung von Cyclodextrin zwischen 10 und 104 liegt Aus der Kurve b geht hervor, daß der ίο optimale pH-Wert für die Amylaseaktivität bei 4,5 liegt

(3) pH-Wert-Bereich mit stabiler Aktivität

Es wurde untersucht in welchem pH-Wert-Bereich das Enzym stabil gehalten werden kann.

is Die mit Sephadex entsalzte Enzymlösung (0,01 ml) wurde mit jeweils 0,1 ml der in der nachstehenden Tabelle angegebenen Pufferlösungen gemischt Das Gemisch wurde 10 min lang auf 50° C erhitzt Dann wurden 0,2 ml einer Pufferlösung mit dem pH-Wert 10,0 und 0,2 ml eines Substrats zu der erhitzten Lösung zugesetzt Danach wurde die Testwirksamkeit bei verschiedenen pH-Werten bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

Tabelle 14

pH-Wert

Pufferlösung

Restaktivität

4	Acetat	0
5	Acetat	10
6	Tris-ma!eat	60
7	Tria-maleat	65
H 8	Tris-maleat	80
10	Na₂CO₃-NaHCO,	60
11	Na-CO,	10

(4) Temperaturbeständigkeit

(Bedingungen für die Inaktivierung)

Die Temperaturbeständigkeit des Enzyms wurde untersucht

₄-, Es wurde die auch in dem vorhergehenden Abschnitt (3) angegebene Enzymlösung in einer Tris-nialeat-Pufferlösung mit dem pH-Wert 7 hergestellt Zur Bestimmung der Inaktivierung der Lösung wurde diese jeweils 10 min lang auf verschiedene Temperaturen so erhitzt.

Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:

Tt n|.
⁰C

Zeit

Restaktivität

10
10
10
10

100
80
40

Die Probe des Enzyms wurde vorher mit Sephadex G-25 entsalzt.

(5) Hemmung, Aktivierung und Stabilisierung

Es wurde die in/ Abschnitt (3) angegebene Enzymlösung mit dem pH-Wert 7 hergestellt.
Der Lösung wurde Ca⁺⁺ in verschiedenen Mengen

zugesetzt. Danach wurde die Aktivität bestimmt. Eine Erhöhung wurde nicht festgestellt.

Zur Bestimmung der Temperaturbeständigkeit derselben Lösung wurde diese mit einem Gehalt von 5 Millimol Ca⁺* jeweils 20 min lang auf verschiedene Temperaturen erhitzt. Danach wurde die Restaktivität der Lösung bestimmt. Die erzielten Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 16 angegeben.

Tabelle 16	KL«l:ikit\it.tt
Ιι.·πιρ	IfX)
50	80
55	20
60	5
65	0
70	0
75	0
80

(10) Elementaranalyse
C 47.8% H 7,2% S 0,6% N 15.4% Asche 0.9%

IV. Von der Bacillus-Art Nr. 17-2 (ATCC 31007)
erzeugtes Enzym

(1) Wirksamkeit gegenüber einem Substrat

Das durch das Züchten des genannten Mikroorganismus unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen erzeugte Enzym ist wirksam gegenüber Stärke. Es verringert die Stärke-Jod-Reaktion. Dagegen kann eine Erhöhung der reduzierenden Wirkung nicht festgestellt werden.

Die Endprodukte des Enzyms bestehen daher fast ausschließlich aus Cyclodextrin.

(2) Optimaler pH-Wert

(6) Reinigung des Enzyms

Der Kulturbrühe des Mikroorganismus wurde CaCL' (5-molar) zugesetzt. Der dadurch gebildete Niederschlag wurde von der Flüssigkeit abgeschleudert. Zur Bildung eines Niederschlages wurde der Kulturbrühe m ein halbes Volumen Aceton zugesetzt.

Der gebildete Niederschlag wurde abgetrennt und in Wasser gelöst. Die Lösung wurde über Nacht dialysiert und danach mit Polyäthylenglykol konzentriert.

Nach einer Gelfiltrations-Chromatographie mit Se- r> phadex G-100 wurden die wirksamen Fraktionen abgetrennt. Das Enzym wurde in einer Kolonne auf DEAE-Cellulose. die mit 10 Millimol einer 1 Millimol CaCI; enthaltenden Tris-HCI-Pufferlösung mit dem pH-Wert 9.0 gepuffert war, adsorbiert. Dann wurde durch Erhöhung der NaCl-Konzentration von 0 auf 0.5-molar das adsorbierte Enzym eluiert. Gewöhnlich kann man das Enzym bei einer etwa 0,1-molaren Konzentration eluieren.

Zur Gewinnung des Endproduktes wurden die 4-, aktiven Fraktionen abgetrennt und wurde die abgetrennte Lösung mit Sephadex G-75 gelfiltriert.

Kurven zur Darstellung der Abhängigkeit der Aktivität des Enzyms von dem pH-Wert vor und nach der Reinigung sind einander im wesentlichen gleich. y>

(7) Verwendungstemperaturbereich

Die Aktivität des Enzyms wurde bei verschiedenen Temperaturen gemessen. Es wurde festgestellt daß der optimale Verwendungstemperaturbereich des Enzyms zwischen 45⁼ und 50" C liegt

(8) Molekulargewicht des Enzyms

Durch Gelfiltration wurde das Molekulargewicht des Enzyms mit etwa 60 000 bestimmt

(9) Isoelektrischer Punkt

Durch Elektrophorese mit Filterpapier wurde festgestellt daß der isoelektrische Punkt des Enzyms etwa bei dem pH-Wert 4.5 liegt

pll-Wert

PulTcrliisunB

4.5
6.7.8

10. II. 12

Acetat

Phosphat

Borat

Glycin-NaOH-NaCI

Die Probe des Enzyms wurde vorher mit Sephadex G-25 entsalzt.

Die in der vorstehend angegebenen Weise erzielten Ergebnisse sind in der Fig.4 dargestellt, in der die Kurve a die Ausbeute an Cyclodextrin bei verschiedenen pH-Werten und die Kurve b die relativen Aktivitäten der Amylase bei verschiedenen pH-Werten darstellt.

Aus der Kurve a geht hervor, daß der optimale pH-Wert für die Erzeugung von Cyclodextrin zwischen 10 und 10.5 liegt. Aus der Kurve b geht hervor, daß der optimale pH-Wert für die Amylaseaktivität bei 4,5 liegt.

(3) pH-Wert-Bereich mit stabiler Aktivität

Die mit Sephadex entsalzte Enzymlösung (0,01 ml) wurde mit jeweils 0,1 ml der in der nachstehenden Tabelle angegebenen Pufferlösungen gemischt Das Gemisch wurde 10 min lang auf 55° C erhitzt Dann wurden 0,2 ml einer Pufferlösung mit dem pH- »^ert 104 und 0,2 ml eines Substrat zu der erhitzten Lösung zugesetzt Danach wurde die Restwirksamkeit bei verschiedenen pH-Werten bestimmt Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 17 angegeben.

Tabelle 17	Pufferlösung	Restalctivität ('/:)
pH-Wert	Acetat Tris-maleat Tris-maleat Tris-maleat Na,CO,-NaHCO, Na,CO-NaOH	0 40 70 95 80 20
4 6 1 8 10 11

(4) Tempsraturbeständigkeit
(Bedingungen für Inaktivierung)

Das Enzym erlitt einen Aktivitätsverlust von etwa 20—30%, wenn es bei dem pH-Wert 10 IO min lang auf 55⁰C erhitzt wurde. Die Aktivität des Enzyms ging fast vollständig verloren, wenn es 10 min lang auf 60°C e^r! itzt wurde.

(5) Hemmung, Aktivierung und Stabilisierung

Es wurde der Einfluß eines Zusatzes von Ca ' ' auf die Aktivität des En/.yms untersucht. Durch den Zusatz von Ca' ' konnte die Aktivität nicht erhöht, aber die Temperaturbeständigkeit verbessert werden.

Eine Enzymlösiing mit dem pH-Wert 10 wurde hergestellt und 20 min lang auf 55"C erhitzt. Bei unterschiedlichen Gehalten von Ca · * in der Lösung wurde deren Restaktivität bestimmt.

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 18 angegeben.

Tabelle 18

Ci -Menge
Mikrnmol.

ReMaktnit.it

0.15
0.25
0.5
1.0

30

40

60

80

100

(6) Reinigung

Das Enzym kann nach dem für die Reinigung des von der Bacillus-ArtNr. 13(ATCC 31006) erzeugten Enzyms beschriebenen Verfahren gereinigt werden.

(7) Verwendungstemperaturbereich

Die Aktivität des Enzyms wurde bei verschiedenen Temperaturen gemessen. Es wurde festgestellt, daß der optimale Verwendungstemperaturbereich des Enzyms zwischen 50° und 55"C liegt.

(8) Molekulargewicht

Durch Gelfiltration wurde das Molekulargewicht mit etwa 50 000 bis 60 000 bestimmt.

(9) Isoelektrischer Punkt

Nach dem Ampholin-Elektrofokussierverfahren wurde festgestelll. HaB rlpr UnpIpIttrUrhp Punkt ftp«; Fnzytm bei dem pH· Wert 4,5 liegt.

(10) Elementaranalyse
C 48,0% H 7.3% S 0,65% N 15.7% Asche 1,01%

Aufgrund der physikalisch-chemischen Eigenschaften der von den Bacilh<-Arten Nr. 38-2 (ATCC 21783). 135 (ATCC 21595). 169 (ATCC 21594), 13 (ATCC 31006) und 17-1 (ATCC 31007) erzeugten Amylasen kann man feststellen, daß der optimale pH-Wert dieser Amylasen für die Erzeugung von Cyclodextrin im Bereich von 9 bis 10.5, insbesondere von 10 bis 10,5, liegt. Die Antnelderin hat ferner festgestellt, daß das Verhältnis der relativen Aktivitäten bei den pH-Werten 4,5 und 10 für die verschiedenen Amylasen verschieden ist. wie aus der Tabelle 19 hervorgeht.

Tabelle

Bacillus-Art

Optimaler pH-Wert der Cyclodexlrin-Glycosyl- Transferase Verhältnis der (relativen)
Amylase-Aktivitäten bei dem

pH-Wert 4,5 pH-Wert 10

Nr. 13 (ATCC 31 006)
Nr. 17-1 (ATCC 31 007)
Nr. 38-2 (ATCC 21 783)
Nr. 135 (ATCC 21 595)
Nr. 169 (ATCC 21 594)

10-10.5

9-9.5

10-10,5

10-10.5 100%
100%
100%
100%
100%

30-50%

40-50%

70-80%

80%

Bei den erhaltenen Amylasen handelt es sich also um Cyclodextrin-GIycosyl-Transferasen mit einem optimalen pH-Wert im alkalischen Bereich.

Für das erfindungsgemäße Verfahren muß der optimale pH-Wert im Bereich von 7—103, zweckmäßig von 8—10,5. insbesondere von 10—103. liegen. Besonders gut wird eine Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase verwendet, die einen optimalen pH-Wert im Bereich von 8—10 hat.

Insbesondere wird die verwendete Cyclodextrin-GIycosyl-Transferase aus den Amylasen ausgewählt, die durch Züchten eines der vorstehenden Mikroorganismen der Bacillus-Arten Nr. 38-2 (ATCC 2 !783X !35 (ATCC 21595), 169 (ATCC 21594), 13 (ATCC 31006) und 17-1 (ATCC 31007) erzeugt worden ist

In der Praxis kann das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt durchgeführt werden:

Stärke wird zweckmäßig mit NaOH vollständig verflüssigt. Die Stärkelösung wird auf einen pH-Wert von 6,0—103, zweckmäßig 9,0—103, eingestellt. Dann wird die Lösung mit der vorstehend angegebenen Cyclodextrin-GIycosyl-Transferase versetzt und die Lösung so lange auf der optimalen Behandlungstemperatur gehalten, daß Cyclodextrin erzeugt wird. Die optimale Behandlungstemperatur ist davon abhängig, welche der vorstehend angegebenen, alkalischen Amylasen verwendet wird. Im allgemeinen kann die Erzeugung von Cyclodextrin innerhalb von 12 Stunden durchgeführt werden.

Nach der Fermentation und dem Filtrieren der

erhaltenen Lösung kann man das Cyclodextrin in hoher Ausbeute durch Einengen gewinnen, ohne daß man ein organisches Lösungsmittel verwendet, was bei üblichen Verfahren unerläßlich ist.

Insbesondere kann man die ursprüngliche Stärkeflüssigkeit auf einen pH-Wert von etwa 10 einstellen und danach homogen gelatinieren und abkühlen. Dann wird der Flüssigkeit zur Durchführung der Reaktion eine von dem vorgerannten Mikroorganismus erzeugte Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase zugesetzt. Das flüssige Reaktionsgemisch wird dann zum Inaktivieren des Enzyms erhitzt und danach abgekühlt und sein pH-Wert auf etwa 5,0 eingestellt. Zum Abbauen von nicht umgesetzter Stärke wird dann der Reaktionsflüssigkeit eine handelsübliche Glukoamylase zugesetzt. Danach wird das flüssige Reaktionsgemisch filtriert und so eingeengt, daß es mindestens etwa 40% Cyclodextrin enthält, und wird der Flüssigkeit als Keimsubstanz eine kleine Menge Cyclodextrin zugesetzt. Wenn man die Flüssiekeit stehen läßt, fällt das Cyclodextrin aus und setzt sich der Niederschlag ab. Durch Abfiltrieren und Trocknen des Niederschlags erhält man das gewünschte Cyclodextrin in einer hohen Ausbeute von 50—70%.

Da die Cyclodextrin-Glycosyl Transferase einen optimalen pH-Wert im alkalischen Bereich hat, muß der pH-Wert auf etwa 6,0—10,5, zweckmäßig etwa 9,0—10,5, eingestellt werden. Man kann dem flüssigen Reaktionsgemisi.h jede der handelsüblichen Glukoamylasen zusetzen. Die Art des in einer kleinen Menge als Keimsubstanz zuzusetzenden Cyclodextrins ist nicht besonders kritisch. Das flüssige Reaktionsgemisch muß derart eingeengt werden, daß es mindestens 40% Cyclodextrin enthält. Nach diesem Verfahren kann man das gewünschte Cyclodextrin in einer hohen Ausbeute über 50% erhalten.

Ausgefälltes kristallines Cyclodextrin kann zur Erzeugung von reinem Cyclodextrin umkristallisiert werden.

Es wurde gefunden, daß das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Cyclodextrin dieselben physikalisch-chemischen Eigenschaften hat wie das bekannte Cyclodextrin.

Das erfindungsgemäß erzeugte Cyclodextrin hat folgende physikalisch-chemische Eigenschaften:

1. Elementaranalyse

C 44,4% H 6,1% O 49.5%

2. Molekulargewicht

Rohprodukt 1200+100

a-Dextrin-Fraktion 970

^-Dextrin-Fraktion 1140

γ- Dextrin- Fraktion 1300

3. Schmelzpunkt
200°C(acetyliert)

4. Optische Drehung [a]o
a-Dextrin-Fraktion +150
^-Dextrin-Fraktion +160
y-Dextrin-Fraktion +170

5. Ultraviolettabsorptionsspektrum
Keine charakteristischen Merkmale

6. Infrarotabsorptionsspektrum

Fast wie bei dem handelsüblichen α-Dextrin

7. Farbreaktion
a-Dextrin-Fraktion

ß- und )'-Dextrin-Fraktion Unter der Einwirkung

von )od kaum verfärbt, gelblichbraun oder rötlichbraun

8. Kristallographie

Λ-Dextrin-Frakiion hexagonal oder blatt

förmig

^-Dextrin-Fraktion Parallelogramm

y-Dextrin-Fraktion Vierseitig

9. Acidität
Neutral.

10. Farbe
We iö.

! 1. Reduzierende Wirkung
Keine reduzierende Wirkung.

Unter der Einwirkung von I'aka-t-Amylase werden Glukose. Maltose und Malt-triose erzeugt. Keine Wirkung eines F.nzyms, das Poly- oder Okigosaccharide von den Kettenenden her abbaut.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Cyclodextrin enthält eine \-, eine ß- und eine y-Dextrin-Fraktion und hat folgende Strukturformel:

Ci

	G	\ G
/ G		G
G		-G
G-

Blaufärbung unter Einwirkung vor; Jod

G (i

G G

Die Temperaturbeständigkeit der erfindungsgemäß zu verwendenden Enzyme ist um 15—20° C besser als die des bekannten cyclodextrinerzeugenden Enzyms. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren sehr vorteilhaft und wirksam.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Cyclodextrin kann für verschiedene Zwecke verwendet werden, insbesondere als Ersatz für Gummi arabikum oder zum Erzeugen von Süßstoffen, wie Hirsegelee und dergleichen, weil die Cyciodexirin-CHucosyl-Transferase eine Transferasewirkung hat

Ε)« neuartiger, wertvoller Süßstoff kann beispielsweise wie folgt erzeugt werden.

IO g Dextrin oder Stärke werden mit 3 g Rohrzucker gemischt. Das Gemisch wird in Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 100 ml der Cyclodexirin-Glucosyl-Transferase enthaltenden Enzymlösung verjetzt und dann über Nacht bei einer Temperatur von 37° C stehengelassen.

Nicht umgesetztes Dextrin wird mit Trichlorethylen entfernt. Dann werden durch Einengen der Lösung 10 g eines hirsegeleeähnlichen Sirups gebildet. Es wurde festgestellt, daß das Produkt einen kleineren Anteil Rohrzucker und einen größeren Anteil einer Verbindung von Rohrzucker und Glukose enthält und für die Verwendung als Süßstoff genügend süß ist.

Beispiel 1

15 1 Wasser mit einem Gehalt von 4% (Gew./Vol) Kartoffelstärke (600 g Trockensubstanz) wurden mit Natriumhydroxid auf den pH-Wert 10 eingestellt. Zum homogenen Gelatinieren der Stärke wurde die Flüssigkeit 30 mi, lang auf 125°C erhitzt. Die gelatinierte Flüssigkeit wurde auf 50⁰C abgekühlt. Dann wurden der Flüssigkeit 600 mg einer Cyclodextrin-Glucosyl-Transferase zugesetzt, die von der Bacillus-Art Nr. 38-2 (ATCC 21783) erzeugt worden war. Die Reaktion wurde dann 30 Stunden lang bei 50⁰C durchgeführt.

Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zur Inaktivierung des Enzyms 5 min l&ng auf 100⁰C erhitzt und danach auf 55°C abgekühlt und mit Salzsäure auf den pH-Wert 5,0 eingestellt. Danach wurden 900 mg handelsübliches Glukoamylaseprodukt, das eine Aktivität von 2000 Einheiten pro g hat, dem Reaktionsgemisch zugesetzt, und die Reaktion wurde 20 Stunden lang durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde danach mit Aktivkohle entfärbt und auf übliche Weise filtriert. Dann wurde durch Einengen des Reaktionsgemisches dessen Feststoffgehalt auf 65% erhöht und wurde dem Konzentrat eine kleine Menge Cyclodextrin zugesetzt, worauf es in einem Kühlraum über Nacht stehengelassen wurde.

Das ausgefällte Cyclodextrin wurde abfiltriert und vakuumgetrocknet. Dabei wurden 280 g Cyclodextrin erhalten.

Beispiel 2

151 Wasser mit einem Gehalt von 4% (GewVVol) Kartoffelstärke (600 g Tro Trockensubstanz) wurden mit Natriumhydroxid auf den pH-Wert 9.5 eingestellt. Danach wurde die Flüssigkeit 30min lang auf I25°C erhitzt, so daß die Stärke homogen gelatiniert wurde.

Die gelatinierte Flüssigkeit wurde auf 50⁰C abgekühlt.

Dann wurde sie mit 600 mg der von der Bacillus-Art Nr. -. 17-1 (ATCC 31007) erzeugten Cyclodextrin-Giucosyl-Trar.sferase versetzt, und die Reaktion wurde 30 min lang bei 50° C durchgeführt.

Durch Behandlung des Reaktionsgemisches in der im

Beispiel 1 angegebenen Weise wurden 225 g ausgefäll-" tes Cyclodextrin erhalten.

Beispie! 3

Das Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle der von der Bacillus-Art Nr. 38-2 (ATCC 21783) '· erzeugten Cyclodextrin-Glucosyl-Transferase die von den Bacillus-Arten Nr. 13 (ATCC 31006), 135 (ATCC 21595) und 169 (ATCC 21594) erzeugten Cyclodex'rin-Glucosyl-Transferasen verwendet wurden. Es wurden 220 g. 21 5 gbzw. 217 g Cyclodextrin erhalten.

Vergieichsversuch

15 1 Wasser mit einem Gehalt von 4% (Gew.'Vol) Kartoffelstärke (600 g Trockensubstanz) wurden auf den pH-Wert 5,i eingestellt. Die Flüssigkeit wurde

', 30 ..lin lang auf 125°C erhitzt, so daß die Stärke gelatinierte und homogene dispergiert wurde. Die gelatinierte Flüssigkeit wurde schnell auf 40°C abgekühlt.
Getrennt wurden 15 g Calciumcarbonat und 800 ml

im Wasser zu 150 g dünnen, langen Kartoffelstäbchen zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 min lang bei 120° C sterilisiert und danach abgekühlt. Danach wurde das Gemisch mit dem Bacillus macerans (im Institute for Fermentation in Osaka, |apan, unter der Nummer IFO

r> 3490 deponiert) geimpft und der Mikroorganismus etwa zwei Wochen lang bei 37'C unter Schütteln gezüchtet. Durch Filtrieren des Nährbodens wurden Zellen entfernt. Als Filtrat wurde eine Enzymflüssigkeit erhalte'.

in 15 1 dieser Enzymflüssigkeit wurden zu der vorstehend beschriebenen Stärkeflüssigkeit zugesetzt. Die Reaktion wurde 70 Stunden lang durchgeführt. Zum Inaktivieren der von dem Bacillus macerans erzeugten Amylase wurde das Reaktionsgemisch 5 min lang auf

ii 100°C erhitzt. Danach hatte es, auf die Trockensubstanz bezogen, einen Cyclodextringehalt von 32%.

Bei der Behandlung des Reaktionsgemisches in der im Beispiel 1 angegebenen Weise wurden Cyclodextrinkristalle nicht in nennenswerten Mengen ausgefällt.

Hierzu 4 Bhitt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Erzeugung von Cyclodextrin durch Abbau von Stärke mit Enzymen aus Bacillus-Arten, dadurch gekennzeichnet, daß

a) Stärke in Wasser verflüssigt und die die verflüssigte Stärke enthaltende Lösung auf einen pH-Wert von 6,0 bis 104 eingestellt wird,

b) danach der Lösung eine Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase, die einen optimalen pH-Wert im alkalischen Bereich besitzt, zugesetzt wird,

c) die so erhaltene Lösung filtriert wird,

d) dann zum Abbau von nicht umgesetzter Stärke dem RltratGlukoamylase zugesetzt wird,

e) die so erhaltene Lösung eingeengt wird und

f) zu der eingeengten Lösung Cyclodextrin zur Auskristallisation von reinem, kristallinem Cyclodextrin als Kristallkeimsubstanz zugesetzt wird

oder anstelle von d), e) und Q anschließend an c)

g) die Filtrierte Lösung eingeengt und kristallines Cyclodextrin auskristallisiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase einsetzt, die durch Züchten Bacillus sp. ATCC 21783, ATCC 21595, ATCC 21594, ATCC