DE1957416C

DE1957416C - Verfahren zur Herstellung von Pullulanaseenzym

Info

Publication number: DE1957416C
Application number: DE19691957416
Authority: DE
Inventors: Robert Edward Forest 111 Heady (V St A)
Original assignee: CPC International Ine , Englewood Cliffs, NJ (V St A )
Filing date: 1969-11-14
Publication date: 1973-06-14

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Pullulanase unter aerobem Einsatz eines Stammes von Aerobacter aerogenes in Kohlenhydratmaterialien enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen.

Pullulanaseenzym ist ein besonders wertvolles Enzym, weil es speziell die alpha-l,6-Bindungen in Stärken aufspaltet. Produziert wird das Enzym durch das Bakterium Aerobacter aerogenes. Wenn das Pullulanaseenzym in Verbindung mit einem Maltose bildenden Enzym, beispielsweise Malzdiastase, zur Anwendung kommt, lassen sich Stärken leicht zu Sirupen mit einem höheren Maltosegehalt konvertieren, wie es nicht zu erreichen ist, wenn die Stärken mit Malzdiastase allein konvertiert werden.

Wenn die Herstellung des Pullulanaseenzyms in der Literatur beschrieben worden ist, wurde besonders darauf hingewiesen, daß die besten Ergebnisse erzielt werden, wenn die Bildung des Enzyms mit Maltose, Maltotriose oder Pullulan angeregt wird, und zwar wenigstens in der Fermentationsstufe und vorzugsweise in der Impfmaterial- und in der Fermentationsstufe. Pullulan ist ein Polysaccharid, das von der schwarzen Hefe Pullularia p"''ulans gebildet wird. Seine Struktur ist die eines Polymeren aus Maltotriose, verbunden durch alpha-l,6-Bindungen. Maltose soll eine vorzügliche Kohlenhydratquelle für die Bildung des Pullulanaseenzyms sein.

In »Bergeys Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage, 1957, S. 342, findet sich eine Charakterisierung von Aerobacter aerogenes, aus der jedoch nicht zweifelsfrei hervorgeht, ob Stärke und Dextrin durch Aerobacter aerogenes assimiliert werden, da lediglich kurz erwähnt wird, daß Säure und Gas auf einer Vielzahl von Kohlenhydraten offenbar gebildet werden. Aber selbst wenn man annimmt, daß hieraus die Assimilation der speziell genannten Kohlenhydrate bekannt sei, ist dieser Veröffentlichung die Auswahl

so gerade von Stärke und Stärkehydrolysaten mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 zur Verwendung in wenigstens einer der nachfolgend aufgeführten Stufen bei der bekannten Herstellung von Pullulanase unter aerobem Einsatz eines Stammes von Aerobacter aerogenes in Kohlenhydratmaterialien enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen nicht zu entnehmen. Auch ist hieraus die Verwendung der letztgenannten Kohlenhydrate zur Erzeugung von Pullulanase in höherer Ausbeute als üblich nicht erkennbar. Die Fachwelt hatte als bislang wirksamste Kohlenhydratquelle für Pullulanase-Enzymzubereitung die Maltose angesehen. Dennoch hat die mit Maltose erzielte Enzymausbeute nicht befriedigt, überraschenderweise wurde aber gefunden, daß unter Verwendung von bestimmten Kohlenhydratmaterialien noch bessere Ausbeuten erzielt werden können als mit Maltose, dem bislang bewährtesten Kohlenhydrat.

Es ist bekannt, daß die Ausbeuten an Pullulanaseenzym selbst dann bei weitem nicht so hoch sind, wie es wünschenswert ist, wenn die als wirksamste Kohlenhydratquelle bekannte Maltose verwendet wird. Dadurch wird die Herstellung dieser wertvollen Enzymzubereitung kostspielig, und die wirtschaftliche Verwendung ist in den meisten Fällen nicht realisiert worden, obwohl die damit hergestellten Stärkehydrolysatprodukte besondere Eigenschaften gezeigt und sich als wertvoll bei der Verwendung für eine Anzahl von Lebensmitteln erwiesen haben.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Pullulanase unter aerobem Einsatz eines Stammes von Aerobacter aerogenes in Kohlenhydratmaterialien enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen in besonders hohen Ausbeuten und zu niedrigen Kosten sowie in einer leicht durchführbaren und wirtschaftlichen Art zu schaffen, und zwar durch Verwendung einer Kohlenhydratquelle in einer oder in mehreren Stufen der Enzymherstellung, durch welche insgesamt eine wesentlich erhöhte Enzymmenge erhalten wird.

Fermentationsprozesse, wie sie bei der Herstellung von Enzymen durch Mikroorganismen angewendet werden, verlaufen im allgemeinen über die Stufen A Erhaltung der Kultur, B Entwicklung des Impfmaterials und C Fermentation. In der Stufe A wird die Kultur im allgemeinen auf Agar-Platten erhalten, wobei zur Erhaltung der Lebensfähigkeit in periodischen Zeitabständen ein Uberimpfen erfolgen muß. Bei der Entwicklung des Impfmaterials (Stufe B) wird die Kultur von der Stufe A auf ein flüssiges Kulturmedium übertragen, um eine aktive Kultur in ausreichendem Volumen zum Animpfen des Produktionsmediums zu erhalten. Die Stufe B kann aus einer einmaligen übertragung auf ein flüssiges Medium bestehen; es können aber auch mehrere Übertragungen vorteilhaft sein, wenn dies der Aktivierung der Kultur dient oder für das Produktionsmedium der Stufe C ein ausreichendes Volumen an Impfmasse zur Verfugung gestellt werden soll. Die Fermentationsstufe C wird mit der Kultur geimpft, welche von der letzten übertragung der Stufe B erhalten worden ist. Das in der Stufe C erhaltene Enzym wird entweder als flüssige Kultur oder in Form eines Filtrates oder nach weiterer Behandlung und Reinigung eingesetzt.

Das Verfahren zur Herstellung von Pullulanase unter aerobem Einsatz eines Stammes von Aerobacter aerogenes in Kohlenhydratmaterialien enthaltenen Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen ist nun erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenhydratquelle Stärke in der ersten der folgenden Stufen oder daß man als Kohlenhydratquelle Stärke in der ersten und als Kohlenhydratquelle ein Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 in der zweiten und/oder dritten der folgenden Stufen oder daß man als Kohlenhydratquelle ein Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 in wenigstens einer der folgenden Stufen verwendet: A. Bei der Erhaltung der Kultur, B. bei der Entwicklung des Impfmaterials und C. bei der Fermentation.

Für die wirtschaftliche Vervendung des danach erhaltenen Enzyms zur Stärkehydrolyse ist insbesondere die letzte Stufe von Bedeutung, um das Enzym in ausreichenden Mengen zu produzieren. Die Enzymausbeute läßt sich im Vergleich mit der Verwendung von Stärke in der ersten Stufe oder einem Stärkehydrolysat mit einen DE-Wert von weniger als etwa 40 in nur einer Stufe weiter erhöhen, wenn ein Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 iii jeweils zwei der drei Stufen zur Anwendung kommen. Schließlich wurde gefunden, daß besonders hohe Enzymausbeuten erhalten werden können, wenn man Stärke in Stufe A und Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 in der Stufe B in einer Menge von ^l/₂ bis 2 Gewichtsprozent und in der Stufe C in einer Menge von V₂ bis 4 Gewichtsprozent, jeweils bezogen auf das Gewicht der betreffenden Medien, einsetzt. Dies war im Hinblick auf die bereits erwähnten Typen von Medien, die für die Pullulanaseproduktion vorgeschlagen worden sind, völlig unerwartet.

Wie tatsächlich gefunden werden konnte, wird durch den Ersatz von Maltose in einer der drei Stufen der konventionellen Enzymherstellung durch Stärke oder ein Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 eine erhöhte Ausbeute an Pullulanaseenzym realisierbar. Dies ist der Fall, obwohl nach den Feststellungen der Literatur für die besten Ausbeuten als Kohlenhydratquelle Maltose verwendet werden muß, und zwar wenigstens in der Fermentations- oder Enzymproduktionsstufe und vorzugsweise sowohl in der Impfmaterialsstufe als auch in der Fermentationsstufe. Es wurde gefunden, daß die PuUulanaseenzym-Herstellung im Vergleich zu der Verwendung von Maltose in einer oder in beiden dieser Stufen zu viel besseren Ergebnissen führt, wenn Stärke oder Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 statt Maltose als Kohlenhydratquelle verwendet werden.

Weiterhin wurde beobachtet, daß der Ersatz von Glucose, die üblicherweise in der Stufe der Erhaltung der Kultur verwendet wird, durch Stärke oder Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 ebenfalls zu einer wesentlich erhöhten Ausbeute an dem gewünschten Pullulanaseenzym führt.

Die erste Stufe bei der Gewinnung der gewünschten Pullulanase besteht natürlich darin, die das gewünschte Enzym produzierende Kultur in einem Medium zu erhalten. In der Stufe der Erhaltung der Kultur wird das Bakterium lebensfähig gehalten. Die Erhaltung der Kultur erfolgt auf Schrägplatten und üblicherweise auf einem Agar-Nährboden. Wie bereits erwähnt wurde, erhält man höhere Ausbeuten in der Fermentationsstufe, wenn Stärke oder ein Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 in der Stufe der Erhaltung der Kultur zur Anwendung kommen, und zwar auch dann, wenn in den beiden folgenden Stufen Stärke oder ein Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 nicht eingesetzt werden. Dies gilt beispielsweise auch dann, wenn in der Impfmaterialsstufe und/oder der Fermentationsstufe Maltose oder ein anderes Kohlenhydrat verwendet werden.

M. W. Y a 1 e und Mitarbeiter haben in »Bergeys Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage, S. 341 und 342, 1957 (Williams & Wilkins Company, Baltimore), die charakteristischen Eigenschaften, durch die Glieder der Gattung Aerobacter aerogenes unterschieden werden können, beschrieben, obwohl es aus der Fachliteratur bekannt ist, daß von Zeit zu Zeit mulante Stämme isoliert werden, die mit dieser Beschreibung nicht vollständig übereinstimmen.
Kulturen von Aerobacter aerogenes, die für die

Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet :ind, können von der American Type Culture Collection 12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland, bezogen werden. Eine typische Kultur, wie sie verwendet werden kann, ist dort unter der Bezeichnung A.erobacter aerogenes ATCC 9621 zu erhalten. Wie noch gezeigt werden wird, ist das ern'ndungsgemäße Verfahren aber nicht vom Bakterienstamm abhängig, denn aucii ein anderer Aerobacter-aerogenes-Stamm als der Aerobacter aerogenes ATCC 9621 führt beim erfindungsgemäßen Verfahren zum Erfolg (vgl. Beispiel 12).

In der Stufe der Erhaltung der Kultur werden V2 bis 2% Stärke oder Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 als Kohlenhydratquelle angewendet. Die bevorzugte Kohlenhydratquelle in dieser Stufe ist Stärke.

Ein geeignetes Nährmedium auf Agar-Platten, um die Kultur zu erhalten, hat die folgende Zusammensetzung:

20

1,0% Pepton,

0,1% Hefeextrakt,

0,1 % dibasisches Kaliumphosphat,

1,0% Stärke oder Stärkehydrolysat mit einem

DE-Wert von weniger als etwa 40 als

Kohlenhydratquelle,
1,6% Agar.

Die nächste Stufe zur Herstellung des Pullulanaseenzyms ist die Entwicklung des Impfmaterials. Die Impfmasse wird durch aseptische übertragung von den beschriebenen Agar-Platten oder anderen geeigneten Kulturmedien mit Zellen einer reinen Kultur eines Aerobacter aerogenes in einen Kolben mit sterilem Nährboden der folgenden Zusammensetzung erhalten:

40

1,0% Pepton,
0,1% Hefeextrakt,
0,1 % dibasisches Kaliumphosphat,
1,0% Stärke oder Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 als Kohlenhydratquelle.

45

In einem typischen Versuch '.äßt man die Kultur sich 20 Stunden lang unter aeroben Bedingungen entwickeln. Dann wird das Impfgut in einen zweiten Impfkolben oder Fermentor, beispielsweise in einer Menge von 5% übertragen, der einen Nährboden der gleichen Zusammensetzung enthält. Man läßt 6 weitere Stunden, ebenfalls unter aeroben Bedingungen, wachsen.

Die Endstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Fermentationsstufe, welche die eigentliche Produktionsstufe der Pullulanase darstellt. Ein typisches Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

2,5% Pepton, 2,0% Hefeextrakt,

0,66% Diammoniumsulfat,

2% Stärke oder Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 als Kohlenhydratquelle.

In einem typischen Schüttelkolben versuch erhielt die abschließende Fermentationsstufe 5% Impfmaterial, bezogen auf das Volumen des Fermentationsmediums. Die Fermentationen wurden dann in 1-1-Erlenmeyerkolben, wie sie von Hin ton modifiziert wurden, durchgeführ*, die 200 ml Nährmedium enthielten. Die Belüftung und das Rühren wurden durch Verwendung eines Gump-Drehschüttlers erreicht, der bei 225 UpM arbeitete. Die Fermentationstemperatur betrug 28 bis 30⁰C. Im allgemeinen war die Fermentation nach 72 Stunden beendet.

In gleicher Weise wie bei den Stufen der Erhaltung der Kultur und der Entwicklung des Impfmaterials verursachte die Verwendung von Stärke oder von Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 auch in der Fermentationsstufe einen Anstieg der Enzymausbeute, und zwar auch dann, wenn in den ersten beiden Stufen eine andere Kohlenhydratquelle verwendet wurde. Auf diese Weise läßt sich also durch die Verwendung von Stärke oder Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 in jeder Stufe ein Anstieg der Enzymausbeute realisieren. Durch Verwendung des gleichen Kohlenhydrats in zwei der drei Stufen wird die Enzymausbeute erhöht. Die höchste Enzymausbeute wird erhalten, wenn in allen drei Stufen des Prozesses zur Enzymgewinnung als Kohlenhydratquelle eine Stärke oder ein Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 verwendet wird.

Die bevorzugte Kohlenhydratquelle sowohl bei der Entwicklung des Impfmaterials als auch bei der Fermentation ist ein Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40, obwohl eine erhöhte Enzymausbeute auch erhalten wird, wenn das Hydrolysat lediglich bei der Erhaltung der Kultur verwendet wird. Die besten Ergebnisse werden mit Erzeugnissen mit einem DE-Wert im Bereich von etwa 5 bis etwa 25 erzielt.

Wenn es gewünscht wird, kann nach der Fermentationsstufe eine konzentrierte getrocknete Pullulanaseenzym-Zubereitung erhalten werden. Dabei kann wie folgt verfahren werden: 1500ml gekühltes (4"C) Aceton werden zu 1 1 gekühlter (4°C) zellfreier Kulturflüssigkeit gefügt, die 10 g Diatomeenerde enthält. Nach vollständigem Vermischen der Suspension wird unter Vakuum filtriert, um das ausgelallte Enzym zu gewinnen. Nach Beendigung der Filtration wird der Filterkuchen in dünner Schicht ausgebreitet und über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Sobald der Filterkuchen getrocknet ist, wird er auf seine Pullulanaseenzym-Aktivhät untersucht.

Die Höhe der Pullulanaseenzym-Aktivität in den Pullulanase-Zubereitungen nach Beendigung der Fermentation kann in folgender Weise ermittelt werden: Eine Probe der Enzymlösung wird auf pH 5,5 eingestellt und in geeigneter Weise mit Wasser verdünnt. Eine i,0ml aliquote Menge wird dann einem Verdauungsgemisch zugesetzt, das sich aus 2 ml einer 5%igen Pullulanlösung und 7 ml einer M/50-Phosphatpufferlösung, pH 5,5, zusammensetzt. Die Reaktion wird in Prüfgläsern durchgeführt, die in ein Wasserbad von 40⁰C eingebracht werden, und dauert 1 Stunde. Nach Ablauf der Verdauungszeit wird die Reaktion durch Zusatz von Salzsäure bis auf den pH-Wert von 3,0 unterbrochen. In der Verdauungsmischung, in der Kulturflüssigkeil und in dem verwendeten Pullulan wird der Gehalt an reduzierenden Zuckern nach einer modifizierten alkalischen Kaliumferricyanid-Methode, die nachfolgend beschrieben wird, bestimmt und als Mikrogramm-Äquivalente

von D-Glucose (Dextrose) ausgedrückt. Die Pullu- !anase-Aktivität wird wie folgt berechnet:

A =

T -(C + P)
180-60

D,

A =

T =

C =

ρ —

D =
180 =

60 =

Pullulanaseenzym-Aktivität, Einheiten je Milliliter oder Gramm der Enzym-Zubereitung,

Gesamtmenge an reduzierenden Zuckern in der Verdauungsmischung in Mikrogramm, berechnet als D-Glucose (Dextrose),

Rest an reduzierenden Zuckern in der Kulturflüssigkeit in Mikrogramm, berechnet als D-Glucose (Dextrose),
Reduktionswert des in der Verdauungsmischung verwendeten Pullulan-Polysaccharide in Mikrogramm, berechnet als D-Glucose (Dextrose),
Verdünnungsfaktor der Enzymzubereitung, Reduktionswert von 1 Miicromol D-Glucose (Dextrose),
Reaktionszeit in Minuten.

Eine Pullulanase-Einheit wird definiert als die Menge Enzym, die erforderlich ist, um 180 Mikrogramm reduzierende Zucker, berechnet als D-Glucose (Dextrose), je Minute unter den beschriebenen Bedingungen aus Pullulan zu bilden.

Das Polysaccharid Pullulan, das ein Polymeres aus Maltotriose-Einheiten darstellt, die durch alpha-1,6-Bindungen miteinander verbunden sind, kann aus Pullularia pullulans ATCC 9348 nach dem Verfahren von S. Ueda, F. Fujita, K. Komatsu und Z. Nakashima, veröffentlicht in »Applied Microbiology«, 11, S. 211 bis 215 (1963), erhalten werden.

Die modifizierte Kaliumferricyanid-Methode, die für die Bestimmung der reduzierenden Substanzen in den Versuchs-Enzym-Zubereitungen herangezogen wurde, wird wie folgt durchgeführt:

Reagenzien

Alkalisches Ferricyanid: Es werden 1,170 g Kaiiumferricyanid und 19,5 g wasserfreies Natriumcarbonat in Wasser gelöst und auf 11 verdünnt. Die Lösung wird in einer braunen Flasche aufbewahrt.

Standard-Dextrose-Lösung: Es werden 1,000 g reine wasserfreie Dextrose abgewogen und auf 100 ml verdünnt. Mit einer Pipette werden 10,0 ml der Lösung in einen 1-1-Meßkolben übergeführt und bis zur Marke verdünnt. Die Lösung enthält 0,1 mg D-Glucose (Dextrose) im ml.

Durchführung der Bestimmung

Standardisierung: 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 und 2,5 ml der Standard-Dextrose-Lösung (0,1 mg/ml) werden in je 18-ml-Prüfgläser pipettiert- Dann wird Wasser hinzugefügt, um den Inhalt der Gläser jeweils auf 2,5 ml zu bringen. Der Blindversuch enthält 2,5 ml Wasser. Zu jedem Glas werden dann 5 ml der alkalischen Ferricyanidlösung gefügt- Die Mischung wird für genau 5 Minuten in einem siedenden Wasserbad erwärmt, sofort in einem Wasserbad gekühlt, mit Wasser auf ein Volumen von 12,5 ml verdünnt und gemischt. Unter Verwendung von Wasser als Vergleichslösung mit der Absorption 0 wird mit einem Beckmann-Spektophotometer DU unter Verwendung von 1-ml-Küvetten die Absorption des Blindversuchs und von allen übrigen Standardgläsern bei 373 πΐμ ermittelt.

Analyse

Es wird ein aliquoter Teil der Enzymzubereitung verwendet, der 1 bis 10 mg reduzierende Zucker je 10 ml Verdauungsgemisch bildet. Die Probe des Verdauungsgemisches, die durch diese Methode geprüft wird, enthält 50 bis 250 Mikrogramm reduzierende Zucker.

Berechnung

Die abgelesene Absorption der Standardgläser wird hinsichtlich des Blindversuchs korrigiert und gegen die Mikrogramm-Dextrose je 12,5 ml in ein Koordinatensystem eingetragen, um eine Standardisierungskurve zu erhalten.

Die Stärke, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet ist, kann aus einer Vielzahl von Rohstoffquellen stammen. Geeignete Stärken sind Getreidestärken, wie Mais-, körnige Sorghum- und Weizenstärke, weiterhin wachsige Stärken, wie wachsige Milostärke und Wachsmaisstärke. Auch Wurzelstärken, wie Kartoffel- und Tapiokastärke, und hochamylosehaltige Stärken können verwendet werden. Weiterhin können stärkehaltige Rohstoffe, wie gemahlenes Getreide, zerkleinerte Wurzeln oder die daraus gewonnenen teilweise gereinigten Stärken eingesetzt werden.

Die zweite Klasse von Kohlenhydratmaterialien, die im Rahmen der Erfindung Verwendung finden kann, bilden Stärkehydrolysate mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40. Diese Produkte werden dadurch erhalten, daß man eine Stärkequelle der Enzym- oder Säurebehandlung oder einer Kombination dieser beiden Behandlungen unterwirft. Wie bereits ausgeführt worden ist, weisen bevorzugte Stärkehydrolysate einen DE-Wert, der in dem Bereich von etwa 5 bis etwa 25 liegt, auf. Für die Herstellung von Hydrolysaten mit einem DE-Wert der gewünschten Zusammensetzung auf enzymatischem Wege ist insbesondere Bakterien-aipha-Amyiase geeignet.

Der Begriff »DE« (Dextrose-Äquivalent) bezeichne! den Gehalt an reduzierenden Zuckern in einem Stärkehydrolysat, berechnet als D-Glucose (Dextrose und bezogen auf Trockenmasse, wie er durch die Methode L u f f—S choorl (NBS-Rundschreiber C-440, S. 195, 1942, veröffentlicht in »Polarimetry Saccharimetry and the Sugars«, Autoren F. J. B a t e < und Mitarbeiter) ermittelt werden kann.

Die folgenden Beispiele illustrieren den technischer Fortschritt der Erfindung. Die drei Stufen der Erhal tung der Kultur, der Entwicklung des Impfmaterial! und der Fermentation werden in der bereits beschrie benen Weise unter Verwendung konventioneller Ver fahren durchgeführt. Die Pullulanase-Ausbeute win ausgedrückt in Einheiten/ml (Einheiten aktives Enzyn je ml Gärungsfiüssigkeit). Prozentangaben werden ii Gewichtsprozent gemacht.

Beispiel 1

Bei diesem Versuch wurde die üblicherweise zu Erhaltung der Aerobacter-aerogenes-Kultur verwen dete Glucose durch Maisstärke ersetzt

309624/96

A. aerogenes wurde auf Schrägplatten in folgendem Nährmedium gezüchtet:

1,0% Pepton,

0,1% Hefeextrakt,

0,1% dibasisches Kaliumphosphat,

1,0% Stärke oder 0,5 bis 1,0% Glucose.

Nach einem Wachstum von 72 Stunden bei 28⁰C auf den Platten wurde eine Platinöse voll mit Zellen unter aseptischen Bedingungen in einen 1-1-Erlenmeyer-Kolben mit 200 ml eines sterilen Nährmediums für das Impfmaterial übertragen, das folgende Zusammensetzung hatte:

1,0% Pepton,

0,1% Hefeextrakt,

0,1 % dibasisches Kaliumphosphat,

1,0% Maltose.

Nach einer Inkubation von 20 Stunden bei 28° C auf einer Schütteleinrichtung wurden 10 ml der Impf-

20 flüssigkeit auf einen zweiten Kolben mit dem gleichen Nährmedium übertragen. Dieser Kolben wurde dann 6 Stunden lang unter den gleichen Bedingungen behandelt. Danach wurden 10 ml der Kultur auf einen 1000-ml-Erlenmeyerkolben vom Hinton-Typ mit 200 ml sterilem Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung übertragen:

2,5% Pepton,
2,0% Hefeextrakt,
0,66% Diammoniumsulfat,
2% Maltose.

Die Fermentationsstufe wurde 72 Stunden bei 28° C in einer Schütteleinrichtung durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt worden. Wie daraus leicht abgelesen werden kann, wurde die gebildete Menge an Pullulanaseenzym hinsichtlich der Ausbeute durch Verwendung von Maisstärke als Kohlenhydratquelle im Vergleich zu Glucose in der Stufe der Erhaltung der Kultur erheblich gesteigert.

	Tabelle 1	Impfmaterialstufe	Fermentationsstufe	Pullulanase-Ausbeute (Einheiten/ml)
Kulturstufe	Γ/ο Maltose 1% Maltose 1% Maltose	2% Maltose 2% Maltose 2% Maltose	4,0 0,75 10,3
0,5% Glucose 1 % Glucose 1% Maisstärke

Beispiel 2

In dieser Versuchsreihe wurde eine Anzahl von Stärkehydrolysaten mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 in der Fermentationsstufe angewendet, um Maltose zu ersetzen, die hier üblicherweise eingesetzt wird. Es wurde entsprechend Beispiel 1 ver· fahren. Wie aus der Tabelle 2 zu ersehen ist, war auch durch die Verwendung von einem Stärkehydrolysa als Kohlenhydratquelle im Vergleich zu der Ver wendung von Maltose die Ausbeute an Pullulanase enzym stark erhöht.

Tabelle Kulturstufe

lmpfmatcrialstufe

Fermentationsstufe* I

0,5% Glucose 1% Maltose 2%

0,5% Glucose 1% Maltose 2% *) Sl H. = Maisstärkehydrolysat.

Bei s pi e 1 3

Hierbei wurde ein Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 in der Impfmaterial-Tabelle Maltose
15DE St. H.
16,5DE St. H.
20 DE St. H.

Pullulanase-Ausbeute (Einheiten ml I

4,2

7,6

10.4

8,6

stufe angewendet. Wiederum wurde die Pullulanasc Ausbeute im Vergleich zu der üblichen Verfahren: weise erhöht (Tabelle 3).

Kulturstufe	*Impfmaterialstufe)**	Fermentationsstufe	Pullulanase-Ausbeute (Einheiten/ml)
0,5% Glucose	1,0% Maltose	0,5% Maltose	0,69
0,5% Glucose	1,0% Maltose	1,0% Maltose	0,65
0,5% Glucose	1,0% Maltose	2,0% Maltose	0,68
0,5% Glucose	1,0% 15DE StH.	0,5% Maltose	5,0
0,5% Glucose	1,0% 15DE StH.	1,0% Maltose	3,5
0,5% Glucose	1,0% 15DE StH.	2,0% Maltose	4,6

StH. = Maisstärkehydrolysat.

Beispiel 4

Bei diesen Versuchen wurde eine Stärkequelle sowohl in der Kulturstufe als auch in der Impfmaterialstufe eingesetzt und mit der üblichen Methode verglichen. Wie bereits erwähnt wurde, lassen sich hierdurch erheblich höhere Pullulanasemengen erhalten. In gleicher Weise wird eine Erhöhung der Enzymausbeuten festgestellt, wenn Stärke bzw. Stärkehydrolysat sowohl in der Kultur- als auch in der Fermentationsstufe eingesetzt werden. Schließlich wird auch eine erhöhte Pullulanaseenzym-Ausbeute er-5 halten, wenn Stärke oder Stärkehydrolysat in der Impfmaterial- und der Fermentationsstufe als Kohlenhydratquelle eingesetzt werden.

Tabelle 4

Kultursture	Impfmaterialstufe*)	Fermen tationsstufe*)	Pullulanase-Ausbeute (Einheiten/ml)
0,5% Glucose 0,5% Glucose 1,0% Maisstärke 1,0% Maisstärke	1% Maltose 1% 15DE StH. 1% 15 DE St. H. 1% Maltose	2% Maltose 2% 15DE St. H. 2% Maltose 2% 15DE St. H.	4,0 12,9 8,0 24,3

*) Sl. H. = Maisstärkehydrolysat.

Beispiel 5 _etwa 4Q verwendet. Durch diese Technik wurde im

In allen drei Stufen wurde eine Stärke oder ein Rahmen der vorliegenden Erfindung die höchst-Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als 25 mögliche Ausbeute an Pullulanaseenzym erreicht.

Tabelle 5

Kulturstufe	I mpfmaterialstufe*)	Fermentationsstufe*)	Pullulanase-Ausbeute (Einheiten'ml)
1 % Maisstärke 1% 15DE St. H.	1% 15DE St. H. 1 % 15 DE St. H.	2% 15DE St. H. 2% 15DE St. H.	34,1 25,2

*) St. H. = Maisstärkehydrolysat.

Beispiele _{zu erse}h_en \_st können Stärkehydrolysate mit DE

In dieser Versuchsreihe wurden in der Fermen- 4° Werten in dem Bereich von 5 bis 42 DE verwende

tationsstufe Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von werden, wobei in allen Fällen verbesserte Ausbeuter

weniger als etwa 40 verwendet. Wie aus der Tabelle 6 an Pullulanaseenzym erhalten werden

Tabelle 6

Kulturstufe	Impfmaterialstufe*)	Fermentationsstufe*)	Pullulanase-Ausbeute (Einheiten/ml)
1% Maisstärke	1% 10 DE SLH.	2% 5 DE Sl. H.	12,6
1% Maisstärke	1% 10 DE SLH.	2% 11,8DE SLH.	22,2
1% Maisstärke	1% 10 DE SLH.	2% 15DE St.H.	2Z0
1% Maisstärke	1% 10 DE SLH.	2% 20 DE St. H.	14.8
1% Maisstärke	1% 10 DE SLH.	2% 24 DE St. H.	183
1% Maisstärke	1% 10 DE SLH.	2% 29,5 DE St. H.	153
1% Maisstärke	1% 10 DE SLH.	2% 36 DE SL H.	13,0
1% Maisstärke	1% 10 DE SLH.	2% 42 DE SL H.	7,4

·) St H. = Maisstärkehydrolysat.

„ - 17 hydrolysate für die Entwicklung des Impfmaterial

^e ¹ ^s P* 65 eingesetzt und nicht wie im Beispiel 6 in der Fermeii

Es wurde wiederum eine Anzahl von Stärkehydroly- tationsstufe. Wie aus der Tabelle 7 zu ersehen is

säten mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 ver- wurden, unabhängig von dem DE-Wert der Stärke

wendet. Jedoch wurden die verschiedenen Stärke- hydrolysate gute Pullulanase-Ausbeuten erzielt.

13

Tabelle 7

14

Kulturstufe	Impfmaterialstufe*)
1% Stärke	1 % 5 DE St. H.
1% Stärke
1% Stärke
1% Stärke
1% Stärke
1% Stärke
1% Stärke
1% Stärke
% 11,8 DE St. H
% 15DE St. H.
% 20 DE St. H.
% 24 DE St. H.
% 29,5 DE St. H
% 36 DE St. H.
% 42 DE St. H.

Fermentations?! ufe*)

1%	15	DE
1%	15	DE
I /o	15	DE
1%	15	DE
1%	15	DE
1%	15	DE
1%	15	DE
1%	15	DE

St. H. St. H. St. H. St. H. St. H. St. H. St. H. St. H.

Pullulanase-Ausbeute (Einheilen/ml)

29.5 32.6 34,1 34,1 27,1 31,6 37,8 32,5

*) St. H. = Maisstärkehydrolysat.

Beispiel 8

Dieser Versuch zeigt, daß entweder Stärke oder ein Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als

etwa 40 in der Stufe der Erhaltung der Kultur ais Kohlenhydratquelle verwendet werden können. Ir beiden Fällen wurden ausgezeichnete Ausbeuten an PuUulanaseenzym erhalten.

Tabelle 8

Kulturstufe*)	Impfmaterialstufe*)	Fermentationsstufe*)	Pullulanase-Ausbeute (Einhe>!en/ml)
1% Maisstärke 1 % 25 DE St. H.	1% 15DE St. H. 1% 15DE St. H.	2% 15DE St. H. 2% 15DE St. H.	34,1 25,2

*) St. H. = Maisstärkehydrolysat.

B e i s ρ ι e 1 9 ₃₅ verschiedener Herkunft und verschiedenen Typs für

Diese Versuche zeigten, daß Stärkehydrolysate mit die Erzeugung von PuUulanaseenzym als Kohleneinem DE-Wert von weniger als etwa 40 aus Stärken hydratquelle gleich gut geeignet sind.

Tabelle 9

Kulturstufe*)	Impfmaterialstufe*)	Fermentationsstufe) *)	Pullulanase-Ausbeute (Einheiten/ml)
1% 15DE St. H. 1% 15DE St. H. 1% 15DE St. H.	1% 15DE St.H. 1% 15DE St. H. 1% 15DE St.H.	1% 15DE St.H. 1% 12DE W. H. 1% 13DE K.H.	16.7 22.3 20,6

*) SL H. = Maisstärkehydrolysat. ·*) W. H. = Hydrolysat aus wachsiger Miloslärke. ***) K- H. = Kartoflelstärlcehydrolysat.

B e i s ρ i e 1 10 ^{als etwa 4}^ ^{in emer}' ^{in zwei} °^^CT in drei Stufen dei

Erhaltung der Kultur, der Entwicklung des Impf

In dieser Versuchsreihe wurden eine Stärke oder materials und der Fermentation eingesetzt. Die Er ein Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger 55 gebnisse waren wie folgt:

Tabelle 10

Kulturstufe	Impfmaterialstufe	Fermentationsstufe	Pullulanase-Ausbeute (Einheiten/ml!
0,5% Glucose 0,5% Glucose 0,5% Glucose 0,5% Glucose	1% Maltose 1% Maltose 1% Maltose 1% Maltose	2% Maltose 2% 15DE SLH. 2% 16,5 DE W. H. 2%'20 DE WH.	4,2 7,6 10,4 8,6

3222

Fortsetzung

Kulturstufe	Irapimaterialslufe	Fermentationsstufe	PuUulanase-Ausbeule (Einheiten/ml)
0,5% Glucose		2% 15DE StH.	15,2
0,5% Glucose		2% 15 DE St. H.	14,1
0,5% Glucose		2% 15DE StH.	\2$
0,5% Glucose		2% 15DE StH.	14,3
1% 11,8DE W. H.		2% 15DE StH.	20,0
1% 25DE St. H.		2% 15DE StH.	25,2
1% Maisstärke		2% 15DE StH.	27,1
% 5 DE St. H.
1% 11,8DE W. H.
1% 15DE StH.
1% 20DE SLH.
1% 5DESt-H.
1% 15DE St. H.
I % 24 DE St. H.

St. H. = MaisstärkehydrolysaL W. H. = Hydrolysat aus wachsiger Milostärke. Beispiel

Die folgenden Versuche illustrieren, daß eine Vielzahl von Stärkehydrolysaten mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 dazu dienen können, um hohe Ausbeuten an Pullulanase zu erhalten, und zar unabhängig davon, ob sie durch Säure- oder Enzymhydrolyse hergestellt werden. Diese verschiedenen Stärkehydrolvsate wurden in der Fermentationsstufe eingesetzt. Die Erhaltung der Kultur erfolgte auf Glucose und die Entwicklung des Impfmaterials unter Verwendung eines Maisstärkehydrolysais mit 15 DE als Kohlenhydratquelle. Die Ferrnentationszeit betrug 48 Stunden.

Tabelle

	Hergestellt durch	Konzentration	PuHulanase-Ausbeute
Stärkehydrolysat	Enzymhydrolyse	0,5	(Einheilen/ml)
10,8 DE,			10,3
Maisstärke	Enzymhydrolyse	1,0
10,8 DE,			21,0
Maisstärke	Säurehydrolyse	0,5
15DE,			12,7
Maisstärke	Säurehydrolyse	1,0
15DE,			10,8
Maisstärke	Enzymhydrolyse	0,5
12 DE, wachsige			11,7
Sorghumstärke	Enzymhydrolyse	1,0
12 DE, wachsige			14,8
Sorghumstärke	Enzymhydrolyse	0,5
13,8DE,			11,6
Kartoffelstärke	Enzymhydrolyse	1,0
13,8DE,			17,2
Kartoffelstärke		0,5
Maltose		1,0	3,8
Maltose		5,8

Beispiel

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht spezifisch für den verwendeten Bakterienstamm. Das gleiche in den vorstehenden Beispielen gezeigte Phänomen tritt auch dann ein, wenn andere Stämme der Art Aerobacter aerogenes als der Aerobacter aerogenes ATCC 9621 verwendet werden.

In diesem Beispiel ist der verwendete Stamm Aerobacter aerogenes ATCC 8724. Die Ergebnisse hinsichtlich der Herstellung von Pullulanaseenzym-Zubereitungen unter Verwendung von Stärke und Stärkehydrolysaten mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 als Kohlenhydratquelle für diesen Stamm sind in Tabelle 12 zusammengestellt worden. Wie klar ersichtlich ist, wird die Pullulanase-Ausbeute bei der Verwendung einer Stärke oder eines Stärkehydrolysats mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 als Kohlenhydratquelle erhöht, und diese Ausbeutesteigerung ist nicht von der Herkunft des Bakteriums Aerobacter aerogenes abhängig, das für die Produktion des gewünschten Enzyms verwendet wird.

Kulturstufe

0,5% Glucose
1% Stärke
1% Stärke

·) St- H. = Stärkehydrolysat.

Tabelle 12

IO

18

lmpfmaterialsiufe")

1% Maltose
1% Maltose
1 % 15 DE St. H. Fermenlationsstufe·)

2% Maltose 2% 15DE St-H. 2% 15DE StH.

Pullulanase-Ausbeute (Einheiten/ml)

0,65 12,6 12,3

Beispiel 13

In diesem Beispiel wurde eine Anzahl von Stärkehydrolysaten mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 hinsichtlich ihrer verschiedenen Bestandteile untersucht. Diese Stärkehydrolysate waren sowohl durch die Technik der Enzym- als auch der Säurehydrolyse hergestellt worden.

Wie aus den Werten der Tabelle 13 hervorgeht, is

Stärkehydrolysate mit einem DE-

20 Literatur lehrt.

Tabellen

Zusammensetzung von Stärkehydrolysaten (%, bezogen auf Trockensubstanz)

Art der Hydrolyse	DE	DP, (Glucose)	DP₂ (Maltose)	DP₃ (Malto- triose)	DP₄	DP₅	DP₆	DP₇	Vergärbares %·)
Enzym	10	1	2	5	4	4	9	75	8
	15	1	4	8	5	6	18	58	13
	20	2	7	10	6	8	19	48	19
	25	3	10	12	7	11	16	41	25
	30	7	13	14	7	13	10	36	34
Säure	10	2	2	3	3	2	3	85	7
	15	3	4	4	5	4	4	76	11
	20	4	5	6	6	5	5	69	15
	30	10	9	9	8	8	7	49	28

DP = Polymerisationsgrad.
") = Summe von DP₁, DP₂ und DP,.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Pullulanase unter aerobem Einsatz eines Stammes von Aerobacter aerogenes in Kohlenhydratmaterialien enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenhydratquelle Stärke in der ersten der folgenden Stufen oder daß man als Kohlenhydratquelle Stärke in der ersten und als Kohlenhydratquelle ein Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 in der zweiten und/oder dritten der folgenden Stufen oder daß man als Kohlenhydratquelle ein Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 in wenigstens einer der folgenden Stufen verwendet:

A. Bei der Erhaltung der Kultur, B. bei der Entwicklung des Impfmaterials und C. bei der Fermentation.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke in einer Menge von V₂ bis 2 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht des Kulturmediums, vorhanden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 in der Stufe B in einer Menge von V₂ bis 2 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht des Impfmaterial-Mediums, vorhanden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 in der Stufe C in einer Menge von V₂ bis 4 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht des Fermentations-Mediums, vorhanden ist.

5 Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke in der Stufe A und das Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 in der Stufe B jeweils in einer Menge von V₂ bis 2 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht der betreffenden Medien, vorhanden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke in der Stufe A in einer Menge von V₂ bis 2 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht des Kulturmediums, und das Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 in der Stufe C in einer Menge von V₂ bis 4 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht des Fermentationsmediums, vorhanden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von weniger als etwa 40 in der Stufe B in einer Menge von ¹Z₂ bis 2 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht des Impfmaterial Mediums, und in der Stufe C in einer Menge von V₂ bis 4 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewich ·, des Fermentationsmediums, vorhanden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke in der Stufe A in einer Menge von V₂ bis 2 Gewichtsprozent, das Stärkehydrolysat mit einem DE-Werl von weniger als etwa 40 in der Stufe B in einer Menge von V₂ bis 2 Gewichtsprozent und in der Stufe C in einer Menge von V₂ bis 4 Gewichtsprozent, jeweils bezogen auf das Gewicht des betreffenden Mediums, vorhanden ist.