DE2507787C2

DE2507787C2 - Verfahren zur Herstellung von Pullulanase und deren Verwendung zur Stärkehydrolyse

Info

Publication number: DE2507787C2
Application number: DE2507787A
Authority: DE
Inventors: Anthony Andrew Decatur Ill. Bulich
Original assignee: AE Staley Manufacturing Co Decatur Ill; Tate and Lyle Ingredients Americas LLC
Current assignee: AE Staley Manufacturing Co Decatur Ill; Primary Products Ingredients Americas LLC
Priority date: 1974-02-25
Filing date: 1975-02-22
Publication date: 1985-11-28
Also published as: GB1499340A; IT1029805B; DK61375A; NL180333C; JPS50117987A; DK141253C; BE825317A; US3963575A; CA1047424A; JPS5822197B2; BR7501110A; FR2273065A1; SE7501458L; NL7502253A; SE424337B; DE2507787A1; DK141253B; SE7900557L; FR2273065B1; NL180333B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des a-l,6-glucosldische Bindungen hydrolyslerenden Enzyms Pullulanase.

In den letzten Jahren hat man die potentielle kommerzielle Bedeutung von Enzymen erkannt, die In der Lage sind, a-l,6-glucosidische Stärkebindungen spezifisch zu hydrolysieren. Die konventionellen Amylasen sind nicht befriedigend wirksam beim Hydrolysleren von 1,6-Stärkeblndungen und bilden häufig unerwünschte Stärkehydrolysatnebenprodukte. Bei Verwendung von <z-l,6-glucosldlsche Bindungen hydrolyslerenden Enzymen (wie

z. B. Pullulanase) in Verbindung mit anderen Amylasen wäre die Umwandlungssirupindustrie in der Lage, ein breiteres Spektrum von Stärkehydrolysaten und Umwandlungssirupprodukten herzustellen und außerdem könnten, wenn Pullulanase bei wirtschaftlich tragbaren Kosten zur Verfügung stünde, Stärkeumwandlungssirupe mit einer besseren Qualität und einem wesentlich niedrigeren Preis hergestellt werden.
Im allgemeinen wird Pullulanase hergestellt durch Inokulieren und Fermentieren eines assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und mineralische Nährstoffe enthallenden Kulturmediums mit Aerobacter aerogenes unter solchen Bedingungen, die für sein Wachstum förderlich sind. In einigen Verfahren kann die Pullulanaseblldung gleichzeitig mit der Zellenvermehrung auftreten. Bei anderen Verfahren tritt die Pullulanaseblldung erst spät In der Wachstumsphase auf. Bei einigen Verfahren wird die Pullulanaseblldung durch Verwendung eines Kulturmediums, das einen Mangel an Saccharldmateriallen aufweist, die für die Pullulanasesynthese als wesent-Hch angesehen werden, absichtlich unterdrückt. Nach einem ausreichenden Wachstum werden die Zellen dann mit einem Kohlehydrat, wie Maltose, Maltotrlose oder Pullulan, zur Pullulanasebildung angeregt.

Als Klasse haben die bisher in der Pullulanaseblldungsstufe verwendeten Aerobscter aerogenes-Stämme Im allgemeinen die Eigenschaft, verschiedene Mengen an extrazellulärem Enzym, fest gebundenem Enzym und oberflächlich gebundenen Enzym zu bilden, wenn verschiedene Kohlehydratquellenmaterialien verwendet werden. Das Verhältnis von durch einen Aerobacter aerogenes-Organlsmus gebildetem extrazellulärem Enzym zu zellgebundenem Enzym wird häufig einfach umgekehrt durch Ändern oder Substituieren eines Kohlehydrats durch ein anderes In dem Fermentationsverfahren. Je nach der jeweils verwendeten Kohlehydratquelle begünstigt das Fermentatlonsveffahren normalerweise entweder die extrazelluläre Pullulanaseblldung (z. B. mehr als 75%) oder die zellgebundene Pullulanasebllrtung (z. B. etwa 75% oder mehr). Als Klasse sind diese Aerobacter aerogenes-Organlsmen nicht In der Lage, Pullulanase zu bilden, wenn Dextrose die einzige Kohlehydralquelle 1st.

In »Biochemische Zeitschrift«, 334, 79-95 (1961), weisen H. Bender und K. Wallenfels darauf hin, daß ^

Kohlehydrat-Induzlerstoffe wesentlich für die Pullulanaseblldung sind. Bei dem darin beschriebenen Verfahren |

werden etwa 75 bis etwa 80% der gesamten Pullulanase in fest gebundener, extrazellulärer Form gebildet. In »Biochemical & Biophysical Research Communications«. Band 22, Nr. 3, Selten 254-261 (1966), haben Wallenfels et al dann vorgeschlagen, den Organismus In Gegenwart von gleichen Mengen Glucose und Maltose zu züchten. Dabei haben sie gefunden, daß bei diesem Verfahren die Bildung von extrazellulärer Pullulanase bis auf einen Wert von etwa 20% oder weniger abnimmt. Die restliche Pullulanase 1st dabei In der Nähe der Oberflüche des Organismus lokalisiert und kann durch oberflächenaktive Mittel leicht freigesetzt werden.

so Nach den Angaben In den US-Patentschriften 36 54 087, 36 54 088 und 36 54 089 können nach einem 2-Stufen-Verfahren bessere Pullulanaseausbeuten erzielt werden. In der ersten Stufe wird das Wachstum von Aerobacter aerogenes durch Kultivieren mit einem nicht-Induzierenden Kohlehydrat, wie Dextrose, begünstigt ohne merkliche Pullulanasebildung. Nach einer ausreichenden Zellenvermehrung werden die Zellen dann zur Pullulanaseblldung angeregt. In der US-Patentschrift 36 54 088 1st angegeben, daß bessere Produktionsstufenausbeuten erhalten werden können, wenn man die Induzierten Zellen mit Amylopectin lnkublert. Im allgemeinen handelt es sich bei der durch Aerobacter aerogenes in den In den oben genannten US-Patentschriften beschriebenen Verfahren gebildeten Pullulanase In erster Linie um ein zellgebundenes Enzym (z. B. zu 65 bis 75% oder mehr).
In anderen Patentschriften sind andere Mikrobenstämme beschrieben, die In der Lage sind, a-D-l.o-glycosidlsche Bindungen hydrolyslerende Enzyme zu bilden. In der US-Patentschrift 35 60 345 1st angegeben, daß jedes beliebige Kohlehydratmaterial mit ar-1,4- oder -1,6-glucosidlschen Bindungen eine geeignete Kohlenstoffquclle für die Synthese von extrazellulären Isoamylasen mittels Pseudomonas amyloderamosa Ist. In dieser Patentschrift ist die Erzielung von extrazellulären Enzymausbeuten von etwa 180 bis etwa 220 Einheiten pro ml durch Inkubieren in Maltose oder lösliche Stärke als einzige Kohlehydratquelle enthaltenden Kulturmedien beschrieben, wobei die Pullulanaseausbeuten bei einem aus Maltose, Ammoniumsalzen und Sojabohnenhydrolysaien bestehenden Medium (mit bis zu 130 Elnheiten/ml) größer sind als In solchen, In denen ein Stärkehydrolysal verwendet wird. In der US-Patentschrift 36 22 460 sind maximale Ausbeuten von etwa 125 «-1,6-Gluco.sldase- j

Einheiten pro ml bei Verwendung von Stärkehydrolysate (mit einem Dextroseäquivalent (D. E.) von 2 bis 15'*) i

und Sojabohnenhydrolysate enthaltenden Kulturmedien und bei Verwendung von Escherichia Litermedia beschrieben (die darin beschriebenen »Einheiten« wurden mittels eines Jodtests bestimmt, der höhere Einheiten-Werte liefert als das zur Bestimmung der »Einheiten« hier angewendete Testverfahren). In der kanadischen Palentschrift 9 01 503 werden Stärkehydrolysate mit einem Dextroseäquivalent (D. E.) von S b:s 40 verwendet, um die Pullulanasebildung zu erleichtern.

Man Ist daher seit langem auf der Suche nach einem Verfahren, mit dessen Hilfe es möglich ist, hohe Ausbeulen an Pullulanase in einer leicht abtrennbaren unci verwendbaren Form zu erzielen. Einige Verfahren liefern nämlich verhältnismäßig hohe Ausbeuten an Pullulanase in einer für die Gewinnung ungeeigneten Form während andere Verfahren eine leicht gewinnbare Pullulanase In niedrigen Ausbeuten liefern. Obgleich ein kommerzieller Bedarf für Pullulanase mit einem Preis, der seine Verwendung in Stärkeumwandiungsprozessen wirtschaftlich rechtfertigen würde, besteht, kann Pullulanase bisher weder zu einem Preis noch in einer Menge hergestellt werden, wie sie für die Stärkesirup.'ndustrie erforderlich wären. Trotz dieses bestehenden Bedürfnisses war es bisher nicht möglich, einen Organismus zu finden und zu züchten, der in der Lage ist, hohe Ausbeuten an Pullulanase unter solchen Verfahrensbedingungen zu liefern, bei denen die Pullulanase leicht und wirtschaftlich In einer für die kommerzielle Verwendung geeigneten Form abgetrennt werden kann.

Aufgabe der Erfindung 1st es daher ein Verfahren zur Herstellung von Pullulanase bereitzustellen, das innerhalb eines verhältnismäßig kurzen Zeitraums zu hohen Pullulanaseausbeuten führt, dia leicht und wirtschaftlich von eirer Kulturbrühe abgetrennt werden können.

Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Pullulanase durch Inkubieren eines assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbare Stickstoffquellen enthaltenden wäßrigen Nährmediums mit einem Pullulanase bildenden Mikroorganismus, Inkubieren der Kultur unter aeroben Bedingungen und Gewinnen eines Pullulanasepräparats aus der Kultur gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Klebslella pneumonlae NRRL-B-5780, Klebsiella pneumoniae NRRL-B-5783 und/oder Klebsiella pneumonlae NRRL-B-5784 lnkublert.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen bilden

a) mindestens dreimal mehr Pullulanase, wenn als einzige Kohlenhydratquelle Amylopectin mit einem D. E. von weniger als 2,0 verwendet wird, als in einem Nährmedium, In oem das Hauptkohlehydrat (bezogen auf eine äquivalente Kohlehydratgewichtsbasis) eine Kohlehydratquelle aus der Gruppe Maltose, Dextrose, Lactose und Pullulan 1st;

b) Pullulanase In einem Verhältnis von extrazellulärer Pullulanase zu oberflächlich gebundener Zellenpullulanase zwischen 2 :3 und weniger als 7:3, wenn der Mikroorganismus in einem Nährmedium gezüchtet wird, das Amylopectin als einzige Kohlehydratquelle enthält; und

c) Pullulanase In einem Nährmedium, das als einzige Kohlehydratquelle Dextrose enthält, und worin der Mikroorganismus für einen solchen Zeitraum in einem Nährmedium Inkubiert wird, der ausreicht, um ein Produktionskulturmedium zu erzeugen, das pro ml Produktionskulturmedium mindestens 350 Einheiten Pullulanase enthält, wobei das Produktionskulturmedium ein Verhältnis von extrazellulärer Pullulanase zu oberflächlich gebundener Pullulanase aufweist, das zwischen 2 : 3 und weniger als 7 : 3 liegt.

Im Vergleich zu den Pullulanase bildenden Organismen des Typs, wie er ursprünglich von Wallenfels et a! beschrieben worden Ist (der hler verwendete Ausdruck »Aerobacter aerogenes« wurde bisher stets zum Identifizieren des Pullulanase bildenden Organismus des von Wallenfels et al beschriebenen Typs verwendet (möglicherweise wegen seiner ursprünglichen Charakterisierung, daß er sich »wie Aerobacter verhält«), obgleich ihn neuere Klassifikationen als Organismus des Genus Klebsiella (Klebsiella pneumonia) bezeichnen, weisen die erfindungsgemäß Inkubierten Mikroorganismen atypische Stoffwechseleigenschaften auf. Diese Stoffwechselunterschiede (metabollschen Unterschiede) können dadurch gezeigt werden, daß man in einem wäßrigen Nährmedium, das (bezogen auf Trockenfeststoffe) aus 2% Bactopepton, 0,5% Ammoniumacetat, 0,05% Natriumeitrat, 0,10% Kallummonohydrogenorthophosphat (K₂HPO₄), 0,1% Kallumdihydrogenorthophosphat (KH₂PO₄), 0,05% Magnesiumsulfat (Epsomsalz), 0,05% Kaliumchlorid, 0,001% EisendUsulfat (Melanterit) und Wasser besteht, verschiedene Kohlehydratquellenmateriallen verwendet.

Im allgemeinen 1st die Zellenvermehrung (Zellenfortpflanzung) durch die erfindungsgemäß inkubierten Mikroorganismen für Kohlehydratquellenmaterialien, wie Pullulan, Lactose, Dextrose, Maltose, Malsstärkehydrolysate mit einem D. E.-Wert von 5 bis 25, gelatinierte Stärke und gelatiniertes Amylopectin, etwa äquivalent. Der gebildete Pullulanase-Typ wird jedoch definitiv durch das jeweilige Kohlehydratquellenmaterial in dem Kulturmedium beeinflußt. Dextrose als einziger Kohlehydratnährstoff unterdrückt die Bildung von extrazellulärem Enzym (beispielsweise um etwa 30%). Andere Kohlehydrate, wie Lactose, Maltose, Maltotriose, Pullulan, Gelbzahn-Maisstärkehydrolysate, assimilierbare hohe Amylosestärken, als einzige Kohlehydratnährstoffquelle führen zur Bildung von etwa äquivalenten Mengen an extrazellulärer Pullulanase und oberflächlich gebundener Pullulanase (bezogen auf eine Einheit).

Wenn Dextrose als einzige Saccharldquelle verwendet wird, bildet Aerobacter aerogenes ATCC 15 050 keine Pullulanase. Im Gegensatz dazu bilden die erfindungsgemäß Inkubierten Mikroorganismen In einem Kulturmedium, das Dextrose als einzige Kohlehydratquelle enthält, extrazelluläres Enzym (etwa 10 Pullulanase-Elnhelten pro ml oder mehr, von denen etwa 30% extrazelluläre Pullulanase sind). In dem oben erwähnten wäßrigen Nährmedium mit Lactose als ausschließlicher Kohlehydratquelle bilden die erfindungsgemäß Inkubierten Mikroorganismen mehr als achtmal mehr Pullulanase als Aerobacter aerogenes ATCC 15 050. Kohlehydrat-Induktlonsmittel. wie Maltose, Maltotriose und Pullulan (die von vielen als wesentlich für die Pullulanasebildung bezeichnet werden), unterdrücken die Pullanasebildung.

ObElelch die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen In der Lage sind, In Gegenwart von fermentler-

baren Stärkehydrolysaten Pullulanase zu bilden, werden durch verzweigte Stärlefraktionen mit einem höheren Molekulargewicht (z. B. Amylopectin) die Pullulanaseausbeuten verbessen. Wie in der Tabelle 1 des weiter unten folgenden Beispiels 2 angegeben, wird durch gelatiniertes, im wesentlichen nicht-hydrolysiertes Amylopectin (als einzige Kohlehydratquelle) die Pullulanasebildung optimiert. Im Vergleich dazu verringert eine gelail-5 nierte Maisstärke die Pullulanasebildungsausbeuten, während die Stärkehydrolysate davon iz. B. eine Maisstärke mit 12 D. E.) das Pullulanasebildungsvermögen noch weiter hemmen. Fermentierbare Zucker (während der Pullulanasebildungsstufe) unterdrücken das Pullulanasebildungsvermögen.

Eine weitere hervorstechende Eigenschaft der erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen ist das Verhältnis von extrazellulärer Pullulanase zu lose gebundener Pullulanase, die gebildet werden. Wenn Amylopectin in ίο der oben genannten Grundkultur verwendet wird, bildet Aerobacter aerogenes eine verhältnismäßig geringe Menge an extrazellulärem Enzym und eine große Menge an zellengebundener Pullulanase. Umgekehrt führt die Inkubation der Mikroorganismen mit Amylopectin im allgemeinen zur Bildung eines Pullulanaseeinheltsverhältnisses von extrazellulärer Pullulanase zu lose gebundener Pullulanase von mehr als 2 : 3 bis weniger als 7 :3 (in der Regel weniger als 2: 1) bei einer wesentlich geringeren Menge an fest an die Zelle gebundener Pullulanase 15 (z. B. weniger als 20% der Gesamtmenge der gebildeten Pullulanase liegen in der an die Zelle gebundenen Form vor).

Wegen des hohen Mengenanteils der Pullulanasebildung in der extrazellulären und oberflächlich gebundenen Form ist die leichte und verhältnismäßig billige Verarbeitung, die bei der Gewinnung der hohen Pulluianaseausbeuten in einer kommerziell brauchbaren Form auftritt, ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfah-20 rens. Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfharens kann die Menge an Intrazellulärer oder intern gebundener Pullulanase (bei der für die Abtrennung normalerweise die Zelle zerstört werden muß) auf weniger als etwa 10% (vorzugsweise weniger als etwa 5%) der Gesamtmenge der gebildeten Pullulanase minimalisiert werden. Während der Enzymbildungsstufe wird ein hoher Mengenanteil an Pullulanase durch den Mikroorganismus in der wäßrigen Kulturmediumsphase in Form eines wasserlöslichen Enzyms gebildet. Die 25 erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen können ein Einheitsverhältnis von extrazelluläref Pullulanase zu oberflächlich gebundenem Enzym zwischen etwa 3 : 4 und etwa 2 : 1 (vorzugsweise von etwa 1 . 1 bis etwa 3 :2) bilden, wenn als einzige Kohlehydratquelle in dem oben erwähnten wäßrigen Nährkulturmedium ein Kohlehydratquellenmaterial (in einer Menge von 2%, bezogen auf die Trockenfeststoffe) verwendet wird, das ausgewählt wird aus gelatiniertem Amylopectin, gelatinierter Maisstärke, Maltose, Lactose, Pullulan und Maito-30 dextrin.

Wenn die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen in dem oben genannten wäßrigen Nährmedium inkubiert werden, sind sie praktisch frei von schleimigen Polysaccharidmaterialien. Ein übermäßig stark in der Zelle gebildetes schleimiges Polysaccharld beeinflußt die Ausbeute der abtrennbaren Pullulanase nachteilig. In den Bildungs- und Abtrennungsstufen erleichtert die Abwesenheit dieses schleimigen Materials die Übertragung 35 und Dispersion der Pullulanase in der wäßrigen Phase des Produktionskulturmedlums. Nach Beendigung der Pullulanasebildungsstufe wird die oberflächlich gebundene Pullulanase nicht aufgenommen In oder elngeschlos-M sen durch das in der Zelle gebildete schleimige Material. Diese oberflächlich gebundene, zellgebundene PuIIuIa-

I? nase kann leicht in eine lösliche Form überführt und mit Detergentien daraus freigesetzt werden.

I Die erfindungsgemäß verwendeten Organismen haben die Fähigkeit, mehr als 350 Einheiten Pullulanase pro

I 40 ml Produktionsmedium (auf Basis einer kommerziellen Produktion) zu bilden. Ein spezieller Verfahrensvorteil,

I der diesen Organismen eigen ist, liegt in den Eigenschaften der Pullulanase, welche diese Organismen bilden.

II Die Fähigkeit der Organismen, Pullulanase im wesentlichen in der extrazellulären und In der oberflächlich I gebundenen Form zu bilden, erleichtert die Abtrennung von mindestens 80% der Gesamtpullulanase in dem |j Endproduktionsmedium. In einem Produktionskulturmedium, das im wesentlichen aus Amylopectin als I 45 Kohlehydratquelle besteht, können Ausbeuten an oberflächlich gebundener Pullulanase und extrazellulärer ^ Pullulanase von mindestens 500 Einheiten/ml erzielt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren wird zweck-,| mäßig in einem Nährkulturmedium unter Inkubationsbedingungen durchgeführt, so daß die Pullulanaseausbeui ten mehr als 750 Einheiten pro ml Kulturmedium betragen und mehr als 85% (beispielsweise etwa 85 bis etwa I 95% oder mehr) der Gesamtmenge der dadurch gebildeten Pullulanase in der extrazellulären und In der ober-I so flächlich gebundenen Form vorliegen. Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung liegen mehr als 90'*,

* der gesamten Pullulanaseproduktion in diesen beiden Formen vor.

f Die Fähigkeit der Mikroorganismen zur Bildung von Pullulanase wird in Gegenwart eines Produktlonskuliur-

i mediums beträchtlich verbessert, das Amylopectin als Hauptkohlehydratquellenmaterial (bezogen auf das

I Gewicht der Trockenfeststoffe) enthält. Ein Produktionskulturmedium, das Amylose als Hauptkohlehydrai

ti 55 (bezogen auf das Gewicht) enthält, unterdrückt nicht vollständig die Pullulanasebildung, aber die Pullulanase-

ί ausbeuten sind wesentlich geringer als diejenigen bei einem höheren Gehalt an Amylopectin.

U Als Amylopectinquelle können die verschiedensten Stärkesorten verwendet werden. Zu beispielhaften Stärkc-

I Sorten gehören solche mit einem verhältnismäßig hohen Amylopectingehalt (von beispielsweise mehr als 70%).

I Diese Stärkesorten weisen in der Regel eine Gelatinlerungstemperatur von weniger als etwa 80° C auf. Zu

f 6'j Beispielen für Amylopectin enthaltenden Stärkesorten gehören Knollen- und Wurzelstärken [z. B. von Kartoffel.

• Tapioka. Canna. Pfeilwurz und Süßkartoffel (Batate)], die Getreidestärke (z. B. von Mals, Sorghum, Weizen, i. Reis, ttachsartigem Mais, wachsarilgem Reis und wachsartigem Sorghum), Mischungen davon und dgl. SUlrken, I die im wesentlichen aus Amylopectin bestehen (z. B. solche mit einem Amylosegehalt von weniger als 10% und I mehr als 90% Amylopectin), wie wachsartiger Mais, wachsartiges Korn, wachsartiger Sorghum, wachsartiger I 65 Reis, wachsartige Gerste und Mischungen davon, stellen besonders wirksame Kohlehydrate für die Optimierung I der Pullulanasebildung dar.

I Wie in den konventionellen Pullulanaseverfahren werden zur Herstellung des Kulturmediums assimilierbare

K Kohlehydrate verwendet. Als assimilierbare Kohlehydratquelie können gelatinierte Stärke und/oder icllwcl.se

liydrolysierte Stärke (ζ. B. mit einer Säure oder einem Enzym dünn gemachte Stärken) in einer Menge verwendet werden, die ausreicht, um die Umwandlung der Stärkequelle durch die Organismen bei gleichzeitiger PuIIulanascblldung zu ermöglichen. Stärkehydrolysate mit einer merklichen Menge an fermentierbaren Zuckern unterdrücken die Pullulanaseblldung. So nimmt vergleichsweise die Pullulanasebildung ab, wenn der D. E.-Wert des .Stärkehydrolysate zunimmt. Stärkehydrolysate mit einem D. E.-Wert von mehr als 30% unterdrücken beachtlich die Pullulanaseblldung im Vergleich zu solchen mit einem D. E.-Wert von weniger als 20% oder weniger als 10%. Verbesserte Pullulanaseausbeuten werden entweder mit nicht-verdünntem Amylopectin oder mit partiellen Stärkehydrolysaten mit einem D. E.-Wert von weniger als 5,0% erzielt, wobei mit einem angezeigten Amylopectinsubstrat mit einem D. E.-Wert von weniger als etwa 2,0% optimale Ausbeutert erzielt werden.

Das Produktionskulturmedium sollte eine ausreichende Menge an Kohlehydratquellenmaterialien enthalten, um den Mikroorganismus, die weitere Vermehrung und die Bildung von Pullulanase darin zu ermöglichen. Im allgemeinen wird die Pullulanaseherstellung in Gegenwart von Amylopectin in einer Menge durchgeführt, die ausreicht, um die oben erwähnten Pullulanaseausbeuten zu erzielen. Allgemein wird die Menge des Kohlehydralmaterials innerhalb des Bereichs von 1 bis 10 Gewichtsteilen Kohlehydrat auf jeweils 100 Gewichtsteile Wasser In dem Produktionskulturmedium liegen. Amylopectin in einer Menge von mindestens 1 bis 6 Gewichtstellen erhöht sowohl die Geschwindigkeit als auch die Menge der durch die Mikroorganismen gebildeten Pullulanase. Das Produktionskulturmedium weist zweckmäßig ein Gewichtsverhältnis von Amylopectin- zu Nicht-Amylopectin-Kohlehydratquellematerial von mindestens 7 : 3 auf. Ein Produktionskulturmedium, das im wesentlichen frei von anderen Kohlehydraten Ist und 2 bis 4 Gew.-Teile Amylopectin auf jeweils 100 Gew-Teilc Wasser enthält, liefert außergewöhnlich hohe Pullulanaseausbeuten. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Nährmedium verwendet, das als Hauptkohlehydratquelle (bezogen auf das Gesamtgewicht des Kohlehydrats) Amylopectin enthält und welches das Amylopectin und ein Kohlehydrat aus der Gruppe Pullulan. Maltose, Dextrose und Lactose in einem Gewichtsverhältnis, bezogen auf die Trockensubstanz, von mindestens 3 : 1 enthält. Weitere bevorzugte Beispiele sind die Verwendung eines Nährmediums, das im wesentlichen frei von fermentierbaren Zuckern und Pullulan ist und als Hauptkohlehydratquelle Amylopectin enthält; die Verwendung einer Kohlehydratquelle, die im wesentlichen vollständig aus Amylopectin besteht; und die Verwendung eines Gewichtsverhältnisses (bezogen auf das Trockengewicht) von Amylopectinkohlehydraten zu amylopectlnfrelen Kohlehydraten in dem Nährmedium von mindestens 9:1.

Bei der Herstellung von Pullulanase ist es üblich, eine Impfkultur oder ein Inokulum zu verwenden, um lebensfähige Organismen für das Pullulanase-Produktionskulturmedium zu erzielen. In der kommerziellen Praxis enthält die Impfkultur eine hohe Zellpopulation, die zum Inokulieren des Produktionskulturmediums verwendet wird. Je nach dem jeweils angewendeten Verfahren zur Herstellung der Impfkultur kann die Pullulanasebildung bei der Entwicklung dieser Impfkultur unterdrückt oder begünstigt werden. Normalerweise wird die Impfkultur mit den verschiedensten Kohlehydraten kultiviert, die für die Vermehrung (Fortpflanzung) des Organismus förderlich sind, ungeachtet der Tatsache, ob das Kohlehydrat die Pullulanasebildung hemmt oder fördert.

Das Produktionskulturmedium kann unter Anwendung konventioneller Impfkulturmethoden mit den lebensfähigen Mikroorganismen inokuliert werden. Das Impfkulturmedium selbst oder die durch Fortpflanzung daraus entstandenen Organismen können zum Inokulieren des Produktionskulturmediums verwendet werden. Bei Verwendung von Amylopectin als Kohlehydratquelle für die Impfkultur kann dieses direkt als Inokulum verwendet werden, ohne daß dadurch das Gesamtkohlehydratgleichgewicht des Pullulanasebildungskulturmedlums nachteilig beeinflußt wird.

In dem Produktionskulturmedium sollte ein assimilierbares Stickstoffquellenmaterial in einer Menge vorhanden sein, die ausreicht, um die Bildung von Pullulanase zu ermöglichen. Das Stickstoffquellenmaterial kann vor dem Inokulieren eingeführt werden oder es kann portionsweise während der Vermehrung (Fortpflanzung) und während des Pulluianasebildungscyclus zugegeben werden. Während der anfänglichen Produktionsstufen wird die Stickstoffquelle hauptsächlich für das Zellenwachstum verwendet. Während der späteren Inkubationsstufen wird die Stickstoffquelle hauptsächlich für die Bildung von Pullulanase verwendet. Die Menge des Stickstoffquellenmaterials kann beträchtlich variieren, in der Regel Hegt sie jedoch innerhalb des Bereiches von 2 bis 15 Gew.-Teilen, bezogen auf Trockenfeststoffe, auf jeweils 100 Gew.-Teile des Wassers des Produktionskulturmediums.

Als assimilierbares Stickstoffquellenmateria] können in dem erfindungsgemäßen Venahrsn organisd.c, JAz^- stoff enthaltende Zusammensetzungen verwendet werden. Typische organische Stickstoffquellen vom wasserlöslichen Typ Sind z. B. Harnstoff, Pepton, Fleisch, Hefeextrakte, Maisquellwasser, Caseinhydrolysate, Fischmehl, Pflanzenhydrolysate (z. B. Weizen, Kleie, Reis, Korn, Protein), Aminosäuren (z. B. Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin) und Mischungen davon.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird Malsquellwasser als assimilierbare, organische Stickstoffquelle verwendet. Jedoch hemmt eine übermäßige oder unzureichende Menge des als einzige organische Stickstoffquelle verwendeten Maisquellwassers die Pullulanasebildung. So unterdrückt beispielsweise ein Produktionskulturmedium, das mehr als 6 Gew.-Teile Maisquellwasser (bezogen auf Trockenfeststoffe) enthält, die Pullulanase- en bildung. Wenn weniger als etwa 2 Gew.-Teile Maisquellwasser (bezogen auf Trockenfeststoffe) ausschließlich als assimilierbare organische Stickstoffquellen verwendet werden, enthält das Kulturmedium im allgemeinen genügend Stickstoff, um das Zellwachstum aufrechtzuerhalten, jedoch wird die Pullulanasebildung dadurch wesentlich beeinträchtigt. Wenn es erwünscht ist, als ausschließliche Stickstoffquelle Maisquellwasser zu verwenden, werden normalerweise hohe Pullulanaseausbeuten erzielt, wenn die Menge der vorhandenen Trockenfeststoffe des M aisquell wassers 2 bis 5 Gew.-Teile auf 100 Gew.-Teile des ProdukUonskulturmediumwassers beträgt. Bei etwa 4 Gew.-Teilen Malsquellwasser, bezogen auf Trockenfeststoffe, werden optimale Pullulanasebildungsergebnisse erzielt.

Die Kombination aus einer assimilierbaren anorganischen Stickstoffquelle und einer assimilierbaren organischen Stickstoffquelle in dem Produktlonskullurmedium erhöht, wie gefunden wurde, welter die Gesamtproduktion von Pullulanase durch die Organismen. Üblicherweise können wasserlösliche Stickstoffquellen als anorganische Stickstoffergänzung verwendet werden. Es können Ammoniak, Ammoniumsalze (z. B. Ammoniumchlorid Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat, Ammoniumsulfat, Ammonlumphosphal), die Alkallmetallnitrate (z.B. Natriumnitrat), Mischungen davon und andere ähnliche wasserlösliche Salze als beispielhafte ergänzende anorganische Stlckstoffquelienmaterlallen verwendet werden.

Das Überwiegende Stickstoffquellenmaterial (bezogen auf das Gewicht) In dem Produktlonskulturmedlum Ist normalerweise ein organisches Stickstoffquellenmaterial. Die Gewichtsverhältnisse von organischen Stlckstollquellenmateriallen zu anorganischen Stlckstoffquelienmaterlallen liegen in der Regel Innerhalb des Bereiches von weniger als 1:1 bis zu etwa 15:1 oder höher. Verbesserte Pullulanaseausbeuten werden erzielt bei einem Gewichtsverhältnis von organischem Stickstoff zu anorganischem Stickstoff von 3:1 bis weniger als 10: I, vorzugsweise von 4 : 1 bis 6 : 1. _n ., ,

Im allgemeinen kann die Menge der wasserlöslichen Stickstoffsalze innerhalb des Bereiches von 0,25 bis J Qpw -Teilen pro 100 Gew-Teile Wasser des Produktionskulturmediums liegen. Dle_ assimilierbaren Ammoniumsalze'sind" besonders gut geeignet als anorganisches Stickstoffquellenmateriai. Bevorzugte anorganisc.e Stickstoffquellen für die Optimierung der Pullulanaseausbeuten sind Ammoniumacetat und Ammon umsullat. Die Gesamtmenge der ausgebildeten Pullulanase bleibt verhältnismäßig konstant über 1 Gew.-% des Wertes der anorganischen Stickstoffquelle. Die wasserlöslichen Stickstoffe enthaltenden Salze sind In einer Menge von 0,5 bis 1 Gew.-Tellen (vorzugsweise von etwa 0,75 Gew.-Tellen) besonders wirksam In bezug auf die Erhöhung sowohl die Produktionsgeschwindigkeit als auch der Ausbeuten.

Spurenmengen von Elsen, wie sie üblicherweise in Kulturmedien verwendet werden, um die Zellenfortpllanzung aufrechtzuerhalten, sind Im allgemeinen weniger wirksam als solche, denen eine geringe Menge eines Überschusses von assimilierbarem Eisen zugesetzt worden sind. Zur Optimierung der Pullulanaseblldung ist es daher wichtig daß mindestens während der Pullulanasebildungsstufe des Verfahrens das Produktlonsku turmedlum an einer wirksamen Menge eines assimilierbaren Eisens angereichert wird, die ausreicht, um einen meßbaren Effekt auf die Pullulanaseblldung zu haben.

Die zur Erzielung der maximalen Pullulanaseblldung durch die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen erforderliche Menge an zugesetztem (ergänzendem) Elsen hängt teilweise von dem jeweiligen Mutantenstamm ab. Klebslella pneumoniae NRRL-B-5783 eignet sich In Abwesenheit von zugesetztem (ergänzendem Elsen nicht für die wirksame Bildung von Pullulanase. Obgleich Klebslella pneumoniae NRRL-B-5780 und Klebslelle pneumoniae NRRL-B-5784 eine beträchtliche Menge Pullulanase In Abwesenheit von ergänzendem Eisen bilden, liegen diese Ausbeuten beträchtlich unterhalb Ihres Optimums. Der Einfluß von assimilierbarem Elsen auf die Produktionskapazität dieser Mutanten wird in den welter unten folgenden Beispielen näher erläu-

Das EisendDionen [z. B. ElsendDsulfat] als Elsenquelle enthaltende Produktlonskulturmedlum verbessert die Pullulanaseausbeuten gegenüber denjenigen, die nur Eisen(III)lonen [z. B. Eisen(III)chlorld] enthalten Das erforderliche assimilierbare Elsen kann aus den verschiedensten konventionellen Quellen stammen Beispiele tür geeignete EisendD-Verblndungen sind die EisendDsalze von Acetat-, Carbonat-, Cltrat-, Lactat-, Nitrat-, bullat-, Sulfit- und Thiosulfatanionen, Mischungen davon und dgl. Andere Materlallen, die von Natur aus Spurenmengen an Elsenionen enthalten, wie z. B. Maisquellwasser, und an EisendD- oder EisendID-Verblndungen reiches Leitungswasser können ebenfalls als Elsenquelle verwendet werden. Ein Produktlonskulturrnediurn, das mehr als 1.0, zweckmäßigerweise mehr als 2,0, z. B. vorzugsweise etwa 3,0 bis etwa 5,0 mg EisendDionen pro Liter ^

Produktionskulturmedium enthält, verbessert die Gesamtpullulanaseproduktlon. |

Während der Puilulanaseblldungsstufe sollte das Kulturmedium bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8 gehalten w

werden Etwas oberhalb pH 8,0 hört die Pullulanaseblldung auf und unterhalb pH 7,2 wird sie gehemmt Während der Anfangsstufen der Bildung bleibt der pH-Wert Im allgemeinen verhältnismäßig konstant wahrend der späteren Stufen steigt er jedoch mit einer hohen Geschwindigkeit beträchtlich an. Um das Produktionskulturmedium auf seinem optimalen Bildungs-pH-Werl zu halten, sollten Puffer oder eine neutralisierende Saure in einer zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes auf einem Wert zwischen etwa 7,5 bis weniger als etwa 8 0 ausreichenden Menge verwendet werden, insbesondere während des letzten Teils der Inkubation. Konventionelle neutralisierende "Säuren, wie Schwefelsäure, Citronensäure, Chlorwasserstotlsaure, Miicnsaurc oa.pele.caurc. Kohlensäure, Essigsäure und Phosphorsäure, können verwendet werden, um den pH-Wert au! eine geeignete Höhe einzustellen und ihn dabei zu halten.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen vermehren sich innerhalb eines verhältnismäßig breiten Temperaturbereiches ohne einen merklichen Unterschied in bezug auf die Wachstumsgeschwindigkeit (Wachstumsrate) Während der Anfangsstufen der Pullulanasebildung enthält das Produktlonskulturmedlum normalerweise nicht mehr als Spurenmengen an Pullulanase. Die Organismen vermehren sich etwa mit einer äquivalenten Geschwindigkeit über den Bereich von 20 bis 40⁰C. Eine optimale Pullulanasebildung ist jedoch temperaturabhängig. Bei Temperaturen unterhalb 25° C oder oberhalb 35° C 1st die Pullulanaseblldung beeinträchtigt. Wegen dieser Temperaturabhängigkeit ist es zweckmäßig (mindestens während der letzten Stufe der Bildung), die Temperatur der Kultur innerhalb dieses engen Bereichs zu halten. Optimale Pullulanaseausbeuten werden erzielt, wenn das Produktlonskulturmedlum bei etwa 28° C gehalten wird. Es 1st jedoch bevorzugt, die optimale Temperatur sowohl für die Vermehrung als auch für die Pullulanaseblldungsstufen zu verwenden.

Ein typisches Pullulanaseverfahren, in dem verschiedene Aerobacter aerogenes-Stämme (z.B. ATCC 15 und ATCC 8724) verwendet werden, benötigt normalerweise meher als 35 Stunden zur Erzielung optimaler Ausbeuten. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können optimale Pullulanaseausbeuten (mehr als Einheiten/m!) leicht innerhalb eines wesentlich kürzeren Zeltraums erzielt werden. Der mit der Inokulation mil

einer Klcbslella-Impfkultur beginnende gesamte Produktionscyclus bis zu seinem Ende kann auf etwa 20 bis etwa 25 Stunden verkürzt werden.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren können gewünschtenfalls auch andere Nährstoffe, Mineralien, Salze und andere Fermentationshilfsmittel (wie sie z. B. üblicherweise In anderen Pullulanasebildungsverfahren angewendet werden) In dem Produktlonskulturmedium verwendet werden. Wie andere Pullulanase bildende Organlsmcn benötigen auch die erfindungsgemäß verwendeten Klebslella-Organlsmen naszierenden Sauerstoff für die Pullulanaseblldung. Für diesen Zweck können konventioneile Fermentations-, Rühr- und Belüftungseinrlchtun gen zur Einführung von naszlerendem Sauerstoff In ähnliche Organismen vom aeroben Typ verwendet werden. Nach Beendigung der Pullulanasebildungsfermentation kann die Pullulanase auf die verschiedenste Weise abgetrennt werden. Da die erfindungsgemäß verwendeten Klebslella-Organlsmen eine Gärbrühe mit einem hohen Prozentsatz an darin enthaltener extrazellulärer Pullulanase und sehr locker gebundener Pullulanase bilden, ist eine zusätzliche Verarbeitung erforderlich, um die Pullulanase in eine kommerziell brauchbare Form zu überführen.

Pullulanaseausbeuten von mehr als 85% der gesamten Pullulanasebildung können i>. ·:>..ί abgetrennt werden durch Behandeln des Produktionskulturmediums mit einem oberflächenaktiven Mittel. Die anfängliche Behänd- i$ lung mit dem oberflächenaktiven Mittel überführt den größten Teil des oberflächlich gebundenen Enzyms in eine wasserlösliche Form und erleichtert die Abtrennung desselben zusammen mit der darin enthaltenen extrazellulären Pullulanase. Die durch das oberflächenaktive Mittel freigesetzte Pullulanase und das darin enthaltene extrazelluläre Enzym können eingeengt (z. B. durch Trocknen im Vakuum bei einer verhältnismäßig tiefen Temperatur oder durch Ultrafiltrieren) und kommerziell verwendet werden. Flüssige Pullulanasekonzentrate mit einer Pullulanasekonzentratlon von mehr als 2000, vorzugsweise mehr als etwa 3000 Einheiten pro ml können auf diese Welse leicht hergestellt werden, wobei die Gärbrühe als flüssiger Träger fungiert. Gewünschtenfalls können Zellenbruchstücke und unlösliche Bestandteile von der Fermentationsbrühe abgetrennt werden. Alternativ kann das Produktionsmedium nacheinander (1) mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelt werden, um das oberflächlich gebundene Enzym freizusetzen, (2) es können die unlöslichen Bestandteile da.on abgetrennt werden, (3) die Pullulanase kann mit üblichen Zusätzen aus der flüssigen Phase ausgefällt werden und (4) die Pullulanase kann getrocknet werden. Wenn eine vollständigere Abtrennung (Gewinnung) der Pullulanase gewünscht Ist, kann der zelluläre Rückstand wiederholt mit oberflächenaktiven Mitteln behandelt oder alternativ einer Lysis unterworfen werden. Durch die erfindungsgemäß eingesetzten Klebsiella-Organismen wird nur wenig, falls überhaupt, intrazelluläre Pullulanase gebildet.

Das oberflächlich gebundene Enzym wird durch konventionelle Zusätze und Methoden zur Freisetzung der locker gebundenen mlkroblellen Enzyme leicht in eine wasserlösliche Form überführt. Kommerziell ist es vorteilhaft, die oberflächlich gebundene Pullulanase ohne Lysis freizusetzen. Es können konventionelle oberflächenaktive Mittel (z. B. Natrlumlaurylsulfat und ein Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol) in einer Menge verwendet werden, die ausreicht, um das oberflächlich gebundene Enzym, ohne daß eine wesentliche zelluläre Lysis desselben auftritt, auf wirksame Weise freizusetzen. Ein konventionelles, Pullulanase freisetzendes, nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel in einer Menge, die ausreicht, um ein Produktionskulturmedium zu liefern, das 0,1 bis 0,5 Vol.-% enthält, unter Rühren desselben für einen Zeltraum von etwa 5 bis etwa 20 Stunden eignet sich für die Freisetzung von oberflächlich gebundenem Enzym. Eine längere Behandlung mit dem oberflächenaktiven Mittel bei höheren Konzentrationen (beispielsweise 25 Stunden lang oder mehr bei 0,5%) kann zu einer Lysis desselben führen.

Im folgenden werden einige bevorzugte Möglichkeiten zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben. Beisplelsweies wird so gearbeitet, daß die Kohlehydratquelle in dem Nährmedium im wesentlichen vollständig aus einem Amylopectin mit einem D.E.-Wert von weniger als 2,0% besteht und daß die Inkubation des Nährmediums bei einer Temperatur von 25° C bis weniger als 35° C für einen Zeitraum durchgeführt wird, der ausreicht, um eine Pullulanaseausbeute von mindestens 500 Pullulanaseeinheiten pro ml des Produktionskulturmediums zu erzielen. Günstig Ist es auch, wenn die Inkubation des inokulierten Nährmediums für einen solchen Zeitraum fortgesetzt wird, der ausreicht, um mindestens 690 Pullulanaseeinheiten pro ml des Produkllonskulturmedlums zu bilden. Gemäß einem weiteren Beispiel arbeitet man mit einem Nährmedium, das bezogen auf 100 Gew.-Teile des Kulturmediums, 0,25 bis 2 Gew.-Teile eines assimilierbaren Ammoniumsalzes und 3 bis 4 Gew.-Telle Maisquellwasser enthält. Bevorzugt kann das erfindungsgemäße Verfahren so durchgeführt worden daß das Nährmedium, bezogen auf 100 Gew.-Teile Nährmedium, 1 bis 6 Gew.-Telle Amylopectin, 2 bis !5 Gew.-Telle einer Stickstoffquelle, die eine assimilierbare organische Slickstoffquelle und eine assimilierbare anorganische Stickstoffquelle In einem Gewichtsverhältnis innerhalb des Bereiches von 1:1 bis 15:1 enthält, und eine wirksame Menge Eisen(II)ionen enthält, die in Kombination mit dem assimilierbaren Amylopectin und der assimilierbaren Stickstoffquelle ein Nährmedium ergeben, welches den Organismus in die Lage versetzt, mindestens 500 Einheiten Pullulanase pro ml Nährmedium zu bilden, wobei die Inkubation des Nährmediums bei einer Temperatur von 25 bis 35° C für einen Zeitraum durchgeführt wird, der ausreicht, um ein Produktionskullurmedium mit mindestens 500 Pullulanaseeinheiten pro ml Produktionskulturmedium zu bilden. Bei dieser Durchführungsform ist es besonders günstig, wenn das Nährmedium, bezogen auf 100 Gew.-Teile des Nährmediums, 3 bis 5 Gew.-Teile Malsquelhvasser. 0,25 bis 2 Gew.-Teile eines assimilierbaren, wasserlöslichen anorganischen Stickstoffsalzes und 2 bis 5 mg Eisen(II)ionen pro Liter Nährmedium enthält, wobei bevorzugt das assimilierbare, wasserlösliche anorganische Salz im wesentlichen vollständig aus einem assimilierbaren Ammoniumsalz besteht.

Beispiel 1

Unter Verwendung von Klebsiella pneumoniae NRRL-B-5780 als Pullulanase bildendem Organismus wurde eine Produktionskultur hergestellt, die pro ml der Kulturmediumsbrühe 790 Einheiten Pullulanase bildete

Es wurde ein Inokulum-Nährmedlum hergestellt, das bestand aus (bezogen auf das Gewicht) 2,0% wachsartiger Malsstärke [handelsübliche, körnige wachsartige Maisstärke (100% Amylopectin) mit einer mittleren Brookfield-Viskosität von etwa 2000 mPa · s (Spindel Nr. 3, 20 Upm bei 66° C und einem Trockenfeststoffgehalt von 40 bis 45%) und einem D.E. von weniger als 1%, die mit Säure verdünnt war], 2,0% handelsübliches Pepton-Präparat, 0,5% Ammoniumacetat, 0,0596 Natriumcltrat (Na₃C₆H₅O₇ · 2H₂O), 0,196 K₂HPO₁, 0,1% KH₂PO₄, 0,05%

in MgSO₄-7H₂O, 0,05% KCl, 0,001% FeSO₄-OH₂O und Wasser. Dieses Medium wurde hergestellt, indem man nacheinander das Natriumcltrat, die anderen Mineralsalze, das Pepton und schließlich die wachsartige Maisstärke zusetzte. Die dabei erhaltene Mischung wurde dann unter Rühren auf einem "Wasserdampfbad erhitzt zur Herstellung eines homogenen Kulturmediums, das eine gründlich eingeteigte wachsartige Malsstärke enthielt. Zu jedem von fünf 500 ml-DeLong-Kolben mit einem Leitblech am Boden wurden 100 ml des Inokulum-Medlums und 1 Tropfen eines Antischaummittel zugegeben und dann wurde 15 Minuten lang bei 121°C sterilisiert. Die sterilisierten Medien wurden mit Klebsiella pneumoniae NRRL-B-5780 (Schrägagar) in okuliert und 16 Stunden lang bei 28° C und 265 UpM auf einem New Brunswlck-Rotatlonsschüttler Inkubiert zur Herstellung j

des Impfinokulums für das Produktionskulturmedium. I

Es wurde ein Pullanasebildungs-Nährmedium hergestellt durch (1) Auflösen von 60 Gew.-Teilen Natrlumcl-

M trat (Na)C₆H₅OT 2H₂O) in 1000 Gew.-Tellen (1 1) Leitungswasser (2O⁰C), (2) langsames Zugeben (unter Rühren) von 350 Gew.-Teilen Malsquellwasser (bezogen auf Trockenfeststoffe, nachfolgend abgekürzt mit d.s.b.) und (3) Einstellen des pH-Wertes auf 6,3 durch Zugabe einer 50%lgen Kallumhydroxldlösung.

Dann wurde ein pastenförmiges wachsartiges Maispräparat getrennt davon hergestellt durch (1) langsames Zugeben unter Rühren von 350 Gew.-Tellen einer wachsartigen Maisstärke mit einer niedrigen Viskosität zu 5000 Gew.-Teilen (5 1) Wasser und sorgfältiges Einteigen der wachsartigen Malsstärke durch Erhitzen auf 96" C und (2) Zugeben von 50 Gew.-Teilen Kaliumchlorid und 70 Gew.-Teilen Ammoniumsulfat zu dem pastenförmlgen Stärkemedium.

Die oben angegebene Natriumcitrat-Maisquellenwasser-Lösung und das wäßrige pastenförmige Stärkemedium (bei 96° C) wurden dann unter Zugabe von heißem Leitungswasser miteinander gemischt zur Herstellung eines wäßrigen 10 1-Produktionskulturmedlums, das in eine Fermentlervorrichtung mit einer Kapazität von 14 I eingeführt und 45 Minuten lang bet 121° C in einem Autoklaven behandelt wurde. Es wurde eine sterile, 0,036 molare, angesäuerte ElsendDsulfatlösung, gelöst in 0,08 m Chlorwasserstoffsäurelösung, hergestellt, um ergänzende ElsendDionen zu liefern und es wurden 20 ml der dabei erhaltenen ElsendDsulfatlösung (20 ml) In der Fermentiervorrichtung gelöst unter Bildung eines Produktionsnährmediums, das 4,0 mg EisendDlonen [20 mg ElsendDsulfat] pro Liter des wäßrigen Produktionsmediums enthielt.

Das vorstehend beschriebene wäßrige Produktionsmedium wurde dann mit den Impfinokulum (Anfangs-pH-Wert 6,3) inokuliert und dann bei 28° C und einer Rührergeschwindigkeit von 550 UpM und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 6 Volumentellen Luft pro Volumenteil der Fermentationsbrühe pro Minute (v.v.m.) 23 Stunden lang inkubiert. Die Schaumentwicklung (nur ein Problem unmittelbar beim Beginn der Fermentation) wurde durch automatische Zugabe eines Entschäumungsmittels unterdrückt. Während der anfänglichen 9 Stunden der Fermentation stieg der pH-Wert allmählich auf 7,75 an und wurde innerhalb des Produktlonscycius mit einer wäßrigen 14 M Essigsäurelösung (8O96lge Essigsäure) mittels einer automatischen Meß- und Dosiereinrichtung dabei gehalten. Nach 23stündigen Fermentieren wurden die optimalen Pulluianaseausbeuten (790 Einheiten Pullulanase pro ml Fermentationsbrühe) erzielt.

Bei der Bestimmung der Ausbeuten an extrazellulärer Pullulanase, oberflächlich gebundener Pullulanase und interzellulärer Pullulanase wurde das nachfolgend angegebene Pullulanase-Testverfahren angewendet:

Bei dem Pullulanase-Testverfahren handelt es sich um eine Modifikation des Dinitrosalicylsäure (DNSA)-Verfahrens von E. H. Fisher und E. A. Stein, 1958, »J. Biol. Chem.«, 232, 867-879, das nachfolgend beschrieben wird.

Verwendete Reagentien

DNSA-Reagens: Das 3,5-DinitrosalIcylsäure-Reagens wurde wie von Fisher und Stein 1958 beschrieben Irisch hergestellt:

L Zuerst wurden 20,0 g DNSA zu 400 ml destilliertem Wasser zugegeben,

2. dazu wurde unter Rühren eine NaOH-Lösung (32,0 g Natriumhydroxid d.s.b. In 300 ml destilliertem Wasser) zugegeben; diese Lösung sollte klar sein, wenn sie das nicht ist, muß man sie langsam erwärmen, bis sie klar ist,
*n 3. langsam und portionsweise wurden dann 600,0 g Kaliumnatrlumtartrat zugegeben,

4. es wurde destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 2,01 zugegeben,

5. die Lösung Avurde durch ein großes gesintertes Glasfilter filtriert.

Acetaispuffen 0,1 M-pH 5,0-Acetatpuffer (Natriumacetat und Essigsäure).
o5 Substrat: Eine 1,0 gew.-%ige wäßrige Pullulanaselösung.

Testverfahren

Eine 0,5 ml-Portion elnei Pullulanase-Testprobe wurde in festgelegten Zeltintervallen zu 4,5 ml eines lcmpcraturäqulllbrierter PuHulansubstrats (2,0 ml 0,01 M-pH 5,0-Acetatpuffer und 2,5 ml Pullulanlösung) in 18 mm· 150 mm großen Teströhrchen zugegeben. Nach 0-, 6- und 12minütiger Inkubation wurde 1,0 ml der Dlgcstlonsmlschung zu 1,0 ml DNSA-Reagens (unter gründlichem Mischen) zugegeben, um die Digestionsrcakl'on zu stoppen. Durch 5,0minütiges Erhitzen der Röhrchen in einem 100° C-Wasserbad entwickelte sich dann eine Farbe. Unmittelbar nach dem Erhitzen wurden die Röhrchen 5 Minuten lang in kaltem Wasser ('7⁰C) abgekühlt. Nach dem Abkühlen wurden 10,0ml destilliertes Wasser (20⁰C) zugegeben und jedes Röhrchen wurde gründlich durchgemischt.

Die Menge der entwickelten Farbe wurde mit einem Bausch und Lomb-Spectronlc 70-Spektrophotometer als Prozentsatz der Transmission bei 545 nm (¹ST₅₄₅) gegen eine Reagens-Blindprobe für 100% T bestimmt. Der Prozentsatz der Transmissionwerte wurde nach der folgenden Formel in die Absorption umgewandelt:

A₅₄₅ = 2 - log % T₅₄₅

Die Änderung der Absorption pro Zeiteinheit (A₅₄₅) wurde durch das Maltoseäquivalent im mg aus einer geeichten Standard-Maltosekurve ausgedrückt.

Definition einer Pullulanaseeinhelt

Eine Einheit Pullulanase ist definiert als die Menge Enzym, die 1 mg Maltoseüqulvalent pro ml Aufschluß aus einer 0,5%Igen Pullulanlösung in 60 Minuten bei 45° C und einem pH-Wert von 5,0 bildet. Basierend auf dem Pullulanasetestverfahren können die Einheiten Pullulanase pro ml des Produktionskulturmediums nach der folgenden Gleichung bestimmt werden:

Einheiten/ml =

mg Maltose 1 ml Aufschluß

60 Min.

Digestierzeit

der Testprobe

(in Min.)

1 ml

0,5 ml
(verdünnte
Testprobe)

Endvolumen in der Verdünnungsblindprobe

zu der Verdünnungsblindprobe zugegebene ml

Zur Bestimmung der Menge der extrazellulären Pullulanase In dem Produktionskulturmedium wurde eine gleichförmige 5 ml-Pullulanase-Testprobe (eine homogene Mischung von unlöslichen und löslichen Bestandteilen des Ferments) aus der Fermentlervorrichtung entnommen. Diese Probe wurde entnommen, während die Fermentiervorrichtung In Betrieb gehalten wurde. Die Testprobe wurde mit einer Zentrifugalkraft von 7500 g 5 Minuten lang zentrifugiert. Die dabei erhaltene überstehende Flüssigkeit, welche die extrazelluläre Pullulanase enthielt, wurde durch Dekantieren von den abzentrifugierten unlöslichen Bestandteilen vorsichtig abgetrennt. Bei diesem vorstehend beschriebenen Pullulanasetestverfahren wies das Produktionskulturmedium einen extrazelluläre-. t\,|lulanasegehalt von 390 Einheiten/ml Produktionsbrühe auf. Während der Rührer der Fementiervorrichtung in Betrieb gehalten wurde (550 UpM), wurden 40 ml eines nicht-Ionischen oberflächenaktiven Mittels der Fermentlervorrichtung zugegeben. Das nlcht-lonlsche oberflächenaktive Mittel und das Produktlonskullurmedlum wurden In der Fermentiervorrichtung bei 55OUpM 12 Stunden lang ständig gerührt, um die locker gebundene Pullulanase in eine wasserlösliche Form zu überführen. Die Kulturbrühe, welche die wasserlösliche Pullulanase enthielt, wurde dann zentrifugiert und nach dem gleichen Testverfahren, wie es zur Herstellung der Testprobe der extrazellulären Pullulanase angewendet wurde, abgetrennt. Die dabei erhaltene überstehende Flüssigkeit enthielt, wie gefunden wurde, 720 Einheiten Pullulanase pro ml Produktionskulturmedium (umfassend sowohl extrazelluläre als auch durch einer oberflächenaktives Mittel löslich gemachte Pullulanase).

Zur Bestimmung der von der erfindungsgemäß verwendeten Mutante NRRL-B-5780 gebildeten Gesamtpullulanase wurde eine erschöpfende Pullulanaseextraktlon ohne Lysis der Zellen durchgeführt. Das bei der erschöpfenden Extraktion der Pullulanase aus dem Produktionsferment angewendete Verfahren war das folgende:

1. 100 ml der Fermentationsbrühe wurden In einen 500 ml-Erlenmeyerkolben eingeführt und es wurden

0,5 ml eines oberflächenaktiven Mittels zugegeben,

2. der Kolben wurde dann 20 Stunden lang in einem Rotationsschüttler gerührt (bei 265 UpM und 28° C),

3. die Pullulanasetestproben wurden dann entnommen, wobei der Pullulanasetest nach dem vorstehend beschriebenen Pullulanaseprobetestverfahren durchgeführt wurde,

4. die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugieren (wie oben angegeben) und Dekantieren von der Flüssigkeit abgetrennt,

5. der unlösliche, abzentrlfugierte Rückstand wurde zweimal mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen, wobei der Pullulanasetest mit dem dabei erhaltenen Waschwasser durchgeführt wurde,

6. die gewaschenen, abzentrifugierten Feststoffe wurden dann in einen 500 ml-Erlemeyerkolben eingeführt, der 0,4 g des oberflächenaktiven Mittels und 100 ml destilliertes Wasser enthielt,

7. die Stufen 2 bis 6 wurden nacheinander wiederholt, bis der Pullulanasetest in der Stufe (3) eine Pullulanaseausbeute von weniger als 0,5 Pullulanaseeinhelten/ml anzeigte.

Der Anfangstest für die Pullulanase in der Stufe (3) mit der FermentatlonsbrQhe entsprach hinsichtlich seines Wertes den oben erwähnten 720 Elnhelten/ml. Ein Hauptanteil der danach bestimmten Gesamtpullulanase wurde unmittelbar In dem nächsten Extraktlonscyclus mit einem oberflächenaktiven Mittel [d. h. in der Stufe (6)3 erhalten, woran sich die- Stufen (2) und (3) anschlossen. Danach zeigten die sich daran anschließenden Pullulanasetests der Stufe (3) beträchtlich niedrigere Pullulanaseelnheltswerte. Die Gesamtmenge der Pullulanaseelnheiten, die bei der erschöpfenden Pullulanaseextraktlon ermittelt wurden, betrug 70 Einheiten/ml der Fermentationsbrühe. Auf diese Welse betrug die Gesamtpullulanaseausbeute sowoii! an extrazellulärer Pullulanase als auch an oberflächlich gebundener Pullulanase 790 Einheiten/ml des Produktionskulturmediums. Wegen der zu Beglan durch eine einzige Extraktionsstufe mit einem oberflächenaktiven Mittel erzielten hohen gewlnnbaren Ausbeuten (von 720 Elnheiien/ml) werden die nachfolgende Solubilisierung und Behandlung der Zellenbruchstücke mit dem oberflächenaktiven Mittel beim kommerziellen Betrieb am zweckmäßigsten weggelassen. Das Verhältnis von extrazelluiärer Pullulanase zu oberflächlich gebundener Pullulanase betrug 39:40.

Nach Beendigung der vorstehend beschriebenen erschöpfenden Pullulanaseextraktlon wurde der unlösliche Zellenrückstand [aus der Stufe (5)] einer Ultraschallbehandlung unterworfen, um eine Lysis herbeizuführen. Das dabei erhaltene zellenfreie Lysat wurde auf Pullulanase hin untersucht und es wurde gefunden, daß es keine enthielt.

Dieses Beispiel wurde wiederholt unter Verwendung von Klebslella pneumonlae NRRL-B-5783 In einem Produktionsdurchgang und von Klebsiella pneumonlae NRRL-B-5784 In einem anderen Produktionsdurchgang. Der NRRL-B-5783-Stamm lieferte 690 Elnhelten/ml und der NRRL-B-5784-Stamm lieferte 744 Elnhelten/ml, wie nach dem oben beschriebenen Testverfahren ermittelt wurde. Der Produktlonskulturbrühe-Test zeigte an, daß diese beiden Klebsiella-Stämme Pullulanase In praktisch der gleichen Form wie der NRRL-B-5780-Stamm lieferten. Keiner dieser Stämme lieferte eine meßbare Menge von Intrazellulärem Enzym. Wie bei NRRL-B-5780 lag die durch den Organismus gebildete Pullulanase Im wesentlichen In extrazellulärer und oberflächlich gebundener Form In praktisch den gleichen Mengenverhältnissen wie bei dem NRRL-B-5780-Stamm vor.

Beispiel 2

Dieses Beispiel erläutert den Einfluß verschiedener Kohlehydratquellenmaterlallen auf die Pullulanaseblldung. Das Kulturmedium war das gleiche wie das Inokulationsmedium In Beispiel 1, jedoch mit der Ausnahme, daß als Kohlehydratquelle die In der folgenden Tabelle I angegebenen Materlallen verwendet wurden. Die Versuchsproben wurden 36 Stunden lang inkubiert. Zu Vergleichszwecken wurde Aerobactor aerogenes 15050 unter äquivalenten Inkubationsbedingungen ebenfalls jedem Versuch unterworfen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind In der folgenden Tabelle I zusammengefaßt.

35 Tabelle I

Ver- Kohlehydrat in dem Produktionskulturmedium such in Gew.-%, bezogen auf das Gesatntgewicht des Nr. Kulturmediums

Aerobacter aerogenes
ATCC 15050

Klebsiella pneumoniae NRRL-B-5780

extrazelluläre Ausbeute extrazeliulSre Ausbeute Pullulanase in % Pullulanase in %

1 2% wachsartige Maisstärke ^a) mit mittlerer Viskosität

2 2% wachsartige Maisstärke ^b) mit niedriger Viskosität

3 2% pastenförmige Perlstärke ^c)

4 2% Pullulan

5 2% wachsförmige Stärke ^d)

6 2% Maltose

7 1,5% Maltose + 0,5% wachsartige Maisstärke Ό mit mittlerer Viskosität

8 1% Maltose + 1% wachsartige Maisstärke ^a) mit mittlerer Viskosität

9 0,5% Maltose + 1,5% wachsartige Maisstärke ^a) mit mittlerer Viskosität

10 0,25% Maltose + 1,75% wachsartige Maisstärke ^a) mit mittlerer Viskosität

11 2% Dextrose

12 2% Lactose

13 1% Lactose + 1% wachsartige Maisstärke ^a) mit mittlerer Viskosität

14 2% Amylose

21	2,5	52	100
22	2,5	50	86
20	2,2	48	67
33	13,2	47	11,9
20	3,8	49	85,5
35	17,6	51	. 12,6
30	11,3	50	15,1
30	10,7	50	15,7
20	3,8	51	25,2
21	3,1	48	55,3
0	0,0	30	3,1
23	2,5	51	18,2
21	2,5	53	18,2

0,0

Fortsetzung

Ver- Kohlehydrat in dem Produktionskulturmedium such in Gew.-T^ bezogen auf das Gesarotgewicht des Nr. Kulturmediums

Aerobacter aerogenes ATCC 15050	Ausbeute in%	Klebsiella pneumoniae NRRL-B-5780	Ausbeute in%
extrazellulära Pullulanase	6,0	extrazelluläre Pullulanase	24,5
19	4,4	47	61,6
14	0,0	47	0,0
0	0

2% Maltodextrin^e) 2% Getreidestärke ·) mit 12 D.E.

") wie im Beispiel 1 verwendet

^h) eine körnige Maisstärke (100% Amylopectin) mit einer niedrigen Viskosität, die mit Säure verdünnt ist, die in der Regel charakterisiert ist durch eine Brookfield-Viskosität von etwa 500 mPa · s (Spindel Nr. 2, 20 UpM, 66° C bei einem Trockenfeststoirgehalt von 40 bis

45%) und einen D.E.-Wert von weniger als 1%
Ό nicht-hyd'olysierte, pastenförmige Perlstärke
^J) nichl-hydrolysierte, pastenförmige wachsartige Maisstärke
^e) Saccharidverteilung: D.P., - 3,1%, D.P.₂ - 5,65%, D.P.₃ - 7,38%, D.P., - 5,14%, D.P.s - 4,86%, D.P.₆ - 9,81%, D.P.₇ und s - 13,82%,

D.P., - 3,09%, D.P.iot - 47,15%
^r) Saccharidverteilung: D.P-i - 0,6%, D.P.₂ - 3,3%, D.P.₃ - 6,1%, D.P.< - 4,0%, D.P.₅ - 4,5%, D.P.₆ - 6,4%. D.P.₇ - 5,7%, D.P.₈ - 4,0%,

D.P ., - 3,0%, D.P.io - 2,6%, D.P.n-30 - 18,2%, D.P._3(k - 41,56%

Die Im Versuch Nr. 1 der vorstehenden Tabelle I angegebenen Ergebnisse für Klebsiella pneumoniae NRRL-B-5780 sind auf diejenigen des Beispiels 1 bezogen. Zu Vergleichszwecken beziehen sich die In der Tabelle angegebene Ausbeuten in % auf diejenigen von NRRL-B-5780 im Versuch Nr. 1. Wie In den Versuchen Nr. 6, 7, 8, 9 und 10 angegeben, Inhibierte die Erhöhung der Konzentration der Maltose in dem Produktionskulturmedium die Pullulanasebildung bei NRRL-B-5780. Umgekehrt wurde die Pulluianasebildung bei Aerobacter aerogenes ATCC 15050 beträchtlich erhöht (vgl. z. B. die Versuche Nr. 6, 7, 8, 9 und 10) In Gegenwart von Maltose. Die ■höchste Pullulanaseausbeute für Aerobacter aerogenes ATCC 15050 (Versuch Nr. 6) wurde mit Maltose allein erzielt, diese Ausbeute betrug jedoch nur 17,6% der Ausbeute von NRRL-B-5780 im Versuch Nr. 1. Im Gegensatz dazu ergab NRRL-B-5780 nur 11,9% der Ausbeute im Versuch Nr. 1, wenn als einzige Kohlehydratquelle 2% Maltose verwendet wurden. Pullulan hatte als einzige Kohlehydratquelle einen ähnlichen Unterdrückungseffekt bei Klebsiella pneumoniae NRRL-B-5780, während die Pullulanasebildung durch Aerobacter aerogenes ATCC 15050 dadurch erhöht wurde (vgl. Versuch Nr. 3). Im allgemeinen war Aerobacter aerogenes ATCC 15050 zu einer wirksamen Pullulanasebildung nicht Imstande, wenn Stärke oder Stärkehydrolysate mit einem verhältnismäßig hohen Polymerisationsgrad als Hauptkohlehydratquelle verwendet wurde (wurden) (vgl. z. B. die Versuche Nr. 1 bis 3, 5, 9, 10 und 15). Dagegen hatte die erfindungsgemäß verwendete Mutante ein beträchtlich größeres Pullulanasebldlungsvermögen in Gegenwart von pasienförmlgen Stärken und insbesondere In einem Produktionskulturmedium, das eine hohe Konzentration an Amylopectin enthielt.

Wie aus dem Versuch Nr. 11 hervorgeht, war Aerobacter aerogenes ATCC 15050 zur Pullulanasebildung nlchl imstande, wenn Dextrose als einzige Kohlehydratquelle verwendet wurde, während Klebsiella pneumoiae unter den Produktionsbedingungen dieses Beispiels eine geringe Menge Pullulanase bildete. Mit Ausnahme des Versuchs Nr. 11 (d. h. der Verwendung von Dextrose als einzigem Kohlehydrat) bildete Klebsiella pneumoniae NRRL-B-5780 etwa 47 bis etwa 53% extrazelluläre Pullulanase (bei dem übrigen Anteil handelte es sich Im wesentlichen um die erforderlich gebundene Form), während Aerobacter aerogenes ATCC 15050 in jedem der Versuche 35% oder weniger extrazelluläre Pullulanase bildete.

Wie oben erwähnt, benötigen die Pullulanase bildenden Organismen vom Aerobacter aerogenes-Typ Im allgemeinen ein Kohlehydrat-Induziermittel zur Erzielung optimaler Pullulanaseausbeuten. Die erfindungsgemäß verwendeten Mutanten werden durch diese Kohlehydrat-Induziermittel unterdrückt.

Ein Slärkesubstrat mit einem niedrigen D.E.-Wert und einem hohen Amylopectingehalt verbessert die Pullulanasebildung mit NRRL-B-5780. Dies zeigen die mit NRRL-B-5780 erzielten Ausbeuten In den Versuchen Nr. 1,2 und 5. Die Viskositätseigenschaften dieser Stärkesubstrate mit hohem Amylopectingehalt (bei einer Pastenmenge von 40 bis 45%) betragen jeweils etwa 5000 cP, 2000 cP und eine extrem hohe Viskosität. Wie ein Vergleich zwischen den prozentualen Ausbeuten der Versuche Nr. 1, 2 und 3 !n der Tabelle I zeigt, fördern Kuliurmedlumsubstrate mit einem hohen Amylopectingehalt stärker die Pullulanasebildung als pastenförmige Pcrlstärke. In den Versuchen Nr. 15 und 16 wurden der Amylopectlnantell der Stärke übermäßig hydrolysiert und sie enthielt auch Kohlehydratquellenmaterialien mit einem verhältnismäßig hohen Prozentsatz an niedrigen D.P.-Saccharlden, welche das Pullulanasebildungsvermögen hemmten.

Beispiel 3

Erhöhte Pullulanaseausbeuten werden erzielt, wenn das Produktionskulturmedium zusätzliche (ergänzende) EisendI)Ionen enthält. Mit Ausnahme der angegebenen verschiedenen Mengen an Elsen(II)lonen, des Malsquellenwassers und der Inkubationszelt, wie sie in der nachfolgenden Tabellen angegeben sind, erfolgte in diesem Beispiel die Pullulanasebildung auf die gleiche Welse wie In Beispiel 1. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengefaßt.

Ii

Tabelle Π

Versuch Nr.

% Maisquellwasser

Fe⁺+ in mg/1

Ausbeute in Einheiten Zeit in

pro ml Kulturmedium Stunden

18 19 20

1" 21 22 23

4,0	3,0
3,5	4,0
3,0	4,4
3,0	0,0
3,5	4,4
3,5	6,4

744
790
730
656
780
775

28,0 26,0 27,0 28,0 27,5 27,5

'S Wie aus dem Vergleich der Versuche Nr. 20 und 21 in der vorstehenden Tabelle hervorgeht, führte die Verwendung von zusätzlichen Eisen(II)lonen [das hier verwendete Maisquellwasser enthielt 0,7 Eisen(II)lonen] pro Liter zu einer mehr als 10«igen Erhöhung der Pullulanaseausbeuten. Beim Vergleich stellt die Ausbeute VGn 656 Einheiten pro ml in dem Versuch Nr. 21 noch eine überlegene Ausbeute gegenüber denjenigen dar, die mit Aerobacter aerogenes erzielt wurden. Wie ein Vergleich der Ausbeuten in den Versuchen Nr. 19, 20, 22 und

2« 23 zeigt, führte eine Erhöhung der EisenODionen auf mehr als 4,0 mg/1 zu höheren Ausbeuten als diejenigen, die ohne zusätzliche Eisen(II)ionen erzielt wurden, jedoch wurden die Ausbeuten nicht über diejenige der Versuche Nr. 19 hinaus srhöht.

Die erfindungsgemäß verwendeten Organismen sind dadurch charakterisiert, daß sie mehr Pullulanaseelnhelten bilden, wenn Amylopectin als einziges Kohlehydrat verwendet wird, als wenn ein Kohlehydrat aus der Gruppe Maltose, Dextrose, Lactose und Pullulan als einzige Kohlehydratquelle verwendet wird. Bei der Bestimmung der vergleichenden Pullulanaseausbeuten mit diesen verschiedenen Kohlehydraten als einzige Kohlehydratquelle sollten Produktionskulturmedien unter den in Beispiel 1 angegebenen Produktlonsinkubatlonsbcdlngungen verwendet werden, jedoch mit der Ausnahme, daß ein anderes spezielles einziges Kohlehydralquellenmaterial verwendet wird. Die Fähigkeit zur Pullulanasebildung in Gegenwart von Dextrose als einziger Kohlehydratquelle kann ebenfalls unter Verwendung der in Beispiel 1 angegegebenen Medien und Produktionskultur bestimmt werden. Die Puliulanaseeinheiten pro ml Produktionskulturmedien werden nach dem In Beispiel 1 angegebenen Pullulanasetestverfahren (-bestimmungsverfahren) ermittelt. Die Menge der extrazellulären Pullulanase wird bestimmt auf der Grundlage der Menge der wasserlöslichen Pullulanase in dem Produktionsmedium vor der Freisetzung der locker gebundenen Pullulanase daraus (z. B. vor der Freisetzung mit einem oberflächenaktiven Mittel), wie in Beispiel 1 angegeben. Die oberflächlich gebundene Pullulanase wird nach dem Pullulanasetest durch Extraktion derselben mit einem oberflächenaktiven Mittel wie In Beispiel 1 bestimmt (einschließlich der Einheiten pro ml Produktionsmedium durch erschöpfende Extraktion mit einem oberflächenaktiven Mittel ohne Lysis). Das Verhältnis von extrazellulärer Pullulanase zu oberflächlich gebundener Pullulanase (bezogen auf eine Einheit pro ml Produktionsbrühe) wird ebenfalls nach dem In Beispiel 1

40 beschriebenen Testverfahren bestimmt.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Pullulanase durch Inkubieren eines assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbare Stickstoffquellen enthaltenden wäßrigen Nährmediums mit einem Pullulanase bildenden Mikroorganismus, Inkubieren der Kultur unter aeroben Bedingungen und Gewinnen eines Pullulanasepräparats aus der Kulturbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Klebslella pneumonlae NRRL-B-5780, Klebsieila pneumonlae NRRL-B-5783 und/oder Klebsiella pneumonlae NRRL-B-5784 inkubiert.

2. Verwendung der nach Anspruch I erhaltenen Pullulaiiase zur Stärkehydrolyse.