DE2507787A1 - Verfahren zur herstellung von pullulanase - Google Patents

Description

Decatur» Illinois (United States of America)

T 49761 Verfahren zur Herstellung von Pullulanase

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des cc-1,6-glucosidische Bindungen hy ^:rolysierenden Enzyms Pullulanase.

In den letzten Jahren hat man die potentielle kommerzielle Bedeutung von Enzymen erkannt, die in der Lage sind, oc-1,6-glucosidische Stärkebindungen spezifisch zu hydrolysieren. Die konventionellen Amylasen sind nicht befriedigend wirksam bein Hydrolysieren von 1,6-Stärkebindungen und bilden häufig unerwünschte Stärkehydrolysatnebenprodukte_o Bei Verwendung von oc-1,6-glucosidische Bindungen hydrolysierenden Enzymen (.vie z.B. Pullulanase) in Verbindung mit anderen Amylasen wäre die Umwandlungssirupindustrie in der Lage, ein breiteres Spektrum von Stärkehydrolysaten und Umwandlungssirupprodukten herzustellen und außerdem könnten, wenn Pullulanase bei wirtschaftlich tragbaren Kosten zur Verfugung stünde, Stärkeumwandlung ssirupe mit einer besseren Qualität und einem wesentlich niedrigeren Preis hergestellt werden.

Im allgemeinen wird Pullulanase hergestellt du^ch Inokulieren und Fermentieren eines assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff

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und mineralische Fährstoffe enthaltenden Kulturmediums mit Aerobacter aerogenes unter solchen Bedingungen, die für sein Wachstum förderlich sind. In einigen Verfahren kann die PulIuIanasel)ildung gleichzeitig mit der Zellenvermehrung auftreten. Bei anderen Verfahren tritt die Pullulanasebildung erst spät in der Wachstumsphase auf_o Bei einigen Verfahren wird die Pulliilanasebildung durch Verwendung eines Kulturmediums, das einen Mangel an Saccharidmaterialien aufweist, die für die Pullulanasesynthese als wesentlich angesehen werden, absichtlich unterdrückt. Nach einem ausreichenden Wachstum werden die Zellen dann mit einem Kohlehydrat, wie Maltose, Maltotriose oder Pullulan, zur Pullulanasebildung angeregt.

Als Klasse haben die bisher in der Pullulanasebildungsotufe verwendeten Aerobacter aerogenes-Stämme im allgemeinen die Eigenschaft, verschiedene Mengen an extrazellulärem Enzym, fest gebundenem Enzym und oberflächlich gebundenem Enzym zu bilden, wenn verschiedene Kohlehydratquellenmaterialien verwendet; werden. Das Verhältnis von durch einen Aerobacter aerogenes-Organismus gebildetem extrazellulärem Enzym zu zellgebundenem Enzym wird häufig einfach umgekehrt durch Andern oder Substituieren eines Kohlehydrats durch ein anderes in dem Fermentationsverfahrenο Je nach der Jeweils verwendeten Kohlehydratquelle begünstigt das Fermentationsverfahren normalerweise entweder die extrazelluläre Pullulanasebildung (z.B. mehr als 75 °/°) oder die zellgebundene Pullulanasebildung (z.B. etwa 75 % oder mehr)_o Als Klasse sind diese Aerobacter aerogenes-Organismen nicht in der Lage, Pullulanse zu bilden, wenn Dextrose die einzige Kohlehydratquelle ist.

In "Biochemische Zeitschrift", 554-, 79 - 95 (1961), weisen H. Bender und K. Wallenfels darauf hin, daß Kohlehydrat-Indu- ^ierstoffe wesentlich für die Pullulanasebildung sind» Bei dem darin beschriebenen Verfahren werden etwa 75 bis etwa 80 % der gesamten Pullulanase in fest gebundener, extrazellulärer Form gebildete In "Biochemical & Biophysical Research

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Communications", Band 2.1, Nr. 3, Seiten 254 - 261 (1966), haben Wallenfels et al dann vorgeschlagen, den Organismus in Gegenwart von gleichen Mengen Glucose und Maltose zu züchten. Dabei haben sie gefunden, daß bei diesem Verfahren die Bildung von extrazellulärer Pullulanase bis auf einen Wert von etwa 20 % oder weniger abnimmt. Die restliche Pullulanase ist dabei in der Nähe der Oberfläche des Organismus lokalisiert und kann durch oberflächenaktive Mittel leicht freigesetzt werden.

Nach den Angaben in den US-Patentschriften 3 654 087, 3 654 088 und 3 654 089 können nach einem 2-Stufen-Verfahren bessere Pullulanaseausbeuten erzielt werden. In der ersten Stufe wird das Wachstum von Aerobacter aerogenes durch Kultivieren mit einem nicht-induzierenden Kohlehydrat, wie Dextrose, begünstigt ohne merkliche Pullulanasebildung. Nach einer ausreichenden Zellenvermehrung werden die Zellen dann zur Pullulanasebildung angeregte In der US-Patentschrift 3 654 088 ist angegeben, daß bessere Produktionsstufenausbeuten erhalten werden können, venn man die induzierten Zellen mit Ämylopeccin inkubiert_o Im allgemeinen handelt es sich bei der durch Aerobacter aerogenes in den in den oben genannten US-Patentschriften beschriebenen Verfahren gebildeten Pullulanase in erster Linie um ein zellgebundenes Enzym (z.B. zu 65 bis 75 °/o oder mehr).

In anderen Patentschriften sind andere Mikrobenstämne beschrieben, die in der Lage sind, a-D-1,6-glycosidische Bindungen hydrolysierende Enzyme zu bilden_o In der US-Patentschrift 3 56O 345 ist angegeben, daß jedes beliebige Kohlehydratmaterial mit oc-1,4- oder -1,6-glucosidischen Bindungen eine geeignete Kohlenstoffquelle für die Synthese von extrazellulären Isoamylasen mittels Pseudomonas amyloderamosa ist. In dieser Patentschrift ist die Erzielung von extrazellulären Enzymausbeuten von etwa 180 bis etwa 220 Einheiten pro ml durch

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Inkubieren in Maltose oder lösliche Starke als einzige Kohlehydratquelle enthaltenden Kulturmedien beschrieben, wobei die Pullulanaseausbeuten bei einem aus Maltose, Ammoniumsalzen und Sojabohnenhydrolysaten bestehenden Medium (mit bis zu 130 Einheiten/ml) größer sind als in solchen, in denen ein Stärkehydrolysat verwendet wirdo In der US-Patentschrift 3 622 4-60 sind maximale Ausbeuten von etwa 125 oc-1,6-Glucosidase-Einheiten pro ml bei Verwendung von Stärkehydrolysate (mit einem Dextroseäquivalent (D.E.) von 2 bis 15 %) und Sojabohnenhydrolysate enthaltenden Kulturmedien und bei Verwendung von Escherichia intermedia beschrieben (die darin beschriebenen "Einheiten" wurden mittels eines Jodtests bestimmt, der höhere Einheiten-Werte liefert als das zur Bestimmung der "Einheiten" erfindungsgemäß angewendete Testverfahren). In der kanadischen Patentschrift 901 503 werden Stärkehydrolysate mit einem Dextroseäquivalent (D.E.) von 5 bis 4-0 verwendet, um die Pullulanasebildung zu erleichtern.

Man ist daher seit langem auf der Suche nach einem Verfahren, mit dessen Hilfe es möglich ist, hohe Ausbeuten an Pullulanase in einer leicht abtrennbaren und verwendbaren Form zu erzielen. Einige Verfahren liefern nämlich verhältnismäßig hohe Ausbeuten an Pullulanase in einer für die Gewinnung ungeeigneten Form, während andere Verfahren eine leicht gewinnbare Pullulanase in niedrigen Ausbeuten liefern» Obgleich, ein kommerzieller Bedarf für Pullulanase mit einem Preis, der seine Verwendung in Stärkeumwandlungsprozessen wirtschaftlich rechtfertigen würde, besteht, kann Pullulanase bisher weder zu einem Preis noch in einer Menge hergestellt werden, wie sie für die Stärkesirupindustrie erforderlich wären_e Trotz dieses bestehenden Bedürfnisses war es bisher nicht möglich, einen Organismus zu finden und zu züchten, der in der Lage ist, hohe Ausbeuten an Pullulanase unter solchen Verfahrensbedingungen zu liefern, bei denen die Pullulanase leicht und wirtschaftlich in einer für die kommerzielle Verwendung geeigneten Form ab-

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getrennt werden kann_o

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Pullulanaseausbeuten zu erhöhen und innerhalb eines verhältnismäßig kurzen Zeitraumes hohe Pullulanaseausbeuten zu erzielen. Ziel der Erfindung ist es ferner, ein Verfahren anzugeben, nach dem mikrobiell hergestellte Pullulanase leicht und wirtschaftlich von einem Produktionskulturmedium abgetrennt werden kann. Ziel der Erfindung ist es schließlich, Pullulanase bildende Mutanten mit überlegenen Pullulanasebildungseigenschaften zu verwenden und ein Produktionskulturmedium anzugeben, das in Kombination mit Pullulanase bildenden Mutanten wesentlich bessere Pullulanaseausbeuten ergibt„

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Pullulanase durch Inokulieren eines assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbare Stickstoffquellen enthaltenden wäßrigen Nährmediums mit einem aeroben, Pullulanase bildenden mikrobiellen Organismus unter Bildung einer Kultur desselben, inkubieren der Kultur unter Bedingungen, die für die Bildung von Pullulanase förderlich sind, und anschließende Gewinnung eines Pullulanasepräparats mit einer größeren Potenz als die inkubierte Kultur, wobei der mikrobielle Organismus dadurch charakterisiert ist, daß er

a) mindestens dreimal mehr Pullulanase bildet, wenn als einzige Kohlehydratquelle Amylopectin mit einem D.E. von weniger als 2,0 verwendet wird, als in einem Nährmedium, in dem das Hauptkohlehydrat (bezogen auf eine äquivalente Kohlehydratgewichtsbasis) eine Kohlehydratquelle aus der Gruppe Maltose, Dextrose, Lactose und Pullulan ist;

b) Pullulanase in einem Verhältnis von extrazellulärer Pullulanase zu oberflächlich gebundener Zellenpullulanase zwischen 2 : 3 und weniger als 7 : 3 bildet, wenn die Mutante

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in einem Nährmedium gezüchtet wird, das Amylopectin als einzige Kohlehydratquelle enthält; und

c) Pullulanase in einem Nährmedium bildet, das als einzige Kohlehydratquelle Dextrose enthält, und worin der Pullulanase bildende Organismus für einen solchen Zeitraum in einem Nährmedium inkubiert wird, der ausreicht, um ein Produktionskulturmedium zu erzeugen, das pro ml Produktionskulturmedium mindestens 350 Einheiten Pullulanase enthält, wobei das Produktionskulturmedium ein Verhältnis von extrazellulärer Pullulanase zu oberflächlich gebundener Pullulanase aufweist, das zwischen 2 : 3 und weniger als 7 : 3 liegt.

Im Vergleich zu den Pullulanase bildenden Organismen des Typs, wie er ursprünglich von Wallenfels et al beschrieben worden ist (der hier verwendete Ausdruck "Aerobacter aerogenes*wurde bisher stets zum Identifizieren des Pullulanase bildenden Organismus des von Wallenfels et al beschriebenen Typs verwendet (möglicherweise wegen seiner ursprünglichen Charakterisierung, daß er sich "wie Aerobacter verhält"), obgleich ihn neuere Klassifikationen als Organismus des Genus Klebsiella (Klebsiella pneumonia) bezeichnen), weisen die erfindungsgemäßen Organismen atypische Stoffwechseleigenschaften auf. Diese Stoffwechselunterschiede (metabolischen Unterschiede) können dadurch gezeigt werden, daß man in einem wäßrigen Nährmedium, das (bezogen auf Trockenfeststoffe) aus 2 % Bactopepton, 0,5 % Ammoniumacetat, 0,05 % Natriumeitrat, 0,10 % Kaliummonohydrogenorthophosphat (KpHPO^.), 0,1 % Kaliumdihydrogenorthophosphat (KH₂PO₄), 0,05 % Magnesiumsulfat (Epsomsalz), 0,05 % Kaliumchlorid, 0,001 % Eisen(II)sulfat (Melanterit) und Wasser besteht, verschiedene Kohlehydratquellenmaterialien verwendet.

Im allgemeinen ist die Zellenvermehrung (Zellenfortpflanzung) durch die erfindungsgemäßen Mutanten für Kohlehydratquellen-

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materialien, wie Pullulan, Lactose, Dextrose, Maltose, Mai s s tarkehydr ο lys ate mit einem D.E.-Wert von 5 "bis 25, gelatinierte Stärke und gelatiniertes Amylopectin,etwa äquivalent. Der durch die Mutanten gebildete Pullulanase-Typ wird jedoch definitiv durch das jeweilige Kohlehydratquellenmaterial in dem Kulturmedium beeinflußt. Dextrose als einziger Kohlehydratnährstoff unterdrückt die Bildung von extrazellulärem Enzym (beispielsweise um. etwa 30 %) durch die Mutante. Andere Kohlehydrate, wie Lactose, Maltose, Maltotriose, Pullulan, Gelbzahn-Maisstärkehydrolysate, assimilierbare hohe Amylosestärken, als einzige Kohlehydratnährstoffquelle führen zur Bildung von etwa äquivalenten Mengen an extrazellulärer Pullulanase und oberflächlich gebundener Pullulanase (bezogen auf eine Einheit).

7/enn Dextrose als einzige Saccharidquelle verwendet wird, bildet Aerobacter aerogenes ATCG I5O5O keine Pullulanase. Im Gegensatz dazu bilden die erfindungsgemäßen Mutanten in einem Kulturmedium, das Dextrose als- einzige Kohlehydratquelle enthält^extrazelluläres Enzym (etwa 10 Pullulanase-Einheiten pro ml oder mehr, von denen etwa JO % extrazelluläre Pullulanase sind)_o In dem oben erwähnten wäßrigen Nährmedium mit Lactose als ausschließlicher Kohlehydratquelle bilden die erfindungsgemäßen Mutanten mehr als achtmal mehr Pullulanase als Aerobacter aerogenes ATGG I5O5O. Kohlehydrat-Induktionsmittel, wie Maltose, Maltotriose und Pullulan (die von vielen als wesentlich für die Pullulanasebildung bezeichnet werden), unterdrücken die Pullulanasebildung der Mutanten.

Obgleich die Mutanten in der Lage sind, in Gegenwart von fermentierbaren Stärkehydrolysaten Pullulanase zu bilden, werden durch verzweigte Stärkefraktionen mit einem höheren Molekulargewicht (z.B. Amylopectin) die Pullulanaseausbeuten verbesserte Wie in der Tabelle I des weiter unten folgenden Beispiels 2 angegeben, wird durch gelatiniertes, im wesentli-

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chen nicht-hydrolysiertes Amylopectin (als einzige JCohleaydratquelie) die Pullulanasebildung lurcL die Mutanten cptiiiiier"Co la 7ergleich dazu verringert eine gelatinierte Maisstärke die Puiluisrasebilaungsausceuten, "jährend die Stärkehydrolysate davon ^3,3* eine Maisstärke mit 12 D.E„) das Pulliilanasebildungsvermögen der Mutanten noch weiter hemmen«, I'armentierbare Zucker (während der Fullulsmsebiidungsstufe) unterdrücken das -rullulanasebildungsvermögen der Mutanten,

Eine weitere hervorstechende Eigenschaft dar üutanten ist das ^T~3rh.ält^is ve·" -yrbr-aE-elluls^sr- Pil ","lan» se su lose gebundsner ^illulanase.- wia sis dnroü die Mutant3 gebildet werden, Wenn Amylopectin in ce:? cts'?, ;i*s2i£.:inte23. G-nindkultto? "rer^fendet ^:"ird« bildet A-^rcbacte:? -^3I=CgSIiSS 3i:is 'Virnältiiismäßig geringe Menge an extrazellulären! Ensys. :.:nd sine große Menge an zellengebundener Pullulaj^ase , Umgekehrt führt die Inkubation der Pullulanasemutanten mit Amylopectin im allgemeinen zur Bildung eines PuliuianaseeinheitSTerhältnissas τοπ si-ctrazellulärer Pullulanase su lose sefcundsner ?ulliils.2zase von saeb.r als 2 ι bis weniger als 7 : 3 (in ier Hegel "/eniger als 2 ; 1) bei einer wesentlich geringeren Ilenge an fest an die Zelle gebundener Puliulanase (z.B. weniger als 20 % der Gesamtmenge der gebildeten Puliulanase liegen in der an die Zelle gebundenen Form vor).

Wegen des hohen Mengenanteils der Pulliilanasebildung in der extrazellulären und oberflächslich gebundenen Form ist die leichte und verhältnismäßig billige Verarbeitung, die bei der Gev/innung der hohen Puilulanaseausbeutsn in einer kommerziell brauchbaren Form auftritt, ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens„ Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Menge an intrazellulärer oder intern gebundener Puliulanase (bei der für die Abtrennung normalerweise die Zelle zerstört werden muß) auf

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ale et^a ΎΖ % (vorzugsweise weniger als etwa 5 %)

er ale et^
der Gesamtmenge der gebildeten Pullulanase miiiiaalisiert

werden. Während der isnz:ymbildungsstu£"e wird ein anteil an Pullulanase durch die ivlucar.ts iti de;: -.

hoher Mengen-

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Kulturmeaiumsphase in i^?or*:u eines wasserlöslicher:, ünsyms gebildet, G-eiaäß eines speziellen Aspekt dar Erfindung sind eis erfindungsgemäßen Mutanten dadurch charakterisiert, daß sis ein Einheitsverhältnis von extrazellulärer Pullulanase sti oberflächlich gebundenem Enzym zwischen etwa 3 : ¹^ und etv/a 2 : 1 (vorzugsweise von etwa. 1 ; 1 bis etwa 3 ' 2) bilden^ wenn als einzige Kohlehydratqueile in dem oben erwähnten wäßrigen Nährkulturmedium ein Kohlehydratquellenmaterial (in einer Menge von 2 %, bezogen auf die Trockenfeststoffe) verwendet wird, das ausgewählt wird aus gelatiniertem Amylopectin, gelatinierter Maisstärke, Maltose, Lactose, Pullulan und Maltodextrin.

Wenn die erfindungsgemäßen Mutanten in dem oben genannten wäßrigen Nährmedium inkubiert werden, sind sie praktisch frei von schleimigen Polysaccharidmaterialieno Ein übermäßig stark in der Zelle gebildetes schleimiges Polysaccharid beeinflußt die Ausbeute der abtrennbaren Pullulanase nachteilig. In den Bildungs- und Abtrennungsstufen erleichtert die Abwesenheit dieses schleimigen Materials die Übertragung und Dispersion der Pullulanase in der wäßrigen Phase des Produktionskulturmediums. Nach Beendigung der Pullulanasebildungsstufe wird die oberflächlich gebundene Pullulanase nicht aufgenommen in oder eingeschlossen durch das in der Zelle gebildete schleimige Material. Diese oberflächlich gebundene, zellgebundene Pullulanase kann leicht in eine lösliche Form überführt und mit Detergentien daraus freigesetzt werden«,

Der erfindungsgemäß verwendete Organismus hat die Fähigkeit, mehr als 350 Einheiten Pullulanase pro ml Produktionsmedium (auf Basis einer kommerziellen Produktion) zu bilden. Ein spezieller Verfahrensvorteil, der diesen Organismen eigen ist,

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liegt in den Eigenschaften der Pullulanase_s welche diese Organismen bilden_c Die Fähigkeit der Organismen., Pullulanase im wesentlichen in der extrazellulären und in der oberflächlich gebundenen Form zu bilden, erleichtert die Abtrennung von mindestens 80 % der GesamtpuUulanase in dem EndproduktionsBiediumo In einem Produktionskulturmedium, das im wesentlichen aus Amylopectin als Kohlehydratquelle besteht, können Ausbeuten an oberflächlich gebundener Pullulanase und extrazellulärer Pullulanase von mindestens 500 Einheiten/ml erzielt v/erden. Das erfindungsgemäße Verfahren wird zweckmäßig in einem Nährkulturmedium unter Inkubationsbedingungen durchgeführt, so daß die Pullulanaseausbeuten mehr als 750 Einheiten pro ml Kulturmedium betragen und mehr als 85 % (beispielsweise etwa 85 bis etwa 95 % oder mehr) der Gesamtmenge der dadurch gebildeten Pullulanase in der extrazellulären und in der oberflächlich gebundenen Form vorliegen,, Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung liegen mehr als 90 % der gesamten Pullulanaseproduktion in diesen beiden Formen vor.

Die Fähigkeit der Mutanten zur Bildung von Pullulanase wird in Gegenwart eines Produktionskulturmediums beträchtlich verbessert, das Amylopectin als Hauptkohlehydratquellenmaterial (bezogen auf das Gewicht der Trockenfeststoffe) enthalte Ein Produktionskulturmedium, das Amylose als Hauptkohiehydrat (bezogen auf das Gewicht) enthält, unterdrückt nicht vollständig die Pullulanasebildung, aber die Pullulanaseausbeuten sind wesentlich geringer als diejenigen bei einem höheren Gehalt an Amylopectin.

Als Amylopectinquelle können die verschiedensten Stärkesorten verwendet werden. Zu beispielhaften Stärkesorten gehören solche mit einem verhältnismäßig hohen Amylopectingehalt (von beispielsweise mehr als 70 %)· Diese Stärkesorten weisen in der Regel eine Gelatinierungstemperatur von weniger als etwa 80⁰G auf. Zu Beispielen für Amylopectin enthaltenden Stärkesorten gehören Knollen- und V/urzelstärken (z.B. von

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Zartoffel, 'lapioka, Canna. Pfeilwurz und Süßkartoffel (Batate)), die G-etreidestärken (z.B. von Mais, Sorghum, 7/eizen, Reis, wachsartigem Mais, wachs artigem Reis und wachsartigem Sorghum), Mischungen davon und dgl. Stärken, die im wesentlichen aus Amylopectin bestehen (z.B. solche mit einem Amylosegehalt von weniger als 10 % und mehr als 90 % Amylopectin)j wie wachsartiger Mais, wachsartiges Korn, v/achsartiger Sorghum, wachsartiger Reis, wachsartige Gerste, Mischungen davon und dgl», stellen besonders" wirksame Kohlehydrate für die Optimierung der Pullulanasebildung dar.

7/ie in den konventionellen Pullulanaseverfahren werden zur Herstellung des Kulturmediums assimilierbare Kohlehydrate verwendete Als assimilierbare Kohlehydratquelle können gelatinierte Stärke und/oder teilweise hydrolysierte Stärke (z.Bo mit einer 3är_re oder einem Enzym dünn gemachte Stärken) in einer Menge verwendet werden, die ausreicht, um die TJmv/anilung der Stärkequelle durch die Mutanten bei gleichzeitiger Pullulanasebildung zu ermöglichen. Stärkehydrolysate mit einer merklichen Menge an fermentierbaren Zuckern unterdrücken die Puilulanasebildung durch die Mutanten» So nimmt vergleichsweise die Pullulanasebildung ab, wenn der S.E.Wert des Stärkehydrolysats zunimmt. Stärkehydrolysate mit einem D.E.-Wert von mehr als 30 °/° unterdrücken beachtlich die Pullulanasebildung im Vergleich zu solchen mit einem D.E.Wert von weniger als 20 % oder weniger als 10 %. Verbesserte Pullulanaseausbeuten werden entweder mit nicht-verdünntem Amylopectin oder mit partiellen Stärkehydrolysate!! mit einem D.E.-7/ert von weniger als 5,0 % erzielt, wobei mit einem angezeigten Amylopectinsubstrat mit einem D.E.-Wert von weniger als etwa 2,0 % optimale Ausbeuten erzielt werden·

Das Produktionskulturmedium sollte eine ausreichende Menge an Kohlehydratquellenmaterialien enthalten, um den Mutanten die weitere Vermehrung und die Bildung von Pullulanase darin zu ermöglichen·. Im allgemeinen wird die Pullulanaseherstellung

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in Gegenwart von Amylopectin in einer Menge durchgeführt, die ausreicht 5 um die oben erwähnten Pullulanaseausbeuten zu erzielen«. Allgemein kann die Menge des Kohlehydratmaterials innerhalb des Bereiches von 1 bis 10 Gewichtsteilen Kohlehydrat auf jeweils 100 Gewichtsteile Wasser in dem Produktionskulturmedium liegen» Amylopectin"in einer Menge von mindestens 1 bis 6 Gewichtsteilen erhöht sowohl die Geschwindigkeit als auch die Menge der durch die Mutanten gebildeten Pullulanase. Das Produktionskulturmedium weist zweckmäßig ein Gewichtsverhältnis τοπ .Amylopectin- zulTicht-Amylopectin-Eohlehydratquellenmaterial von mindestens 7 : 3» vorzugsweise von nicht mehr als 9 ' 1 auf ο Ein Produktionskulturmedium, das im wesentlichen frei von anderen Kohlehydraten ist und 2 bis 4 Gsw_a-2sils Amylopectin auf jeweils 100 Gew.-Teile Wasser enthält,. liefert außergewöhnlich hohe Pullulanaseausbeuteno

Bei der Herstellung von Pullulanase ist es üblich, eine Impfkultur oder ein Inokulum au verwenden, um lebensfähige Organismen für das Pullulanase-Produktionskulturmedium zu erzielen. In der kommerziellen Praxis enthält die Impfkultur eine hohe Zellpopulation, die zum Inokulieren des Produktionskulturmediums verwendet wird_o Je nach dem jeweils angewendeten Verfahren zur Herstellung der Imüfkultur kann die Pullulanasebildung bei der Entwicklung dieser Impfkultur unterdrückt oder begünstigt werden«, Erfindungsgemäß kann die Impfkultur mit den verschiedensten Kohlehydraten kultiviert werden, die für die Vermehrung (Fortpflanzung) des Organismus förderlich sind, ungeachtet der Tatsache, ob das Kohlehydrat die Pallulanasebildung hemmt oder förderte

Das Produktionskulturmedium kann unter Anwendung konventioneller Impfkulturmethoden mit lebensfähigen Mutanten inokuliert werden. Das Impfkulturmedium selbst oder die durch Fortpflanzung daraus entstandenen Mutanten können zum Inokulieren des

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Produktionskulturmediums verwendet werden. Bei Verwendung von Amylopectin als Kohlehydratquelle für die Impfkultur kann dieses direkt als Inokulum verwendet werden, ohne daß dadurch das Gesamtkohlehydratgleichgewicht des Pullulanasebildungskulturmediums nachteilig beeinflußt wird.

In dem Produktionskulturmedium sollte ein assimilierbares Stickstoffquellenmaterial in einer Menge vorhanden sein, die ausreicht, um die Bildung von Pullulanase durch die Mutanten zu ermöglichen. Das S^ickstoffquellenmaterial kann vor dem Inokulieren eingeführt werden oder es kann -portionsweise während der Vermehrung (Fortpflanzung) und während des Pullulanasebildungscyclus zugegeben werden. Während der anfänglichen Produktionsstufen wird die Stickstoffquelle hauptsächlich für das Zellenwachstum verwendet. Während der späteren Inkubationsstufen wird die Stickstoffquelle hauptsächlich für die Bildung von Pullulanase verwendet. Die Menge des Stickstoffquellenmater-ials kann beträchtlich variieren, in der Regel liegt! jedoch innerhalb des Bereiches von 2 bis 15 Gew.-Teilen, bezogen auf Trockenfeststoffe , auf jeweils 100 Gew.-Teile des Wassers des Produktionskulturmediumsο

Als assimilierbares Stickstoffquellenmaterial können in dem erfindungsgemäßen Verfahren organische, Stickstoff enthaltende Zusammensetzungen verwendet werden. Typische organische Stickstoff quellen vom wasserlöslichen Typ sind Harnstoff, Pepton, Fleisch, Hefeextrakte, Maisquellwasser, Caseinhydrolysate, Fischmehl, Pflanzenhydrolysate (z.B. Weizen, Kleie, Reis, Korn, Protein), Aminosäuren (z.B. Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin), Mischungen davon und dgl.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Maisquellwasser als assimilierbare, organische Stickstoffquelle verwendet. Jedoch hemmt eine übermäßige oder unzureichende Menge des als einzige organische Stickstoffquelle verwendeten Maisquellwassers die Pullulanasebildung. So unterdrückt bei-

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spielsweise ein Produktionskulturmedium, das mehr als 6 Gew.-Teile Maisquellwasser (bezogen auf Trockenfeststoffe (d.s.b.) enthält, die Pullulanasebildung_e Wenn weniger als etwa 2 Gew.-Teile Maisquellwasser (bezogen auf Trockenfeststoffe) ausschließlich als assimilierbare organische Stickstoffquellen verwendet werden, enthält das Kulturmedium im allgemeinen genügend Stickstoff, um das Zellenwachstum aufrechtzuerhalten, jedoch wird die Pullulanasebildung dadurch wesentlich beeinträchtigt. Wenn es erwünscht ist, als ausschließliche Stickstoffquelle Maisquellwasser zu verwenden, werden normalerweise hohe Pullulanaseausbeuten erzielt, wenn die Menge der vorhandenen Trockenfeststoffe des Maisquellwassers 2 bis 5 Gew.-Teile auf 100 Gew.-Teile des Produktionskulturmediumwassers beträgt_o Bei etwa 4- Gew.-Teilen Maisquellwasser, bezogen auf Trockenfeststoffe, werden optimale Pullulanasebildungsergebnisse erzielte

Die Kombination aus einer assimilierbaren anorganischen Stickstoffquelle und einer assimilierbaren organischen Stickstoff quelle in dem Produktionskulturmedium erhöht, wie gefunden wurde, weiter die Gesamtproduktion von Pullulanase durch die Mutanten· Üblicherweise können wasserlösliche Stickstoffquellen als anorganische Stickstoffergänzung verwendet werden. Es können Ammoniak, Ammoniumsalze (z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat, Ammoniumsulfat ,. Ammoniumphosphat), die Alkalimetallnitrate (z.B. natriumnitrat), Mischungen davon und andere ähnliche wasserlösliche Salze als beispielhafte ergänzende anorganische Stickstoffquellenmaterialien verwendet werden.

Das überwiegende Stickstoffquellenmaterial (bezogen ajif das Gewicht) in dem Produktionskulturmedium ist normalerweise ein organisches Stickstoffquellenmaterial. Die Gewichtsverhältnisse von.organischen Stickstoffquellenmaterialien zu anorganischen Stickstoffquellenmaterialien liegen in der Regel innerhalb des Bereiches von weniger als 1 : 1 bis zu etwa 15:1

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oder höher_o Verbesserte Pullulanaseausbeuten werden erzielt bei einem Gewichtsverhältnis von organischem Stickstoff zu anorganischem Stickstoff von 3 : 1 bis weniger als 10 : 1, vorzugsweise von 4- ; 1 bis 6 t 1

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Im allgemeinen kann die Menge der wasserlöslichen Stickstoffsalze innerhalb des Bereiches von 0,25 bis 2 Gew.-Teilen pro 100 Gew.-Teilen Wasser des Produktionskulturmediums liegen. Die assimilierbaren Ammoniumsalze sind besonders gut geeignet als anorganisches Stickstoffquellenmaterial. Bevorzugte anorganische Stickstoffquellen für die Optimierung der Pullulanaseausbeuten sind Ammoniumacetat- und Ämmoniumsulfat. Die Gesamtmenge der durch die Mutanten gebildeten Pullulanase bleibt verhältnismäßig konstant über 1 Gew»-% des Wertes der anorganischen Stickstoffquelle» Die wasserlöslichen Stickstoff enthaltenden Salze sind in einer Menge von 0_}5 bis 1 Gew.-Teilen (vorzugsweise von etwa 0,75 Gew.-Teilen) besonders wirksam in bezug auf die Erhöhung sowohl der Produktionsgeschwindigkeit als auch der Ausbeuten,

Spurenmengen von Eisen, wie sie üblicherweise in Kulturmedien verwendet werden, um die Zellenfortpflanzung aufrechtzuerhalten, sind im allgemeinen weniger wirksam als solche, denen eine geringe Menge eines Überschusses von assimilierbarem Eisen zugesetzt worden sind. Zur Optimierung der Pullulanasebildung ist es daher wichtig, daß mindestens während der Pullulanasebildungsstufe des Verfahrens das Produktionskulturmedium an einer wirksamen Menge eines assimilierbaren Eisens angereichert wird, die ausreicht, um einen meßbaren Effekt auf die Pullulanasebildung zu haben.

Die zur Erzielung der maximalen Pullulanasebildung durch die Mutanten des Genus Klebsiella erforderliche Menge an zugesetztem (ergänzendem) Eisen hängt teilweise von dem jeweiligen Mutantenstamm abo Klebsiella pneumoniae IiRRL B-5783 eignet sich in Abwesenheit von zugesetztem (ergänzendem) Eisen nicht für die

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wirksame Bildung von Pullulanase. Obgleich Klebsieila pneumoniae NRHL B-5780 und Klebsiella pneumoniae NKRL B-5784- eine beträchtliche Menge Pullulanase in Abwesenheit von ergänzendem Eisen bilden, liegen diese Ausbeuten beträchtlich unterhalb ihres Optimums, Der Einfluß von assimilierbarem Eisen auf die Produktionskapazität dieser Mutanten wird in den weiter unten folgenden Beispielen näher erläutert.

Das Eisen(II)ionen (z.B. Eisen(ll)sulfat) als Eisenquelle enthaltende Produktionskulturmedium verbessert die Pullulanaseausbeuten gegenüber denjenigen,, die nur Eiserx(III)ionen (z.B. Eisen(IIl)chlorid) enthaltene Das erforderliche assimilierbare Eisen kann aus den verschiedensten konventionellen Quellen stammen» Beispiels für geeignete Eisen(II)-Verbindungen sind die Eisen(II)salze von Acetat-, Garbonat-, öitrat-, Lactat-, Hitrat-, Sulfat-, Sulfit- und T'hiosulfatanionen, Mischungen davon und dgl. Andere Materialien» die von Natur aus Spurenmengen an Eisenionen enthalten, wie 3,B_O Maisquellwasser,und an Eisen(II)- oder Eisen(III)-Verbindungen reiches Leitungswasser können ebenfalls als Eisenquelle verwendet werden. Ein Produktionskulturmedium, das mehr als 1,0, zweckmäßigerweise mehr als 2,0, z.B. vorzugsweise etwa 3₅O bis etwa 5»0 mg Eisen-(II)ionen pro Liter Produktionskulturmedium enthält, verbessert die Gesamtpullulanaseproduktion,

Während der Pullulanasebildungsstufe sollte das Kulturmedium bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8 gehalten v/erden. Etwas oberhalb pH 8,0 hört die Pullulanasebildung auf und unterhalb pH 7,2 wird sie gehemmt. Während der Anfangsstufen der Bildung bleibt der pH-Wert im allgemeinen verhältnismäßig konstant, während der späteren Stufen steigt er jedoch mit einer hohen Geschwindigkeit beträchtlich an. Um das Produktionskulturmedium auf seinem optimalen Bildungs-pH-Wert zu halten, sollten Puffer oder eine neutralisierende Säure in einer zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes auf einem Wert zwischen etwa 7j5 bis weniger als etwa 8,0 ausreichenden Menge verwendet werden, insbesondere

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während des letzten Teils der Inkubation_o Konventionelle neutralisierende Säuren, wie Schwefelsäure, Citronensäure, Chlorwasserstoffsäure, Milchsäure, Salpetersäure, Kohlensäure, Essigsäure und Phosphorsäure, können verwendet werden, um den pH-Wert auf eine geeignete Höhe einzustellen und ihn dabei zu halten.

Die Mutanten "vermehren sich innerhalb eines verhältnismäßig breiten Temperaturbereiches ohne einen merklichen Unterschied in bezug auf die Wachstumsgeschwindigkeit (W_achstumsrate). Während der Anfangsstufen der Pullulanasebildung enthält das Produktionskulturmedium normalerweise nicht mehr als Spurenmengen an Pullulanase. Die Mutanten vermehren sich etwa mit einer äquivalenten Geschwindigkeit über den Bereich von 20 bis 40 C. Eine optimale Pullulanasebildung ist jedoch temperaturabhängig. Bei Temperaturen unterhalb 25°C oder oberhalb 35°C ist die Pullulanasebildung beeinträchtigte Wegen dieser Temperaturabhängigkeit ist es zv/eckmäßig (mindestens während der letzten Stufen der Bildung), die Temperatur der Kultur innerhalb dieses engen Bereiches zu halten. Optimale Pullulanaseausbeuten werden erzielt, wenn das ProduVtionskialturmedium bei etwa 28 C gehalten wird. Es ist gedoch bevorzugt, die optimale Temperatur sowohl für die Vermehrung als auch für die Pullulanasebildungsstufen zu verwenden.

Ein tjrpisches Pullulanaseverfahren, in dem verschiedene Aerobacter aerogenes-Stämrae (z.B. ATCC I5O5O und ATCC 8724) verwendet werden, benötigt normalerweise mehr als 35 Stunden zur Erzielung optimaler Ausbeuten. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können optimale Pullulanaseausbeuten (mehr als 75O Einheiten/ml) leicht innerhalb eines wesentlich kürzeren Zeitraums erzielt werden. Der mit der Inokulation mit einer Klebsiella-Impfkultur beginnende gesamte Produktionseyelus bis zu seinem Ende kann auf etwa 20 bis etwa 25 Stunden verkürzt werden.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren können gewünschtenfalls auch

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andere Fährstoffe, Mineralien, Salze und andere Fermentationshilfsmittel (wie sie z.B. üblicherweise in anderen Pullulanasebildungsverfahren angewendet werden) in dem Produktionskulturmedium verwendet werden,, Wie andere Pullulanase bildende Organismen benötigen auch die erfindungsgemäß verwendeten Klebsiella-Organismen naszierenden Sauerstoff für die Pullulanasebildung. Für diesen Zweck können konventionelle Fermentations-, Rühr- und Belüftungseinrichtungen zur Einführung von naszierendem Sauerstoff in ähnliche Organismen vom aeroben Typ verwendet werden. Nach Beendigung der Pullulanasebildungsfermentation kann die Pullulanase auf die verschiedenste Weise abgetrennt werden. Da die erfindungsgemäß verwendeten Klebsiella-Organismen ein Produktionsbier (production beer) in einer hohen Ausbeute mit einem hohen Prozentsatz an darin enthaltener extrazellulärer Pullulanase und sehr locker gebundener Pullulanase bilden, ist eine nominelle zusätzliche Verarbeitung erforderlich, um die Pullulanase in eine kommerziell brauchbare Form zu überführen·

Pullulanaseausbeuten von mehr als 85 % der gesamten Pullulanasebildung können leicht abgetrennt werden durch Behandeln des Produktionskulturmediums mit einem oberflächenaktiven Mittel» Die anfängliche Behandlung mit dem oberflächenaktiven Mittel überführt den größten Teil des oberflächlich gebundenen Enzyms in eine wasserlösliche Form und erleichtert die Abtrennung desselben zusammen mit der darin enthaltenen extrazellulären Pullulanase. Die durch das oberflächenaktive Mittel freigesetzte Pullulanase und das darin enthaltene extrazelluläre Enzym können eingeengt (z.B. durch Trocknen im Vakuum bei einer verhältnismäßig tiefen Temperatur oder durch Ultrafiltrieren) und kommerziell verwendet werden. Flüssige Pullulanasekonzentrate mit einer Pullulanasekonzentration von mehr als 2000, vorzugsweise mehr als etwa 3000 Einheiten pro ml können auf diese Weise leicht hergestellt werden, wobei das Produktionsferment als flüssiger Träger fungierte Gewünschtenfalls können Zellenbruchstücke und unlösliche Bestandteile von

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der Fermentationsbrühe abgetrennt werden. Alternativ kann das Produktionsmedium nacheinander (1) mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelt werden, um das oberflächlich gebundene Enzym freizusetzen, (2) es können die unlöslichen Bestandteile davon abgetrennt werden, (3) die Pullulanase kann mit üblichen Zusätzen aus der flüssigen Phase ausgefällt werden und (4) die Pullulanase kann getrocknet werden. Wenn eine vollständigere Abtrennung (Gewinnung) der Pullulanase gewünscht ist, kann der zelluläre Rückstand wiederholt mit oberflächenaktiven Mitteln behandelt oder alternativ einer Lysis unterworfen werden. Durch diese Klebsiella-Organismen wird nur wenig, falls überhaupt, intrazelluläre Pullulanase gebildet„

Das oberflächlich gebundene Enzym wird durch konventionelle Zusätze und Methoden zur Freisetzung der locker gebundenen mikrobiellen Enzyme leicht in eine wasserlösliche Form überführte Kommerziell ist es vorteilhaft, die oberflächlich gebundene Pullulanase ohne Lysis freizusetzen. Es können konventionelle oberflächenaktive Mittel (z.B. Katriumlaurylsulfat und Triton X-1OO (ein Alkyiphenoxypolyäthoxyäthanol)) in einer Menge verwendet werden, die ausreicht, um das oberflächlich gebundene Enzym,ohne daß eine wesentliche zelluläre Lysis desselben auftritt, auf wirksame Weise freizusetzen. Ein konventionelles, Pullulanase freisetzendes, nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel in einer Menge, die ausreicht, um ein Produktionskulturmedium zu liefern, das 0,1 bis 0,5 VoI«-% enthält, unter Rühren desselben für einen Zeitraum von etwa 5 bis etwa 20 Stunden eignet sich für die Freisetzung von oberflächlich gebundenem Enzym, Eine längere Behandlung mit dem oberflächenaktiven Mittel bei höheren Konzentrationen (beispielsweise 25 Stunden lang oder mehr bei 0,5 %) kann, zu einer Lysis desselben führen·,

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein«

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Beispiel 1

Unter Verwendung von Klebsiella pneumoniae KRRL B-578O als Pullulanase bildendem Organismus wurde eine Produktionskultur hergestellt, die pro ml der Kulturmediumsbrühe 790 Einheiten Pullulanase bildete«

Es wurde ein Inokulum-Nährmedium hergestellt, das bestand aus (bezogen auf das Gewicht) 2,0 % wachsartiger Maisstärke fSTA-TAPE 110, eine körnige wachsartige Maisstärke (100 % Amylopectin) mit einer mittleren Brookfield-Viskosität von etwa 2000 cP (Spindel Nr. 3, 20 UpM bei 66⁰C (15O⁰F) und einem Trockenfeststoff gehalt von 4-0 bis 4-5 %) und einem D.E₀ von weniger als 1 %, die mit Säure verdünnt war, ein Produkt der Firma A.E. Staley Manufacturing Go₀J, 2,0 % Bacto-Peptone (einem Pepton-Präparat der Firma Difco Laboratories, Detroit, Michigan/USA), 0,5 % Ammoniumacetat, 0,05 % Natriumcitrat (Na₃G₅H₅O₇c2H₂O), 0,1 % K₂HPO₄, 0,1 % KH₂PO₄, 0,05 % MgSO₄ο7H₂O, 0,05 % KGl, 0,001 % FeSO₄.6H₅O und Wasser. Dieses Medium wurde hergestellt, indem man nacheinander das Natriumcitrat, die anderen Mineralsalze, das Pepton und schließlich die wachsartige Maisstärke zusetzte„ Die dabei erhaltene Mischung wurde dann unter Rühren auf einem Wasserdampfbad erhitzt zur Herstellung eines homogenen Kulturmediums, das eine gründlich eingeteigte wachsartige Maisstärke enthielt. Zu jedem von fünf 500 ml-DeLong-Kolben mit einem Leitblech am Boden wurden 100 ml des Inokulum-Mediums und 1 Tropfen eines Antischaummittels (Hodag M-8) zugegeben und dann wurde 15 Minuten lang bei 121⁰G sterilisierte Die sterilisierten Inokuli wurden mit Klebsiella pneumoniae NERL B-5780 (Schrägagar) inokuliert und 16 Stunden lang bei 28°G und 265 UpM auf einem New Brunswick-Rotationsschüttler inkubiert zur Herstellung des Impfinokulums für das Produktionskulturmedium.

Es wurde ein Pullanasebildungs-Nährmedium hergestellt durch (1) Auflösen von 60 Gew.-Teilen Natriumeitrat (Na₃C₆H₅O₇₀2H₂O)

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" ²¹ " 7507787

in 1000 Gew.-Teilen (1 1) Leitungswasser (20⁰G), (2) langsames Zugeben (unter Rühren) von 350 Gew.-Teilen Maisquellwasser (bezogen auf Trockenfeststoffe, nachfolgend abgekürzt mit d.s.b.) und (3) Einstellen des pH-'.i'ertes auf 6,3 durch Zugabe einer 50 %igen Kaliumhydroxidlösungc

Dann wurde ein pastenf örniiges wachsartigen Maispräparat getrennt davon hergestellt durch (1) langsames Zugeben unter Rühren von 350 Gew.-Teilen einer wachsartigen Maisstärke mit einer niedrigen Viskosität (STA-TAPE 110) zu 5000 Gew.-Teilen (5 1) V/asser und sorgfältiges Eint eigen der wachsartigen Maisstärke durch Erhitzen auf 96⁰G und (2) Zugeben von 50 Gew.-Teilen Kaliumchlorid und 70 Gew.-Teilen Ammoniumsulfat zu dem pastenförmigen Stärkemedium«

Die oben angegebene Natriuncitrat-Maisquellwasser-Lösung und das wäßrige pastenförmige Stärkemedium (bei 96 G) wurden dann unter Zugabe von heißem Leitungswasser miteinander gemischt zur Herstellung eines wäßrigen 10 1-Produktionskulturmediums, das in eine Fermentiervorrichtung (New Brunswick MF 114 Fermentor mit einer Kapazität von 14 1) eingeführt und 45 Minuten lang bei 121⁰G in einem Autoklaven behandelt/C Es wurde eine sterile, 0,036 molare, angesäuerte Eisen(II)sulfatlösung, gelöst in 0,08 M einer Chlorwasserstoffsäurelösung,hergestellt, um ergänzende Eisen(ll)ionen zu liefern und es wurden 20 ml der dabei erhaltenen Eisen(ll)sulfatlösung (20 ml) in der Fernentiervorrichtung gelöst unter Bildung eines Prodriktionsnährmediums, das 4,0 mg Eisen(ll)ionen (20 mg Eisen(II)sulfat) pro Liter des wäßrigen Produktionsmediums enthielte

Das vorstehend beschriebene wäßrige Produktionsmedium wurde dann mit dem Impfinokulum (Anfangs—pH-Wert 6,3) inokuliert und dann bei 28°C und einer Rührergeschwindigkeit von 550 UpM und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 6 Volumenteilen Luft pro Volumenteil der Fermentationsbrühe pro Minute (v.v.m.)

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23 Stunden lang inkubiert. Die Schaumentwicklung (nur ein Problem unmittelbar beim Beginn der Fermentation) wurde durch automatische Zugabe eines Entschäumungsmittels (Hodag M-8 antifoam) unterdrückte Während der anfänglichen 9 Stunden der Fermentation stieg der pH-Wert allmählich auf 7,75 an und wurde innerhalb des Produktionscyclus mit eine"¹" wäßrigen 14 M Essigsäurelösung (80 %ige Essigsäure) mittels einer automatischen Meß- und Dosiereinrichtung dabei gehalten. Nach 23-stündigem Fermentieren wurden die optimalen Pullulanaseausbeuten (790 Einheiten Pullulanase pro ml Fermentationsbrühe) erzielte

Bei der Bestimmung der Ausbeuten an extrazellulärer Pullulanase, oberflächlich gebundener Pullulanase und interzellulärer Pullulanase wurde das nachfolgend angegebene Pullulanase-Testverfahren angewendet:

Bei dem Pullulanase-Testverfahren handelte es sich um eine Modifikation des Dinitrosalicylsäure (DNSA)-Verfahrensvon E.H. Fisher und E.A. Stein, 1958, "J. Biol. Chem.", 232, 867-879» das nachfolgend beschrieben wird_e

Verwendete Reagentien

DNSA-Heagens: Das 3,5-Dinitrosalicylsäure-Reagens wurde wie von Fisher und Stein 1958 beschrieben frisch hergestellt: 1.) Zuerst wurden 20,0 g DNSA zu 400 ml destilliertem wasser

zugegeben,

2.) dazu wurde unter Rühren eine NaOH-Lösung (32,0 g Natriumhydroxid d.s.b. in 300 ml destillier^rem Wasser) zugegeben; diese Lösung sollte klar sein, wenn sie das nicht ist, muß man sie langsam erwärmen, bis sie klar ist, ' 3.) langsam und portionsweise wurden dann 600,0 g Kaliumnatrium-

tartrat zugegeben,

4.) es wurde destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 2,0 1 zugegeben,

β Π β 80 8/0998

5.) die Lösung wurde durch ein großes gesintertes Glasfilter filtriert.

Acetatpuffer; 0,1 M-pH 5?0-Acetatpuffer (Natriumacetat und Essigsäure).

Substrat; Eine 1,0 gew.-%ige wäßrige Pullulanaselösung. Testverfahren

Eine 0,5 ml-Portion einer Pullulanase-Testprobe wurde in festgelegten Zeitintervallen zu 4-, 5 ml eines temperaturäquilibrierten Pullulansubstrats (2,0 ml 0,01 M-pH 5,0-Acetatpuffer und 2,5 ml Pullulanlösung) in 18 mm . I50 mm großen Teströhrchen zugegeben. Nach 0-, 6- und 12-minütiger Inkubation wurde 1,0 ml der Digestionsmischung zu 1,0 ml DNSA-Reagens (unter gründlichem Mischen) zugegeben, um die Digestionsreaktion zu stoppen. Durch 5»0-niinütiges Erhitzen der Röhrchen in einem 100°C-Wasserbad entwickelte sich dann eine Farbe„ Unmittelbar nach dem Erhitzen wurden die Röhrchen 5 Minuten lang in kaltem Wasser (1?⁰C) abgekühlte Nach dem Abkühlen wurden 10,0 ml destilliertes Wasser (20 0) zugegeben und jedes Röhrchen wurde gründlich durchgemischt.

Die Menge der entwickelten Farbe wurde mit einem Bausch und Lomb-Spectronic 70-Spektrophotometer als Prozentsatz der Transmission bei 5^5 nm (%Τ™,-) gegen eine Reagens-Blindprobe für 100 % T bestimmt. Der Prozentsatz der Transmissionswerte wurde nach der folgenden Formel in die Absorption umgewandelt:

= 2 - log 9O

Die Änderung der Absorption pro Zeiteinheit (A₁-^c) wurde durch das Maltoseäquivalent in mg aus einer geeichten Standard-Maltosekurve ausgedrückt _o

6Π9808/0998

Definition einer Pullulanaseeinheit

Eine Einheit Pullulanase ist definiert als die Menge Enzym, die Λ mg Maltoseäuqivalent pro ml Aufschluß (digest) aus einer 0,5 %igen Pullulanlösung in 60 Minuten bei 45°0 und einem pH-Wert von 5?0 bildet. Basierend auf dem Pullulanasetestverfahren können die Einheiten Pullulanase pro ml des Produktionskulturmediums nach der folgenden Gleichung bestimmt werden:

■p- _h ,-4-_ori/ τ _ mg Maltose χ 60 Min. χ 1 ml

^xnnei-oen/mx - ι _ml Aufschluß Digestierzeit 0,5 ml

der Testprobe (verdünnte (in Min.} Testprobe)

Endvolumen in der Verdünnungsblindprobe zu der Verdünnungsblindprobe zugegebene ml

Zur Bestimmung der Menge der extrazellulären Pullulanase in dem Produktionskulturmedium wurde eine gleichförmige 5 ml-Pullulanase-Testprobe (eine homogene Mischung von unlöslichen und lösliehen Bestandteilen/Fermente) aus der Fermentiervorrichtung entnommene Diese Probe wurde entnommen, während die Fermentiervorrichtung in Betrieb gehalten wurde« Die Testprobe wurde mit einer Zentrifugalkraft von 7500 g 5 Minuten lang zentrifugiert. Die dabei erhaltene überstehende Flüssigkeit, welche die extrazelluläre Pullulanase enthielt, wurde durch Dekantieren von den abzentrifugierten unlöslichen Bestandteilen vorsichtig abgetrennt. Bei diesem vorstehend beschriebenen Pullulansetestverfahren wies das Produktionskulturmedium einen extrazellulären Pullulanasegehalt von 390 Einheiten/ml Produktionsbrühe auf. Während der Rührer der Fermentiervorrichtung in Betrieb gehalten wurde (550 UpM), wurden 40 ml eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels (Triton X-100) der Fermentiervorrichtung zugegeben. Das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel und das Kulturbier (das Produktionskulturmedium) wurden in der Fermentiervorrichtung bei 550 UpM 12 Stunden lang ständig gerührt,

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um die locker gebundene Pullulanase in eine wasserlösliche Form zu überführen_o Das Kulturbier (die Kulturbrühe), welches die wasserlösliche Pullulanase enthielt, wurde dann zentrifugiert und nach dera gleichen Testverfahren, wie es zur Herstellung der Testprobe der extrazellulären Pullulanase angewendet wurde, abgetrennte Die dabei erhaltene überstehende Flüssigkeit enthielt, wie gefunden wurde, 720 Einheiten Pullulanase pro ml Produktionskulturmedium (umfassend sowohl extrazelluläre als auch durch ein oberflächenaktives Mittel löslich gemachte Pullulanase).

von der
Zur Bestimmung der/erfindungsgemäß verwendeten Mutante HKRL-

B-5780 gebildeten GesamtpulIuIanase wurde eine erschöpfende Pullulanaseextraktion ohne Lysis der Zellen durchgeführt„ Das bei der erschöpfenden Extraktion der Pullulanase aus dem Produktionsferment angewendete Verfahren war das folgende: 1.) 100 ml der Fermentationsbrühe wurden in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben eingeführt und es wurden 0,5 ml eines oberflächenaktiven Mittels (Triton X-100) zugegeben, 2.) der Kolben v/urde dann 20 Stunden lang in einem Rotationsschüttler gerührt (New Brunswick-Rotationsschüttler bei 265 UpM und 28°C),

5.) die Pullulanasetestproben wurden dann entnommen, wobei der Pullulanasetent nach dem vorstehend beschriebenen Pullulanaseprobetestverfahren durchgeführt v/urde, 4.) die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugieren (wie oben angegeben) und Dekantieren von der Flüssigkeit abgetrennt,

5.) der unlösliche, abzentrifugierte Rückstand wurde zweimal mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen, wobei der Pullulanasetest mit dem dabei erhaltenen Waschwasser durchgeführt wurde,

6.) die gewaschenen, abzentrifugierten Feststoffe wurden dann in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben eingeführt, der 0,4 g des oberflächenaktiven Mittels und 100 ml destilliertes Wasser enthielt,

Λ Π 9.8 0 8 /0998

7.) die Stufen 2 "bis 6 wurden nacheinander wiederholt, bis der Pullulanasetest in der Stufe (3) eine PulIulanaseausbeute von weniger als 0,5 Pullulanaseeinheiten/ ml anzeigte.

Der Anfangstest für die Pullulanase in der Stufe (3) mit der Fermentationsbrühe entsprach hinsichtlich seines Wertes den oben erwähnten 720 Einheiten/ml_o Ein Hauptanteil der danach bestimmten Gesamtpullulanase wurde unmit ;elbar in dem nächsten Extraktionscyclus mit einem oberflächenaktiven Mittel (d„h. in der Stufe (6)) erhalten, woran sich die Stufen (2) und (3) anschlossen. Danach zeigten die sich daran anschließenden Pullulanasetests der Stufe (3) beträchtlich niedrigere PulIulanaseeinheitswerte_o Die Gesamtmenge der Pullulanaseeinheiten, die bei der erschöpfenden Pullulanaseextraktion ermittelt wurden, betrug 70 Einheiten/ml der Fermentationsbrühe₀ Auf diese Weise betrug die Gesamtpullulanase-ausbeute sowohl an extrazellulärer Pullulanase als auch an oberflächlich gebundener Pullulanase 790 Einheiten/ml des Produktionskulturmediums_o Wegen der zu Beginn durch eine einzige Extraktionsstufe mit einem oberflächenaktiven Mittel erzielten hohen gewinnbaren Ausbeuten (von 720 Einheiten/ml) worden die nachfolgende Solubilisierung und Behandlung der iellenbruchstücke mit dem oberflächenaktiven Mittel beim kommerziellen Betrieb am zweckmäßigsten weggelassen. Das "Verhältnis von extrazellulärer Pullulanase zu oberflächlich gebundener Pullulanase betrug 39 : 4-0.

Nach Beendigung der vorstehend beschriebenen erschöpfenden Pullulanaseextraktion wurde der unlösliche Zellenrückstand (aus der Stufe (5)) einer Ultraschallbehandlung unterworfen, um eine Lysis herbeizuführen. Das dabei erhaltene zellenfreie Lysat wurde auf Pullulanase bin untersucht und es wurde gefunden, daß es keine enthielte

Dieses Beispiel wurde wiederholt unter Verwendung von Klebsiella nneumoniae JSTRHL-B-5783 in einem Produktionsdurchgang und

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?5D7787

von Klebsiella pneumonia« NRRL-B-5784 in einem anderen Produktionsdurchgang. Der NRRL-B-5783-Stamm lieferte 690 Einheiten/ml und der EREL-B-5784-Stamm lieferte 744 Einheiten/ml, wie nach dem oben beschriebenen Testverfahren ermittelt wurde. Der Produktionskulturbrühe-Test zeigte an, daß diese beiden Klebsiella-Stämme Pullulanase in praktisch der gleichen Form wie der HRRL-B-5780-Stamm lieferten. Keiner dieser Stämme lieferte eine meßbare Menge von intrazellulärem Enzyme Wie bei NRRL-B-5780 lag die durch den Organismus gebildete Pullulanase im wesentlichen in extrazellulärer und oberflächlich gebundener Form in praktisch den gleichen Mengenverhältnissen wie bei dem NRRL-B-5780-Starnra vor.

Beispiel 2

Dieses Beispiel erläutert den Einfluß verschiedener Kohlehydratquellenmaterialien auf die Pullulanasebildung. Das Kulturmedium war das gleiche wie das Inokulationsmedium in Beispiel 1, jedoch mit der Ausnahme, daß als Kohlehydratquelle die in der folgenden Tabelle I angegebenen Materialien verwendet wurden. Die Versuchsproben wurden 36 Stunden lang inkubiert. Zu Vergleichs zwecken wurde Aerobacter aerogenes I5O5O unter äquivalenten Inkubationsbedingungen ebenfalls jedem Versuch unterworfen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Ver- Kohlehydrat in dem Produktions- Aerobacter aerogenes

such kulturmedium in Gew.-%, bezogen ATCC 15050

Nr. auf das Gesamtgewicht des Kultur- extrazel- Ausmediums luläre Pul- beute

lulanase in )o in %

Ti	2
	3
co	4
GO	5
O	6
CD
t£3
CO	η

10

Klebsieila pneumoniae

NRRL-B-5780
extrazel- Au°- luläre Pul- _ beute lulanase in % in %

2 % wachsartige Maisstärken a) mit mittlerer Viskosität

2 % wachsartige Maisstärke b) mit niedriger Viskosität

2 % pastenförmige Perlstärke c)

2 % Pullulan

2 % wachsartige Stärke d)

2 % Maltose

1,5 % Maltose + 0,5 % wachsartige Maisstärke: a) mit mittlerer Viskosität

1 % Maltose + 1 % wachsartige Maisstärke a) mit mittlerer Viskosität

0,5 % Maltose + 1,5 °'ί wachsartige Maisstärke a) mit mittlerer Viskosität

0,25 % Maltose + 1,75 % wachsartige Maisstärke a) mit mittlerer Viskosität

100

22	2,5	50	86	I	cn O -J -J OO -J
20	2,2	48	67	00
33	13,2	47	11,9	I
20	3,8	49	85,5
35	17,6	51	12,6
30	11,3	50	15,1
30	10,7	50	15,7
20	3,8	51	25,2
21	3,1	48	55,3

Fortsetzung von Tabelle I

11 2 % Dextrose

12 2 % Lactose

1 % Lactose + 1 % wachsartige Maisstärke a) mit mittlerer

13 Viskosität

14 2 % Amylose

y> 15 2 % Maltodextrin e) ,J₃ 2 % Getreidestärke (corn oo 16 starch) f) mit 12 D.E.

S 17 -

O	0,0	30	5,1
25	2,5	51	18,2
21	2,5	53	18,2
O	0,0	0	0,0
19	6,0	47	24,5
14	4,4	47	61,6
O	0,0	0	0,0

a} STA-TAPE 110: vgl. die Angaben in der Klammer auf Seite 20 ,Abs. 2

b) STA-TAPE 100: ein Produkt der Firma A.E. Staley Manufacturing Company - eine körnige wachsartige Maisstärke (100 % Amylopectin) mit einer niedrigen Viskosität, die mit
Säure verdünnt ist, die in der Regel charakterisiert ist durch eine Brookfield-Viskosität von etwa 500 cP (Spindel Nr. 2, 20 UpM, 66⁰C (150⁰F) bei einem Trockenfeststoff gehalt von 40 bis 45 %) und einen D.E.-Wert von weniger als 1 %

c) nicht-hydrolysierte, pastenförmige Perlstärke

d) nicht-hydrolysierte, üastenförmige wachsartige Maisstärke

e) Saccharidverteilung: D.P^ - 3,1 %, D.P.₂ - 5,65 %, D.P., - 7,38 %, D.P.₄ - 5,14 %,

D.P.₅ - 4,86 %, ^D-P-₆ - 9,81 #, D, \_7&8 - 13,82 %, D.P.q - 3,09 ^, D.P. _1Q+ - 47,15 %

f) Saccharidverteilung: D.P^ - 0,6 %, D.P._p - 3,3 %, D.P.^ - 6,1 %, D.P.₄ - 4,0 %,
D.P.₅ - 4,5 %, D.P.g - 6,4 %, D.P._? - 5,7 %, D.P.g - 4,0 $, D.P₁₉ - 3,0 %,
D.P._1O - 2,6 %, D.P^₁ - 18,2 %, D-P^₀₊ - 41,56 >6.

Die im Versuch' Nr. 1 der vorstehenden Tabelle I angegebenen Ergebnisse für Klebsiolla pneumoniae ITRRL-B-5780 sind auf diejenigen des Beispiels 1 bezogen. Zu Vergleichszwecken beziehen ßich die in der Tabelle angegebenen Ausbeuten in °/> auf diejenigen von HREIr-B-5780 im Versuch ITr. 1. Wie in den Versuchen ITr. 6, 7» 8, 9 und 10 angegeben, inhibierte die Erhöhung der Konzentration der Maltose in dem Produkt ionslraltürmedium die Pullulanasebildung bei IiERL-B-5780· Umgekehrt wurde die Pullulanasebildung bei Aerobacter aorogcnes Al¹GO 15050 beträchtlich erhöht (vgl. z.B. die Versuche ITr. 6_t 7, 8, 9 und 10) in Gegenwart von Maltose. Die höchste Pullulanaseausbeute für Aerobacter aerogeneo Al¹CC I5050 (Versuch !Tr. 6) wurde rait Maltose allein erzielt, diese Ausbeute betrug jedoch nur 17,6 ^c/o der Ausbeute von 17RZL-B-573O in Versuch ITr. 1. Im Gegensatz dazu ergab 1TBRL-B-573O nur 12,6 % der Ausbeute im Versuch ITr. .1, wenn al3 einzige Kohlehydratquolle 2 }■> Lialtose verwendet wurden«, Pullulan hatte als einzige Kohlehydratquelle : einen ähnlichen Unterdrückungseffekt bei Klebsiella pneumoniae IJTiRL-B-5780, v/älirend die Pullulanasobil&ung durch Aerob· ic tor aerogenes ATGC I5O5O dadurch erhöht wurde (vgl. Versuch Nr. 3)* Im allgemeinen war Aerobacter aerogenes ATCC I5050 zu einer wirksamen Pullulanasebildung nicht imstande, wenn Stärke oder Stärkehydrolysate rait einem verhältnismäßig hohen Polymorisationsgrad als Hsuptkohlehydratquelle verv/endet wurde (wurden) (vgl. z.B. die Versuche ITr. 1 bis 3, 5, 9, 10 und 15). Dagegen hatte die erfindungsgemäß verwendete Mutante ein beträchtlich größeres Pullulanasebildungsvermögen in Gegenwart von pastenförmigen Stärken und insbesondere in einem Produktionskulturmedium, das eine hohe Konzentration an Amylopectin enthielt.

Wie aus dem Versuch ITr. 11 hervorgeht, war Aerobacter aerogenos ATCC 15050 zur Pullulanasebildung nicht imstande, wenn Dextrose als einsige Kohlehydratquelle verwendet wurde, während Klebsiella pneumoniae unter den Produktionsbedingungen dieses Beispiels eine geringe Menge Pullulanase bildete* Mit Ausnahme des

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Versuchs Hr, 11 (d_oh_o der Verwendung von Dextrose als einzigem Kohlehydrat) bildete Klebsieila pneumoniae WERL-B-5780 etwa 47 bis etwa 53 % extrazelluläre Pullulanase (bei dem übrigen Anteil handelte es sich im wesentlichen um die oberflächlich gebundene Form), während Aerobacter aerogenes ATCG 15O?O in jedem der Versuche 35 °/° oder weniger extrazelluläre Pullulanase bildeteο

Wie oben erwähnt,benötigen die Pullulanase bildenden Organismen vom Aerobacter aerogenes-Typ im allgemeinen ein Kohlehydrat-Induziermittel zur Erzielung optimaler Pullulanaseausbeuten. Die erfindungsgemäß verwendeten Mutanten werden durch diese Kohlehydrat-Induziermittel unterdrückte

Ein Stärkesubstrat (STA-TAPE 110) mit einem niedrigen D.E₀-Wert und einem hohen Amylopectingehalt verbessert die Pullulanasebildung mit KRRL-B-5780. Dies zeigen die mit HREL-B-5780 erzielten Ausbeuten in den Versuchen Nr₀ 1, 2 und 5« Die Viskositätseigenschaften dieser Stärkesubstrate mit hohem ^mylopectingehalt (bei einer Pastenmenge von 40 bis 45 yo) betragen jeweils etwa 5000 cP, 2000 cP und eine extrem hohe Viskosität₀ Wie ein Vergleich zwischen den prozentualen Ausbeuten der Versuche Nr. 1, 2 und 3 in der Tabelle I zeigt, fördern Kulturmediumsubstrate mit einem hohen Amylopectingehalt stärker die Pullulanasebildung als pastenförmige Perlstärke· In den Versuchen ITr. 15 und 16 wurde der Amylopectinanteil der Stärke übermäßig hydrolysiert und sie enthielt auch Kohlehydratquellenmaterialien mit einem verhältnismäßig hohen Prozentsatz an niedrigen D.P.-Sacchariden, welche das Pullulanasebildungsvermögen hemmten.

Beispiel 3

Erhöhte Pullulanaseausbeuten werden erzielt, wenn das Produktionskulturmedium zusätzliche (ergänzende) Eisen(II)ionen enthalte Mit Ausnahme der angegebenen verschiedenen Mengen an Eisen(II)ionen, des Maisquellwassers und der Inkubationszeit,

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wie sie in der nachfolgenden Tabelle II angegeben sind, erfolgte in diesem Beispiel die Pullulanasebildung auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

Ver such Nr.	% Maisquellwas ser (D.S.B.)	Fe++ in mg/1	Ausbeute in Einheiten pro ml Kulturmedium	Zeit in Stunden
18	4,0	3,0	744	28,0
19	3,5	4,0	790	26,0
20	3,0	4,4	730	27,0
21	3,0	0,0	656	28,0
22	3,5	4,4	780	27,5
23	3,5	6,4		27,5

Wie aus dem Vergleich der Versuche Nr. 20 und 21 in der vorstehenden Tabelle hervorgeht, führte die Verwendung von zusätzlichen EisenCII)ionen (das hier verwendete Maisquellwasser enthielt 0,7 mg Eisen(ll)ionen) pro Liter zu einer mehr als 10 %igen Erhöhung der Pullulanaseausbeuten. Beim Vergleich stellte die Ausbeute von 656 Einheiten pro ml in dem Versuch Nr. 21 noch eine überlegene Ausbeute gegenüber denjenigen dar, die mit Aerobacter aerogenes erzielt wurden. Wie ein Vergleich der Ausbeuten in den Versuchen Nr₀ 19, 20, 22 und 23 zeigt, führte eine Erhöhung der Eisen(II)ionen auf mehr als 4,0 mg/1 zu höheren Ausbeuten als diejenigen, die ohne zusätzliche Eisen(II)ionen erzielt wurden, Jedoch wurden die Ausbeuten nicht über diejenige der Versuchs Nr. 19 hinaus erhöht.

Die erfindungsgemäß verwendeten Organismen sind dadurch charakterisiert, daß sie mehr Pullulanaseeinheiten bilden, wenn Amylopectin als einziges Kohlehydrat verwendet wird, als wenn ein Kohlehydrat aus der Gruppe Maltose, Dextrose, Lactose und Pullulan als einzige Kohlehydratquelle verwendet wird. Bei der Bestimmung der vergleichenden Pullulanaseausbeuten

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mit diesen verschiedenen Kohlehydraten als einzige Kohlehydratquelle sollten Produktionskulturmedien unter den in Beispiel 1 angegebenen Produktionsinkubationsbedingungen verwendet werden, .jedoch mit der Ausnahme, daß ein anderes spezielles einziges Kohlehydratquellenmaterial verwendet wird. Die Fähigkeit zur Pullulanasebildung in Gegenwart von Dextrose als einziger Kohlehydratquelle kann ebenfalls unter Verwendung der in Beispiel 1 angegebenen Medien und Produktionskultur bestimmt werden. Die Pullulanaseeinheiten pro ml Produktionskulturmedium werden nach dem in Beispiel 1 angegebenen Pullulanasetestverfahren (-bestimmungsverfahren) ermittelt. Die Menge der extrazellulären Pullulanase wird bestimmt auf der Grundlage der Menge der wasserlöslichen Pullulanase in dem Produktionsmedium vor der Freisetzung der locker gebundenen Pullulanase daraus (z.B. vor der Freisetzung mit einem oberflachenaktiven Mittel), wie in Beispiel 1 angegeben. Die oberflächlich gebundene Pullulanase wird nach dem Pullulanasetest durch Extraktion derselben mit einem oberflächenaktiven Mittel wie in Beispiel 1 bestimmt (einschließlich, der Einheiten pro ml Produktionsmedium durch erschöpfende Extraktion mit einem oberflächenaktiven Mittel ohne Lysis). Das Verhältnis von extrazellulärer Pullulanase zu oberflächlich gebundener Pullulanase (bezogen auf eine Einheit T>ro ml Produkt ionsbr'ihe) wird ebenfalls nach dem in Beispiel 1 beschriebenen 'Testverfahren bestimmt.

Patentansprüche:

B Π 9 B Q 8 / 0 9 9 8

Claims (1)

1. Patentansprüche

   Verfahren zur Herstellung von Pullulanase durch Inokulieren eines assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbare Stickstoffquellen enthaltenden wäßrigen Nährmediums mit einem aeroben, Pullulanase bildenden Mikroorganismus zur Herstellung einer Kultur davon, Inkubieren der Kultur unter aeroben Bedingungen, welche die Pullulanasebildung f or dem _s unter Bildung eines Produktionskulturmediums davon und anschließendes Gewinnen eines Pullulanasepräparats aus dem Produktionskulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus verwendet wird, der

   a) mindestens dreimal mehr Pullulanase bildet, wenn Amylopectin mit einem D.E.-Wert von weniger als 2,0 als einzige Kohlehydratquelle verwendet wird, als in einem Nährmedium, in dem das Hauptkohlehydrat, bezogen auf das Kohlehydrat-Äquivalentgewicht, eine Kohlehydratquelle aus der Gruppe Maltose, Dextrose, Lactose und Pullulan ist,

   b) Pullulanase in einem Verhältnis von extrazellulärer Pullulanase zu oberflächlich gebundener Pullulanase von 2 : 3 bis weniger als 7 '· 3 bildet, wenn die Mutante in einem Nährmedium gezüchtet wird, das Amylopectin als einzige Kohlehydratquelle enthält,

   c) Pullulanase in einem Nährmedium bildet, das Dextrose als einzige Kohlehydratquelle enthält, wobei der Organismus in einem Nährmedium ausreichend lange inkubiert wird, um ein Produktionskulturmedium zu bilden, das mindestens 350 Pullulanaseeinheiten pro ml des Prodiiktionskulturmediums enthält, wobei das Produktionskulturmedium ein Verhältnis von extrazellulärer Pullulanase zu oberflächlich gebundener Pullulanase von 2 : 3 bis weniger als 7 : 3 aufweist.

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   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

   daß ein Nährmedium verwendet wird, das als Hauptkohlehydratquelle (bezogen auf das Gesamtgewicht des Kohlehydrats) Amylopectin enthält und welches das Amylopectin und ein Kohlehydrat aus der Gruppe Pullulan, Maltose, Dextrose und Lactose in einem Gewichtsverhältnis, bezogen auf die Trockensubstanz, von mindestens 3 : 1 enthält.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nährmedium verwendet wird, das im wesentlichen frei von fermentierbaren Zuckern und Pullulan ist und als Hauptkohlehydratquelle Amylopectin enthält»

   4-, Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kohlehydratquelle verwendet wird, die im wesentlichen vollständig aus Amylopectin besteht,

   5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3₅ dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis (bezogen auf das Trockengewicht) von Amylopectinkohlehydraten zu amylopectinfreien Kohlehydraten in dem Nährmedium mindestens 9 ' beträgt.

   6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium mit einem Organismus des Genus Klebsieila inokuliert und inkubiert wird.

   7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Organismus Klebsiella pneumoniae verwendet wird.

   8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß als Pullulanase bildende!? Organismus mindestens ein Vertreter aus der Gruppe Klebsiella pneumoniae NRRL-B-5780? Klebsiella pneumoniae KRRL-B-5783 und Klebsiella pneumoniae NRRL-B-5784 verv/endet v/ird_o

   9ο Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8,

   6 η 9 B -Q ^;8 / Ti 9 9 S

   dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlehydratquelle des Nährmediums im wesentlichen aus einer assimilierbaren Stärke mit einem D.E.-Wert von weniger als 20 % besteht.

   1Oo Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlehydratquelle des Nährmediums im wesentlichen aus einer assimilierbaren Stärke mit einem D.E.-Wert von weniger als 5 % besteht.

   11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlehydratquelle im wesentlichen vollständig aus Amylopectin mit einem D.E.-Wert von weniger als 2 % besteht.

   12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Herstellung der Pullulanase bei einer Temperatur von 25 bis 35°C durchgeführt wird.

   13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,

   daß als Organismus ein solcher vom Genus Klebsieila verwendet wird und daß die Kohlehydratquelle in dem Nährmedium im wesentlichen vollständig aus einem Amylopectin mit einem D.E.Wert von weniger als 2,0 % besteht und daß die Inkubation des Nährmediums bei einer Temperatur von 25°C bis weniger als 35°C für einen Zeitraum durchgeführt wird, der ausreicht, um eine Pullulanaseausbeute von mindestens 500 Pullulanaseeinheiten pro ml des Produktionskulturmediums zu erzielen.

   14o Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation des inokulierten Nährmediums für einen solchen Zeitraum fortgesetzt wird, der ausreicht, um mindestens 690 Pullulanaseexnheiten pro ml des Produktionskulturmediums zu bilden.

   15„ Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein Organismus verwendet wird, der in Gegenwart von Amylopectin als einziger Kohlehydratquelle

   0 9

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   ein Verhältnis von extrazellulären Pullulanaseeinheiten zu oberflächlich getnmdenen Pullulanaseeinheiten von 3 : 4 Ms 2 : 1 bildet.

   16. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß praktisch die gesamte von dem Organismus gebildete Pullulanase in extrazellulärer und oberflächlich gebundener Form vorliegt, wobei das Verhältnis der Einheiten der extrazellulären Pullulanase zu den Einheiten der oberflächlich gebundenen Pullulanase 3 : bis 2 : 1 beträgt_o

   17· Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium eine assimilierbare anorganische Stickstoffquelle in einer Menge enthält, die ausreicht, um die Pullulanasebildung durch den Organismus zu erhöhen.

   18o Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium, bezogen auf 100 Gew.-Teile des Kulturmediums, 0,25 bis 2 Gew.-Teile eines assimilierbaren Ammoniumsalzes und 3 bis 4 Gew.-Teile Maisquellwasser enthält.

   19· Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Abtrennung der Pullulanase aus dem Produktionskulturmedium das Medium mit einer wirksamen Menge eines oberflächenaktiven Mittels behandelt wird, um die oberflächlich gebundene Pullulanase in eine wasseriösliehe Form zu überführen und dadurch ein Produktionskulturmedium herzustellen, das mindestens 85 % der gesamten Pullulanaseausbeute in einer wasserlöslichen Form enthält.

   20. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansori'che, dadurch gekennzeichnet, dsJ3 das Nährmedium mehr als 1 mg Eisen(II)ionen pro Liter Nährmedium enthält.

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   21. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17» dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium, bezogen auf 100 Gew.-Teile Nährmedium, 1 bis 6 Gew.-Teile Amylopectin (d.s.ΐ>.), 2 bis 15 Gew.-Teile 'einer Stickstoffquelle (d.s.b.), die eine assimilierbare organische Stickstoffquelle und eine assimilierbare anorganische Stickstoffquelle in einem Gewichtsverhältnis innerhalb des Bereiches von 1 : 1 bis 15:1 (d.s.b.) enthält, und eine wirksame Menge Eisen(Il)ionen enthält, die in Kombination mit dem assimilierbaren Amylopectin und der assimilierbaren Stickstoff quelle ein Nährmedium ergeben, welches den Organismus in die Lage versetzt, mindestens 5OO Einheiten Pullulanase pro ml Nährmedium zu bilden, wobei die Inkubation des Nährmediums bei einer Temperatur von 25 bis 35 G für einen Zeitraum durchgeführt wird, der ausreicht, um ein Produktionskulturmedium mit mindestens 5OO Pullulanaseeinheiten pro ml Produktionskulturmedium zu bilden.

   22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium, bezogen auf 100 Gew.-Teile des Nährmediums, 3 bis 5 Gew.-Teile (d_os.b.) Maisquellwasser, 0,25 bis 2 Gew.-Teile eines assi¹^: I:¹' urbaren, wasserlöslichen anorganischen Stickstoffsalzes und 2 bis 5 mg Eisen(II)ionen pro Liter Nährmedium enthält.

   23ο Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das assimilierbare, wasserlösliche anorganische Salz im wesentlichen vollständig aus einem assimilierbaren Ammoniumsalz besteht .

   2^zl-, Klebsiella-Präparat, das sich für die Herstellung von Pullulanase in Ausbeuten von mehr als 5OO Pullulanaseeinheiten pro ml Produktionskulturmedium eignet, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen vollständig aus Klebsiella pneumoniae-Organismen besteht, die

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   a) mindestens dreimal nehr Pullulanase bilden, wenn Amylopectin mit einem D.E.-Wert von weniger als 2,0 als einzige Kohlehydratquelle verwendet wird, als in einem Nährmedium, in dem das Hauptkohlehydrat (bezogen auf das Kohlehydratilquivalentgewicht) eine Kohlehydratquelle aus der Gruppe Maltose, Dextrose, Lactose und Pullulan ist,

   b) Pullulanase in einem Verhältnis von extrazellulärer Pullulanase zu oberflächlich gebundener Zellenpullulanase von 2 : 3 bis weniger als 7 '· 3 bilden, wenn die Mutante in einem Nährmedium gezüchtet wird, das als einzige Kohlehydratquelle Amylopectin enthält, und

   c) Pullulanase in einem Nährmedium bilden, das als einzige Kohlehydratquelle Dextrose enthält.

   25· Präparat nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen Organismus aus der Gruppe Klebsiella pneumoniae NRRL-B-5780, Klebsiella pneumoniae NRRL-B-5783 und Klebsiella pneumoniae NRRL-B-5784- enthält.

   26o Präparat nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es als Organismus Klebsiella pneumoniae NERL-B-5780 enthält.

   27· Verfahren zum Hydrolysieren der oc-1,6-glucosidischen Bindungen einer Stärke unter Bildung eines Stärkehydrolysats unter Verwendung eines Pullulanase-Präparats, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse in Gegenwart eines Pullulanase-Präparats durchführt, das von Klebsiella-Organismen abgeleitet ist, die

   a) mindestens dreimal mehr Pullulanase bilden, wenn Amylopectin mit einem D.E.-Wert von weniger als 2,0 als einzige Kohlehydratquelle verwendet wird, als in einem Nährmedium, in dem das Hauptkohlehydrat (bezogen auf das Kohlehydrat-

   ■6 Γ) 9 8 0 B / ^;Π ^;9 9 8

   äquivalentgewicht) eine Kohlehydrat quelle aus der Gruppe Maltose, Dextrose, Lactose und Pullulan ist,

   b) Pullulanase in einem Verhältnis von extrazellulärer Pullulanase zu oberflächlich gebundener Zellenpullulanase von 2 : 3 bis weniger als 7 J 3 bilden, wenn die Mutante in einem Nährmedium gezüchtet wird, das als einzige Kohlehydratquelle Amylopectin enthält, und

   c) Pullulanase in einem Nahrmedium bilden, die als einzige Kohlehydratquelle Dextrose enthält.

   28© Verfahren nach Anspruch 27» dadurch gekennzeichnet, daß man als Organismus mindestens einen aus der Gruppe Klebsiella pneumoniae EERL-B-5780, Klebsiella pneumoniae MEL-B-5783, Klebsiella pneumoniae NKRL-B-5784· i^cl Mutanten davon verwendet

   29o Verfahren nach Anspruch 27 und/oder 28, dadurch gekenn zeichnet, daß man die Hydrolyse in Kombination mit einer anderen Amylase durchführt, um die Stärke zu einem Konversionssirupprodukt zu hydrolysieren.

   3Oo Verfahren nach Anspruch 28 und/oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß man das Pullulanasepraparat herstellt unter Verwendung von Klebsiella pneumoniae !NRRL-B-5780 oder einer Mutanten davon.

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