JPS5822197B2 - プルラナ−ゼオドウカスル スグレタノウリヨクオユウスルビセイブツニヨル プルラナ−ゼノセイゾウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はａ−１，ｂ−グルコシド加水分解酵素であるプ
ルラナーゼの製造法に関する。

最近、ａ−１，ｂ−グルコシドでんぷん結合の加水分解
に特殊性を有する酵素の可能な商業的重要性が認められ
ている。

従来のアミラーゼはａ。ｂ−でんぷん結合の加水分解に
充分には有効ではなく、しばしば好ましくないでんぷん
加水分解副産物を形成する。

ａ−１，ｂ−グリコシド加水分解酵素（例えば、プルラ
ナーゼ）を他のアミラーゼと組合せて使用することによ
り、転化シロップ産業は幅広いスペクトルのでんぷん加
水分解生成物および転化シロップ生成物を製造すること
ができ、さらに経済的に適当な費用でプルラナーゼが利
用される場合には、最良質のでんぷん転化シロップがか
なり低い費用で製造されうる。

一般に、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓを、
その成長を誘導する条件下で、同化性炭素、窒素および
無機栄養を含有する培地に接種することおよび発酵させ
ることにより、プルラナーゼが製造される。

ある方法では、プルラナーゼ製造は細胞繁殖と同時に起
りうる。

他の方法では、プルラナーゼ生産は成長相の最後まで起
らない。

ある方法では、プルラナーゼ合成に必須と思われる糖類
が不足した培地を用いることにより、プルラナーゼ製造
は故意に抑制される。

充分に成長した後、細胞はマルトース、マルトトリオー
スまたはプルランのような炭水化物によるプルラナーゼ
の製造が誘起される。

種類として、プルラナーゼ製造段階にこれまで使用され
たＡｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅ’ｒｏｇｅｎｅｓ菌株は一
般に、異なる炭水化物源を使用する場合、相違する水準
の細胞外酵素、強固に結合した酵素および表面的結合の
酵素を製造する性質を有する。

Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ細菌により製
造された細胞結合酵素に対する細胞外酵素の割合は、発
酵過程で一つの炭水化物を別の炭水化物に変更または代
用することにより、簡単にしばしば逆にされる。

特殊な炭水化物源により、発酵過程は普通、細胞外プル
ラナーゼ製造（例えば７５係以上）かまたは細胞結合プ
ルラナーゼ製造（例えば約７５ｆｂまたはそれ以上）を
支持する。

種類として、これらのＡｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇ
ｅｎｅｓ細菌は、デキストロースが唯一の炭水化物源で
ある場合には、プルラナーゼを生産することはできない
。

ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅＺｉｅｔｓｃｈｒｉｆｔ、３
３４゜７９−９５．１９６１年に、Ｈ，Ｂｅｎｄｅｒと
に、Ｗａｌｌｅｎｆｅｌｓは、プルラナーゼ製造に必須
なものとして炭水化物インデューサーを報告した。

それに記載された方法では総プルラナーゼの約７５〜８
０Ｌ：ｆｂが強固に結合した細胞外型のものを製造した
。

Ｗａｌｌｅｎｆｅｌｓ等（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｂ
ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉ
ｃａｔｉｏｎｓ、２２巻、３号、１９６６年、２５４〜
２６１ページ）は次に、その細菌を等量のグルコースと
マルトースの存在下での繁殖を提示した。

この方法により、細胞外プルラナーゼは約２０’％また
はそれ以下の量に低減されたことが報告されている。

残りのプルラナーゼは細菌の表面付近に局在化し、それ
は界面活性剤により容易に遊離されうる。

米国特許明細書第３，６５４，０８７号、第３，６５４
，０８８号および第３，６５４，０８９号では、２段階
法によりプルラナーゼ収量の改良が達成された。

そのオ一段階では、デキストロースのような非誘導性炭
水化物で培養することにより、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒａ
ｅｒｏｇｅｎｅｓ成長は認知されるほどのプルラナーゼ
製造をもむらさないで促進された。

充分な細胞繁殖の後、細胞はプルラナーゼを製造するよ
うに誘導された。

米国特許明細書第３，６５４，０８８号では、その誘導
細胞をアミロペクチンで培養することにより、改良され
た製造段階収量が得られることが報告されている。

一般に、前記米国特許におけるＡｅｒｏｂａｃｔｅｒａ
ｅｒｏｇｅｎｅｓにより製造されたプルラナーゼは、主
として細胞結合酵素である（例えば６５〜７５係または
それ以上）。

他の特許では、ａ−Ｄ−１，６−グルコシド加水分解酵
素を製造しうる別の微生物菌株を報告している。

米国特許明細書牙３，５６０，３４５号では、ａ−１，
４−または１，６−グルコシド結合を有するあらゆる炭
水化物材料が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｍｙｌｏｄｅ
ｒａｍｏｓａによる細胞外イソアミラーゼの合成に適し
た炭素源として報告されている。

この特許は、マルトース、アンモニウム塩および大豆加
水分解物からなる培地からのプルラナーゼ収量（１３０
単位Ｚｍ１以内）で、唯一の炭水化物源としてマルトー
スまたは可溶性でんぷんを含有する培地中での培養によ
って、約１８０〜２２０単位／ｍｌの細胞外イソアミラ
ーゼ収量の製造について記載している。

米国特許明細書第３，６２２，４６０号では、でんぷん
加水分解物（２〜１５％（７）Ｄ、Ｅ、）と大豆加水分
解物とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａを
含有する生産培地からの約１２５単位／ｍｌのａ−１，
６−グルコシダーゼの最大収量について記載している（
ここに記載された単位は、本明細書中の単位を測定する
のに使用した分析法により得られたものより高い単位値
を与える沃素分析により測定される）。

カナダ特許明細書オ９０１，５０３号では、５〜４０の
り、Ｅ、を有するでんぷん加水分解物がプルラナーゼ製
造を促進するために使用されている。

容易に回収することができて使用できる形で、プルラナ
ーゼの高収量を与える方法が検討された。

ある方法では、回収に適しない形で比較的高いプルラナ
ーゼ収量を与える。

他の方法では、低収量で容易に回収しうるプルラナーゼ
を与える。

でんぷん転化工程においてプルラナーゼ利用を経済的に
正当化する値段でのプルラナーゼの商業的要求があるけ
れども、でんぷんシロップ産業により要求される値段で
も量でもプルラナーゼを得ることができない。

この要求にもかかわらず、プルラナーゼが商業的利用に
適した形で、容易にしかも経済的に回収しつる、工程条
件下で高いプルラナーゼ収量を与えることのできる、細
菌の発見および開発ができなかった。

本発明の目的はプルラナーゼ収量を増大させること、お
よび比較的短時間に高収量のプルラナーゼを得ることで
ある。

さらに本発明の目的は、微生物により製造されたプルラ
ナーゼが容易にしかも経済的に生産培地から回収されつ
る方法を提供することである。

本発明の他の目的は優れたプルラナーゼ生産性を有する
プルラナーゼ製造用の突然変異体を利用することであり
、さらに、プルラナーゼ製造用の突然変異体と組合せで
、かなり改良されたプルラナーゼ収量を与える生産培地
を提供することも本発明の目的である。

本発明によれば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属に属する好気
性プルラナーゼ生産微生物を、その培養菌を与えるよう
に同化性炭素と同化性窒素源を含有する水性栄養培地に
接種し、プルラナーゼの製造を導く条件下でその培養菌
を培養し、その後、その培養菌よりも大きい能力を有す
るプルラナーゼ調製物を回収することによるプルラナー
ゼの製造法において、前記微生物は、 （ａ）大部分の炭水化物（等量の炭水化物重量に基づき
）がマルトース、デキストロース、ラクトースおよびプ
ルランからなる群から選ばれた炭水化物源である栄養培
地中でのプルラナーゼ生産に比べて、唯一の炭水化物群
として２．０以下のり、Ｅ。

のアミロペクチンを使用する場合には、少なくとも３倍
多くのプルラナーゼを生産し、 （ｂ）前記突然変異体が唯一の炭水化物源としてアミロ
ペクチンを含有する栄養培地で生産される場合には、２
：３から７：３までの細胞外プルラナーゼ：表面的結合
の細胞プルラナーゼの割合でプルラナーゼを生産し、 （ｃ）２：３から７＝３までの細胞外プルラナーゼ二表
面的結合プルラナーゼの割合を含有する生産培地の１ｍ
ｌに対して、少なくとも３５０単位のプルラナーゼを含
有する生産培地を与えるのに充分な時間、栄養培地でプ
ルラナーゼ製造用微生物が培養され、そして唯一の炭水
化物源としてデキストロースを含有する栄養培地中でプ
ルラナーゼを生産することを特色とする、プルラナーゼ
の製造法を提供する。

本発明は特に、ＫｌｅｂｓｉｅＩＩａ属に属する好気性
プルラナーゼ生産微生物を、その培養菌を与えるように
同化性炭素と同化性窒素源を含有する水性栄養培地に接
種し、プルラナーゼの生産を導く好気条件下でその培養
菌を培養し、それによってその生産培地をもたらし、そ
の後その生産培地からプルラナーゼ調製物を回収するこ
とによるプルラナーゼの製造法において、Ｋｌｅｂｓｉ
ｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ種の菌株としてＫｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ−５７
８０、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲ
ＲＬ−Ｂ−５７８３またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ−５７８４を使用すること
を特徴とする、フチラナー巳わ製造法を提供する。

ＷａｌＩｅｎｆｅｌｓ等により最初に記載した型のプル
ラナーゼ製造微生物（下記の脚注参照）に比べて、本発
明の微生物は特有の代謝性を有する。

これらの代謝の相違は、乾燥固体に基づき、２ｆｂバク
トーペプトン、０．５％酢酸アンモニウム、０．０５％
くえん酸ナトリウム、０．１０％オルトりん酸−水素カ
リウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、０．１％オルトりん酸二水素
カリウム（ＫＨ２ＰＯ，）、０．０５％硫酸マグネシウ
ム（ニブサム塩）、０．０５％塩化カリウム、ｏ、ｏｏ
１％硫酸オー鉄（緑はん）および水からなる水性栄養培
地に、相違する炭水化物源物質を代えることζはり説明
１゜一般に、本発明の突然変異体による細胞繁殖は、プ
ルラン、ラクトース、デキストロース、マルトース、５
〜２５のり、Ｅ、値を有するコーンスターチ氷解物、糊
化でんぷんおよび糊化アミロペクチンのような炭水化物
源物質でほぼ等しい。

しかしながら、突然変異体により製造されたプルラナー
ゼの型は、培地中の特定炭水化物源物質により明らかに
影響される。

唯一の炭水化物栄養としてのデキストロースは、突然変
異体の細胞外酵素の生産を抑圧する（例えば約３０係）
。

唯一の炭水化物栄養源としての他の炭水化物、例えばラ
クト−ス、マルトース、マルトトリオース、プルラン、
イエロー・プント・コーンスターチ加水分解物、同化性
高アミロースでんぷんは、表面的結合プルラナーゼとほ
ぼ等しい量の細胞外プルラナーゼ（単位に基づき）の生
産をもたらす。

唯一の糖類源としてデキストロースを使用する場合には
、ＡｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓＡＴＣＣ１
５０５０はプルラナーゼを生産しない。

それに対し、本発明の突然変異体は、唯一の炭水化物源
としてデキストロースを含有する培地中に細胞外酵素を
製造する（約３０ｆＯが細胞外作用プルラナーゼである
約１０単位／ｍｌまたはそれ以上のプルラナーゼ）。

〔注〕語句Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓは
１微生物がＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属 （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｊａ）であるこ
とを示すより最近の分類にもかかわらず、Ｗａｌｌｅｎ
ｆｅｌｓ型のプルラナーゼ製造微生物の同定の技術に一
貫して用いられている（多分Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒと同
じ挙動をするその本性のためであろう）。

唯一の炭水化物源としてラクトースを有する前記水性栄
養培地では、本発明の突然変異体はＡｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒａｅｒｏｇｅｎｅｓＡＴＣＣ１５０５０よりも約８倍
多くのプルラナーゼを生産する。

炭水化物インデューサー、例えばマルトース、マルトト
リオースおよびプルラン（製造に必須のものとして多く
記載されている）は、突然変異体のプルラナーゼ製造を
抑制する。

突然変異体は発酵性でんぷん加水分解物の存在下でのプ
ルラナーゼの製造を可能にするけれどもより高分子量の
分岐でんぷん区分（例えばアミロペクチン）はプルラナ
ーゼ収量を改良する。

例２の第１表に示したように、糊化し、実質的に加水分
解されていないアミロペクチン（唯一の炭水化物源とし
ての）は突然変異体によるプルラナーゼ製造を最高にす
る。

比較的には、糊化コーンスターチはプルラナーゼ製造収
量をより低下させるがそのでんぷん加水分解物（例えば
１２Ｄ、Ｅ、のコーンスターチ）は突然変異体のプルラ
ナーゼ製造能力をより抑制する。

発酵性糖（プルラナーゼ製造段階の間の）は突然変異体
のプルラナーゼ製造能力を抑圧する。

突然変異体の別の顕著な特色は、突然変異体により生産
されたゆるく結合したプルラナーゼに対する細胞外プル
ラナーゼの割合である。

アミロペクチンを前記基質培養基に利用する場合には、
Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓはかなり低量
の細胞外酵素と高比率の細胞結合プルラナーゼを生産す
る。

逆に、アミロペクチンによるプルラナーゼ突然変異体の
培養は一般に、２：３以上から７：３以下まで（普通は
２：１以下）の細胞外プルラナーゼ：ゆるく結合したプ
ルラナーゼのプルラナーゼ単位比の製造をもたらし、そ
れは実質的により少量の強固に細胞結合したプルラナー
ゼを有する（例えば、総プルラナーゼ同化の２０％以下
が細胞結合型である）。

高比率の細胞外型と表面的結合型のプルラナーゼ生産に
よって、商業的に利用しうる型での高収量のプルラナー
ゼの回収における、容易でしかも比較的安価な工程が、
本方法の特殊な利点である。

本発明の方法の実施では、細胞内または細胞間結合プル
ラナーゼの量（それは普通回収のための細胞分裂を必要
とする）は、総プルラナーゼ製造の約１０係以下（好ま
しくは約５係以下）に最小限にされうる。

酵素製造段階の間に、高比率のプルラナーゼが水溶性酵
素として、水性培地相中に突然変異体により生産される
。

本発明のさらに限定された面では、本発明の突然変異体
は、糊化アミロペクチン、糊化コーンスターチ、マルト
ース、ラクトース、プルランおよびマルトデキストリン
からなる群から選ばれた炭水化物源物質（２係乾燥固体
量）が前記水性養分培地における唯一の炭水化物源とし
て使用される場合に、約３：４から約２：１（好ましく
は約１：１から約３：２まで）までの細胞外プルラナー
ゼ二表面的結合酵素の単位比を生産することを特色とす
る。

本発明の突然変異体を前記水性養分培地で培養する場合
には、それらは実質的に粘液多糖類物質を有しない。

過剰の細胞生産物の粘液多糖類は、回収しうるプルラナ
ーゼの収量に悪影響を及ぼす。

製造および回収段階において、この粘液多糖類のないこ
とが、生産物培地の水相へのプルラナーゼの移動および
分散を促進する。

プルラナーゼ製造段階の終結時には、表面的結合プルラ
ナーゼは、細胞生産物の粘液物質中に取込まれも吸収さ
れもしない。

この表面的結合した細胞結合プルラナーゼは、容易に可
溶性型に変換され、界面活性剤によりそれから遊離され
うる。

本発明に使用される微生物は、１ｍｌの生産肉汁に対し
て３５０単位以上のプルラナーゼの生産能力（商業的製
造に基づく）を有する。

これらの微生物に固有の特殊処理の利点は、その微生物
が製造するプルラナーゼの特色にある。

実質的に細胞外型と表面的結合型のプルラナーゼを製造
するための微生物の能力は、最終生産肉汁中の総プルラ
ナーゼの少なくとも８０係の回収を容易にする。

炭水化物源として本質的にアミロペクチンからなる生産
培地では、少なくとも５００単位／ｍｌの細胞外プルラ
ナーゼと表面的結合プルラナーゼのプルラナーゼ収量を
製造しうる。

有利には、本発明の方法は、プルラナーゼ収量が１ｍｌ
の培地に対し７５Ｄ単位以上で、それにより製造された
総プルラナーゼの８５％以上（例えば８５％〜約９５係
またはそれ以上）が細胞外型と表面的結合型であるよう
な培養条件下、栄養培地により行なわれる。

本発明の好ましい具体例では、総プルラナーゼ生産物の
９０％以上がこれらの二つの型である。

突然変異体のプルラナーゼを製造する能力は、主な炭水
化物源物質（乾燥固体重量に基づく）としてアミロペク
チンを含有する生産培地の存在下でかなり促進される。

主な炭水化物（重量に基づく）としてアミロースを含有
する生産培地はプルラナーゼ製造を全く抑圧しないが、
プルラナーゼ収量はより高いアミロペクチン含有量のも
のと比べてかなり低い。

アミロペクチン源としては種々のでんぷんが使用されつ
る。

そのでんぷんの例としては、比較的高いアミロペクチン
含有量（例えば７０％以上）を有するものが含まれる。

これらのでんぷんは特色として約８０℃以下の糊化温度
を有する。

例示的なアミロペクチン含有でんぷんには、塊茎および
根茎でんぷん（例えばジャガイモ、クピオカ、カンナ、
クズウコンおよびサツマイモ）、穀物でんぷん（例えば
コーン、ツルガム、コムギ、コメ、ワキシーメイズ、モ
チゴメおよびワキシーツルガム）およびその混合物など
が含まれる。

ワキシーメイズ、ワキシーコーン、ワキシーツルガム、
モチゴメ、モチオオムギおよびその混合物などのような
、本質的にアミロペクチンからなるでんぷん（例えば１
０’％以下のアミロース含有量と９０係以上のアミロペ
クチンを有するもの）が、プルラナーゼ製造を最高にす
るために特に有効な炭水化物である。

便利なプルラナーゼ工程に関しては、同化性炭水化物が
生産培地に使用される。

糊化でんぷんおよび／または、突然変異体がプルラナー
ゼ製造を伴なってでんぷん源を代謝させるに充分な量に
部分加水分解されたでんぷん（例えば、酸または酵素に
より希薄されたでんぷん）が、同化性炭水化物源として
使用されうる。

多少の発酵性糖を有するでんぷん加水分解物は、突然変
異体によるプルラナーゼ製造を抑圧する。

比較に基づき、プルラナーゼ製造はでんぷん加水分解物
のり、Ｅ、が増大するにつれて減少する。

３０％以上のり、Ｅ。のでんぷん加水分解物は、２０％
以下または１０係以下のり、Ｅ、でのものに比良で、プ
ルラナーゼ製造をかなり抑圧する。

５．０係以下のり、Ｅ。を有する非希薄化アミロペクチ
ンかまたは部分でんぷん加水分解物かにより改良された
プルラナーゼ収量が達成され、約２．０％以下のり、Ｅ
、を有する糊化アミロペクチン基質により最適収量を与
える。

生産培地は突然変異体をさらに繁殖させるのに充分な量
の炭水化物源物質を含有すべきで、その中でプルラナー
ゼを製造する。

一般に、プルラナーゼ製造は、前記プルラナーゼ収量を
与えるのに充分な量のアミロペクチンの存在下で行なわ
れる。

広くは、炭水化物物質の量は生産培地中の水１００重量
部に対して１〜１０重量部の炭水化物範囲である。

少なくとも１〜６重量部の量のアミロペクチンが、突然
変異体により製造されるプルラナーゼの量と速度の双方
を促進する。

有利には、生産培地は少なくとも７：３、好ましくは９
：１以上のアミロペクチン：非アミロペクチン炭水化物
源物質の重量比を有する。

本質的に他の炭水化物を含まず、１００重量部の水に対
して２〜４重量部のアミロペクチンを含有する生産培地
は、非常に高いプルラナーゼ収量を与える。

プルラナーゼ製造には、プルラナーゼ生産培地用の生育
微生物を与えるための接種物または接種培養物を利用す
ることが便利である。

商業的実施では、接種培養物は、生産培地に接種するた
めに用いられる高細胞集団を含有する。

接種培養物を与えるのに使用される特定方法によって、
プルラナーゼはこの接種培養物の発育を抑圧するかまた
は支持する。

本発明では、接種培養物は、炭水化物がプルラナーゼ製
造を抑制するかまたは支持するかにかかわりなく、微生
物の繁殖をもたらす広範囲の炭水化物により培養されう
る。

生産培地は従来の接種培養物技術によって生育突然変異
体で接種されうる。

接種培地それ自体または繁殖した突然変異体は、生産培
地に接種するのに使用されうる。

接種培養物のための炭水化物源としてアミロペクチンを
使用することにより、それはプルラナーゼ生産培地の全
体的炭水化物均衡に悪影響を与えないで、接種物として
直接使用されうる。

突然変異体がプルラナーゼを与えさせるに充分な量の同
化性窒素源物質が、生産培地に与えられるべきである。

その窒素源物質は、接種の前に導入されるかまたは、繁
殖とプルラナーゼ製造サイクルの間じゆう徐々に添加さ
れうる。

初期製造段１看の間、窒素源は王として細胞生長のため
に代謝される。

後者の培養段階の間、窒素源は主としてプルラナーゼの
製造に使用される。

窒素源物質の量はかなり変えられうるが、普通は１００
重量部の生産培地水に対して２〜１５重量部乾燥固体範
囲である。

有機窒素含有組成物が本発明の方法における同化性窒素
源材料として使用されうる。

水溶性型の代表的有機窒素源には、尿素、ペプトン、肉
、酵母抽出物、コーン浸液、カゼイン加水分解物、魚肉
、植物加水分解物（例えば、コムギ、ぬか、コメ、コー
ンたんばく質）、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタ
ミン酸、アスパラギン酸、アラニン）およびそれらの混
合物などが含まれる。

本発明の好ましい具体例では、コーンスチープリカーが
同化性有機窒素源として使用される。

しかしながら、唯一の有機窒素源として使用される過剰
または不充分な量のコーンスチープリカーはプルラナー
ゼ製造を抑制する。

例えば、６重量部以上のコーンスチープリカー（乾燥固
体に基づく：を含有する生産培地は、プルラナーゼ生産
を抑制する傾向がある。

約２重量部以下のコーンスチープリカー（乾燥固体に基
づく）を同化性有機窒素源として排他的に使用する場合
には、培地は一般に細胞生長を支持するのに充分な窒素
を含有するが、プルラナーゼ製造はかなりそれにより害
されるようになる。

唯一の窒素源としてコーンスチープリカーを使用しよう
とする場合には、存在するコーンスチープリカー乾燥固
体の量が１００重量部の生産培地水に対して２〜５重量
部であるときに普通、高プルラナーゼ収量が得られる。

約４重量部のコーンスチープリカー乾燥固体量で、最適
プルラナーゼ製造結果が得られる。

生産培地に同化性無機窒素源と同化性有機窒素源を組合
せることが、突然変異体による全体的プルラナーゼ製造
をさらに増大させることがわかっている。

従来の水溶性窒素源が無機窒素補充物として使用されう
る。

アンモニア、アンモニウム塩（例えば塩化アンモニウム
、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、りん酸アンモニウム）、硝酸
アルカリ（例えば硝酸ナトリウム）、それらの混合物お
よび他の同様な水溶性塩が、使用されうる例示的な補充
用の無機窒素源物質である。

本発明の生産培地中の主な窒素源物質（重量に基づく）
は普通は、有機窒素源物質である。

有機窒素源物質：無機窒素源物質の重量比は代表的には
１：１以下から約１５：１までまたはそれ以上の範囲で
ある。

３：１から１０：１まで、好ましくは４：１から６＝１
までの有機：無機窒素重量比で、改良されたプルラナー
ゼ収量が得られる。

一般に、水溶性窒素塩の量は、１００重量部の生産培地
水に対して０．２５〜２重量部の範囲でありうる。

同化性アンモニウム塩は無機窒素源物質として特に適す
る。

酢酸アンモニウムと硫酸アンモニウムがプルラナーゼ収
量を最高にするための好ましい無機窒素源である。

突然変異体により製造されるプルラナーゼの総量は、無
機窒素源の量を１重量優越えて比較的一定を保つ、０．
５〜１重量部（好ましくは約０．７５重量部）の量の水
溶性窒素含有塩が、製造速度と収量の双方を促進するの
に特に有効である。

細胞繁殖を支持するために従来から培地に使用されてい
るような微量の鉄は、少量の過剰同化性鉄で補充された
ものよりも、一般的に有効性が少ない。

かくして、プルラナーゼ製造を最高にするには、少なく
ともその工程のプルラナーゼ製造段階の間に、プルラナ
ーゼ生産に対する適度の効果を有するのに充分な、有効
量の同化性鉄で生産培地を強化することが重要である。

Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属から突然変異体のための最大プ
ルラナーゼ生産を得るのに必要な補充鉄の量は、特定突
然変異体菌株に一部依存する。

ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬＢ
−５７８３（微工研寄託第２９２０号）は、補充鉄なし
ではプルラナーゼ製造に有効ではない。

ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬＢ
−５７８０（微工研寄託第２９１９号）とＫｌｅｂｓｉ
ｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬＢ−５７８４（
微工研寄託第２９２１号）は、補充鉄なしで実質的な量
のプルラナーゼを生産するけれども、これらの収量はそ
の最高量よりかなり低い。

これらの突然変異体の製造能力に対する同化性鉄の効果
は後述の実施例でさらに示す。

鉄源としてオー鉄イオン（例えば硫酸第一鉄）を含有す
る生産培地は、第二鉄イオン（例えば塩化第二鉄）だけ
を含有するものよりもプルラナーゼ収量を改良する。

同化性鉄必要量は種々の従来の源から誘導されうる。

例示的オー鉄化合物には、アセタート、カルボナート、
シトラード、ラフタート、ニドラード、スルフアート、
スルフイツトおよびチオスルフアートアニオンのオー鉄
塩およびそれらの混合物などが含まれる。

微量の鉄イオンを固有に含有する他の物質、例えば、第
一鉄または第二鉄化合物に富んだ水道水およびコーンス
チープリカーも、鉄源として使用されうる。

１１の生産培地に対して１．０１１ＩＩ？以上、有利に
は２．０〜以上の第一鉄イオン（例えば、好ましくは約
３．０■〜約５．０ｍ９の範囲）を含有する生産培地が
、総プルラナーゼ製造量をさらに改良する。

プルラナーゼ製造段階の間、培地は６．０〜８のＰＨに
保持されるべきである。

ＰＨ８，０をわずかに越えるとプルラナーゼ製造は停止
し、ＰＨ７，２以下では抑制される。

製造の初期段階の間は、ＰＨは一般に比較的一定に保た
れるが、その後の段階の間では迅速にかなり高くなる傾
向がある。

生産培地をその最適同化ＰＨに保持するためには、約７
．５〜約８．０の間の値にＰＨを保持するのに充分な緩
衝剤または中和用の酸が、特に後者の部分の培養の間に
使用されるべきである。

普通の中和用の酸、例えば硫酸、くえん酸、塩酸、乳酸
、硝酸、炭酸、酢酸およびりん酸が、適当な量でＰＨを
制御し、保持するために使用されうる。

突然変異体は、生長速度に多少の差異もなく、比較的広
い温度範囲で繁殖する。

プルラナーゼ製造の初期段階の間は、生産培地は普通、
せいぜい微量のプルラナーゼを含有する。

突然変異体は２０℃〜４０℃の範囲の間じゆう、はとん
ど同じ速度で繁殖する。

しかしながら、最高プルラナーゼ製造は温度依存性であ
る。

２５℃以下、または３５℃以上の温度では、プルラナー
ゼ生産がそこなわれる。

この温度依存性のために、この狭い温度範囲内に培養温
度を保持することが有利である（少なくとも製造段階の
後者の段階の間）。

生産培地を約２８℃に保持すると、最高プルラナーゼ収
量が得られる。

しかしながら、繁殖とプルラナーゼ製造段階の双方のた
めのその最適温度を使用することが好ましい。

種々のＡｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ菌株（
例えばＡＴＣＣ１５０５０およびＡＴＣＣ８７２４）を
用いる代表的プルラナーゼ工程は普通、最高収量を得る
ためには３５時間以上を要する。

本発明の方法では、実質的により短い時間で最高プルラ
ナーゼ収量（７５０単位／ｍ１以上）を容易に得ること
ができる。

Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ接種培養物でのその接種に始まり
、その完結までの全製造サイクルは、２０〜約２５時間
に短縮されうる。

他の生産培地養分、鉱物、塩および他の発酵酸（例えば
、他のプルラナーゼ製造法に普通使用されているもの）
が、場合によっては本発明の方法に使用されうる。

他のプルラナーゼ製造微生物と同じく、本明細書記載の
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ微生物はプルラナーゼ製造のため
に発生期の酸素を必要とする。

この目的のためには、同様な好気型の微生物により発生
期の酸素を与えるための普通の発酵、撹拌および通気の
方法が使用されうる。

プルラナーゼ生産発酵の終結時に、プルラナーゼは種々
の方法により回収されうる。

本明細書記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ微生物は高比率の
固有の細胞外プルラナーゼと非常にゆるく結合したプル
ラナーゼで、高収量の生産物ビールを与えるので、プル
ラナーゼを商業的に利用しうる型にするには、それの微
量の付加的処理を必要とする。

総プルラナーゼ生産物の８５係を越えるプルラナーゼ収
量は、生産培地の界面活性剤処理により容易に回収され
うる。

最初の界面活性剤処理では、大部分の表面的結合の酵素
を水溶性型にし、それを固有の細胞外プルラナーゼと共
に容易に回収しうるようにさせる。

界面活性剤により遊離されたプルラナーゼと固有の細胞
外酵素は、濃縮され（例えば比較的低温での真空乾燥、
または限外沖過により）、そして商業的に使用される。

２，０００単位／ｒｒｄ１以上のプルラナーゼ効力を有
する液体プルラナーゼ濃縮物（好ましくは約３，０００
単位／ｍ１以上のもの）は、その液体担体として作用す
る生産酵素で、この方法で容易に製造されうる。

場合によっては、細胞残渣および不溶物が発酵肉汁から
分離されうる。

選択的に、生産培地は引続き、（１）表面的結合酵素を
遊離するように界面活性剤で処理され、（２）不溶物が
それから分離され、（３）プルラナーゼが普通の添加物
を有する液相から沈でんされ、そして（４）プルラナー
ゼが乾燥される。

より完全なプルラナーゼの回収を望む場合には、細胞残
渣が界面活性剤で反復処理されるか、または選択的に崩
壊を受ける。

あってもごく微量であるが、細胞内プルラナーゼがこれ
らのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ微生物により製造される。

表面的結合酵素は、ゆるく結合した微生物酵素を遊離す
るための従来の添加物および技術により水溶性型に容易
になる。

商業的には、崩壊しないで表面的結合プルラナーゼを遊
離することが有オしである。

実質的な細胞崩壊を引起すことなく、表面的結合酵素を
有効に遊離させるに充分な量で、従来の界面活性剤（例
えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびトリトンＸ−１０
０−アルキルフエノキシポリエトキシエテノール）が使
用されうる。

０．１〜０．５容量係を含有する生産培地を与えるに充
分な量の従来のプルラナーゼ遊離用非イオン界面活性剤
が、それを約５〜２０時間撹拌して、表面的結合酵素を
遊離するのに適している。

より高い濃度でのより長時間の界面活性剤処理では、そ
の崩壊をもたらす（例えば、０．５係で、２５時間また
はそれ以上）。

次の実施例は単に例証のためであって、本発明の範囲を
限定しようとするものではないことを考慮すべきである
。

例１ プルラナーゼ生産微生物としてＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬＢ−５７８０を用いること
により、ＩＴＬｌの培地肉汁に対して７９０単位のプル
ラナーゼを与える生産培地を調整した。

接種栄養培地は（重量に基づき）、ｚ、ｏｆｏワキシー
メイズでんぷん（ＳＴＡ−ＴＡＰＥｌｌｏ。

Ａ、Ｅ、ＳｔａｌｙＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＣｏ、
）、２．０係バクトーペプトン（ＰｅｐｔｏｎｅＰｒｅ
ｐａｒａｔｉｏｎｏｆＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ。

デトロイト、ミシガン）、０．５％酢酸アンモニウム、
０．０５係くえん酸ナトリウム （Ｎａ３ｃ６Ｈ６０７−２Ｈ２０）、０．１係に２ＨＰ
０４．０．１係ＫＨ２ＰＯ４，０，０５係ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２０，０，０５係ＫＣ１゜０．００１％ＦｅＳＯ４
・６Ｈ２０と水からなり、それを調製した。

この培地は引続き、くえん酸ナトリウム、 〔注〕５ＴＡ−ＴＡＰＥＩＩＯは、代表的には約２，０
００ｃｐｓのブルックフィールド粘度（４０〜４５係の
乾燥固体含有量で、 １５０Ｆで、Ｎ０１３スピンドル、２０ｒｐｍ：と１チ
以下のり、Ｅ、を有する、中間的粘度、酸−希薄した粒
状ワキシーメイズでんぷん（１００％アミロペクチン）
である。

他の無機塩、ペプトン、そして最後にモチトウモロコシ
でんぷんを添加することにより調合した。

次に、その結果生成した混合物を、完全に糊化したワキ
シーメイズでんぷんを含有する均質培地を与えるように
、撹拌しながら蒸気浴で加熱した。

五つの５００ｍ１の底仕切りＤｅＬｏｎｇフラスコのそ
れぞれに、１００ＴＬｌの接種培地と１滴の油止剤（Ｈ
ｏｄａｇＭ−８（商品名：米国食品医薬凸周によって認
可された発酵工程で用いるための油止剤）〕を添加し、
次に１２１℃で１５分間滅菌した。

その滅菌した接種物をＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅＮＲＲＬＢ−５７８０で接種しく寒天斜面）
、生産培地のためのシード接種物を与えるように、Ｎｅ
ｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋ回転振とう器で、２８℃、２６５
ｒｐ、ｍで１６時時間様した。

（１）１，０００重量部（１１）の水道水（２０℃）中
に６０重量部のくえん酸ナトリウム （Ｎａ３ｃ６Ｈ，０７−２Ｈ２０）を溶解し、（２）３
５０重量部のコーンスチーブリ力−（ｄ、ｓ、ｂ、）を
徐々に添加しく撹拌しながら）、そして（３）それに５
０係水酸化カリウム溶液を添加することによりＰＨを６
．３に調整することにより、プルラナーゼ生産栄養培地
を調製した。

次に、（１）５，０００重量部（５１）の水に３５０重
量部の低粘度ワキシーメイズでんぷん（ＳＴＡ−ＴＡＰ
Ｅｌｌｏ）を撹拌しながら徐々に添加して、９６℃に加
熱することによりワキシーメイズでんぷんを完全に糊化
し、そして（２）その糊化でんぷん培地に、５０重量部
の塩化カリウムと７０重量部の硫酸アンモニウムを添加
することにより、糊化ワキシーメイズ調製物を別に調製
した。

次に、前記くえん酸ナトリウムーコーンスチー７’ＩＪ
カー溶液と水性でんぷん糊状培地（９６℃）を、１０１
の水性生産培地を与えるための別の温水道水と混合し、
発酵器（１４１容量のＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋＭＦ１
１４Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）中に入れ、そして４５分間１
２１℃で圧熱滅菌した。

補充オー鉄イオンを与えるために、０．０８Ｍ塩酸溶液
中に溶解した無菌の０．０３６モル酸性化硫酸オー鉄溶
液を調製し、その結果生成した硫酸オー鉄溶液（２０ｍ
ｌ）の２０７ｒＬｌを、１１の水性生産培地に対して４
．０１ｎ９のオー鉄イオン（２０■の硫酸第一鉄）を含
有する生産栄養培地を与えるように発酵器中に溶解する
。

次に、前記水性生産培地をシード接種物（初期ＰＨ６−
３）で接種し、次に２８℃、５５０ｒｐｒｒ：の撹拌機
速度および６ｖ、ｖｏｍ（１分間に容量発酵肉汁に対す
る容量空気）の通気速度で２３時間培養した。

泡発生（発酵の始まりの瞬間だけの閥題）は、泡止剤（
ＨｏｄａｇＭ−８泡止剤）の自動添加により抑圧した。

発酵の最初の９時間の間に、ＰＨは徐々に７，７５に増
大し、自動感度および計量装置により、１４Ｍ酢酸水溶
液（８０係酢酸）を用いて、製造サイクルの間じゆうそ
れに保持した。

２３時間発酵した後、最高プルラナーゼ収量（１７７１
１の発酵肉汁に対して７９０単位のプルラナーゼ）を得
た。

細胞外プルラナーゼ、表面的結合プルラナーゼおよび細
胞間プルラナーゼの収量を測定するには次のプルラナー
ゼ分析操作を用いた。

そのプルラナーゼ分析法は、下記のＦｉｓｈｅｒ。

Ｅ、Ｈｌおよび５ｔｅｉｎ、Ｅ、Ａ、、（１９５８”。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２３２巻、８６７−８７９の
ジニトロサリチル酸（ＤＮＳＡ）法の変形である。

試薬 ＤＮＳＡＮＳ−Ｆｉｓｈｅｒおよび５ｔｅｉｎ（１９５
８）により記載されているようにして、３．５−ジニト
ロサリチル酸試薬を新しく調製した。

１４００ｍ１の蒸留水に２０．０ｇのＤＮＳＡを添加す
る。

２撹拌しながら、前記（１）に、３００ｍ１の蒸留水中
のＮａＯＨ溶液（３２，０ｇ水酸化ナトリウムｄ、ｓ、
ｂ、）を満願する。

この溶液は透明であるべきで、透明でない場合は透明に
なるまで静かに熱する。

３前記２に６００．０ｇの酒石酸カリウムナトリウムを
徐々に増して添加する。

４２、Ｏｌの最終容量まで蒸留水を添加する。

５大きな半融ガラス濾過器を通してその溶液を沖過する
。

酢酸緩衝液−０，１Ｍ−ＰＨ５，０酢酸緩衝液（酢酸ナ
トリウムと酢酸） 基質−１，０％（重量）プルラナーゼ水溶液操作 １８Ｘ１５０ｍｍの試験管中の４．５ｍｌの一定温度の
プルラン基質（２，０ｍｌの０．１Ｍ−ＰＨ５，０の酢
酸緩衝液と２．５ｍｌのプルラン溶液）に適当な時間の
間に、０．５ｍ１部のプルラナーゼ試験試料を添加する
。

０，６および１２分の培養の後、消化反応を停止するた
めのＬＯｍｌのＤＮＳＡＮＳ−充分に混合しながら）に
、１．０ｄの消化混合物を添加する。

次に、１００℃水浴中で５．０分間、試験管を加熱する
ことにより色が出る。

加熱直後、試験管を冷水（１７℃）中で５分間冷却する
。

冷却後、それに１０．０ｍｌの蒸留水（２０℃）を添加
し、各試験管を充分に混合する。

ついた色の程度を、ＢａｕｓｃｈａｎｄＬｏｍｂＳｐｅ
ｃｔｒｏｎｉｃ７０分光光度計により、１００％Ｔに固
定された試薬ブランク（ｂｌａｎｋ）に対する５４５ｎ
ｍ（チＴ５４５）での透過百分率として測定する。

透過百分率の読みを式、Ａ５４５＝２−１０ｇ％Ｔ５４
５によって吸光度に変える。

単位時間に対する吸光度の変化（Ａ５４５）は、標準目
盛りのマルトース曲線から（〜マルトース当量）として
表わされる。

プルラナーゼ単位の定義 １単位のプルラナーゼは、４５℃、ＰＨ５，０で６０分
間に０．５％プルラン溶液から、ＩＴＬｌの消化物に対
して１ｍＩ？のマルトース当量を製造する酵素の量であ
ると定義する。

プルラナーゼ分析操作に基づき、ＩＴｎｌの生産培地に
対するプルラナーゼの単位は、次の式により決定されう
る。

生産培地中の細胞外プルラナーゼの量を測定するのに、
５ｍｌの均一プルラナーゼ試験試料（酵素の不溶性物と
可溶性物の均質混合物）を発酵器から取出した。

発酵器を作動させながらこの試料を取出した。

その試験試料を７，５００ｇの遠心力で５分間遠心させ
た。

その結果生成した細胞外プルラナーゼを含有する上澄を
注意深く、遠心不溶物から傾瀉により分離した。

前記のプルラナーゼ分析法によれば、生産培地は３９０
単位／Ｔ／ｌｌの生産物肉汁の細胞外プルラナーゼ分析
値を有していた３発酵器の撹拌機を用いる（５５０ｒｐ
ｍ）間に、４０Ｔｌｌの非イオン界面活性剤（トリトン
−１００：を発酵器に添加した。

ゆるく結合したプルラナーゼを水溶性型に変えるために
、非イオン界面活性剤と培養ビール（生産物培地）を発
酵器（５５０ｒｐｒｒ中で１２時間連続的に撹拌した。

次に、水溶性プルラナーゼを含有する培養ビールを、細
胞外プルラナーゼの試験試料の確保に用いたものと同じ
試験操作下で遠心分離した。

その結果生成した上澄は、１ｍｌの生成培地に対して７
２０単位のプルラナーゼを含有していることがわかった
（細胞外プルラナーゼと界面活性剤により溶解したプル
ラナーゼの双方を含む）。

本発明のＮＲＲＬ−Ｂ−５７８０突然変異体により製造
された総プルラナーゼを測定するために、細胞の崩壊な
しの徹底的なプルラナーゼ抽出を行なった。

生産酵素からのプルラナーゼの徹底的抽出に使用する操
作は次の通りであった。

１．１００７７２１の発酵ビールを５００ｍ１の三角フ
ラスコに入れ、０．５ｍｌ！の界面活性剤（トリトンＸ
−１００）をそれに添加した。

２、次にそのフラスコを回転振とう器（２６５ｒｐｍ２
８℃でのＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋＲｏｔａｒｙＳｈａ
ｋｅｒ）中で２０時間撹拌した。

３、次に、前記プルラナーゼ分析試験操作により製造さ
れたプルラナーゼ試験品から、プルラナーゼ試験試料を
取出した。

４、遠心（前記）と傾瀉により液から不溶物を分離した
。

５、不溶性遠心残渣を１００ｍ１の蒸留水で２回洗浄μ
プラルラナーピ試験はそつ後の沈水で行線オ必。

６、次に、その洗浄し遠心した固体を、０．４．９の界
面活性剤と１００ｍ１の蒸留水を含有する５００ｍ１の
三角フラスコ中に入れた。

７、（３）ｌ＆階のプルラナーゼ試験品が０．５プルラ
ナ一ゼ単位／ｍｌ以下のプルラナーゼ収量を示すまで、
（２）〜（６）段階を引続き反復した。

発酵ビール上の（３）段階のプルラナーゼのための最初
の試験では、前記の７２０単位の値にほとんど等しかっ
た。

その後に試験した総プルラナーゼの大部分は、次の界面
活性剤−抽出サイクルの直後に得た〔すなわち、（６）
段階の後に（２）と（３）の段階がきた〕。

その後は、次の（３）段階のプルラナーゼ試験は、かな
り低いプルラナーゼ単位値を示した。

徹底的なプルラナーゼ抽出により試験されたプルラナー
ゼ単位の総量は、７０単位／ｙｄ発酵ビールであった。

かくして、細胞外プルラナーゼと表面的結合プルラナー
ゼの双方の総プルラナーゼ収量は、７９０単位／ＴＬｌ
生産培地であった。

１回の界面活性剤抽出段階により高回収性収量が最初に
得られたために（すなわち、７２０単位／ＴＬｌ）、そ
の後の細胞残渣の処理および溶解化は、商業的操作では
大抵適当に除去されている。

細胞外プルラナーゼ二表面的結合プルラナーゼの比は３
９：４０であった。

前記の徹底的なプルラナーゼ抽出の完結時に、不溶性細
胞残渣（５段階からの）にその崩壊を生じさせるように
ソニフイケーション （ｓｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を受けさせた。

その結果生成した細胞なしの溶解質のプルラナーゼを試
験したが、全然含まれていなかった。

一つの製造操業にＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ−５７８３、もう一
つの製造操業にＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ−５７８４を用いて
本例を反復した。

前記試験操作によって、ＮＲＲＬ−Ｂ−５７８３菌株は
６９０単位／ｍｌを与え、ＮＲＲＬ−Ｂ−５７８４菌株
は７４４単位／ｍｌを与えた。

生産培地ビール試験で、これらの二つのＫｌｅｂｓｉｅ
１１ａ菌株は、ＮＲＲＬ−Ｂ−５７８０菌株とほとんど
同じ型でプルラナーゼを与えたことを示した。

菌株は測定可能な量の分子内酵素も製造しなかった。

ＮＲＲ，Ｌ−Ｂ−５７８０と同じく、微生物により製造
されたプルラナーゼは、ＮＲＲＬ−Ｂ−５７８０菌株と
ほとんど同じ性質の本質的には細胞外型と表面的結合型
？、ｆ）＜力。

例２ 本例は、相違する炭水化物源物質がプルラナーゼ生産に
対して有する効果を示した。

培地は、炭水化物源物質が第１表に示したものであるこ
とを除いては、例１と同じ接種培地であった。

操業は３６時間培養であった。

比較の目的のため、同じ培養条件下でＡｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓＡＴＣＣ１５０５０も同じ操業
に従わせた。

それらの結果を次の第１表に示した。

第１表の操業１では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ−５７８０の報告結果が、例１
のものに相関している。

比較の目的で、表示の収量百分率は操業１のＮＲＲＬ−
Ｂ−５７８０のものに関するものである。

操業６，７：８．９および１０に示すように、生産培地
中のマルトースの濃度が増せば、ＮＲＲＬ−Ｂ−５７８
０によるプルラナーゼ製造を抑制する。

逆に、ＡｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓＡＴＣ
Ｃ１５０５０によるプルラナーゼ製造（例えば、操業６
，７，８，９および１０を参照）は、マルトースの存在
下でかなり増強された。

ＡｅｒｏｂａｅＬｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓＡＴＣＣ１５
０５０による最高プルラナーゼ収量（操業６）はマルト
ースのみにより得られたが、この収量は操業１における
ＮＲＲＬ−Ｂ−５７８０の１７．６％にすぎなかった。

それに比べ、２％マルトースを唯一の炭水化物源として
使用した場合、ＮＲＲＬ−Ｂ−５７８０はその操業１見
返り収量の１２．６％しか与えなかった。

唯一の炭水化物源としてのプルランはＫｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ−５７８０に対
して同様な抑圧効果を有したが、ＡｅｒｏｂａｃＬｅｒ
ａｅｒｏｇｅｎｅｓＡＴＣＣ１５０５０によるプルラナ
ーゼ製造はそれによって増強された（操業３参照）。

一般に、比較的高い重合度を有するでんぷんまたはでん
ぷん加水分解物を主な炭水化物源として使用した場合（
例えば、操業１゜２．３，５，９，１０および１５参照
）、ＡｅｒｏｂａｃＬｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓＡＴＣＣ
１５０５０はプルラナーゼを有効に生産することはでき
なかった。

比較してみると、本発明の突然変異体は、糊化でんぷん
の存在下、特に高濃度のアミロペクチンを含有する生産
培地中で、かなりより大きなプルラナーゼ製造能力を有
する。

操業１１で明らかなように、デキストロースを唯一の炭
水化物源として使用した場合、 ＡｅｒｏｂａｃＬｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓＡＴＣＣ１５
０５０はプルラナーゼを生産することができなかったが
、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは本例の
製造条件下で少量のプルラナーゼを製造することができ
た。

操業１１（すなわち、唯一の炭水化物としてデキストロ
ース）を除いて、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ−５７８０は約４７％〜５３％の細
胞外プルラナーゼ（その残りの部分は本質的に表面的結
合型である）を生産したが、ＡｅｒｏｂａｃＬｅｒａｅ
ｒｏｇｅｎｅｓＡＴＣＣ１５０５０は各操業で３５％ま
たはそれ以下の細胞外プルラナーゼを製造した。

前記のように、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅ
ｓ型のプルラナーゼを生産する微生物は一般に、最高プ
ルラナーゼ収量を与えるための炭水化物インデューサー
を必要とする。

本発明の突然変異体はこれらの炭水化物インデューサー
により抑圧される。

低り、Ｅ、および高アミロペクチン含有量を有するでん
ぷん基質（ＳＴＡ−ＴＡＰＥｌｌｏ）は、ＮＲＲＬ−Ｂ
−５７８０によるプルラナーゼ製造を増進する。

このことはＮＲＲＬ−Ｂ−５７８０操業１，２および５
の収量により明らかである。

これらの高アミロペクチンでんぷん基質（４０〜４５％
糊量での）の粘度特性は、それぞれ約５０００ｃｐｓ、
２０００ｃｐｓおよび極度に高い粘度である。

第１表の操業１，２および３の間の収量百分率の比較に
より明らかなように、高アミロペクチン含有量の培地基
質は糊化パールでんぷんよりもプルラナーゼ製造に貢献
する。

操業１５および１６では、でんぷんのアミロペクチン部
は過剰に加水分解され、プルラナーゼ製造能力を抑制す
る、比較的高比率の低り、Ｐ、多糖類の炭水化物源物質
をも含有する。

例３ 生産培地が補充第一鉄イオンを含有すると、増進された
プルラナーゼ収量が得られる。

第２表に示した種々の量の第一鉄イオン、コーンスチー
プリカーおよび培養時間を除いては、例１と同様にして
本例はプルラナーゼ製造を行なった。

その結果を第２表に示した。

前記操業２０と２１を比較することにより明らかなよう
に、補充第・−鉄イオン（０，７ｍ９の第一鉄イオンを
含有するコーンスチープリカーを使用）／ｌの使用で、
１０％以上のプルラナーゼ収量の増量を与えた。

比較に基づき、操業２１での６５６単位／ｍｌ収量はさ
らに、ＡｅｒｏｂａｃＬｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓにより
得たものよりはるかに収量の増大を示す。

操業１９，２０，２２および２３における収量を比較す
ることから明らかなように、４．０■／１以上の第一鉄
イオンの増大が補充第一鉄イオンなしで得られたものよ
りも高収量を与えたが、操業１９のもの以丘には収量を
増大しなかった。

本発明に使用される微生物は、マルトース、デキストロ
ース、ラクトースおよびフルランから選択された炭水化
物が唯一の炭水化物源として使用される場合のプルラナ
ーゼ生産に比べて、アミロペクチンが唯一の炭水化物源
として使用される場合に、より多くのプルラナーゼ単位
を生産することを特色とする。

唯一の炭水化物源としてのこれらの相違する炭水化物に
よる比較的プルラナーゼ収量の測定では、特定の唯一の
炭水化物源物質をそれに代えることを除いては、例１に
特定した生産培養条件下での生産培地を使用すべきであ
る。

唯一の炭水化物源としてのデキストロースの存在下での
プルラナーゼを生産する能力は、例１の培地と生産培養
に従って同様に測定される。

本発明のプルラナーゼ単位／ｍｌ生産培地は、例１のプ
ルラナーゼ分析操作に従って測定される。

細胞外プルラナーゼの量は、例１に示したように、ゆる
く結合したプルラナーゼをそれから離す前に（例えばそ
の界面活性剤遊離の前に）、生産培地中の水溶性プルラ
ナーゼの量に基づき確かめられる。

表面的結合プルラナーゼは、例１のその界面活性剤抽出
によるプルラナーゼ分析（崩壊なしての徹底的な界面活
性剤抽出による単（１／ｍｌ生産培地を含む）によって
確かめられる。

細胞外プルラナーゼ：表面的結合プルラナーゼの比（単
位／ｒａｌ生産物ビール）も、例１の分析操作に従って
測定される。

ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬＢ
−５７８０、同Ｂ−５７８３、及びＢ−５７８４の菌学
的性質は、下記の通りである。

■形態 小さな桿状菌で、ダラム陰性、胞子を形成せず、運動性
はない。

■培地と培養条件 ■、培地 （１）組成： ワキシースタ−−チ２％、バクトーペプトン２％、酢酸
アンモニウム０．５％、クエン酸ナトリウム・２Ｈ，０
０，０５％、 Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、ＩＧ（２ＰＯ４０，１％、Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２００，０５％、ＫＣｌ０００５％、Ｆｅ
ＳＯ４・７Ｈ２００，００１％。

（２）ｐＨ：６．６ （３）殺菌条件＝１２１℃、１５分間 ２、培養条件 ２８℃、振とう、好気性。

■生理学的性質 １、デキストロースからの酸生成陽性 ２、デキストロースからのガス生成〃 ３、リジンカルボキシラーゼ〃 ４、オルニチンカルボキシラーゼ陰性 ５−ａ化水素の生成〃 ６、インドールの生成〃 ７、ラクトースからの酸生成陽性 ８、フェニルアラニンデアミナーゼ〃 ９、ウレアーゼ〃 １０、シトレート〃 ■各培地；こおける生育状態 （１）肉汁寒天平板培養二着色した、胞子を形成しない
クリーム様の良好な盛上った生育。

（２）肉汁寒天斜面培養二上記（１）と同極（３）肉汁
液体培養：培養液に通気した場合、良好な生育が得られ
る。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：良好な生育、ゼラチンの
液化は起こらない。

尚、１９７６年のジ・アメリカン・タイプ・カルチュア
ー・コレクション・カタログ・オブ・ストレインズの第
１〜１２版には、第６６〜６７頁にＫｌｅｂｓｉｅｌｌ
ａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの標題で、”Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＴＣＣ１３８８３−ＮＣＴ
Ｃ９６３３−ＮＣＤＣ２９８−５３゜（ＮＣＤＣ４１０
−６ｓ）タイプ３．“′、”Ｊ、Ｇｅｎ、フィクロバイ
オロジー２３３６０９Ｃ１ｃ＋６ｏ〕）”が提案された
ネオタイプとして目録に記載されている。

ＡＴＣＣ１３８８３は提案されたネオタイプ菌株として
同定されているのでその分類学上あるいは血清学上ある
いは生化学上の特徴はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅの新菌株を区別および固定するための国際的
に容認された基準である。

ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬＢ
−５７８０、ＮＲＲＬＢ−５７８３およびＮＲＲＬＢ−
５７８４菌株と国際的に容認されたＫｌｅｂｓ−ｉｅｌ
ｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＴＣＣ１３８８３ネオタイ
プ菌株との生化学上の比較試験が、アメリカ合衆国イリ
ノイ州デカターのニー、イー、ステーリー、マニュファ
クチュアリング、カンパニーの微生物研究所で行なわれ
た。

生化学試験の結果は以下の通りである。

上記試験データによって説明されるように、ＮＲＲＬＢ
−５７８０，ＮＲＲＬＢ−５７８３およびＮＲＲＬＢ−
５７８４菌株はズルシットからのガス（３２℃で４８時
間発酵後）あるいは酸の発生はいずれも不能であり、こ
れら新規に発生された突然変異体菌株はＡＴＣＣ１３８
８３ネオタイプ菌株とは独特の差違をなしている。

ＮＲＲＬＢ−５７８０，ＮＲＲＬＢ−５７８３およびＮ
ＲＲＬＢ−５７８４として同定されたＫｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株は新規なＫｌｅｂｓｉｅ
ｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株を成す。

プルラナーゼを生産する能力は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ属に共通の性質である。

しかし、これら比較研究は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬＢ−５７８０，ＮＲＲＬＢ−
５７８３およびＮＲＲＬＢ−５７８４と提案されたネオ
タイプ菌株と顕著な生化学上の差違があることを示して
いる。

これらの差違には、例えば、以下の（イ）および（ロ）
がある： （イ）このようなＮＲＲＬ酵素調製物の熱安定性は、Ｋ
ｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＴＣＣ１３
８８３と著しく異なる。

例えば、５０℃で６０分間ではＮＲＲＬＢ−５７８０，
ＮＲＲＬＢ−５７８３およびＮＲＲＬＢ−５７８４菌株
では全く活性は検出されず（０％）、一方ＡＴＣＣ１３
８８３菌株でほぼ１／２（４８％）の活性酵素が残存し
ている。

このデータは、これら新規酵素が主構造において、ネオ
タイプと異なること、を反映している。

（ロ）その上、ＮＲＲＬＢ−５７８０，ＮＲＲＬＢ−５
７８３およびＮＲＲＬＢ−５７８４からのプルラナーゼ
による０、５５％ワキシーメイズスターチの相対加水分
解は、ネオタイプ菌株と異なっている。

ＮＲＲＬＢ−５７８０，ＮＲＲＬＢ−５７８３およびＮ
ＲＲＬＢ−５７８４培地は、ＡＴＣＣ１３８８３菌株の
場合のより高度な活性（５０％）との比較では、たった
の３０−３７％の相対活性域であることを示している。

ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＴＣＣ９
６２１はネオタイプ菌株（５０℃で６０分後３７．３％
活性があり、０．５５％ワキシーメイズスターチの４９
％加水分解）と似ているが、ＫｌｅｂｓｉｅｌＩａｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬＢ−５７８０，ＮＲＲＬＢ−
５７８３およびＮＲＲＬＢ−５７８４菌株とは似ていな
い。

ＮＲＲＬＢ−５７８０，ＮＲＲＬＢ−５７８３およびＮ
ＲＲＬＢ−５７８４菌株は、ネオタイプ菌株を含む従来
のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株との
比較において例外的に高いプルラナーゼ゛生産能を有し
ている。

本発明の実施の態様は次の通りである。

（１）栄養培地は主な炭水化物源（総炭水化物重量に基
づき）としてアミロペクチンを含有し、さらに栄養培地
は少なくとも３：１の重量比（乾燥物質に基づき）のア
ミロペクチン：プルランマルトース、デキストロースお
よびラクトースからなる群から選ばれた炭水化物を特徴
する特許請求の範囲による方法。

（２）栄養培地は本質的に発酵性糖とプルランを含まず
、主な炭水化物源としてアミロペクチンを特徴する特許
請求の範囲による方法。

（３）炭水化物源はほとんどすべてがアミロペクチンか
らなる、特許請求の範囲および前記（１）〜（２）のい
ずれかによる方法。

（４）栄養培地中のアミロペクチン：非アミロペクチン
炭水化物の重量比（乾燥重量に基づき）は少なくとも９
：１である、特許請求の範囲および前記（１）〜（２）
のいずれかによる方法。

（５）栄養培地の炭水化物源は本質的に２０％以下のり
、Ｅ、を有する同化性でんぷんからなる、特許請求の範
囲および前記（１）〜（４）のいずれかによる方法。

（６）栄養培地の炭水化物源は本質的に５％以下のり、
Ｅ、を有する同化性でんぷんからなる、前記（５）によ
る方法。

（７）プルラナーゼの製造は２５°Ｃ〜３５℃の温度で
行なわれる、特許請求の範囲および前記（１）〜（６）
のいずれかによる方法。

（８）栄養培地中の炭水化物源はほとんどすべてが２．
０％以下のり、Ｅ、を有するアミロペクチンであり、栄
養培地の培養は少なくとも５００プルラナ一ゼ単位／ｍ
ｌ生産培地のプルラナーゼ収量を与えるのに充分である
時間、２５℃から３５℃までの温度で行なわれる、前記
（７）による方法。

（９）接種された栄養培地の培養は各ｍｌの生産培地に
対して少なくとも６９０プルラナ一ゼ単位を与えるのに
充分な時間桁なわれる、特許請求の範囲および前記（１
）〜（力のいずれかによる方法。

（１０）微生物は唯一の炭水化物源としてのアミロペク
チンの存在下で、３：４〜２：１の細胞外プルラナーゼ
単位二表面的結合プルラナーゼ単位の比を特徴する特許
請求の範囲および前記（１）〜（９）のいずれかによる
方法。

αυ微生物により製造されたほとんどすべてのプルラナ
ーゼは、３：４〜２：１の細胞外プルラナーゼ二表面的
結合プルラナーゼの単位比を有する細胞外型と表面的結
合型である、特許請求の範囲および前記（１）〜（９）
のいずれかによる方法。

（Ｌ２）栄養培地は微生物によるプルラナーゼ生産を増
進させるのに充分な量で、同化性無機窒素源を特徴する
特許請求の範囲および前＝ｉυのいずれかによる方法。

（１３）栄養培地は、１００重量部の培地に基づき、０
．２５〜２重量部の同化性アンモニウム塩と３〜４重量
部のコーンスチープリカーを含有する、前記（９）によ
る方法。

（１４）生産培地からプルラナーゼを回収する前に、表
面的結合プルラナーゼを水溶性型に変えるため、および
それによって水溶性型で総プルラナ−ゼ収量の少なくと
も８５％を含有する生産培地を与えるために、有効量の
界面活性剤で前記培地が処理される、特許請求の範囲お
よび前記（１）〜（１３）のいずれかによる方法。

０５）栄養培地は各ｌの栄養培地に対して１ｍ９以上の
第一鉄イオンを特徴する特許請求の範囲および前記（１
）−（１４）のいずれかによる方法。

（１６）栄養培地は、１００重量部の栄養培地に基づき
、１〜６重量部のアミロペクチン（ｄ、ｓ、ｂ、）、２
〜１５重量部の窒素源（ｄ、ｓ、ｂ、）を含有し、前記
窒素源は１：１〜１５：１の範囲の重量比（ｄ、ｓ、ｂ
−）の同化性有機窒素源と同化性無機窒素源、および少
なくとも５００単位プルラナーゼ／ｍｌ栄養培地を微生
物が生産させるための栄養培地を、同化性アミロペクチ
ンと同化性窒素源とに組合せて与える有効量の第一鉄イ
オンとからなり、前記栄養培地の培養は少なくとも５０
０プルラナ一ゼ単位／ｍｌ生産培地の生産培地を与える
のに充分な時間、２５℃〜３５℃の温度で行なわれる特
許請求の範囲および前記（１）〜αりのいずれかによる
方法。

（１７）栄養培地は、１００重量部の栄養培地に基づき
、３〜５重量部（ｄ、ｓ、ｂ、）のコーンスチープリカ
ー、０，２５〜２重量部の同化性水溶性無機窒素塩、お
よび各ｌの栄養培地に対して２ＴｒＩｆｌ〜５■の第一
鉄イオンを含有する、前言列６）による方法。

０８）同化性水溶性無機塩のほとんどすべてが同化性ア
ンモニウム塩からなる、前記（１７）による方法。

（１９）（ａ）大部分の炭水化物（等量の炭水化物重量
に基づき）が、マルトース、デキストロース、ラクトー
スおよびプルランからなる群から選ばれた炭水化物源で
ある栄養培地中でのプルラナーゼ生産に比べて、唯一の
炭水化物源として２．０以下のり、Ｅ、のアミロペクチ
ンを使用する場合には、少なくとも３倍多くのプルラナ
ーゼを生産し、 （ｂ）前記突然変異体が唯一の炭水化物源としてアミロ
ペクチンを含有する栄養培地で生産される場合には、２
：３から７＝３までの細胞外プルラナーゼ：表面的結合
の細胞プルラナーゼの割合でプルラナーゼを生産し、そ
して、（ｃ）唯一の炭水化物源としてデキストロースを
含有する栄養培地中でプルラナーゼを生産することを特
色とする、はとんどすべてが Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ微生物から
なる、５００プルラナ一ゼ単位／ｍｌ生産培地を越える
プルラナーゼ収量を与えるのに適したＫｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ調製物。

（２０）微生物はＫｌｅｂｓｉｅｌＩａｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ−５７８０，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ−５７８３、および
ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬ−
Ｂ−５７８４からなる群から選ばれた少なくとも一つで
ある、前記０９）による調製物。

（２１）微生物はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ−５７８０である、前記（２０）に
よる調製物。

（２２）（ａ）大部分の炭水化物（等量の炭水化物重量
に基づき）が、マルトース、デキストロース、ラクトー
スおよびプルランからなる群から選ばれた炭水化物源で
ある栄養培地中でのプルラナーゼ生産に比べて、唯一の
炭水化物源として２．０以下のり、Ｅ、のアミロペクチ
ンを使用する場合には、少なくとも３倍多くのプルラナ
ーゼを生産し、 （ｂ）前記突然変異体が唯一の炭水化物源としてアミロ
ペクチンを含有する栄養培地で同化される場合には、２
：３から７＝３までの細胞外プルラナーゼ二表面的結合
の細胞プルラナーゼの割合でプルラナーゼを生産し、そ
して、（ｃ）唯一の炭水化物源としてデキストロースを
含有する栄養培地中でプルラナーゼを生産することを特
色とする、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ微生物から誘導された
プルラナーゼ調製物の存在下で加水分解を行なうことか
らなる、プルラナーゼ調製物によりでんぷんのα−１，
６−グルコシド結合をでんぷん加水分解物に加水分解す
る方法。

（２３）微生物はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ−５７８０，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ−５７８３゜Ｋｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ−５
７８４およびそれらの突然変異体からなる群から選ばれ
た少なくとも一つである、前言改２）による方法。

圓加水分解は、でんぷんを転化シロップ製品に加水分解
するためのアミラーゼを別に組入れて行なわれる、前記
（２２）または（２鍜こよる方法。

（２５）プルラナーゼ調製物はＫｌｅｂｓｉｅＩｌａｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ−５７８０または突然
変異体により製造される、前記内または０４）による方
法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属に属する好気性プルラーゼ生
   産微生物を、その培養菌を与えるように同化性炭素と同
   化性窒素源を含有する水性栄養培地に接種し、プルラナ
   ーゼの生産を導く好気条件下でその培養菌を培養し、そ
   れによってその生産培地をもたらし、その後その生産培
   地からプルラナーゼ調製物を回収することによるプルラ
   ナーゼの製造法において、 Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ種の菌株と
   してＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲ
   Ｌ−Ｂ−５７８０、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ−５７８３またはＫ
   ｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＮＲＲＬ−Ｂ
   −５７８４を使用することを特徴とする、プルラナーゼ
   の製造法。