JPS60186283A - 微生物による新規な耐熱性プルラナ−ゼａの製造法 - Google Patents
微生物による新規な耐熱性プルラナ−ゼａの製造法Info
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- JPS60186283A JPS60186283A JP59043368A JP4336884A JPS60186283A JP S60186283 A JPS60186283 A JP S60186283A JP 59043368 A JP59043368 A JP 59043368A JP 4336884 A JP4336884 A JP 4336884A JP S60186283 A JPS60186283 A JP S60186283A
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- C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
- C12N9/2457—Pullulanase (3.2.1.41)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、広い最適作用ｐＨ域をもつ新規な１１ＩＩＪ
熱性プルラナーゼＡの製造方法に関するものである。
熱性プルラナーゼＡの製造方法に関するものである。
プルラナーゼは、Ｂｅｎｄｅｒらにより、プルラリャ・
プルランの生産する多糖類プルランを加水分解する酵素
として、エーロバクター・エーロゲネス（Ａｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）に、はじめて見出され
た［Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、 ３
６． ３０９ （１９５９） 。
プルランの生産する多糖類プルランを加水分解する酵素
として、エーロバクター・エーロゲネス（Ａｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）に、はじめて見出され
た［Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、 ３
６． ３０９ （１９５９） 。
特公昭４６−７５５９などコ。 そのｆ麦、この酵素は
、アミロペクチンのα−１，６−グルコシド結合を加水
分解し、β−アミラーゼとの併用により、デンプンから
マルトースを収量よく生産で訝ることから注目され、現
在までに同種の酵素かイ１１々の微生物より生産される
ことが知られている。この１１貝の酵素はプルラナーゼ
、イソアミラーゼなと１４１１々の名称で呼ばれている
が、総称してα−１，６−グルコシダーゼと言われてい
る。たとえば、エラセリシア・インターメディアのイソ
アミラーゼ［Ｅｓｃｂｅｒｉｃｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅ
ｄｉａ、 Ａｐｐｌｉｅｄ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋
１５＋ ４９２（１９６７）］、ストレプトコッカス
・ミティスのプルラナーゼ［５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｙｎｉｔｉｓ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、Ｊ、月■。
、アミロペクチンのα−１，６−グルコシド結合を加水
分解し、β−アミラーゼとの併用により、デンプンから
マルトースを収量よく生産で訝ることから注目され、現
在までに同種の酵素かイ１１々の微生物より生産される
ことが知られている。この１１貝の酵素はプルラナーゼ
、イソアミラーゼなと１４１１々の名称で呼ばれている
が、総称してα−１，６−グルコシダーゼと言われてい
る。たとえば、エラセリシア・インターメディアのイソ
アミラーゼ［Ｅｓｃｂｅｒｉｃｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅ
ｄｉａ、 Ａｐｐｌｉｅｄ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋
１５＋ ４９２（１９６７）］、ストレプトコッカス
・ミティスのプルラナーゼ［５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｙｎｉｔｉｓ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、Ｊ、月■。
３３、（１９６８）］、ストレプトマイセス・ｓｐ、
ＮＯ−２８のイソアミラーゼ［Ｊ、 Ｆｅｒｍｅｎｔ、
１″ｅｃｈ、、 ４９．５５２（１９７１）コ、バシ
ルス属のプルラナーゼ［Ａｇｒｉｃ。
ＮＯ−２８のイソアミラーゼ［Ｊ、 Ｆｅｒｍｅｎｔ、
１″ｅｃｈ、、 ４９．５５２（１９７１）コ、バシ
ルス属のプルラナーゼ［Ａｇｒｉｃ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、迭０．１５１５（１９７６）、
５ｔａｒｃｈ、；ｊｙ４．３４０（１９８２’）など
］などがある。
５ｔａｒｃｈ、；ｊｙ４．３４０（１９８２’）など
］などがある。
糧近、プルラナーゼやイソアミラーゼなどのα−１，６
−グルコシダーゼは、デンプンからグルコースの製造や
、デンプンからマルトース、マルトトリオース、マルト
テトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
スなどのマルトオリコ糖の生産においても、これら糖の
増収に有効であることが認めらｔｉでいる。
−グルコシダーゼは、デンプンからグルコースの製造や
、デンプンからマルトース、マルトトリオース、マルト
テトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
スなどのマルトオリコ糖の生産においても、これら糖の
増収に有効であることが認めらｔｉでいる。
しかるに、従来１．知られているプルラナーゼや ′イ
ソアミラーセなどα−１，６−グルコシダーゼは、一般
に熱安定性に劣り（多くは最適温度４５〜５０℃）、ま
た、作用ｐＨ範囲が狭いため、グルコアミラーゼのよう
に酸性側で作用し、熱安定比に優れた酵素（最適作用ｐ
Ｈ４，５付近、最適作用温度６０℃）や、中性〜弱アル
カリ性に最適作用ｐＨをもつ微生物起源マルトオリゴ糖
生成酵素の、全てのアミラーゼに対して使用するには技
術的および経済的に問題があった。
ソアミラーセなどα−１，６−グルコシダーゼは、一般
に熱安定性に劣り（多くは最適温度４５〜５０℃）、ま
た、作用ｐＨ範囲が狭いため、グルコアミラーゼのよう
に酸性側で作用し、熱安定比に優れた酵素（最適作用ｐ
Ｈ４，５付近、最適作用温度６０℃）や、中性〜弱アル
カリ性に最適作用ｐＨをもつ微生物起源マルトオリゴ糖
生成酵素の、全てのアミラーゼに対して使用するには技
術的および経済的に問題があった。
そこで、本発明者らは、グルコアミラーゼ、β−アミラ
ーゼやマルトトリオース以」二のマルトオリゴ糖を生成
するアミラーゼの、いずれのアミラーゼとも併用できる
。最適作用ｐｆ−Ｉ範囲が広く、且つ熱安定性に優れた
α−１，６−グルコシダーゼを産するプルラナーゼが、
最適作用ｐＨ約４．５〜約７．５の極めて広いｐＨ範囲
にあり、また最適作用温度も約６０℃と高温側にある新
規な銅熱比ゾルラナーゼであることを認め新規な耐熱性
プルラナーゼＡと命名した。□本発ｄはこの知見にもと
すい、てなされたものである。すなわち、本発明は、ｐ
ｉ（約４．５〜約７．５の広いｐＨ範囲に最適作用ｐＨ
をもっ４ｆｒ現な耐熱性プルラナーゼＡを生産する、ク
レブシラ・ニューモニアを培養し、培養物から該酵素を
採取するこ七を特徴とするプルラナーゼの製造方法に関
するもので壺る。
ーゼやマルトトリオース以」二のマルトオリゴ糖を生成
するアミラーゼの、いずれのアミラーゼとも併用できる
。最適作用ｐｆ−Ｉ範囲が広く、且つ熱安定性に優れた
α−１，６−グルコシダーゼを産するプルラナーゼが、
最適作用ｐＨ約４．５〜約７．５の極めて広いｐＨ範囲
にあり、また最適作用温度も約６０℃と高温側にある新
規な銅熱比ゾルラナーゼであることを認め新規な耐熱性
プルラナーゼＡと命名した。□本発ｄはこの知見にもと
すい、てなされたものである。すなわち、本発明は、ｐ
ｉ（約４．５〜約７．５の広いｐＨ範囲に最適作用ｐＨ
をもっ４ｆｒ現な耐熱性プルラナーゼＡを生産する、ク
レブシラ・ニューモニアを培養し、培養物から該酵素を
採取するこ七を特徴とするプルラナーゼの製造方法に関
するもので壺る。
以下に、本発明の内容を更に具体□的に説明する。
本発明において使用される、クレブシラ・ニュー モ＝
７ （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
） ＩＪ、 、 Ｂｅｇａｙの細菌同定書（Ｂｅｒｇｅ
ｙｓ ｔｖｉａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｖｅ Ｂａｃｔｓｒｉｏｌｃｇｙ。
７ （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
） ＩＪ、 、 Ｂｅｇａｙの細菌同定書（Ｂｅｒｇｅ
ｙｓ ｔｖｉａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｖｅ Ｂａｃｔｓｒｉｏｌｃｇｙ。
Ｔｈｅ ＷｉｌＬｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ
、） １′ごおいて、以前はエーロバクター・エーロゲ
ネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）
−と区別されていたが、第８版において、エーロバクタ
ーｅエーロゲネスはクレブシラ・ニューモニアに包含さ
れている。エーロバクター属やタレグシラ属細菌がプル
ラナーゼを生産することについては、すでに本発明以１
１１ｊに公知である。たとえば、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｚ、
、３３Ｃ７９（１９６１）ｔ ＭｅｔｈｏｄｉｎＥｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ ■、 ５５５ （１９６６）、 特公
昭４６−７．５５９ 、 Ａｇｒｉｃ、 Ｄｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、、 ３７ 、２８２１ （１９７３）などに
は、エーロバクター・エーロゲネその生産するプルラナ
ーゼの記載があり、また、特公昭５１−５０７２． 特
公昭５８−２２１９７などには、クレブシラ・ニューモ
ニアなどクレブシラ属の生産するα−１，６−グルコシ
ダーゼについての記載がある。しかし、これら文献や特
許公報１こ記載されている酵素は、いずれも熱安定性に
劣っている。すなわち、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｚ、 ３３
４． ７９（１９６１）とＭｅｔｂｏｄｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ ′ｖｖ、 ５５５ （１９６６）にはエ
ーロバクター・エーロゲネスのプルラナーゼの最適作用
温度は４７５℃とあり、Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 ｌ
ｅｍ、＋３７．２８２１（１９７３）には、同じくエー
ロバクター・エーロゲネスのプルラナーゼの最適作用温
度は５０℃であると記載されている。
、） １′ごおいて、以前はエーロバクター・エーロゲ
ネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）
−と区別されていたが、第８版において、エーロバクタ
ーｅエーロゲネスはクレブシラ・ニューモニアに包含さ
れている。エーロバクター属やタレグシラ属細菌がプル
ラナーゼを生産することについては、すでに本発明以１
１１ｊに公知である。たとえば、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｚ、
、３３Ｃ７９（１９６１）ｔ ＭｅｔｈｏｄｉｎＥｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ ■、 ５５５ （１９６６）、 特公
昭４６−７．５５９ 、 Ａｇｒｉｃ、 Ｄｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、、 ３７ 、２８２１ （１９７３）などに
は、エーロバクター・エーロゲネその生産するプルラナ
ーゼの記載があり、また、特公昭５１−５０７２． 特
公昭５８−２２１９７などには、クレブシラ・ニューモ
ニアなどクレブシラ属の生産するα−１，６−グルコシ
ダーゼについての記載がある。しかし、これら文献や特
許公報１こ記載されている酵素は、いずれも熱安定性に
劣っている。すなわち、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｚ、 ３３
４． ７９（１９６１）とＭｅｔｂｏｄｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ ′ｖｖ、 ５５５ （１９６６）にはエ
ーロバクター・エーロゲネスのプルラナーゼの最適作用
温度は４７５℃とあり、Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 ｌ
ｅｍ、＋３７．２８２１（１９７３）には、同じくエー
ロバクター・エーロゲネスのプルラナーゼの最適作用温
度は５０℃であると記載されている。
そして、特公昭５１−５０７２には、クレブシ Ｃう・
ニューモニアの最適作用温度は４５〜５０℃にあり、基
質の不在下では、５ ’０ ℃でｌ Ｉｌ’、ｆ間加熱
処理すると冶んど失活すると記載されている。
ニューモニアの最適作用温度は４５〜５０℃にあり、基
質の不在下では、５ ’０ ℃でｌ Ｉｌ’、ｆ間加熱
処理すると冶んど失活すると記載されている。
このように、従来、知られているエーロバクター属やク
レブシラ屈のプルラナーゼやぼ−１，６−Ｌ。
レブシラ屈のプルラナーゼやぼ−１，６−Ｌ。
グルコシダーゼの最適作用温度は４５〜５０’″Ｃ，ｅ
Ａ度であると考えら回、るのに′Ｘ−ｊシ、本発明のＸ
ノ１規な耐熱性プルラナーゼＡの最適作用温度は６０〜
６３℃の高温側にあり、基質の不在下で５０℃で１時間
加熱しても殆んど活性の低下は認められない（第１図及
ｑ第２図）など、熱安定性に優れた酵素である。本酵素
は、、基質のｑ、右下では当然、熱安疋挽化され、また
カルシウムなどの金ＪｔＱ塩の存在下でも熱安定、１ヒ
されるので、実用的な反応条件においでも、最低６０℃
の温度で反応を′？ｔなうことかできる。
Ａ度であると考えら回、るのに′Ｘ−ｊシ、本発明のＸ
ノ１規な耐熱性プルラナーゼＡの最適作用温度は６０〜
６３℃の高温側にあり、基質の不在下で５０℃で１時間
加熱しても殆んど活性の低下は認められない（第１図及
ｑ第２図）など、熱安定性に優れた酵素である。本酵素
は、、基質のｑ、右下では当然、熱安疋挽化され、また
カルシウムなどの金ＪｔＱ塩の存在下でも熱安定、１ヒ
されるので、実用的な反応条件においでも、最低６０℃
の温度で反応を′？ｔなうことかできる。
一方、最適作Ｊ１１．ｐＨについてみてみると、エーロ
くフタ−・エーロゲネスやクレブシラ属のプルラナーゼ
やα−１，６−グルコシダーゼの最適作用ｐ１”■ ユ
。
くフタ−・エーロゲネスやクレブシラ属のプルラナーゼ
やα−１，６−グルコシダーゼの最適作用ｐ１”■ ユ
。
よ５．０付近（Ｍｅｔｈｏｉ ｉｎ ＥｎｚｙｍｏｌＯ
ｇｙ Ｌ［ｌ 、 ５５５（１９６６） 。
ｇｙ Ｌ［ｌ 、 ５５５（１９６６） 。
特公昭５１−５０７２など】、または、ｐＨ６１１近（
Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｎ、、３７．２８２１
（１９７３） ）にあり、いずれの場合も、特に、ｐ
Ｈ６以」二においてＩよ著しく活性が低下することが甜
られている。
Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｎ、、３７．２８２１
（１９７３） ）にあり、いずれの場合も、特に、ｐ
Ｈ６以」二においてＩよ著しく活性が低下することが甜
られている。
本発明以＋ｉｉＪに、比較的熱安定性に優れたα−１，
６＝グルコシターセを生産する微生物として、たとえば
、バシルス属のプルラナーゼ（特開昭５７−１７４０８
９．５ｔａｒｃｈ、３４，３４０（１９８２））、」５
よびストレプトマイセス属のイソアミラーゼ（Ｊ、 Ｆ
ｅｒｍｅｎｔ、 ’ｌ’ｅｃｈｎｏ１．．４９ 、５５
２ （１９７］、 ） Ｉか知られている。これらの微
生物の生産するプルラナーゼやイソアミラーゼの最ｉｆ
ｄ作用ｉ’４ａ ＩＵは約６０℃にちるが、いずれも７
ｉｉｊ、 ｉｉ作月１ｐＨは５．０にあり、ｐＨ５以ト
で（１層しく活性が１１１：下する。
６＝グルコシターセを生産する微生物として、たとえば
、バシルス属のプルラナーゼ（特開昭５７−１７４０８
９．５ｔａｒｃｈ、３４，３４０（１９８２））、」５
よびストレプトマイセス属のイソアミラーゼ（Ｊ、 Ｆ
ｅｒｍｅｎｔ、 ’ｌ’ｅｃｈｎｏ１．．４９ 、５５
２ （１９７］、 ） Ｉか知られている。これらの微
生物の生産するプルラナーゼやイソアミラーゼの最ｉｆ
ｄ作用ｉ’４ａ ＩＵは約６０℃にちるが、いずれも７
ｉｉｊ、 ｉｉ作月１ｐＨは５．０にあり、ｐＨ５以ト
で（１層しく活性が１１１：下する。
以−１−１説明したように、本発明以１ｉＩに知られて
いたエーロバクター属やクレブシラ属の酵素は熱安定性
に劣り、最１凶作用温度は５０℃前後にあり、また、最
適作用ｐＨも５．０または６０の狭い範囲にある。これ
に対し、本発明により生産されるタレブシラφニューモ
ニアの新規な耐熱性プルラナーゼＡは、最適作用ｐＨが
約４．５〜約７，５の陸めて広い範囲にあり、そして最
適作用温度は６０〜６３℃と極めて熱安定性に優れた酵
素であり、便来、知られていたニーロバフタ属やクレプ
シラ属の酵素とは違った新規な酵素と認められるもので
ある。
いたエーロバクター属やクレブシラ属の酵素は熱安定性
に劣り、最１凶作用温度は５０℃前後にあり、また、最
適作用ｐＨも５．０または６０の狭い範囲にある。これ
に対し、本発明により生産されるタレブシラφニューモ
ニアの新規な耐熱性プルラナーゼＡは、最適作用ｐＨが
約４．５〜約７，５の陸めて広い範囲にあり、そして最
適作用温度は６０〜６３℃と極めて熱安定性に優れた酵
素であり、便来、知られていたニーロバフタ属やクレプ
シラ属の酵素とは違った新規な酵素と認められるもので
ある。
以下に、新規な耐熱性プルラナーゼＡの酵素１１す性質
についてより詳細に記載する。
についてより詳細に記載する。
（１）作用： プルランのび−１，６−グルコシド、詰
合を分解してマルトｌ−ＩＪオースを生成４−る。
合を分解してマルトｌ−ＩＪオースを生成４−る。
また、澱粉、アミロペクチン、グリコーゲンまたはこれ
らの派生物のα−１，６−グルコシド結合を分解する。
らの派生物のα−１，６−グルコシド結合を分解する。
（２）作用ｐＨ４ｉ包囲及び最適作用ｐｌｙ； ｐＨ約
２５〜約１０の極めて広いｐ■１範囲で作用し、最、６
作用温度はｐｆ（約４．５〜約７，５の広い１１氾１ｊ
ｕに畔められた（２％プルラン、０．０５Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ３〜５５）、トリス綴包ｉＩ／ｉ＊（ｐＨ５，！
５〜７．５）およびトリシン鈑１舶１り（ｐＨ７〜８．
５ ） ノもとｒ５０℃で３０分間反応、第１図（ａ）
） （３）作用温１Ｗ範聞及び最速作用温度：約７５℃まで
作用し、最適作用温度は約６３℃に認められた（２％プ
ルラン、０．０５ Ｍｅｌｌ’ｌ酸緩衝液（ｐｌ（５，
０）又は０．０５Ｍ１リス緩衝液（ｐＨ７，０）のもと
て３０分間反応、第１図（Ｉｌｌ ）。
２５〜約１０の極めて広いｐ■１範囲で作用し、最、６
作用温度はｐｆ（約４．５〜約７，５の広い１１氾１ｊ
ｕに畔められた（２％プルラン、０．０５Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ３〜５５）、トリス綴包ｉＩ／ｉ＊（ｐＨ５，！
５〜７．５）およびトリシン鈑１舶１り（ｐＨ７〜８．
５ ） ノもとｒ５０℃で３０分間反応、第１図（ａ）
） （３）作用温１Ｗ範聞及び最速作用温度：約７５℃まで
作用し、最適作用温度は約６３℃に認められた（２％プ
ルラン、０．０５ Ｍｅｌｌ’ｌ酸緩衝液（ｐｌ（５，
０）又は０．０５Ｍ１リス緩衝液（ｐＨ７，０）のもと
て３０分間反応、第１図（Ｉｌｌ ）。
（４） 熱安定性：酵素水溶液を５０℃、５５℃と６０
℃で加熱処ｊｌｌ ｌ、てのち、残存活性を；ｔｉｌｌ
定した。その結果、５０℃では１時間の加熱後も失活は
殆んど認められなかった。
℃で加熱処ｊｌｌ ｌ、てのち、残存活性を；ｔｉｌｌ
定した。その結果、５０℃では１時間の加熱後も失活は
殆んど認められなかった。
５５”Ｃの加熱では２０分の加熱で約２０％失活し、１
時間の加熱で約６０′各失活した。そして、６０℃の加
かでは３０分間ノ９１１熱で約ＢＯ９ｔｙ失活した（第
２１ｘｉ：ｏｌ ）。
時間の加熱で約６０′各失活した。そして、６０℃の加
かでは３０分間ノ９１１熱で約ＢＯ９ｔｙ失活した（第
２１ｘｉ：ｏｌ ）。
（５１ｐｆ−１安定性、ｐｌ（約４〜約１０の範囲で安
定であった（０１Ｍ酢酸酢酸液、リン酸緩雨、佳または
トリス緩画液のもと、室温（２５°Ｃ）で３時間放置後
、残存活性を測定した］第２１名ｌｔｂ＋３゜ （６）阻害剤；本酵素はＩ Ｘ １０ ’ Ｍノ０ｕＳ
Ｏ４、ＨｇＣ１゜Ｚｎ８０４． ＦｅＳＯ４により、ぞ
れそれ約９３ ’ｔ・、約８９％、約８６％、約２９％
１ｉｌＬ害された。同濃度のＡｇＮ０ａ ＋こよっては
殆んと１・１１害されなかった。
定であった（０１Ｍ酢酸酢酸液、リン酸緩雨、佳または
トリス緩画液のもと、室温（２５°Ｃ）で３時間放置後
、残存活性を測定した］第２１名ｌｔｂ＋３゜ （６）阻害剤；本酵素はＩ Ｘ １０ ’ Ｍノ０ｕＳ
Ｏ４、ＨｇＣ１゜Ｚｎ８０４． ＦｅＳＯ４により、ぞ
れそれ約９３ ’ｔ・、約８９％、約８６％、約２９％
１ｉｌＬ害された。同濃度のＡｇＮ０ａ ＋こよっては
殆んと１・１１害されなかった。
（７）債製方法；本酵素は培養」−治Ｒ１／がらｆｉｉ
：ｊ安力・１＝ｎ（４０〜７０％飽和） 、ＤＥＡＥ−
セーｙ−ｒロースカラｌ、クロマトグラフィー（ｉ＜ｃ
ｉＯ〜０．５ＭでｌＪニヤーグラジエンＩ・溶出）とセ
ファデックスＧ−２００カラムクロマトグラフイーによ
り、クロマト的、電気泳動的に均一まで苗製することが
できる。
：ｊ安力・１＝ｎ（４０〜７０％飽和） 、ＤＥＡＥ−
セーｙ−ｒロースカラｌ、クロマトグラフィー（ｉ＜ｃ
ｉＯ〜０．５ＭでｌＪニヤーグラジエンＩ・溶出）とセ
ファデックスＧ−２００カラムクロマトグラフイーによ
り、クロマト的、電気泳動的に均一まで苗製することが
できる。
（８）分子縫；セファデックスＣ，−２００ケル濾過法
により測定した分子ＪＪｉ、は約１２万であった。
により測定した分子ＪＪｉ、は約１２万であった。
（９）力価測、ゼ法；０．ＩＭト１７ス緩衝？ｌ＆に溶
解させた１？６ブルラン液（ｐＨ７，０） ０．５ ｔ
ｎＬにａ ｊｉｉ：の酵素を加え、水で全Ａ１ｍ１とし
４０’Ｃで反応させる。この条件で１時間に１■のグル
コースに相当するＪ泣元カを生成する酵素縫を１単位と
した。
解させた１？６ブルラン液（ｐＨ７，０） ０．５ ｔ
ｎＬにａ ｊｉｉ：の酵素を加え、水で全Ａ１ｍ１とし
４０’Ｃで反応させる。この条件で１時間に１■のグル
コースに相当するＪ泣元カを生成する酵素縫を１単位と
した。
また本発明において使用される新規な耐熱性プルラナー
ゼＡ生産菌の蘭学的性質は下記に示す辿りである。
ゼＡ生産菌の蘭学的性質は下記に示す辿りである。
（１）形態的性質；約０．８×約１．３μの桿菌、通常
、単桿菌あるいは２連状に連なり生Ｈする、運動性はな
く、また胞子形成は認められない。
、単桿菌あるいは２連状に連なり生Ｈする、運動性はな
く、また胞子形成は認められない。
（２）培養的性質；肉汁寒天では、白色で光沢のあ穿刺
培養では、寒天高層の上層、中部、深部ともに糸秋に生
育が認められ、寒天表面にも染落の形成が認められる。
培養では、寒天高層の上層、中部、深部ともに糸秋に生
育が認められ、寒天表面にも染落の形成が認められる。
（３） 生叩的性１１ｊ
生育温度；約５０℃の温度まで生ａするが、最適生育温
度は約４３℃。
度は約４３℃。
１ｉイｆ ｐＨ； ｐＨ約５〜約９めＱＭ ＩＪＨテ１
＝ （Ｒｔ ル。
＝ （Ｒｔ ル。
最適生ＩＴｐＩｌは７付近。
ダラム染色；陰性。
酸素に対する態度；通性鎌気性。
カタラーゼ；陽性。
オキシダーゼ；陰性
β−ガラクトシダーゼ；陽性
硝酸塩の還元；陽性
炭水化物の利用； グルコース、アト；：トール、Ｌ−
アラビノース、エクスリン、イノシトール、マンニトー
ル、Ｌ−ラムノースなどを、ｆ！Ｊ ｒｒ、ｌ シ酸を
生成する。
アラビノース、エクスリン、イノシトール、マンニトー
ル、Ｌ−ラムノースなどを、ｆ！Ｊ ｒｒ、ｌ シ酸を
生成する。
クエン酸の利用；陽性
マロン酸の利用；陽性
メチルレッド反応；陰性
Ｖ Ｉ）反応；陽性
アルギニンの加水分解；陽性
ゼラチンの液化；陰性
硫化水素の生成；陽性
インドール反応；陰性
リジンの脱炭酸；陽性
オルニテンの脱炭酸；」曲性
ウレアーゼ反応；陽性
フェニールアラニンからのフェニルピルビン酸の生成；
陰性 以上の菌学的性質について、Ｂｅｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕ
ａｌ ｏｆＤｅｔｅｒｔｒｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙの第８版（Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｏ＆
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｆ Ｅ ｊ？ＭＰ−７３８７と
して１子託されている。
陰性 以上の菌学的性質について、Ｂｅｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕ
ａｌ ｏｆＤｅｔｅｒｔｒｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙの第８版（Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｏ＆
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｆ Ｅ ｊ？ＭＰ−７３８７と
して１子託されている。
本閑による新規な耐熱性プルラナーゼＡを生産するため
には、窒素源として、ペプトン、肉エナス、カゼイン、
コーンステイープ・リカーのような有機窒素源あるいは
尿素、硫酸アンモニウム、硝酸塩などの無機屋素化合物
と、炭素源として、。
には、窒素源として、ペプトン、肉エナス、カゼイン、
コーンステイープ・リカーのような有機窒素源あるいは
尿素、硫酸アンモニウム、硝酸塩などの無機屋素化合物
と、炭素源として、。
デンプン、アミロペクチン、デキストリン、マルトース
、グルコース、乳糖などを一種または一種以上、そして
これに補足する栄養源として、リン酸塩、マグネシウム
塩、塩化カリウムと、マンガン塩、カルシウム塩、鉄塩
などの金属塩を含む培地が使用される。
、グルコース、乳糖などを一種または一種以上、そして
これに補足する栄養源として、リン酸塩、マグネシウム
塩、塩化カリウムと、マンガン塩、カルシウム塩、鉄塩
などの金属塩を含む培地が使用される。
培養は、ｐＨ５〜９、温度２０〜４５°℃て、通常好気
的に行われる。
的に行われる。
などの有機溶剤を加えて酵素を、尤超１物として収得ン
、インプロパツール、エタノール、メタノールするなど
の手段により、容易に培養物から酵番を回収することが
できる。
、インプロパツール、エタノール、メタノールするなど
の手段により、容易に培養物から酵番を回収することが
できる。
本発明以前に知られているＡｅｒｏｂａｃｔａｒ属ｊｐ
）Ｇｅｂｓｉｅｌｌａ ｌ属の生産するプルラナーゼや
イソアミラーゼなどα−１，６−グルコンダーゼは、＋
４体内に多ｌｉｔの曲カ□イ。□（％Ｉえ６よ１．．９
゜ｒｕ６−７ｓｓ０、 ［特公昭、５１−５０７２など
）ため、培養終了後、１＋ｌ （’ｊｊから酵素を抽出
回収する装作が必要であるという問題があるが、本発明
により生産される新規な耐熱性プルラナーゼＡは、殆ん
どすべて菌体外に１１−産されるため、培養物からの該
酵素の回収は容易であり、工業的に同酵素を製造する際
に商業的に有利に実施することができる。このことも本
発明の大きな特徴として挙げることかできる。
）Ｇｅｂｓｉｅｌｌａ ｌ属の生産するプルラナーゼや
イソアミラーゼなどα−１，６−グルコンダーゼは、＋
４体内に多ｌｉｔの曲カ□イ。□（％Ｉえ６よ１．．９
゜ｒｕ６−７ｓｓ０、 ［特公昭、５１−５０７２など
）ため、培養終了後、１＋ｌ （’ｊｊから酵素を抽出
回収する装作が必要であるという問題があるが、本発明
により生産される新規な耐熱性プルラナーゼＡは、殆ん
どすべて菌体外に１１−産されるため、培養物からの該
酵素の回収は容易であり、工業的に同酵素を製造する際
に商業的に有利に実施することができる。このことも本
発明の大きな特徴として挙げることかできる。
また、新規な耐熱性プルラナーゼＡは前述の如く、最適
作用ｐＩ−ｉが約４．５〜約７．５の広い範ｉＪｌ目ζ
あり、また熱安定性に優れた酵素であるため、現在、宛
１られているデンプンからグルコースを（↓−産するグ
ルコアミラーゼ、デンプンからマルトースを生ｊ！、（
７する４ｉ（４ｒ（勿また（まζ；ＩＩＩ ＋Ｍのβ−
アミラーゼ（まもとよりマルトトリオースを生成するバ
シルス属アミラーゼ（最適作用ｐＨ６，０〜６．５、特
許出願中 ）、マルトテトラオースを生成するシュート
゛モナス属アミラーゼ（最）１η作月！ｐＨ６，５〜８
、Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
作用ｐＩ−ｉが約４．５〜約７．５の広い範ｉＪｌ目ζ
あり、また熱安定性に優れた酵素であるため、現在、宛
１られているデンプンからグルコースを（↓−産するグ
ルコアミラーゼ、デンプンからマルトースを生ｊ！、（
７する４ｉ（４ｒ（勿また（まζ；ＩＩＩ ＋Ｍのβ−
アミラーゼ（まもとよりマルトトリオースを生成するバ
シルス属アミラーゼ（最適作用ｐＨ６，０〜６．５、特
許出願中 ）、マルトテトラオースを生成するシュート
゛モナス属アミラーゼ（最）１η作月！ｐＨ６，５〜８
、Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、、 １４５． １０５ （１９７１）
など】、マルトペンタオースを生成するバシルス〃ムγ
ミラーゼ【最適作用ｐＨ５〜８、Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙａ１５５．２９０ （１９７３
））、マルトテトラオースを生成するアミラーゼ（最適
伴用ｐｉ−１６，３または８．０、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙａ Ａｃｔａ、 ４１０．３３３（１９７
５）またはＡｇｒ、ｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ＋ｎ、
、 ４６．１５３９（１９８２） ）ノＳど、いずれの
アミラーゼとも、それぞれのアミラーゼの最適条件下で
反応をおこなうことができる。
など】、マルトペンタオースを生成するバシルス〃ムγ
ミラーゼ【最適作用ｐＨ５〜８、Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙａ１５５．２９０ （１９７３
））、マルトテトラオースを生成するアミラーゼ（最適
伴用ｐｉ−１６，３または８．０、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙａ Ａｃｔａ、 ４１０．３３３（１９７
５）またはＡｇｒ、ｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ＋ｎ、
、 ４６．１５３９（１９８２） ）ノＳど、いずれの
アミラーゼとも、それぞれのアミラーゼの最適条件下で
反応をおこなうことができる。
以下に、実施例により本発明の詳１ｇ１１を説明する。
実施例 １
より殺菌後、クレブシラ・ニューモニア（ＩＧ６ｂｓｉ
ｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ） Ｆ Ｅ ＲＭ Ｐ
−７３８７を接種し、３０℃で２日間振温培養した。培
養後、遠心分離機により除菌し、得られた上澄液につい
て生産された新規な耐熱性プルラナーゼＡの活性を測定
した結果、培地耐当り５．６単位であった。
ｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ） Ｆ Ｅ ＲＭ Ｐ
−７３８７を接種し、３０℃で２日間振温培養した。培
養後、遠心分離機により除菌し、得られた上澄液につい
て生産された新規な耐熱性プルラナーゼＡの活性を測定
した結果、培地耐当り５．６単位であった。
実施例 ２
実施例１の培地において、可溶性デンプンの代りにアミ
ロペクチン（トウモロコシ）２％ヲ添加した培地につい
て、実施例１と同様にして培養した結果、生産された耐
熱性プルラナーゼは、培地ｒｒｔＬ ＞１′３す、１０
．８単位であった。
ロペクチン（トウモロコシ）２％ヲ添加した培地につい
て、実施例１と同様にして培養した結果、生産された耐
熱性プルラナーゼは、培地ｒｒｔＬ ＞１′３す、１０
．８単位であった。
この結果及び実施例１の結果から明らかな通り、デンプ
ンよりもアミロペクチンを用いた方か酵素の生産量が増
加できることがわかった。
ンよりもアミロペクチンを用いた方か酵素の生産量が増
加できることがわかった。
実１（３ｊ例 ３
実施例Ｊで使用したと同じ組成の培地３ｔを５１容ジャ
ーファーメンタ−に入れ、常法により殺菌後、クレブシ
ラ・ニューモニアＦＥＲＭＰ−７３８７を接Ｕル、ｍ気
ハｌ ’／ｆｍｎ回転ａ ２５０ｒｐｍで培養した。培
養後、遠心分離機により除＋：ｒｌ シ、Ｄト：１．４
のｒ＋ｌ化デンプン液（固形物として１９）に、市販の
大豆β−アミラーゼ３ｏｏ単位（ＡｇｒｉｃＢｉｏｌ、
Ｃｈｅｒｎ、 ４０＋ １５１５ （１９７６）の測定
法によった）と上記方法により得たクレグシラ・ニュー
モニアの！ｆｒ’ｉｉ！な耐熱性プルラナーゼＡを１ま
たは２単位加え、ｐＨ６，０，５５℃で反応させた。
ーファーメンタ−に入れ、常法により殺菌後、クレブシ
ラ・ニューモニアＦＥＲＭＰ−７３８７を接Ｕル、ｍ気
ハｌ ’／ｆｍｎ回転ａ ２５０ｒｐｍで培養した。培
養後、遠心分離機により除＋：ｒｌ シ、Ｄト：１．４
のｒ＋ｌ化デンプン液（固形物として１９）に、市販の
大豆β−アミラーゼ３ｏｏ単位（ＡｇｒｉｃＢｉｏｌ、
Ｃｈｅｒｎ、 ４０＋ １５１５ （１９７６）の測定
法によった）と上記方法により得たクレグシラ・ニュー
モニアの！ｆｒ’ｉｉ！な耐熱性プルラナーゼＡを１ま
たは２単位加え、ｐＨ６，０，５５℃で反応させた。
得られた糖化物の糖組成は高速液１令クロマトグラフ法
により定ｆｆ１Ｌだ。結果は第１表に示す通りであった
。
により定ｆｆ１Ｌだ。結果は第１表に示す通りであった
。
実施例 ４
１） Ｅ ７．７の液化デンプン液に、市販のグルコア
ミラーゼと実施例２て調製した新規な耐熱性プルラナー
ゼＡを１単位加え、固形分濃度３０％、全ｒｉ。
ミラーゼと実施例２て調製した新規な耐熱性プルラナー
ゼＡを１単位加え、固形分濃度３０％、全ｒｉ。
ｈ目０扉りとして、ｒｒＨ５，０、温度６０ ’Ｃで糖
化した。
化した。
糖化液の糖組成のうす析は高速Ｍｉ（’クロマトグラフ
法によった、？ｊＩられた結果を第２表に示す。
法によった、？ｊＩられた結果を第２表に示す。
表から明らかなように、新規な＋ｍｌ熱性プルラーノー
ーゼＡの添加によりグルコースの収Ｉ１１：が増加した
。
ーゼＡの添加によりグルコースの収Ｉ１１：が増加した
。
ここで６２、Ｇ３はそれぞれグルコースの２ ｊ１１休
、３嵐体を示す。
、３嵐体を示す。
実施例 ５
オース生成アミラーゼ２単位と実施例２で調製した新規
な耐熱性プルラナーゼＡを１．５単位を加え、水で全量
１０＋ａＬとし、ｐＨ７，０、温度５０ ’Ｃで糖化し
た。糖化液の糖組成を分析した結呆は第３表に示す通り
であった。
な耐熱性プルラナーゼＡを１．５単位を加え、水で全量
１０＋ａＬとし、ｐＨ７，０、温度５０ ’Ｃで糖化し
た。糖化液の糖組成を分析した結呆は第３表に示す通り
であった。
表から明らかなように、カバ見な血１熱１生ゾルラナー
ゼＡを添加することにより、マルトトリオースの収址が
著しく増加した。
ゼＡを添加することにより、マルトトリオースの収址が
著しく増加した。
第１図ｆａｔとｆｂｌ、第２図（３）と（１１）は、そ
れぞれクレブシラ・ニューモニアの生産する新規な耐熱
性プ性とｐＨ安定性を示している。 □ 特許出願人 工業技術院長 川 １）裕 Ｐｌ；背１品
（の） 育ｘｍ＜−１ 処理−所１犯句 ４ ６ ．８ １１Ｊ １２ Ｐ日
れぞれクレブシラ・ニューモニアの生産する新規な耐熱
性プ性とｐＨ安定性を示している。 □ 特許出願人 工業技術院長 川 １）裕 Ｐｌ；背１品
（の） 育ｘｍ＜−１ 処理−所１犯句 ４ ６ ．８ １１Ｊ １２ Ｐ日
Claims (1)
- 耐熱性プルラナーゼを生産するクレブシラ・ニューモニ
アを培仰し、培養物から新規な銅熱性プルラナービＡを
採取することを特徴とする新規な耐熱性プルラナーゼＡ
の製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59043368A JPS60186283A (ja) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | 微生物による新規な耐熱性プルラナ−ゼａの製造法 |
| EP85301521A EP0158435B1 (en) | 1984-03-07 | 1985-03-05 | Thermostable pullulanase possessing a wide operating ph and process for production thereof |
| DE8585301521T DE3584182D1 (de) | 1984-03-07 | 1985-03-05 | Thermostabile pullulanase mit einem breiten wirkungs-ph-bereich und verfahren zur herstellung derselben. |
| DK102785A DK164600C (da) | 1984-03-07 | 1985-03-06 | Termostabil pullulanase og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelse deraf i en fremgangsmaade til forsukring af stivelse eller i en fremgangsmaade til fremstilling af maltose med hoej renhed |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59043368A JPS60186283A (ja) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | 微生物による新規な耐熱性プルラナ−ゼａの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60186283A true JPS60186283A (ja) | 1985-09-21 |
| JPS6331195B2 JPS6331195B2 (ja) | 1988-06-22 |
Family
ID=12661899
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59043368A Granted JPS60186283A (ja) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | 微生物による新規な耐熱性プルラナ−ゼａの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0158435B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60186283A (ja) |
| DE (1) | DE3584182D1 (ja) |
| DK (1) | DK164600C (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0417475U (ja) * | 1990-06-06 | 1992-02-13 | ||
| WO1992002614A1 (en) * | 1990-08-01 | 1992-02-20 | Novo Nordisk A/S | Novel thermostable pullulanases |
| JPH05236959A (ja) * | 1992-02-28 | 1993-09-17 | Yoshiyuki Takasaki | プルラナーゼ、その製造法及び該酵素を用いる澱粉の 糖化法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2012831A1 (ja) * | 1968-07-12 | 1970-03-27 | Hayashibara Co | |
| JPS536232B2 (ja) * | 1974-01-11 | 1978-03-06 | ||
| US3963575A (en) * | 1974-02-25 | 1976-06-15 | A. E. Staley Manufacturing Company | Producing pullulanase with organisms having a superior capacity to elaborate pullulanase |
| JPS57174089A (en) * | 1981-04-20 | 1982-10-26 | Novo Industri As | Chain dividing enzyme product |
-
1984
- 1984-03-07 JP JP59043368A patent/JPS60186283A/ja active Granted
-
1985
- 1985-03-05 EP EP85301521A patent/EP0158435B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-05 DE DE8585301521T patent/DE3584182D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-03-06 DK DK102785A patent/DK164600C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6331195B2 (ja) | 1988-06-22 |
| DK102785D0 (da) | 1985-03-06 |
| DE3584182D1 (de) | 1991-10-31 |
| EP0158435B1 (en) | 1991-09-25 |
| DK164600C (da) | 1992-12-07 |
| DK102785A (da) | 1985-09-08 |
| DK164600B (da) | 1992-07-20 |
| EP0158435A3 (en) | 1987-05-20 |
| EP0158435A2 (en) | 1985-10-16 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |