DE2018031A1

DE2018031A1 - Verfahren zur Gewinnung niedermolekularer Amylose

Info

Publication number: DE2018031A1
Application number: DE19702018031
Authority: DE
Inventors: Kaname; Yoshida MiVihiko; Okayama Sugimoto (Jaoan)
Original assignee: Hayashibara Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Co Ltd
Priority date: 1969-04-15
Filing date: 1970-04-15
Publication date: 1970-10-22
Also published as: GB1313422A; AU1390670A; FR2039181B1; ZA702482B; NL7005375A; CA973497A; US3729380A; JPS5146817B1; NO134954B; NO134954C; SE368588B; CH525279A; FR2039181A1; BE748973A

Description

Hayashibara Company 15· April 1970

Okayama / Japan SJ/Hu

hao 7096

Verfahren zur Gewinnung niedermolekularer Amylose

Die Erfindung betrifft ein wirtschaftliches Verfahren zur Gewinnung verhältnismäßig niedermolekularer Amylose von geradkettiger Struktur durch selektive enzymatishhe Hydrolyse lediglich der Seitenkettenbindungen in den aus hochmolekularen Glukosepolymeren bestehenden Amylopektinmolekülen der Stärke.

Bekanntlich enthalten Stärken z.B. von klebrigem Mais oder klebrigem Reis Amylopektin, in welchem die Glukosemoleküle baumzweigartig miteinander verbunden sind, während übliche Stärken, z.B. die oberirdischen Stärken von Weizen, Mais und Sago sowie die unterirdischen Stärken von Süßkartoffeln, Weißkartoffeln und Cassava, etwa 20% Amylose enthalten, d.h, ein aus geradkettig miteinander verbundenen Glukosemolekülen bestehendes Polymer mit einem Polymerisationsgrad (weiterhin EG. genannt) von über 1000 und einem Gehalt von etwa 80% Amylopektin. Obwohl man sich über das Molekulargewicht und die Struktur des Amylopektins nicht im klaren ist, soll der P₁G-.

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der verzweigten Teile bei 20 liegen. Entsprechend seiner Struktur ist Amylopektin sogar in verdünnter Lösung sehr klebrig, deshalb werden klebriger .Reis und e- lediglich aus Amylopektin bestehende Stoffe als Ausgangsstoffe für Reiskuchen und Birnenmarmeladekuchen verwendet. Andere Stärken können durch Quellenlassen in heißem V/asser in halbflüssige hochviskose Pasten umgewandelt werden und als Bindemittel zum Papierleijnen und Textilienschlichten, als nahrhafte Kohlenhydratspender und als Bindemittel für Lebensmittel, wie gekochte Fischpaste und Wurst, verwendet werden. In der Industrie haben bis jetzt jedoch nur partiell modifizierte Stärken Anwendung gefunden.

Vor kurzer Zeit hat man damit begonnen, Stärken mit hohem Amylosegehalt zu gewinnen, und zwar Stärkehybride mit 50 bis 80% Amylose; man hat versucht, hier vor allem eßbare Folien zu entwickeln. Auch hat man versucht, in einem wirtschaftlichen Verfahren die Amyloseanteile gewöhnlicher Stärken abzutrennen. Diese Umstände lassen vermuten, daß Stärke aus zwei, ihrer Struktur und ihren Eigenschaften nach völlig verschiedenen Komponenten von unbekanntem Molekulargewicht besteht und daß ihr Verwendungsbereich daher begrenzt ist. Deshalb hat man versucht, unterschiedliche Produkte von charakteristischen, einfachen und homogenen Stärkekompositionen zu entwickeln.

Die Hydrolyse von Stärke erfolgte bis jetzt hauptsächlich mit

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Säure oder Amylase, wie *£— oder ß-Amylase oder Glukomylase, wobei mit Säure oder J^-Amylase eine Mischung von Bestandteilen mit verschiedenen. Molekulargewichten und verschiedener Struktur, die man Mais- oder Stärkesirup nennt, erhält, während man bei der Hydrolyse mit einem anderen Enzym eine Mischung von niedermolekularer Glukose, Maltose, Dextrinen und Oligosacchariden gewinnt.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht in der Entwicklung eines großtechnisch anwendbaren Verfahrens zur Gewinnung von Produkten gleicher Struktur und gleichen Molekulargewichts durch Verwendung von Isoamylase, d.h. einem Enzym, das die .-jC-1 ,6-Glukosid-Bindungen in den verzweigten Teilen des Amylopektins mit Seitenkettenstruktur hydrolysiert und weiterhin .χ,-1,6-Glukosidase genannt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man vorzugsweise klebrige Stärke bei Temperaturen zwischen 85 bis 17O⁰C gelatiniert bzw. verflüssigt und dann die Bindungen der verzweigten Teile der Amylopektinmoleküle der Stärke mit ^-1,6-Glukosidasen selektiv zersetzt.

Ji-Λ ,6-Glukosidase war bis jetzt als Isoamylase der Hefe und als R-Enzym von Pflanzen bekannt. Die das Pluran zersetzende, aus Aerobacter aerogenes erhaltene Pluranase (vgl. "Biochem.Z." 334/ 1961, 79) hat man für Untersuchungen der Stärkestruktur herangezogen'. Diese Enzyme gehören alle zu den ^-1,6-Glukosidasen und haben eine ähnliche spezifische Wirkung auf Stärke,

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wogegen ihre Wirkungen auf Pluran oder Dextran unterschiedlich sind. Da die genannten Enzyme nur dei\ verzweigten Teil des Amylopektins der Stärke zersetzen, gewinnt man geradkettige Amylose mit einer Kettenlänge, d.h. einem Polymerisationsgrad, die ähnlich demjenigen des verzweigten Teils ist. (P,G. 20). Demnach können nunmehr Stärken von komplizierter Struktur in Stoffe von gleichem Molekulargewicht und gleicher Struktur umgewandelt werden.

Untersuchungen über diesbezüglich geeignete Enzyme ergaben neue enzymbildende Stämme, vor allem Pseudomonas amyloderamosa (ATCC 21262) und Escherichia intermedia (ATCC 21073), ferner Strahlenpilze der Gattungen Streptomyces, Actinomyces, Nocardia, Micromonospora und Thermonospora, sowie Pilze der Gattungen Agrobacterium, Azotobacter, Bacillus, Erwinia, Lactobacillus, Leuconostoc, Hycobacterium, Micrococcus, Pediococcus, Sarcina, Serratia, Staphylococcus und Streptococcus. Die Erfinder haben die Eigenschaften der genannten Enzyme und deren Wirkungen auf Stärken untersucht und deren Anwendung zur Gewinnung von Amylose auf wirtschaftlicher Grundlage gefunden. Die Bedeutung der vorliegenden Erfindung ist deshalb erheblich, weil zu erwarten ist, daß die Nachfrage der Stärkeindustrie nach homogen zusammengesetzter amylosehaltiger Stärke schnell steigen wird, nachdem erfindungsgemäß Produkte mit folgenden Eigenschaften gewinnbar sind:

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erstens Amylose von einheitlicher Kettenlänge und Struktur und einem BG-. von etwa 20,

zweitens Amylose als kristallines nichthygroskopisches Pulver, das als Absorptionsmittel für Riechstoffe und Arzneien sowie als Füllstoff und als stabiles Zusatzmittel verwendbar ist;

drittens Amylose mit einer Wasserlöslichkeit von nur wenigen Prozenten, so daß sie sich zur Herstellung von verdaulichen Filmen und Schaumkörpern eignet;

viertensvdank der einfachen Struktur der Amylose ohne verzweigten Anteil - durch Hydrolyse mit ^6-Amylase oder ß-Amylase mit einer Ausbeute von 100% stark abgebaute Stärkesirupe oder reine Maltose;

fünftens aus Amylose - dank ihres verhältnismäßig niedrigen Molekulargewichts und ihrer Wasserlöslichkeit - ein Brotzusatz oder Kohlenhydratquelle für verschiedene Kulturen von Mikroorganismen;

sechstens - dank der geradkettigen, der Zellulose ähnelnden Struktur der Amylose und ihrer Affinität - Zusatzstoffe für Spezialpapier oder Gellulosefolien;

siebentens - dank der vielen Alkoholgruppen des Amylosemoleküls - Ausgangsstoffe zur Herstellung von synthetischen Lenensmitteln, Harzen und Fasern.

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Als Ausgangsstoffe für das neue Verfahren dienten vorzugsweise "klebrige Stärken", wie klebrige Reisstärke,'wachsartige Maisstärke und wachsartige Milostärke, ferner auch Stärken aus Mais, Tapioka, Sago, Süßkartoffeln, Weißkartoffeln, Reis und Weizen. Der Reinheitsgrad der einzelnen Stärken ist bekanntlich unterschiedlich. Alle Stärken müssen durch Waschen so gründlich wie möglich gereinigt werden, da eine Reinigung nach der Hydrolyse schwierig ist..

Die Verflüssigung der Stärken erfolgt, um die Aktivität der Enzyme zu erleichtern und zu vereinheitlichen. Zu diesem Zweck

en -

v,erd Stärkeauf schlämmungen bei Temperaturen von 150 bis 170 G homogen gelatiniert. Obwohl sich in den verzweigten Stärkeanteilen ein Abbau vollzieht,geht dieser nicht bis zur Bildung von Glukose. Maisstärke kann in einer Konzentration von 30 bis 40% verflüssigt werden. Das erhaltene, verflüssigte Produkt ist zwar hochviskos, jedoch können die Stärkeaufschlämmungen dadurch homogen gelatiniert werden, daß man sie in einen mit einer kontinuierlich laufenden Rührvorrichtung versehenen senkrechten Verflüssigungsbehälter unter Rühren und Dampfeinleiten erhitzt (Japan. Patentschrift 426 973). Bei einem pH-Wert der Stärkeaufschlämmungen von 6 bis 5 erhält man nach 5 bis 20 min langem Erhitzen Lösungen mit einem Dextroseäquivalent (D.E.) von 0,5 bis 5,0; erfindungsgemäß ist jedoch ein D.E. von 0,5 bis 1,0% am günstigsten. Durch Erniedrigung des pH-Werts auf etwa 4 läßt sich die Erhitzungszeit verkürzen.

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Nach einer zweiten Methode wird die Stärkeaufschlämmung zwecks Gelatinierung und Dispergierung auf 100 bis 130°C erhitzt, wobei die Temperatur zuerst allmählich auf 100⁰G und dann zur endgültigen Gelatinierung und Dispergierung auf 130^oG erhöht wird. Bei Erhöhung der Konzentration wird die Arbeitsweise schwierig und die Dispergierung unzureichend.

Gemäß einer dritten Methode wird das verflüssigende Enzym, nämlich 4C-Amjla.se, zur Dispergierung und Gelatinierung bis zu einem niedrigen D.E. benutzt. Hierzu wird ^-Amylase in üblicher Menge von 10 bis 20 Einheiten je S Stärke verwandt und bei einem pH-Wert von 6,0 bis 6,5 im vorgenannten Verflüssigungsgefäß unter schnellem Rühren auf 85 bis 95° erhitzt, so daß man innerhalb weniger Minuten ein verflüssigtes Produkt von etwa 0,5 bis 3,0 D.E. erhält. Wird eine oberirdische Stärke, wie Maisstärke, benutzt, so muß man größere Enzymmengen verwenden und nach der Verflüssigung auf 130°G erhitzen, um die Dispergierung abzuschließen und die Enzyme unwirksam zu machen.

Die erhaltene gelatinierte Stärkedispersion muß möglichst schnell gekühlt werden, da die Dispersion auf Grund ihres geringen Abbaugrades sehr viskos ist und da bei sinkender Temperatur die Viskosität noch zunimmt und Amylolyse rückläufig wird, und zwar werden die Lösungen in einen Vakuumkühltank eingesprüht, wodurch eine ausreichende Kühlung durch Selbstverdampfen eintritt. Wird das Enzym auf die gleiche Weise durch

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Versprühen eingeführt, so erfolgt ein gleichzeitiges Mischen und Kühlen. Zweckmäßigerweise verringert man die Viskosität durch die in der angegebenen Weise schnell durchgeführte Hydrolyse, bevor die Amylolyse rückläufig wird. Gleichzeitig wird das Flüssigkeitsgemisch aus dem Kühler in eine große Menge einer bis zu einem bestimmten Grade hydrolysieren Flüssigkeit gegossen und während der Verweilzeit gerührt. Auf diese Weise wird die verflüssigte Stärke verdünnt und hydrolysiert, ohne daß es zu einer Rückläufigkeit kommt. Das verflüssigte Produkt muß entsprechend dem verwandten Enzym naturgemäß auf einer bestimmten Temperatur und einem bestimmten pH-Wert gehalten werden.

Aus den oben genannten Gründen verwendet man am besten hitzebeständige Enzyme, beispielsweise solche der Lactobacillus-Gattungjplantarum ATCC 8008 und* brevis/lFO 334-5) odei^von den Erfindern gefundenen Strahlenpilzenistreptomyces diastatochromogenes/lFO 3357, Actinomyces globisporus/IFO 12208, Nocardia asteroides/IFO 3384', Micromonospora melanosporea/lFO 12515 und Thermonospora viridis/lFO 12207/. Bei Verwendung derartiger Enzyme kann eine Rückläufigkeit dadurch verhindert werden, daß man eine Lösung mit einem pH-Wert von 5 bis 7 zwecks Viskositätserniedrigung auf einer Temperatur von 50 bis 60⁰C hält.

Nach Verbleib langer als eine Stunde in einem mit Rührer versehenen Mischbehälter wird die nunmehr eine verringerte Visko-

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sität aufweisende Flüssigkeit allmählich in einen Reaktionsbehälter eingeführt, in welchem die Reaktion bei optimalem pH-Wert und optimaler Temperatur in 24 bis 28 h beendet wird. Die optimale Reaktionstemperatur liegt bei 4-0 bis 50 .

Den Reaktionsgrad bestimmt man durch Absorption der Blaufärbung mittels 'Her Farbreaktion einer Jod-Kalium j odid-Lö" sung. Die Figuren 1 und 2 zeigen in Diagrammen die mit Hilfe der Farbreaktionen bestimmte Absorptionskraft (in—Ig T) von Amylose und damit den Reaktionsgrad im Verlauf des erfindungsgemäßen "Verfahrens, 3 dagegen zeigt das Verhältnis von Polymerisationsgrad (P.G.) und Löslichkeit (in mg/ml).

Auch nicht hitzebeständige Enzyme zahlreicher anderer Stämme sind anwendbar, indem man die Enzymlösung bei einer Temperatur von 45 bis 4-0⁰G zumischt und die folgende Reaktion bei

ist 40 bis 50 G durchführt; der optimale pH-Wert/4,0 bis 4,5.kann jedoch auch bei 5 bis 7 liegen. Ein Pseudomonas-Enzym hat ein pH-Optimum von 3; offenbar hat es eine von anderen Enzymen unterschiedliche Wirkung auf Stärke. Wenn das Enzym auf die verdünnte Lösung klebriger Maisstärke oder klebriger Reisstärke einwirkt, fällt die erhaltene Amylose allmählich aus und ist leicht abzutrennen.

Die günstigste Konzentration der Lösung zur Vollendung .der Hydrolyse liegt bei 10 ,bis 20%, bei einer Konzentration über 20% ist die Reaktionsgeschwindigkeit geringjUnd ein vollständiger Abbau wird schwierig. Sobald die Blaufärbung das Ende

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der Reaktion anzeigt, wird die Lösung eingedickt und in Pulverform überführt, und zwar durcli Tromme!trocknung oder Sprühtrocknung.

Ist der Verunreinigungsgrad durch, die eingeführten Enzyme oder als Ausgangsstoff verwendete. Stärke sehr groß, so kann man die Reaktionslösung durch Abkühlen, Abschleudern des Niederschlages und Wasserwäsche reinigen. Auch kann der Niedergefällt

schlag erneut zu einer 20%igen Losung aufgelöst/und geschleudert werden, wodurch man ein Produkt mit weniger als 50% Wassergehalt erhält, das dann getrocknet wird. Das Filtrat oder die abgeschleuderte Lösung wird konzentriert, der gebildete Niederschlag abgetrennt und getrocknet.

Beispiel 1.

(A). En zym.au swahl.

Als Verflüssigungsenzym (^-Amylase) wurde eine aus Bacillus subtilis gewonnene ai -Amylase (Haiidelsprodukt der Japan. Firma Nagase Sangyo KK.) benutzt. Die verwendeten oL-Λ ,6-Glukosidasen bereitete man aus

Pseudomonas amyloderamosa (ATCC 21262) Escherichia intermedia (ATGC 21073)

den Strahlenpilzen

dta. nß

Streptomyces diasitoclirojijDgeiS (IiO Actinomyces globisporus (IEO 12208) Nocardia asteroides (Ii¹O 3384)

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Micromonospora melanospora (IFO 12515) Thermonospora viridis (IFO 12207)

sowie den Pilzen

Agrobacterium tumefaciens (IFO 3085) Azotobacter indictts (IFO 3744) Bacillus cereus (IFO 3001) Erwinia aroydese(IFO 3057) Lactobacillus plantarum (ATCC 8008) Leuconostoc mesenteroides (IFO 3426) Mycobacterium phlei (IFO 3158) Micrococcus lysodicticlls (IFO 3333) Pediococcus acidilactici (IFO 3884) Sarcina rutea (IFO 3232) Serratia indica (IFO 3759) Staphylococcus aureus (IFO 3061 und Streptococcus faecalis (IFO 3128).

(B)-. Bestimmung der Enzymaktivitat Mehrere Prüfröhrchen wurden jeweils mit einer Mischungjvon 1,0 g wasserfreier Weißkartoffelstärke 1,0 ml M/1O-Azetatpufferlösung und 8,0 ml Wasser

gefüllt und mit je 1,0 ml ^-Amylaselöung verschiedener Konzentration versetzt und dann in kochendem Wasser stark bewegt. Nach Gelatinierung der Stärke hielt man die Röhrchen-15 min bei 65°C und hierauf zwecks Enzyminaktivierung 10 min in kochendem

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Wasser. Danach wurde 3 min in Wasser von 17°C gekühlt und mit 1 ml 0,1%iger Fuchsinlösung versetzt, die Höhrchen alsdann verschlossen und -zweimal gedreht, um einheitlich gefärbte Lösungen zu erhalten. Die Enzymaktivität der schwächsten Lösung unter den einheitlich gefärbten Höhrchen wurde als 1 Einheit angesehen.

Die Aktivität der Ji-Λ ,6-Glukosidasen bestimmt man in der Wei se, daß

1 ml Enzymlösung

5 ml 1%iger löslicher klebriger Reisstärke und 1 ml 0,5 M-Aeetatpufferlösung vom pH 6,0

vermischt und 30 min bei 40°G inkubiert wurden. 0,5 ml der Reaktionslösung goß man in eine Mischung aus· 0,5 ml 0,01 M Jod-Kalium jodid-Lösung und 15 ml 0,01 N-Schwefelsäure und bestimmte die Schwärzung (optical density) der erhaltenen blau-purpurnen Lösung nach 15 min bei 620 mu Wellenlänge. Die Differenz zwischen der gemessenen und der zu Anfang der Reaktion bestimmten Schwärzung wurde errechnet und die Aktivität zur Erzielung einer Differenz von 0,01 als 1 Einheit bezeichnet.

(0). Bereitung der Enzymlösungen.

(1) Ein aus Escherichia intermedia (ATCG 21073) bereitetes Enzym wurde (in der Menge einer Platindrahtöse) in einer 500 ml-Flasche in 100 ml eines Kulturmediums mit 0,5% Maltose

0,8% Pepton und . ·

0,5% Natriumnitrat

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inokuliert und das Gemisch einer 48stündigen Rüttelkultur mit 125 U/min bei 3O⁰G unterworfen, bis die Aktivität der J^ -1,6-Glukosidase ihr Maximum erreicht. Alsdann werden die Mikroben abgeschleudert.

Bei der Reinigung der erhaltenen Enzymlösung wurden die in einer Ammoniumsulphat-Konzentration von I5 bis ^8% ausgefällten Anteile entfernt, entwässert und getrocknet. Das erhaltene Enzym benutzte man in Form von Lösungen verschiedener Konzentration entsprechend den benutzten Mengen. Der optimale pH-Wert lag bei 5» 5 bis 6,0, die optimale Temperatur bei 45 G.

(2). Eine aus Pseudomonas Amyloderamosa (SB-I5 ATCC 21262) gebildete 0C-I,6-Glukosidase wurde in ein steriles Medium vom pH 7, das aus

2% Maltose

0,2% Natriumglutamat

0,3% (NH^)₂HPO₄

0,1% IQI₂PO₄ und

0,5% MgSO₄-7H₂O

bestand, inokuliert. Nach 120"stundiger Rüttelkultur bei 30 G lag die Enzymaktivität bei 180-220 Einheiten je ml Kulturmedium. Zur Entfernung der Mikroben wurde die Kulturlösung 10 min mit 10.000 U/min zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit zwecks Enzymausfällung unter Kühlen und Rühren mit kaltem Aceton versfetzt, bis die Losung eine Konzentration von 75% hatte und das abgeschleuderte Enzym im Vakuum gefriergetrocknet.

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Ausbeute an ^-1,6-Glukosidase in Pulverform 80 bis 90%. Das im trockenen Zustand stabile Produkt reinigt man durch Aussalzen z.B. mit Ammoniumsulphat. Das Produkt ist im pH-Bereich zwischen 3 bis 6 .stabil.,, der optimale pH-Wert liegt bei 3, die optimale Arbeitstemperatur bei 40 bis 50⁰G.

(3) (■&). Ein aus Lactobacillus plantarum gebildetes Enzym inokulierte man in 7 ml sterilem Medium enthaltend 0,7% verflüssigte Stärke

0,5% Maltose

1,0% Pepton

0,5% Hefeextrakt

0,1% K₂HPO₄

0,05%

0,001% FeSO₄-7H₂O und

2,0%

und kultivierte bei 30 G zuerst 1 Tag und nach Einführung in weitere 10 1 Medium noch zwei Tage. Der pH-Wert der fertigen Eultur lag bei 4,0, die exozellulare Aktivität betrug 16, die endozellulare Aktivität 17, die Gesamtaktivität 33 Einheiten/ ml Lösung.

(b). Eine Platindrahtöse voll einer Schrägkultur von Micrococcus risodicticus (Ii¹O 3333) inokuliert? man in je 100 ml Medium vom pH 7, enthaltend

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Maltose
0,5% Pepton
0,25% Hefeextrakt
0,2% Harnstoff
0,2% Fleischextrakt
0,1% K₂HPO₄
0,45% KCl und
0,05% H

und kultivierte einen Tug. Vier der erhaltenen Medien vmrden in je ein 20 1-Gefäß übergeführt und unter Rütteln mit 200 U/min ο Tage bei SO⁰G einer belüfteten Kultur unterworfen. Der Endwert betrug 8,2, die exozellulare Aktivität 12, die interzellulare 39, die Gesamtaktivität 51 Einheiten je ml Lö sung.

Aus den Kulturlösungen (α) und (b) wurden die Mikroben abgeschleudert, einmal mit reinem V/asser gewaschen, in einer Pufferlösung in einer Volumenmenge von 1/10 der Kulturlosungen vom pH 7,0, die 0,1% Dodecylbenzclnatriumsulfonat enthielt, suspendiert, dann 2 Tage bei 30~C gerührt und zentrifugiert. Die obenstehende Lösung versetzte man bis zu 0,8 Sättigung mit Ammoniumsulphat. Der ausgefallene Niederschlag wurde in Wasser gelost, einen Tag dialysiert und dann zentrifugiert. Die jeweils erhaltenen obenstehenden Flüssigkeiten benutzte man als Enzymlösung.

Der optimale pH-Wert für das Lactobacillus-Enzym war 5_s0 bis

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6,5, für cLas Micrococcus-Enzym 6 bis 7» die optimale Temperatur lag bei etwa 50 bis 60 bzw. '+5 C. Beide zeichnen sich gegenüber anderen Enzymen durch große Hitzebeständigkeit aus.

Eine Platindrahtöse v-:ll einer der aus den Strahlenpilzen -lev Gattungen ßtreptomyces, Actinömyces, Nocardia, Microwird mcnospora und Thermonospora erhaltenen Enzymlösungen/in Je 20 min bei 3O°C sterilisierten 1 1-Flasche in eine Kulturlösung vom pH 7jO, enthaltend

1,0% verflüssigte Stärke

0,5% Pepton

0,5% Fleischextrakt und

O,5%-Salz

inokuliert und i Tige lung bei JO⁰G geschüttelt. Die erhaltenen Enzymlösungen salzt man mit gesättigtem Ammoniumsulphat (bei C,-r-0,6-Sättigung), behandelt mit 0,0>K essigsaurer Pufferlosung vom pH 7»O, absorbiert danach mit DEAE-Zellulose und eluiert zwecks teilv/eiser Reinigung mit einem Gemisch von 0,02-i.'-esGigsaurer Pufferlosung und 0,5 Π-ITaCl-Lösung. Optimaler pH-Wert 5 bis 7, optimale Temperatur 50 bis 60^wC. Im Vergleich zu anderen Enzymen waren die En,zyme sehr hitzebeständig.

(5) Enzyme der Ί1 enzyrnprcduzierenden Gattungen Agrobacterium, Azotcbacter, Bacillus, Erv/inia, Leuconostcc, Mycobacterium, Pedicc:ccus, Sarcina, Serratia, Staphylococcus und Streptococcus v;urden in Je einem 1000 ml Ilclben in einem sterilen Medium, enthaltend

BAD ORiQINA«

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1,4% verflüssigte Stärke

1,0% Pepton

0,5% Hefeextrakt

0,1% K₂HPO₄

0,05% NaCl und

0_v001% MgSO₄-7H₂O

4- Tage lang einer Rüttelkultur unterworfen und dann die abgeschleuderten Mikroben in einer 0,1% Dodecylbenzolnatriumsulfonat-Pufferlösung suspendiert. Hach 2-tägigem Drehen der Kolben bei 30⁰C wird die überstehende Flüssigkeit entfernt und durch Aussalzen mit Ammoniumsulphat (bei 0,8-Sättigung) gereinigt, die erhaltenen Niederschläge in Wasser gelöst, 24 h lang dialysiert und zentrifugiert. Die überstehenden Flüssigkeiten verwendet man als Enzymlösung. Optimaler pH-Wert 5 bis 7, optimale !Temperatur 45 bis 50⁰C.

(D). Prüfung der Zuckerzusammensetzung und des Reaktionsverlaufs.

Die hydrolysierten Stärkelösungen wurden mit Aktivkohle oder durch Ionenaustausch gereinigt und papierchromatographiert, jeder einzelne Chromatοgrammteil mit Wasser extrahiert, hydrolysiert und nach der Somogyi-Methode jede Komponente in Prozentzahlen der insgesamt gefundenen Zuckermengen sowie die Abbaugrade der verflüssigten Lösungen in Prozentzahlen der gesamten Zuckermengen nach Hydrolyse der zu reduzierenden Zukker mit Salzsäure nach der Iane Keynon-Methode und multipliziert mit 0,9 berechnet.

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Das Fortschreiten des Hydrolysevorgangs wurde bestimmt: Die Reaktion wird durch Zusatz von 9 ml N/1O-HC1 je ml Reaktion si ö sang gestoppt und aus der Lösung eine Menge, die 10 ml des nach der Anthron-Methode bestimmten Zuckers entspricht, herausgenommen, wobei 2 ml der Acetatpufferlösung vom pH 4,0 und 0,5 ml einer 0,5%igen wässrigen Jod-Kaliumjodid-Lösung zugefügt wurden, wodurch die Gesamtmenge 100 ml betrug. Nach 30 min wurde die Schwärzung bei Wellenlänge 570 mu bestimmt. Fig. 1 zeigt, wie sich die' Schwärzung entsprechend der Enzymmenge verändert; das Reaktionsende ist an der Kurve ablesbar.

(E). Stärkehydrolyse.

Angewandt wurden 5 bis 10%ige Suspensionen gründlich gereinigter Stärken, vorzugsweise solcher von wächse^em Mais, klebrigem Reis und Weißkartoffeln. Bei Verwendung eines Pseudomonas-Enzyms stellte man die Suspension auf den pH 4-,O bis 5,0. bei anderen Enzymen auf 6,0 ein. Die Suspensionen wurden dann allmählich unter Rühren erhitzt. Zwecks Vollendung der Gelatinierung erhitzte man die Suspensionen abschließend nach 20

ο min unter einem Dampfdruck von 1,5 bis 2,0 kg/cm und kühlte

danach sofort auf 4-5°C ab. Den Lösungen wurden alsdann 20 bis 100 Einheiten ge g Stärke (E/g St) <^,-1,6-Glukosidase zugegeben. Die Reaktion verlief unter Rühren bei 4-5°G während der ersten 15h schnell; der Reaktionsverlauf ist an Hand der Kurve in Fig. 1 an der Jodreaktion zu erkennen. Die Viskosität

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- 19 sank in den ersten 1 bis 2 h schnell.

Bei Benutzung eines Pseudomonas-Enzyms fiel mit Fortschreiten der-Reaktion die gebildete Amylose aus. Nach Beendigung- : der Reaktion wurde das Produkt bis auf 20% konzentriert und über I\acht zwecks Vollendung' des Abscheidens der Fällungen stehen—gelassen. Die abgeschleuderten ITiederschläge löste man in Wasser zu einer 20%igen Lösung wieder auf, kühlte diese zwecks Abscheidung von Niederschlägen, die alsdann abgeschleu-

o '*■

dert, bei 45 C getrocknet und gepulvert wurden.

Bei Verwendung anderer Enzyme wurden die Hydrolysate in gleicher V/eise aufgearbeitet. Für klebrige Reisstärke oder wachsene Maisstärke benutzte man ein Pseudomonas-Enzym. Vergleichsversuche mit anderen Enzymen als dem Pseudomcnas-Enzym zeigten keine unterschiedlichen Ergebnisse.

Beispiel 2..

Eine 30%ige Aufschlämmung gereinigter klebriger Stärke mit einem pH-Wert vcn G,C sowie gleichzeitig Dampf wurden kontinuierlich- unter Druck auf den Boden eines mit Mehrflügelrührer versehenen Zylindersgepreit und aas Gemisch auf 160 bis 165° unter heftigem Rühren erhitzt. Die erhaltene gelatinietrte Flüssigkeit führte man aus dem oberen Zylinderteil durch eine Reihe von Zylindern, in welchen in 10 bis 20 min ein Abbaugrad von 0.5 bis 3$ D.E. erreicht war. Die viskose, verflüssigte Losung wurde schnell mittels eines Reduzierventils

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in einen Vakuumkahler und gleichzeitig ein Lactobacillus-Enzym eingespritzt. Nach sorgfältigem Kühlen und Mischen in einem Mischbehälter führte man die weitere Umsetzung in einem .Reaktionsbehälter im Chargenbetrieb beim pH 6,0 und ^0⁰G unter derartigem fortlaufendem Entfernen der Reaktionsflüssigkeit, daß die Verweilzeit höchstens 1 h betrug*. Dank der

te hohen Konzentration der Lösung könn/ ein .Reaktionsbehälter geringer Kapazität benutzt werden. Nach Beendigung der Reaktion veijjfll^das Produkt zwecks Unwirksammachung der Enzymaktivität erhitzt, dann gekühlt und der ausgefallene niederschlag wie in Beispiel 1 abgetrennt. Eine Aufbereitung durch Konzentrieren wa£ überflüssig.

In der gleichen Weise wurden hitzebeständige Enzyme, die aus 5 otrahlenpilzstämmen, wie z.B. der Gattung Streptomyces gewonnen waren, benutzt und günstige Ergebnisse erhalten. Die Behandlung war sehr einfach, da das Zumischen eines jeden Enzyms bei verhältnismäßig hohen Temperaturen und die Reaktion trotz hoher Konzentration in zwei Stufen erfolgen konnte.

BeiSOiel p.

20 bis 55% Aufschlämmungen verschiedener gereinigter Stärken wurden auf den pH-V/ert von 5,0 eingestellt, mit 5 bis 10 E/g St reiner ^ -Amylase versetzt und unter Druck in dem oben beschriebenen Verflüssigungsbehälter gemäii der Japan. Patentschrift 4-26 978 mittels Dampf unter Rühren auf 90 bis 95°C erhitzt. Nach 3 bis 5 niin erhielt man viskose, gelatinierte,

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durchsichtige, homogene Flüssigkeiten vom D.E. 0,5 bis 1,0.· Während der Abkühlung der sehr heißen Flüssigkeiten auf 55 bis GQ⁰O durch Einspritzen gemäß Beispiel 2 in einen Vakuumkühler wurde kontinuierlich ein von einem Strahlenpilz gebildetes hitzebeständiges Enzym in einer Menge von 20 bis 50 E/g St zugemischt und unter Kühlen und Rühren die erste .Reaktionsstufe durchgeführt, wobei man das Einleiten und Mischen der gelatinierten Flüssigkeit und das Herausnehmen der Reaktionsflüssigkeit derart abstimmte, daß die Verweilzeit im Reaktionsgefäß 1 bis 2 h betrug. Die eine erniedrigte Viskosität aufweisende Reaktionsflüssigkeit wurde sodann in ein weiteren Reaktionsgefäß 25 bis 40 h bei 4-5⁰C nach dem Chargenbetrieb behandelt. Im Falle, daß bereits in der ersten Reaktionsstufe eine Inaktivierung des Enzyms beobachtet war, führte man zusätzliches Enzym dem im Chargenbetrieb arbeitenden nächsten Reaktionsgefäß zu. Soweit das verflüssigte Produkt einen geringen D.E.-Wert hatte und hochviskos war, wurde die Temperatur in der ersten Stufe der Enzymzufuhr auf etwa 60⁰C erhöht und zusätzliches Enzym dem nächsten Reaktionsgefäß zugegeben. Diese Maßnahmen bewirken günstige Ergebnisse.

Zusammenfassung der Yersuchsergebnisse.

(a). Konzentration der verflüssigten Produkte;

Im Beispiel 1 war bei Konzentrationen bis zu 10% mit Hilfe der Farbreaktion keine Änderung des Umsetzungsgrades zu beobachten; bei Konzentrationen über 20% schien die Reaktions-

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geschwindigkeit geringer zu sein. In Beispiel 2 führten 5 bis 30%ige Konzentrationen "zu ähnlichen Ergebnissen wie im Beispiel 1 Konzentrationen bis zu 20%.

(b). Enzymmengen:

Führt man die Umsetzungen 48 h bei 4-5 bis 5O⁰C durch, so waren Enzymmengen über 20 E/g St erforderlich. Mit Enzymmengen unter 10 E/g St verliefen die Umsetzungen sehr langsam. Bei Enzymmengen über 100 E/g St traten andere schädliche Wirkungen auf.

Cc). Polymerisations- und Verzweigungsgrad;

Der durchschnittliche Polymerisationsgrad wird gemäß der Vorschrift "Measuring of reducing end-group according to oxidation with periodic acid" im Buch "Methods in Carbohydrate Chemistry", Bd. 5, S. 251, die durchschnittliche Zahl Aer Verzweigungen nach T.K. Hamilton, P. Smith im "Journal Amer. Chem. Soc." 2§.> 1956, S. 5910, bestimmt.

Tabelle I zeigt die bei der Einwirkung des Pseudomonas Enzyms auf wächserne Maisstärke erhaltenen Polymerisationsgrade (P.G.) und Verzweigungsgrade (Z.G.), Tabelle II die Ergebnisse bei einer zwei- oder dreimaligen Einwirkung des gleichen En*yms auf den gleichermaßen erhaltenen Niederschlag.

Aus den Tabellen I und II dürfte zu entnehmen sein, daß bei Enzymmengen von 50 E/g St der ausgefällte Anteil teilweise nicht vollständig abgebaute Moleküle enthält. Der Polymerisa-

BAD

...23 009843/1304

" - 23 -

tionsgrad von Amylose enthaltenden Stärken ist hoch,- offenbar auf Grund der Tatsache, daß natürliche Amylose im ausgefällten Teil verbleibt; Verzweigungen liegen aber kaum mehr vor.

(d). Ausbeuten der verschiedenen Fraktionen:

Die Ergebnisse diesbezüglicher Versuche, die unter Anwendung von wächserner Maisstärke als Ausgangsstoff durchgeführt wux'-den, zeigen anschaulich die Tabellen 3 und 4-,

(e). Ergebnisse mit verschiedenen Stärken.

Für die entsprechenden Versuche benutzte man jeweils 50 E/g St eines Lactobacillus-Enzyms; die Fraktionen wurden bei 5/^igsr und 10%iger Stärkekonzentration bestimmt. Die Ergebnisse zeigt Tabelle V. Diese deutet an, dal; im gelösten Teil der Folymerisationsgrad (Bereich von 21 bis 25) keine wesentlichen Unterschiede aufweist, voraus zu, schließen ist, daii die Amylose in den verzweigten Teilen abgebaut war. Andererseits weist der hohe Polymerisationsgrad des ausgefällten Teils darauf hin, dais das Produkt nur halb abgebaut war oder natürliche Amylose enthielt»

( f) . Lösliciikeit der Produkte:

Für diesbezügliche Versuche wurde eine Probe in Wasser von vorbestimmter Temperatur gelöst und über Rächt zwecks Bildung eines Niederschlages bei konstanter Temperatur gehalten. In der gesättigten Lösung bestimmte man die Zuckermenge der

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überstehenden Flüssigkeit nach der Anthron-Methode; die gefundene Menge drückt die Löslichkeit aus. Die Ergebnisse der unter Verwendung verschiedener Pseudomonas-Enzyme durchgeführten Versuche zeigt Fig. J, welche mittels Diagrammkurven das Verhältnis zwischen Polymerisationsgrad und Löslichkeit veranschaulicht.

(g). Spezifische Drehvermögen:

Zur Bestimmung der Eotationskraft wurden 2 g jeder Probe in 100 ml einer 30%igen CaClp-Lösung gelöst und die spezifische Drehkraft gemessen. Die Tabelle VI zeigt im weiten Bereich streuende Werte.

(h). Viskositätsbestimmung:

Hierzu benutzte man einen .Rotationsviskosimeter vom B-Typ sowie einen BL-Adapter von 60er Drehung. Die Tabelle VU zeigt verhältnismäßig niedrige Werte.

(i). Hygroskopizität':

3:i einer relativen Feuchtigkeit von 80% und einer Temperatur von ;;0"C wurde die Hygroskopizität der pulvrigen Produkte mit-

einander verglichen. Der Feuchtigkeitsgehalt erreichte in den ersten 72 h 10% und verblieb danach im Gleichgewichtszustand. Es ist; anzunehmen, daß die Eigenschaften der Pulver auf Grund ihrer Kristallin!tat ähnlich denjenigen der Stärken sind. Die Hygroskopzität der pulverförmigen Produkte der löslichen Fraktionen erreichte bei Konzentrationen von 12 bis Λ'6% den Gleich-

... 3/1304 BAD ORlGSNAL

gewichtszustand.

(k) Menge der Verunreinigungen:

Protein- und Ascheanalysen von Produkten, die aus Stärke von wächsernem Mais mittels Pseudomonas-Enzym erhalten waren, legten nahe, daß Stickstoff und anorganische Stoffe von den Enzymen und Ausgangsstoffen herrühren. Die Bestimmungen ergaben die aus nachfolgender Aufstellung sich ergebenden prozentualen Werte.

	Ve runre ini gungen	in °/o
Fraktion	Eohprotein	Asche
gelöste	1,01	0,030
ausgefällte	0,50	0,010

Aus Vorstehendem ist zu entnehmen, daß das erfindungsgemäße Verfahren die Gewinnung niedermolekularer Amylose mit einem Polymerisationsgrad von 20 bis 30 auf wirtschaftlicher Grundlage ermöglicht, wodurch sich für Stärke ein neuer, breitgestreuter Anwendungsbereich ergibt.

"bad origin*¹-

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tabelle I

	Süärk konz.	e—	EnζvT— menge	ί .. ...	j P.G.	ι	■7 ~. CJ · ^ ·
χ -	1		100	.' 3iitanol—P	22,1	I i J	ü, >·
:·ΐ (D	1		100	I S + P	21, ■■;	I I j
A X	5		100	4 O ; O Ό I -t-	! 55"	ί	%?
V * I	5		20	I JL·	29,5 51,0		1,3 2,?
H	IO		50	Λ.		j ί i	1,9
	20		50	3	21,1 55,1	1 I ί	-
:-i (ii)	25		50	S P	20,5 55,5	) ί	-

Stärke von viäclisernera Mais Behandlung nach Beispiel 1 gelöste Fraktion

K: Eartoffölstärke II: Behandlung nach Bei P: gefällte Fraktion

Tabelle II

R e n.lrGi on s- s um en	Stärke- konz.yo	Snzyin- nenge Ξ/κ St	Reaktions- aauer h	S-ITr al:	Z	tion I P-Pr	i^J.G.	aktion
1	■ 5	50	48	"P-C-.		.or.	51,A-	J Z.G.
2	1	50	2A-	19,5		2 2		ί 2,1
5	1	50	2^	17,8		1,5		' 1,5
17,5	1,2	I ί ι,-'

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Tabelle III

	ilnzyir.-	S-Frnktion	Aus- , beute%	P—Fraktion	Ausbeut %	Gesaint-
	nenge E/g St	r.ü.	10,0	P.G.	90,0	_e ausbeute %
π.	100	19,8	19,0	28,1	81,0	70
10	50	21,0	20,1.	54,5	79,9	88
10	50	20,5	15,2	55,1	8Λ,8	92
10	50	20", 8	50,1	55,2	69,9	75
5	100	21,5	28,1	Γ" 89

Tabelle IV

linzy::;-	Γ. G-. ^Ausbeute)	S-Fraktion	Z.G.
r.onpe .■/_G3t	P-Fraktion	20 (10)	1-2
	2C-50 . (Ό)	20 (20)	1-2
	^:' 30-3;-·" :'c5y.'	18-20 (10)	1 - 0
"OO	25-2^· (90)

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iiao 7096

Tabelle V

3t"rkeart	Amylos eausbeut e	10%	Butanol-P- Fraktion	10%	P.G. im Durchschnitt	10%	P-Fral'.:tion	10% StiMcknz,
	S-Fraktion ^;	64	5%	56	S-Fraktion	24	5/^	56
	5%	54	29	46	5/"	21	88	59
	71	51	45	49	24	22	68	81
Tapioka	55	59	60	'11	24	25	79	76
Hn i r.		55	43	45	25	19	65	57
./eisen		59	?5	61
3i^:;:- ki.rLorrol	61	24
3,-.-o

Tabelle VI

Stärke art	Enzym	Fraktion	P. G.	(«) f
"./	Pseudoiiionas t	P S	52 20	188 ,/T
Tr	'.v i ed erholung	P *->	20	195,0 175,5
Lactoba- ciliun	P S	24 21	165,5 150,4

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2010031

Tabelle VII

liao 7096

Stnrke-	Enzym	Frak tion	P.G.	Stärke- kcn.%	Viskosität bei	50^uG	40^w0
art	Pseudo— monas	S	20,8	15 10 : 5	60^UC	1,50 1,29 0,97	1,89 1,40 1 „14
W	Pseudo— ι monas	P	25,7	15 10 5	1,37 0,97 0,89	6,32 4,50 1,58	6 ,'46 4_T85 2,10
Vl	Lacto— bncilltis	; ^S	24,5	15 10 5	6,19 4_T32 1,23	2,03 1,42 1,13	2,25 1,84 1,15
K	Lacto bacillus	S	23,5	15 10 5		3,01 1,82 1,15	5,96 2,40 1 _r48
	Pseudo— monas	S	21,3	15 10 5		1,61 1,20 1,00	2,10 1,75 1,12
E	Millet.	wassr. Gel		10
4^⁰D.. E..	0,94 0,90

BAD OBlGiNAL

Claims

15- April 1970 SJ/fa

hao 7096

Pat entansprüche

^rA\ Verfahren zur Gewinnung niedermolekularer Amylose von gradkettiger Struktur durch Stärkehydrolyse, dadurch gekennzeichnet, daß man vorzugsweise klebrige Stärke bei Temperaturen zwischen 85 bis 170⁰C gelatiniert bzw. verflüssigt (Stufe A) und dann die Bindungen der verzweigten Teile der Aniylopektinmol.eküle der Stärke mitcC-ijö-Glukosidasen selektiv versetzt (Stufe B).

2. Verfahren nach Anspruch 1 _r dadurch gekennzeichnet,, daß

Stärke , _{N o}

man/in Stufe (A) durch Erhitzen bei 130 bis 170 G bis zu einem Abbaugrad von 0_T5 "bis 3,0% D.E. hydrolysiert.

3. Verfaiiren nach Anspruch 1_r dadurch, gekennzeichnet, daß man Stärke in Stufe (A) in Gegenwart vobPC—Amylase bei 80 bis 10O⁰G bis zu einein Abbaugrad von 0,5 "bis 3»0'/ό D.E. erhitzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Stufe (A) verflüssigte Stärke schnell abkühlt und sofort mit 0C -1,6-Glukosidase hydrolysiert.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Stufe (A) verflüssigte Stärke auf etwa 60°C abkühlt und nach Erreichen eines Viskositätsabfalls mit Hilfe eines hitzebeständigen Enzyms auf die Reaktionstemperatur von 40 bis 50⁰C abkühlt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis f-, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (B) mehrere Enzyme mit verschiedenen Eigenschaften im Geniisch oder einzeln nacheinander anwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als·.' -1,6-Glukosidase die hitzebeständigen Lactobacillus-Stämiae

L. plantarum (ATCC 8008) und

L. brevis (IFO 3345)
oder die 3trahlenpils-Stäir.:ne

Streptoniyces diastauochroisogenes" (IFO 3337) . . ActinoEiyces globisporus (IFO 12208) Nocardia asteroides (IFO 3384)

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Microinonospora inelanosporea (IFO 12515) und Thermonospora viridis (IFO 12207)

verwendet.

S. Verfahren nach Anspruch 1 "bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als<5O-1,6-Glukosidase die lus den Gattungen erhaltenen

Pseudomonas amyloderamosa (ATGC 21262) Escherichia intermedia (ATCG 21073) Agrobacterium tumefaciens (IFO 3085) Azotobacter indicus (IFO 37^/J/Ü Bacillus cereus (IFO 3001) Erwinia aroyde (IFO 3057) LeuconoGtoc mesenteroides (IFO 3^-2G) Hycobacterium phlei (IFO 3158) Micrococcus risodicticua (IFO 3333) Pedioooccus acidilactici (IFO 3884) Surcina rutea (IFO 3252) SerratiH indica (IFO 375?) Staph;/1ococcus aureus (IFG 3^61) und Si:repi;ocOCC¹JiS faocaiis (Ix⁵¹O 3128)

Enz.yrae νerv/endet.

0098£3M?-CU BAD ORlGJNAL

9· Verfahren nach Anspruch 1 "bis 8, dadurch gekennzeichnet,

durch
daß man/Einwirkung eines Pseudomonas-Enzyms auf klebrige Stärke eine leicht abtrennbare und besonders reine Amylose mit einem Polymerisationsgrad von 20 bis 50% gewinnt.

1ο. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch, gekennzeichnet, daß man aus den flüssigkeitshaltigen Reaktionsprodukten durch Sprühtrocknung nichthygroskopische, kristalline Amylo.sepulver gewinnt.

11. Verfahren nach Anspruch I^dadurch gekennzeichnet, daß man die erhaltenen reinen Amyloseniederschläge durch Vakuumtrocknen bei 40 bis 50 G und Pulverisieren in poröse, kristalline Amylosepulver überführt.

BAD ORIGINAL 0098A3/1304

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