DE2909093C2

DE2909093C2 -

Info

Publication number: DE2909093C2
Application number: DE2909093A
Authority: DE
Inventors: Shigetaka Ikoma Nara Jp Okada; Sumio Ibaragi Osaka Jp Kitahata; Shigeharu Osaka Jp Yoshikawa; Kentaro Okayama Jp Miyake
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1978-03-09
Filing date: 1979-03-08
Publication date: 1988-01-07
Also published as: US4254227A; JPS54119092A; CA1114317A; FR2419032A1; JPS5819276B2; FR2419032B1; DE2909093A1; GB2019406B; GB2019406A

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Bescheinigung der Reaktionen, die direkt die glucosischen Reste in verflüssigter Stärke auf Fructose- oder Saccharosemoleküle überträgt, bei der Herstellung von Sirupen oder Sirupfeststoffen mit einem Gehalt an Oligosachariden mit Fructoseendgruppen (nachstehend als SFTO bezeichnet), wobei man eine Mischung mit einem Gehalt an verflüssigter Stärke und entweder Fructose oder Saccharose der Wirkung von immobilisierter Cyclodextringlucanotransferase EC 2.4.1.19 unterwirft (nachstehend als CGT bezeichnet).

Wie in den ungeprüften JP-Patentanmeldungen Nr. 72-20 373, 75-63 189 und 75-88 290 und in Arch. Microbiol., Band 111, Seiten 271 bis 282 (1977) (Hans Bender) beschrieben ist, wird CGT von Bakterien vom Genus Bacillus, z. B. Bacillus macerans, Bacillus megaterium, Bacillus circulans, Bacillus polymyxa und Bacillus stearothermophilus und vom Genus Klebsiella erzeugt, z. B. Klebsiella pneumoniae.

Es ist ferner bekannt, SFTO herzustellen, indem man eine Mischung mit einem Gehalt an verflüssigter Stärke und entweder Fructose oder Saccharose der Wirkung einer CGT-Lösung unterwirft, wodurch die glucosidischen Reste der Dextrinmoleküle in der verflüssigten Stärke auf die Fructose- oder Saccharosemoleküle übertragen werden (siehe z. B. die ungeprüfte JP-Patentanmeldung Nr. 72-20 373).

Es ist ferner aus der ungeprüften JP-Patentanmeldung Nr. 75-12 272, und den geprüften JP-Patentanmeldungen Nr. 74-40 949 und 74-40 950 bekannt, daß SFTO, die man mit CGT erhalten hat, verschiedene und zahlreiche Anwendungen als Süßstoffe finden, und daß, obwohl SFTO verdaubar und absorbierbar in vivo sind, sie neue Süßstoffe darstellen, d. h. daß sie im Gegensatz zu Saccharose wenig karieserzeugend sind bzw. wenig Zahnkaries bewirken.

Im Rahmen der Gestaltung der Erfindung wurden Verfahren entworfen und untersucht, die geeignet sind, die vorteilhaften SFTO herzustellen. Dabei wurde festgestellt, daß mindestens drei Reaktionen eintreten, wenn man eine Mischung mit einem Gehalt an verflüssigter Stärke und entweder Fructose oder Saccharose der Wirkung einer wäßrigen CGT-Lösung unterwirft und SFTO erzeugt.

Die Reaktionen sind die nachstehenden:

"Reaktion I":Die Reaktion, die Cyclodextrine aus der verflüssigten Stärke erzeugt. "Reaktion II":Die Reaktion, die die glucosidischen Reste in den Cyclodextrinen, die sich durch "Reaktion I" gebildet haben, auf die Fructose- oder Saccharosemoleküle überträgt. "Reaktion III":Die Reaktion, die direkt die glucosidischen Reste in der verflüssigten Stärke auf die Fructose- oder Saccharosemoleküle überträgt.

Es wurde auch festgestellt, daß man SFTO wirksamer und vorteilhafter herstellen kann, indem man sich hauptsächlich auf die "Reaktion III" stützt, nämlich die Reaktion, die direkt die glucosidischen Reste in der verflüssigten Stärke auf die Fructose- oder Saccharosemoleküle überträgt, also wenn man sie über Cyclodextrin unter Anwendung der "Reaktionen I und II" herstellt.

Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur Beschleunigung der Reaktion, die direkt die glucosidischen Reste in verflüssigter Stärke auf Fructose- oder Saccharosemoleküle überträgt, bei der Herstellung von Sirupen oder Sirupfeststoffen mit einem Gehalt an Oligosacchariden mit Fructoseendgruppen vorgesehen, bei der man eine Mischung mit einem Gehalt an verflüssigter Stärke und entweder Fructose oder Saccharose der Wirkung von Cyclodextringlukanotransferase aussetzt, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Cyclodextringlukanotransferase eine immobilisierte Cyclodextringlukanotransferase einsetzt.

Die Verwendung von kovalent an Träger gebundenen oder in Träger eingeschlossenen Enzymen für biochemische Verfahren ist zwar bekannt; vgl. Chemiker-Zeitung, 11 (1972) 595. Jedoch waren die nachstehend genannten, überraschenden Ergebnisse nicht zu erwarten, denn beispielsweise wird in Enzyme Technology Digest, 1 (1973) 99-134, beschrieben, daß Pullulanase beim Binden an Träger nicht mehr als 43% ihrer Aktivität beibehält und Beta-Amylase sogar inaktiviert wird.

Man immobilisierte CGT auf bekannte Weise und stelle erfindungsgemäß fest, daß die dextrinerzeugende Aktivität bzw. Aktivität zur Dextrinerzeugung pro Gewichtseinheit CGT-Protein stark im Vergleich zu jener des intakten Enzyms (nicht-immobilisierten Enzyms) abnimmt, während die Aktivität zur Spaltung von alpha-Cyclodextrin kaum abnimmt oder in den meisten Fällen zunimmt, und daß ferner die Berührung mit immobilisiertem Enzym die Übertragungsaktivität bzw. Aktivität zur Übertragung von glucosidischen Resten auf Fructose oder Saccharose drastisch steigert, und daß sich SFTO sehr leicht bilden.

Insbesondere wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß die dextrinerzeugende Aktivität pro Gewichtseinheit CGT-Protein auf etwa 10 bis 30% abnimmt, wenn man das Enzym durch Methoden immobilisiert, z. B. durch die Methoden zum Binden an Träger, die vernetzenden Methoden und die einschließenden Methoden, während die Aktivität zur Spaltung von alpha- Cyclodextrin auf etwa 80 bis 130% kaum abnimmt bzw. ansteigt, verglichen mit jeder des intakten Enzyms.

Ferner wurde erfindungsgemäß festgestellt: Wenn man eine vorgegebene Substratlösung mit einem Gehalt an verflüssigter Stärke und entweder Fructose oder Saccharose in gleichen Anteilen und Konzentrationen unter den gleichen Bedingungen entweder mit immobilisiertem oder inaktem Ezym in der gleichen Menge von Aktivität zur Spaltung von alpha-Cyclodextrin (bezogen auf die Gewichtseinheit verflüssigter Stärke) reagieren läßt, ergibt die Verwendung von immobilisiertem Enzym eine bemerkenswert größere Geschwindigkeit der Übertragung pro Gewichtseinheit CGT-Protein als bei intakten Enzym.

Man stellte also erfindungsgemäß fest, daß man eine wesentlich höhere Geschwindigkeit der SFTO-Bildung pro Gewichtseinheit Enzymprotein durch Verwendung von immobilisiertem Enzym erzielen kann.

Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist, daß man die Menge des Enzymproteins, die man zur Erzielung des gleichen Bildungsverhältnisses in diesem Zusammenhang wird überall das Bildungsverhätlnis als Übertragungsverhältnis ausgedrückt) von SFTO auf etwa 1/1,5 bis 1/5 vermindern kann, wenn man immobilisiertes Enzym anstelle von inaktivem Enzym verwendet.

Das erfindungsgemäß verwendete CGT erhält man, indem man Mikroorganismen, die CGT erzeugen können, beispielsweise Bakterien vom Genus Bacillus oder Genus Klebsiella, in einem Nährmedium kultiviert, das jeweils mindestens eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle und mindestens ein Mineral und mindestens ein Vitamin enthält; und indem man das gebildete CGT auf bekannte Weise gewinnt, z. B. durch Zentrifugieren oder Filtrieren der Kulturbrühe und Sammeln der überstehenden Flüssigkeit bzw. des Filtrats, die bzw. das das Enzym enthält; oder durch Gewinnung der Biomasse aus der Kulturbrühe, Extrahieren des Enzyms aus der Biomasse und Sammeln der überstehenden Flüssigkeit bzw. des Filtrats, die bzw. das das Enzym enthält. Gegebenenfalls kann man die rohe Enzymlösung auf bekannte Weise reinigen, z. B. durch Aussalzen, Dialyse, Adsorption an und Desorption von Stärke, Gelfiltration und/oder Ionenaustauschchromatographie.

Das derart erhaltene rohe oder gereinigte Enzym kann man nach freier Wahl auf bekannte Weise immobilisieren, z. B. mit Methoden zum Binden an Trägern, vernetzenden Methoden oder einschließenden Methoden.

Erfindungsgemäß verwendbare Träger (Matrizen oder Unterlagen) sind beispielsweise natürliche organische Makromoleküle, z. B. Cellulose, Stärke, Agar, Natriumalginat, Gelatine und Derivate davon; synthetische organische Makromoleküle, z. B. Polyacrylamid, Polyäthylenglycol, Polyaminpolystyrol und Polyvinylalkohol; und anorganische Substanzen, z. B. Ton, Aluminiumoxid, Glaskeramik und rostfreier Stahl.

Das Immobilisieren kann man auf beliebige bekannte Weise unter pH- und thermischen Bedingugnen durchführen, bei denen CGT stabil ist, z. B. in einem pH-Bereich von etwa 4 bis 10 und einem Temperaturbereich unterhalb von 70°C.

SFTO kann man leicht chargenweise oder kontinuierlich herstellen, indem man eine Mischung mit einem Gehalt an verflüssigter Stärke und entweder Fructose oder Saccharose der Wirkung eines immobilisierten CGT unterwirft.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann man eine beliebige Stärke als Stärkematerial unabhängig von ihrer Herkunft verwenden, beispielsweise Getreidestärke, z. B. jene von Korn bzw. Mais und Weizen, und Knollen- oder Wurzelstärke, z. B. jene aus süßen oder weißen Kartoffeln (white potatoes). Die Stärke behandelt man mit Säure oder alpha-Amylase, und man erhält eine verflüssigte Stärke mit einem Dextroseäquivalent (D. E.) von etwa 3 bis 40, die man als Donor von glucosidischen Resten verwendet. Das Gewichtsverhältnis des Akzeptors mit einem Gehalt an Ketone, z. B. Fructose oder Saccharose zur verflüssigten Stärke liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 0,2 bis 5. Man kann eine einzelne Verbindung, z. B. Fructose oder Saccharose, oder Mischungen, wie z. B. die von isomerisiertem Zucker oder Invertzucker, als Akzeptor verwenden.

Der bevorzugte Konzentrationsbereich der wäßrigen Substratlösung, die den Akzeptor und den Donor enthält, beträgt etwa 10 bis 50 Gew.-%. Das Vorhandensein von Calciumsalz in einer Menge von ca. 10^-4 bis 10^-2 Mol/l (M) in der wäßrigen Substratlösung hält vorteilhaft die Aktivität von CGT konstant.

Die bevorzugten Reaktionsbedingungen, unter welchen CGT konstant und ausreichend reagiert, liegen im pH-Bereich von etwa 5 bis 10 und im Temperaturbereich von etwa 30 bis 70°C.

In allgemeinen verwendet man etwa 1 bi 10 000 Einheiten Aktivität zur Spaltung von alpha-Cyclodextrin (wie nachstehend erläutert) pro Einheit verflüssigte Stärke. Die Reaktion führt man üblicherweise etwa 0,1 bis 100 h lang durch.

Die wäßrige SFTO-Lösung, die man durch die Reaktion erhalten hat, reinigt man und engt sie entweder ein oder entwässert sie auf bekannte Weise und erhält Sirupe oder Sirupfeststoffe. Die Produkte kann man nach freier Wahl als Süßstoffe, Geschmacksstoffe oder Geschmacksverbesserer für verschiedene Lebensmittel, Getränke, Nahrungsmittel, Süßigkeiten, orale Medikamente, Kosmetika, Zahnpasten und Gurgelmittel verwenden.

SFTO haben die Merkmale, daß sie nicht kristallisierbar, wünschenswert viskos, verdaubar und adsorbierbar in vivo sind, jedoch im Gegensatz zu Saccharose wenig karieserzeugend sind.

Nachstehend sind die Aktivitäten von CGT beschrieben:

(a) Dextrinerzeugende Aktivität:

Man stellte eine Mischung her, indem man 0,5 ml Enzymlösung zu 4,5 ml einer Lösung von löslicher Stärke (0,55 Gew.-%) zugab, die beim pH-Wert von 5,5 gepuffert war, und sie bei 40°C 10 min lang inkubierte. Einen aliquoten Teil von 0,5 ml der Reaktionslösung zog man ab und mischte ihn mit 4 ml einer 0,01 mol. (M) I₂/KI-Lösung.

Danach gab man Wasser zu dem Ergebnis und brachte es auf eine Geamtmenge von 20 ml. Die Enzymmenge, die einen1%ige Steigerung im Durchlaßgrad der Lösung bei 660 nm bewirkte, definierte man als eine Einheit der dextrinerzeugenden Aktivität.

(b) Aktivität zur Spaltung von alpha-Cyclodextrin:

Man stellte eine Mischung her, indem man 2 ml einer Saccharoselösung (2,5 Gew.-%) und 0,5 ml einer Enzymlösung zu 2 ml einer alpha-Cyclodextrinlösung (1 Gew.-%) zugab und bei 40°C für einen gegebenen Zeitraum inkubierte.

Einen aliquoten Teil von 0,5 ml der Reaktionslösung zog man ab und mischte ihn mit 0,1 ml einer Lösung (5 Einheiten) von im Handel erhältlicher kristalliner Glucoamylase. Danach inkubierte man das Ergebnis bei 40°C 1 h lang und hydrolysierte nur die Oligosaccharide mit alpha-1,4-glucosidischen Bindungen zu Glucose, jedoch nicht das alpha-Cyclodextrin.

Die Glukosemenge untersuchte man mit der Somogyi-Nelson-Methode.

Die Menge an CGT, die 1 µMol alpha-Cyclodextrin im Zeitraum von 1 min hydrolysierte, definierte man als eine Einheit der Aktivität zur Spaltung von alpha-Cyclodextrin.

Nachstehend wird die Erfindung durch Versuche näher erläutert.

Versuch 1: Herstellung von CGT

Einen Stamm von Bacillus megaterium impfte man in ein flüssiges Medium ein, das man auf übliche Weise hergestellt hatte, und das 1% Weizenkleie, 1% Maisquellwasser, 0,5% Trockenhefe, 1% Polypepton, 0,25% Ammoniumsulfat, 4% lösliche Stärke, 0,1% Harnstoff und 1,0% Calciumcarbonat enthielt (die Prozente sind jeweils auf Gewicht pro Volumen bezogen); und man inkubierte die Mischung bei 37°C 60 h lang unter Belüftung und Rühren.

Das CGT in der überstehenden Flüssigkeit, die man aus der Kulturbrühe erhalten hatte, zeigte eine dextrinerzeugende Aktivität von etwa 40 Einzeiten/ml. Die überstehende Flüssigkeit kühlte man auf etwa 3°C, vermischte sie mit etwa der halben Menge an kaltem Aceton unter Rühren und bildete eine kleine Menge eines weißen Niederschlags.

Den Niederschlag entfernte man aus der Mischung durch Zentrifugieren, und man erhielt eine überstehende Flüssigkeit. 20 l der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit hielt man bei 3°C, vermischte sie mit Ammoniumsulfat bis zu einer 30%igen Sättigung und bildete wieder eine geringe Menge eines weißen Niederschlags. Den weißen Niederschlag entfernte man durch Zentrifugieren und erhielt eine überstehende Flüssigkeit. Die überstehende Flüssigkeit vermischte man mit 300 g Mais- bzw. Kornstärke, rührte 20 min lang und erhielt eine Suspension, die CGT an der Stärke adsorbiert enthielt.

Die Suspension filtrierte man durch eine Filterschicht, die man zuvor hergestellt hatte, indem man 700 g Mais- bzw. Kornstärke mit 500 g Diatomeenerde vermischt hatte, und wusch den Filterkuchen mit einer gesättigten wäßrigen Ammoniumsulfatlösung (30%) fort. Die erhaltenen Stärke wusch man wieder mit einer kalten wäßrigen Acetonlösung (30 Volumen-%) und eluierte das Enzym, das an der Stärke adsorbiert war, mit einer 1/30 M wäßrigen Dinatriumhydrogenphosphatlösung. Das Eluat vermischte man mit einem Ammoniumsalz oder mit Ammoniak, und es bildete sich ein weißer Niederschlag bei einer Sättigung von 25 bis 45%. Den weißen Niederschlag sammelte und entwässerte man und erhielt eine gereinigte CGT-Zubereitung.

Die spezifische Aktivität der CGT-Zubereitung betrug, berechnet als dextrinerzeugende Aktivität, das etwa 60fache jener der überstehenden Flüssigkeit der Kulturbrühe. Die Ausbeute an Aktivität betrug etwa 65%.

Versuch 2: Immobilisierung von CGT

10 g einer im Handel erhältlichen mit Cyanbromid aktivierten Sepharose 4B wusch man mit 2000 ml einer 10^-3 M wässerigen Salzsäurelösung. Eine Mischung, die man durch Zugabe der gewaschenen mit Cyanbromid aktivierte Sepharose 4B zu etwa 50 ml einer 0,1 M Boratpufferlösung mit einem pH-Wert von 8,3 und einem Gehalt an 0,5 mol/l Natriumchlorid und 100 mg gereinigter CGT-Zubereitung als Protein erhalten hatte, das man gemäß der Methode von Versuch 1 erhalten hatte, ließ man zum Immobilisieren von CGT bei Raumtemperatur unter Rühren reagieren. Das immobilisierte CGT sammelte man durch Filtrieren, suspendierte es wieder in 200 ml einer 1 M wässerigen Äthanolaminlösung mit einem pH-Wert von 9,0 und rührte gelegentlich 2 h lang.

Danach sammelte man das immobilisierte Enzym durch Filtrieren, wusch es ausreichend, abwechselnd und wiederholt mit einer Acetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 4,0 und einem Gehalt von 0,5 M Natriumchlorid und mit einer 0,1 M Boratpufferlösung mit einem pH-Wert von 8,3 und einem Gehalt von 0,5 M Natriumchlorid.

Das derart erhaltene Enzym wurde bestimmt und enthielt etwa 50,8 mg Protein, indem man die Menge an CGT-Protein maß, die mit den Filtraten und Waschflüssigkeiten wegfloß.

Daher betrug das Immobilierungsverhältnis von CGT etwa 50,8%.

Es wurde festgestellt, daß die Aktivitäten der intakten Enzyme pro Gewichtseinheit Enzymprotein bemerkenswert und unverhältnismäßig bei der Immobilisierung variieren. Einzelheiten sind in Tabelle 1 gegeben.

Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, daß die Immobilisierung extrem die dextrinerzeugende Aktivität von CGT herabsetzt, jedoch seine Aktivität zur Spaltung von alpha-Cyclodextrin pro Gewichtseinheit Enzymprotein erhöht.

Obwohl der Mechanismus dieses Phänomens nicht geklärt ist, nimmt man an, daß von den drei genannten "Reaktionen I, II und III" die "Reaktion III" durch die Immobilisierung speziell beschleunigt wird.

Während die Grenzwerte für pH-Wert und thermische Stabilität beim intakten Enzym etwa 6 bis 8 bzw. bis etwa 50°C betragen, stabilisiert die Immobilisierung das Enzym und weitet die Grenzwerte auf einen pH-Wert von 5 bis 9 und eine Temperatur von etwa 55°C aus.

Tabelle 1

Versuch 3: Übertragungswirkung von immobilisiertem CGT

Substratlösungen mit einem Gehalt an 5 Gew.-% Saccharose (Akzeptor) und 5 Gew.-% verflüssigter Stärke (Donor) mit D. E.-Werten von 3,6 bzw. 14,0 bzw. 22,0 stellte man her. Aliquote Teile von 5 ml jeder Substratlösung vermischte man mit 130 Einheiten der Aktivität zur Spaltung von alpha-Cyclodextrin (Restaktivität) von entweder gereinigtem intaktem CGT (etwa 0,19 mg), das man gemäß der Methode von Versuch 1 erhalten hatte, oder immobilisiertem CGT (etwa 0,16 mg), das man gemäß der Methode von Versuch 2 erhalten hatte, und inkubierte die Mischungen bei einem pH-Wert von 6,0 und 40°C unter Schütteln.

Den Inkubationsmischungen entnahm man gelegentlich Proben während der Inkubation und bestimmte das Übertragungsverhältnis der glucosidischen Reste auf Saccharose durch Papierchromatographie.

Das Übertragungsverhältnis bestimmte man unter Anwendung der nachstehenden Gleichung:

worin T das Übertragungsverhältnis bedeutet, A die Menge des Akzeptors bedeutet, auf den die glucosidischen Reste übertragen wurden, und B die Geamtmenge des Akzeptors bedeutet, den man als Substrat verwendete.

Die Ergebnisse sind in den Fig. 1 und 2 gezeigt.

Fig. 1 zeigt die Ergebnisse der Versuche unter Verwendung von gereinigtem intakten CGT als Vergleich; und Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der erfindungsgemäßen Versuche unter Verwendung von immobilisertem Enzym.

Wie sich aus den Ergebnissen der Fig. 1 und 2 klar ergibt, bei welchem man gleiche Mengen von Aktivität zur Spaltung von alpha-Cyclodextrin verwendete, erzielte immobilisiertes CGT unter Reaktionsbedingungen, unter welchen man weniger Gewichtseinheiten Enzymprotein verwendete, ein ungefähr zweimal höheres Übertragungsverhältnis im Vergleich zu jenem, das man mit intaktem Enzym erzielte.

Wie in Versuch 2 beschrieben, nimmt man, obwohl der Mechanismus des Phänomens noch unklar ist, aus dem genannten Versuch an, daß die Immobilisierung von CGT bemerkenswert und insbesondere die erwähnte "Reaktion III" von CGT beschleunigt, d. h. die Reaktion, die direkt die glucosidischen Reste in der verflüssigten Stärke (Donor der glucosidischen Reste) auf die Fructose oder Saccharose (Akzeptor der glucosidischen Reste) übeträgt.

Die benötigte Menge an CGT zur Erzielung eines Übertragungsverhältnisses von 20% bestimmte man gemäß der Methode von Versuch 3 unter Bedingungen, bei welchen das Übertragungsverhältnis im Verhältnis zur Menge des verwendeten CGT variierte. Dabei wurde festgestellt, daß man ein vorgegebenes Übertragungsverhältnis mit immobilisiertem CGT erzielen kann, indem man die Hälfte der Menge an CGT-Protein verwendet, die man bei intaktem CGT benötigt.

Das bedeutet, daß die Immobilisierung von CGT extrem die Übertragungsaktivität pro Protein erhöht. Daher kann man die Reaktionszeit drastisch mit immobilisiertem Enzym verkürzen.

Ferner wurde festgestellt, daß man CGT in einer sehr hohen Enzymproteinkonzentration, etwa 0,1 bis 10 Gew.-%, immobilisieren kann, wobei es kaum seine Aktivitäten verliert, und daß man die Subtratlösung kurz der enzymatischen Reaktion unterwirft, u. zwar aufgrund der hohen Aktivität pro g immobilisiertes Enzym.

Das immobilisierte CGT kann man leicht in einem kontinuierlichen System verwenden. Beispielsweise sind Säulen-Reaktionsbehälter, die mit dem Enzym bepackt sind und die man kontinuierlich arbeiten läßt, zur Massenherstellung von SFTO bei niedrigen Kosten außerordentlich vorteilhaft.

Aus den Fig. 1 und 2 ergibt sich klar: Je niedriger der D. E.- Wert der verflüssigten Stärke ist, desto höher ist das Übertragungsverhältnis.

Verflüssigte Stärke mit einem D. E.-Wert von weniger als 2 ist jedoch anfällig für den Abbau und ergibt Schwierigkeiten in der enzymatischen Reaktion. Wenn man verflüssigte Stärke mit einem D. E.-Wert von 40 oder mehr verwendet, nimmt das daraus erhaltene Übertragungsverhältnis und die SFTO-Herstellung ab.

Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

30 Einheiten (je g verflüssigte Stärke auf Basis der Aktivität zur Spaltung von alpha-Cyclodextrin) immobilisiertes Enzym, das man gemäß der Methode von Versuch 2 erhalten hatte, gab man zu einer wässerigen Lösung mit einem Gehalt an 20 Gew.-% verflüsigter Stärke mit einem D. E.-Wert von 5 und 10 Gew.-% Saccharose. Die erhaltene Mischung inkubierte man chargenweise bei einem pH-Wert von 6,0 und 50°C 48 h lang unter leichtem Rühren.

Einen Teil des Filtrates, den man durch Abfiltrieren des immobilisiertes Enzyms aus der Reaktionslösung erhalten hatte, konnte man außerordentlich leicht durch eine beliebige übliche Reinigungsmethode für Saccharide reinigen, d. h. durch Entfärben mit Aktivkohle und nachfolgendes Entsalzen mit Ionenaustauschern (H- und OH-Typen).

Danach engte man die erhaltene Lösung unter vermindertem Druck ein und erhielt SFTO in Sirupform (Produkt A) mit einem Wassergehalt von 20 Gew.-%.

Das Übertragungsverhältnis des SFTO-Produktes betrug etwa 60% und die Ausbeute 90%, bezogen auf das Substrat, das aus verflüssigter Stärke und Saccharose bestand.

Der Sirup hatte eine milde Süße und hohe Viskosität.

Einen anderen Teil des genannten Filtrates unterwarf man der Wirkung von geringen Mengen im Handel erhätlichen alpha- und β-Amylasen; das Ergebnis reinigte man und engte es auf ähnliche Weise ein und erhielt SFTO in Sirupform (Produkt B) mit im wesentlichen dem gleichen Übertragungsverhältnis. Das Produkt A war einfacher zu handhaben, weil seine Viskosität etwa 2/3 jener des genannten Produktes B betrug.

Beispiel 2

Bacillus macerans IFO 3490 impfte man in ein flüssiges Medium ein, das 1% Maisquellwasser, 1% lösliche Stärke, 0,5% Ammoniumsulfat und 0,5% Calciumcarbonat enthielt (die Prozente sind auf Gewicht pro Volumen bezogen) und inkubierte die erhaltene Mischung bei 37°C 3 h lang unter Belüftung und Rühen. Die überstehende Flüssigkeit, die CGT enthielt, erhielt man durch Zentrifugieren der Kulturbrühe, und man reinigte sie gemäß der Methoden von Versuch 1.

Die spezifische Aktivität der gereinigten Enzymzubereitung (bezogen auf die dextrinerzeugende Aktivität) war etwa 30mal höher als jene der überstehenden Flüssigkeit der Kulturbrühe. Die Ausbeute an dextrinerzeugender Aktivität betrug etwa 70%.

Ferner stellte man eine wässerige Gelatinelösung (etwa 10 Gew.-%) her, indem man sie auf etwa 60°C erwärmte und auf etwa 40°C abkühlte. Die Gelatinelösung mischte man mit der genannten Enzymzubereitung und erhielt eine Lösungsmischung mit einer Enzymproteinkonzentration von etwa 0,5 Gew.-%, die man in Toluol schüttete, das man auf 4°C vorgekühlt hatte, und man verfestigte die Gelatine in Perlenform. Den perlenförmigen Feststoff gewann man aus dem Ergebnis durch Filtrieren und wusch ihn nacheinander mit n-Propylalkohol und kaltem Wasser. 10 g des perlenförmigen Feststoffs tauchte man in 150 ml einer wässerigen Glutaraldehydlösung (2,5 Gew.-%), ließ bei Raumtemperatur 30 min lang stehen und ließ ihn mit Glutaraldehyd reagieren. Das Produkt sammelte man durch Filtrieren, entfernte den überschüssigen Glutaraldehyd mit einer großen Wassermenge und erhielt immobilisiertes Enzym.

Eine geringe Menge an Protein entdeckte man in den Filtraten und Waschflüssigkeiten. Das Immobilisierungsverhältnis betrug nahezu 100%. Das Verhältnis der Restaktivität des immobilisierten Enzyms betrug etwa 21% (bezogen auf die dextrinerzeugende Aktivität) und etwa 102% (bezogen auf die Aktivität zur Spaltung von alpha-Cyclodextrin). Die Menge an Enzymprotein, die man zur Erzielung eines Übertragungsverhältnisses von 20% wie in Versuch 3 benötigte, nahm auf 1/1,5 durch die Immobilisierung ab.

Das immobilisierte Enzym packte man in ene Säule mit einem Verhältnis von Durchmesser zu Höhe von 1 : 3. Eine Mischung mit einem Gehalt von 15 Gew.-% verflüssigter Stärke mit einem D. E.- Wert von 10 und 10 Gew.-% Fructose ließ man mit dem immobilisierten Enzym durch kontinuierliches Durchleiten durch die Säule bei 50°C, einem pH-Wert von 6,0 und einer Fließgeschwindigkeit von SV 2 reagieren. Das Übertragungsverhältnis variierte kaum wähend der gesamten Reaktion, die man eine Woche lang laufen ließ, und betrug am Ende der Reaktion etwa 55%.

Die erhaltene Reaktionsmischung reinigte man und engte man ein wie in Beispiel 1, lyophilisierte sie und pulverisierte sie, wodurch man ein weißes pulveriges SFTO-Produkt in einer Ausbeute von etwa 93% erzielte, bezogen auf das Substrat.

Wahlweise konnte man zusätzlich zur Perlenform die Gelatinelösung, die das Enzym enthielt, das in diesem Beispiel hergestellt wurde, leicht in irgendeine andere beliebige Form oder Gestalt, z. B. in Faser-, Film- oder Röhrenform, auf bekannte Weise bringen. Unabhängig von seiner Gestalt oder Form kann man das derart immobilisierte Enzym bei der Herstellung von SFTO verwenden, ohne irgendeinen Unterschied dem Produkt zu verleihen.

Beispiel 3

einen Stamm von Bacillus stearothermophilus impfte man in ein flüssiges Medium ein, das 2% lösliche Stärke 0,5% Ammoniumchlorid, 0,05% Dikaliumphosphat, 0,025% Magnesiumsulfat · 7 H₂O und 0,5% Calciumcarbonat enthielt (die Prozente sind auf Gewicht pro Volumen bezogen), und inkubierte die erhaltene Mischung bei 50°C 3 d lang unter Belüftung und Rühren. Die überstehende Flüssigkeit, die CGT enthielt, erhielt man durch Zentrifugieren der Kulturbrühe und reinigte sie gemäß der Methode von Versuch 1.

Die spezifische Aktivität des gereinigten CGT (bezogen auf die dextrinerzeugende Aktivität) war etwa 50mal höher als jene der überstehenden Flüssigkeit. Die Ausbeute an dextrinerzeugender Aktivität betrug etwa 90%.

Aluminiumoxidpulver (gamma-Al₂O₃ mit einer Teilchengröße von etwa 0,1 bis 0,5 mm) hielt man in einer wässerigen Salpetersäurelösung (5 Gew.-%) bei 90°C 2 h lang, wusch ausreichend mit destilliertem Wasser, danach nacheinander mit Methanol und Äther, trocknete an der Luft und erhielt aktiviertes Aluminiumoxid. Das erhaltene aktivierte Aluminiumoxid ließ man mit 3- Aminopropyltriäthoxysilan in Toluol (10 Vol.-%) 5 h lang unter Rückflußkochen und Erwärmen reagieren. Das gebildete Alkylaminaluminiumoxid gewann man durch Filtrieren, wusch es nacheinander der mit Toluol und Äther und trocknete es an der Luft.

1000 g Alkylaminaluminiumoxid (Träger) tauchte man in eine wässerige Glutaraldehydlösung (1,25 Gew.-%), die mit einer 0,1 M Phosphatpufferlösung auf einen pH-Wert von 7,0 gepuffert war, und hielt bei Raumtemperatur 1 h lang. Den erhaltenen Träger sammelte man durch Filtrieren, wusch sorgfältig mit Wasser, gab eine 0,1 M Acetatpufferlösung mt einem pH-Wert von 6,0 und einem Gehalt von 100 g den genannten CGT zu, ließ danach bei 8°C 16 h lang stehen und immobilisierte das Enzym. Das immobilisierte Enzym gewann man durch Filtrieren, wusch es mit Wasser und verwendete es in der nachfolgenden Übertragungsreaktion. Das Immobilisierungsverhältnis bestimmte man, indem man die Mengen an Protein berechnete, die in den Filtraten und Waschflüssigkeiten wegflossen, und es betrug etwa 75%. Das Verhältnis der Restaktivität des immobilisierten Enzyms betrug etwa 17% (bezogen auf die dextrinerzeugende Aktivität) und etwa 125% (bezogen auf die Aktivität zur Spaltung von alpha- Cyclodextrin). Die Mengen an Enzymprotein, die man zur Erzielung eines Übertragungsverhältnisses von 20% gemäß der Methode von Versuch 3 benötigt, nahmen auf etwa 1/3 durch die Immobiolisierung ab.

Das immobilisierte Enzym packte man in eine Säule mit einem Verhältnis von Durchmesser zu Höhe von 1 : 10. Eine Mischung mit einem Gehalt an 20 Gew.-% verflüssigter Stärke mit einem D. E.-Wert von 8, 20 Gew.-% Fructose und 10^-3 Calciumchlorid ließ man mit dem immobilisierten Enzym durch kontinuierliches Durchleiten durch die Säule bei einem pH-Wert von 6,0, 65°C und einer Fließgeschwindigkeit von SV 4 reagieren. Das Übertragungsverhältnis variierte kaum während der gesamten Reaktuion, die man 7 Wochen laufen ließ, und betrug am Ende der Reaktion etwa 60%.

Die erhaltenen Reaktionsmischung reinigte man und engte sie ein wie in Beispiel 1, und trocknete sie durch Sprühen, wodurch man ein mildes süßes SFTO-Produkt in Form eines weißen Pulvers mit homogenen Teilchengröße in einer Ausbeute von etwa 91% erhielt, bezogen auf das Substrat.

Beispiel 4

Pulver aus Alklamin und porösem Glas stellte man ähnlich wie in Beispiel 3 her, wobei man poröses Glaspulver (Bio-Glas 500) anstelle von Aluminiumoxid verwendete. 50 g des Alkylamin/poröses-Glas-Pulver tauchte man in eine wäßrige Glutaraldehydlösung mit einem Gehalt an 3 g gereinigter CGT-Zubereitung, die man gemäß der Methode von Versuch 1 erhalten hatte, und erhielt immobilisiertes Enzym.

Das Immobilisierungsverhältnis, das man durch Berechnung wie in Beispiel 3 bestimmte, betrug etwa 80%. Das Verhältnis der Restaktivität betrug etwa 11% (bezogen auf die dextrinerzeugende Aktivität) und etwa 108% (bezogen auf die Aktivität zur Spaltung von alpha-Cyclodextrin). Die Menge an Enzymprotein, die man zur Erzielung eines Übertragungsverhältnisses von 20% gemäß der Methode von Versuch 3 benötigte, nahm auf etwa 1/2 durhc die Immobilisierung ab. Das immobilisierte Enzym packte man in eine Säule mit einem Verhältnis von Durchmesser zu Höhe von 1 : 8. Eine Mischung mit einem Gehalt an 20 Gew.-% verflüssigter Stärke mit einem D. E.-Wert von 20 und 20 Gew.-% Zucker aus isomerisierter Glucose (mit einem Gehalt von 12 Gew.-% Glucose und etwa 8 Gew.-% Fructose) ließ man mit dem immobilisierten Enzym durch kontinuierliches Durchleiten durch die Säule bei einem pH-Wert von 6,5, 50°C und einer Fließgeschwindigkeit von SV 2 reagieren. Das Übertragungsverhältnis war während der gesamten Reaktion ungefähr konstant, welche man 5 Wochen laufen ließ, und am Ende der Reaktion betrug es etwa 45% auf Basis von Fructose.

Die erhaltene Reaktionsmischung reinigte man und engte sie ein wie in Beispiel 1, trocknete sie im Vakuum und pulverisierte sie, wodurch man ein mildes süßes SFTO-Produkt in Form eines weißes Pulver in einer Ausbeute von etwa 95% erhielt, bezogen auf das Substrat.

Beispiel 5

50 g Alkylamin/poröses-Glas-Pulver (Träger) wie in Beispiel 4 ließ man mit einer Mischung, die 50 g p-Nitrobenzoylchlorid, 80 ml Triäthylamin und 1170 ml Chloroform enthielt, 5 h unter Rückflußkochen und Erwärmen reagieren.

Danach wusch man den erhaltenen Träger nacheinander mit Chloroform und Äther, trocknete ihn an der Luft und gab ihn in eine kochende Natriumhydrogensulfitlösung (5 Gew.-%) 4 h lang und wusch ihn danach mit Wasser.

Das erhaltene poröse glas mit Arylamin gab man zu 1000 ml einer 2 N wäßrigen Salzsäurelösung. Die erhaltene Mischung hielt man bei 0°C in einem Eisbad und vermischte sie zum Reagieren mit 5 g Natriumnitrit (fest).

Nach der Reaktion gewann man den Träger durch Filtrieren, entfernte die überschüssige Säure und das überschüssige Natriumnitrit mit Eiswasser und erhielt poröses Glaspulver mit diazotiertem Arylamin.

Ferner stellte man 400 ml einer Lösungsmischung her, indem man eine 0,1 M Carbonatpufferlösung mit einem pH-Wert von 8,5 und 1 Gew.-% der gereinigten CGT-Zubereitung vermischte, welche man gemäß der Methode von Beispiel 3 erhalten hatte, und mischte 40 g des oben erhaltenen Pulvers zu. Das Ergebnis ließ man bei 0°C 5 h lang unter sanftem Rühren stehen und immobilisierte das Enzym. Das immobilisierte Enzym gewann man durch Filtrieren, wusch es ausreichend mit Wasser und verwendete es in der nachfolgenden Übertragungsreaktion. Das Immobilisierungsverhältnis bestimmte man durch Berechnung wie in Beispiel 3, und es betrug etwa 68%. Das Verhältnis der Restaktivität betrug 9% (bezogen auf die dextrinerzeugende Aktivität) und 98% (bezogen auf die Aktivität zur Spaltung von alpha-Cyclodextrin).

Die Menge an Enzymprotein, die man zur Erzielung eines Übertragungsverhältnisses von 20% gemäß der Methode von Versuch 3 benötigte, nahm auf etwa 1/3 durch die Immobilisierung ab. Das immobilisierte Enzym packte man in eine Säule mit einem Verhältnis von Durchmesser zu Höhe von 1 : 10. Eine Mischung mit einem Gehalt von 10 Gew.-% verflüssigter Stärke mit einem D. E.- Wert von 5, 30 Gew.-% Saccharose und 10^-3 Calciumchlorid ließ man mit dem immobilisierten Enzym durch kontinuierliches Durchleiten durch die Säule bei einem pH-Wert von 6,0, 54°C und einer Fließgeschwindigkeit von SV 3 reagieren. Das Übertragungsverhältnis variierte kaum während der gesamten Reaktion, die man 5 Wochen laufen ließ, und am Ende der Reaktion betrug es etwa 25%. Die erhaltene Reaktionsmischung reinigte man und engte man ein wie in Beipsiel 1, wodurch man stark süße SFTO in Form eines nicht-kristallinen Sirups mit einem Wassergehalt von etwa 17 Gew.-% in einer Ausbeute von etwa 94% erzielte (d. s. b. bezogen auf das Substrat).

Claims

Verfahren zur Beschleunigung der Reaktion, die direkt die glucosidischen Reste in verflüssigter Stärke auf Fructose- oder Saccharosemoleküle überträgt, bei der Herstellung von Sirupen oder Sirupfeststoffen mit einem Gehalt an Oligosacchariden mit Fructoseendgruppen, bei der man eine Mischung mit einem Gehalt an verflüssigter Stärke und entweder Fructose oder Saccharose der Wirkung von Cyclodextringlukanotransferase aussetzt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cyclodextringlukanotransferase eine immobilisierte Cyclodextringlukanotransferase einsetzt.