DE2551438A1

DE2551438A1 - Beta-1,3-glucanderivate und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2551438A1
Application number: DE19752551438
Authority: DE
Inventors: Koichi Kato; Takeshi Takahashi; Yoshio Yamazaki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1974-11-26
Filing date: 1975-11-15
Publication date: 1976-08-12
Also published as: NL186243C; US4075405A; NL7513773A; DE2560532C2; FR2292714A1; FR2292714B1; NL186243B; DE2551438C2; GB1531498A

Description

5 KÖLN 1 14.11.75

DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF

27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan)

ß-l,3-Glucanderivate und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft die Herstellung von ß—1,3-Glucanderivaten durch Umsetzung von in Wasser unlöslichen ß-1,3-Glucanen mit einem Cyanhalogenid.

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, in Wasser unlösliche Träger von hoher Reaktionsfähigkeit, die sich für die Herstellung von in Wasser unlöslichen Enzymen und von Säulen für die Affinitätschromatographie eignen, verfügbar zu machen.

Ein allgemeines Verfahren, bei dem ein Polysaccharid mit einem Cyanhalogenid aktiviert und ein Derivat erhalten wird, das sich kovalent an Substanzen zu binden vermag, die primäre oder sekundäre Aminogruppen enthalten, wird beispielsweise in Nature 214 (1967) 1302 und in der US-PS 3 645 852 beschrieben. Die Zahl der Veröffentlichungen, die sich mit der Herstellung von in Wasser unlöslichen Enzymen und von ligandengebundenen stationären Phasen für die Affinitätschromatographie nach diesem allgemeinen Verfahren befassen, ist sehr groß. In keiner dieser Veröffentlichungen wird jedoch die Verwendung von ß-1,3-Qlucanen als Träger erwähnt.

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Telefon: (02 21) 23 45 41 - 4 · Telex: 888 2307 dopa d · Telegramm: Dompotent Köln

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Die Aktivierungsreaktion mit einem Cyanhalogenid wird im allgemeinen bei einem pH-Wert im alkalischen Bereich, insbesondere in der Nähe von pH 11 durchgeführt· Die ß-l,3-Glucane sind jedoch unter diesen pH_Bedingungen in einem solchen Maße löslich, daß durch direkte Anwendung des bekannten allgemeinen Verfahrens als solchem nicht die gewünschten aktivierten, in Wasser unlöslichen] ß-1.,3—Glucane erhalten werden»

In eingehenden Untersuchungen über die Bedingungen aer Aktivierungsreaktion von in Wasser unlöslichen ß-1,3-Glucanen mit einem Cyanhalogenid gelang der Anmelderin die Aktivierung der ß-l,3-Glucane unter Aufrechterhaltung ihrer

Zu den in Wasser ««löslichen ß-l,3-Glucanen, die für die) Zwecke der Erfindung geeignet sind, gehören beispielsweise die Polysaccharide, die von Mikroorganismen der. Gattung Alcaligenes oder Agrobacteriusä gebildet werden* Besonders zu erwähnen sind das Polysaccharid_? das von Alcaligenes faecalis ?ar, nryxogenes 1OC3K gebildet wird (Agricultural Biological Chemistry 3O ί1966) 196 ff. Harada u» Mitarb.), das Polysaccharid, das vora Hutanten— stamm MTK-u (IFO 1314O, ATCC 2168O) von Alcaligenes faecalis var, myxogenes 1OC3K gebildet wird {üS-PSen 3 754 925 und 3 822 25O) (nachstehend als PS-I bezeichnet), das von Agrobacterium radiobacter ilFO 13127, ATCC €466 5 oder seinem Mutantenstamm U-19 {IFO 13126, ATCC 21679) gebildete Poiysaccharid CüS-PSen 3 754 925 und 3 822 250) (nachstehend als PS-2 bezeichnet) und Pachyrnan, das in den als Poria cocos bekannten rohen Dro<re vorkommt {Agr.Biol. ehem. 32 {1968, Nr.1O) 1261). . . .

Die für die Aktivierungsreaktion geir,äß der Erfindung verwendeten, in Wasser unlöslichen ß-l,3-Glucane können j in Form von Pulver oder Form teilen vorliegen, die unter

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Ausnutzung der Tatsache hergestellt werden, daß in Wasser unlösliche ß-l,3-Glucane auf Grund ihrer speziel-j len physikalischen Eigenschaften in die verschiedensten j Formen, z.B. Fasern, Folien, Perlen oder kleine Kugeln u.dgl. oder in die Form von Mikrokapseln durch Auftragen des Glucans auf ein Kernmaterial gebracht werden können.

Die in Wasser unlöslichen ß-1,3-Glucane können nach beliebigen Verfahren, die allgemein auf diesem speziellen Gebiet angewandt werden, zu Formkörpern verarbeitet werden. Um beispielsweise Fasern herzustellen, kann man ein Verfahren anwenden, bei man ein in Wasser unlösliches ß-l,3-Glucan in einer wässrigen Natriumhydroxydlösung löst und die erhaltene ß-l,3-Glucanlösung dann aus einer Düse in eine wässrige Chlorwasserstofflösung spinnt und hierdurch die Lösung neutralisiert und Gelierung des Glucans bewirkt (US-PS 3 899 480).

Eine Folie kann aus einem solchen wasserunlöslichen ß-l,3-Glucan beispielsweise hergestellt werden, indem man das in Wasser unlösliche ß-l,3-Glucan in einer wässrigen Kaliumhydroxydlösung löst, die Lösung auf eine ebene Glasplatte in gleichmäßiger Dicke aufträgt und diel beschichtete Glasplatte abschließend in eine wässrige ' Chlorwasserstofflösung taucht und hierdurch die Folie neutralisiert und Gelierung des Glucans bewirkt (US-PS 3 899 480).

Das ß-l,3-Glucan kann beispielsweise mit Hilfe der folgenden alternativen Verfahren zu Perlen geformt werden: 1) Man führt ein Medium, das ein in Wasser unlösliches ß-l,3-Glucan enthält, durch Strangpressen, Tropfenlassen oder Sprühen in ein erhitztes Ölbad ein und bewirkt hierdurch Gelierung des Glucans (japanische Offenlegungs-.schrift 52 953/1973); 2)-man löst das in Wasser unlösliche ß-l,3-Glucan in einer wässrigen Natriurnhydroxyd-

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lösung und führt die erhaltene Lösung durch eine Tropf— düse in eine wässrige Chlorwasserstofflösung ein und neutralisiert hierbei das Glucan und bewirkt seine Gelierung (US-PS 3 899 480); 3) man dispergiert eine wässrige Alkalilösung des in Wasser unlöslichen ß-1,3— Glucan in einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht leicht mischbar ist, und gibt zur erhaltenen

Dispersion eine organische Säure; 4) man gibt ein Kernmaterial zu einer alkalischen wässrigen Lösung des in Wasser unlöslichen ß-l,3-Glucan und dispergiert das Gemisch in einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht leicht mischbar ist, worauf man der erhaltenen Dispersion eine organische Säure zusetzt. (Die beiden letztgenannten Verfahren werden in der am 21.10. 1975 in Japan eingereichten Prioritätsanmeldung der Anmelderin mit dem Titel "Verfahren zur Herstellung von Gelen in Form von Perlen"beschrieben.)

Nachstehend werden als spezielle Beispiele swei Verfahren zur Herstellung von Gelen in Form von Perlen aus in Wasser unlöslichem ß—1,3—Glucan gemäß der Prioritäts—j amneldung vom 21.10.1975 beschrieben.

a) Zu 9 g pulverförmiger PS-I wurden 27O ml destilliertes Wasser gegeben. Das Gemisch wurde gerührt, wobei es die Konsistenz eines Breies annahm, Diesem Brei wurden 3O ml wässrige In-Natriumhydroxydlösung zugesetzt, wobei das PS-I sich löste. In ein 2 1-Becher- ] glas wurden 12OO nil Toluol und 6 g eines Derivats von Polyoxyäthylen und hydriertem Rizinusöl als oberflächenaktive Verbindung {»»Emalex HC-3O«, Hersteller Japan Emulsion K.K., Japan) gegeben. Unter Rühren mit 8OO UpM mit einem schneckenförmigen Rührer wurde die oben genannte alkalische Lösung von PS-I bei Raumtemperatur zugetropft,

Während weiter aiit 8OO UpM gerührt wurde, wurde die

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erhaltene PS-1-Dispersion einem Gemisch von 2000 ml Toluol und 100 ml Essigsäure zugesetzt. Dann wurde noch eine weitere Stunde gerührt und das System etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Während! dieser Zeit setzte sich das Gelbildungsprodukt ab. ;

Das Lösungsmittel wurde durch Dekantieren entfernt und das Sediment fünfmal mit je 2 1 destilliertem Wasser gespült. Durch diese Behandlung wurde das Sediment neutralisiert und vom organischen Lösungsmittel befreit. Hierbei wurden 240 ml PS-l-Gel in Form von Perlen erhalten.

b) Zu 3 g pulverförmigem PS-I wurden 144 ml destilliertes Wasser sowie 16 ml wässrige ln-Natriumhydroxydlösung gegeben, wobei das Pulver sich löste. Dieser Lösung wurden 9 g SIRASU-Perlen (0,177-0,42 mm, Hersteller Sanki Kogyo K.K., Japan) gegeben, worauf gerührt wurde. Während mit 360 UpM gerührt wurde, wurde das oben genannte Gemisch tropfenweise zu einer Lösung von 2 g der oberflächenaktiven Verbindung "Emalex HC-30" in 600 ml Toluol gegeben und darin dispergiert. Zum erhaltenen Gemisch wurden 15 ml Essigsäure gegeben. Das gebildete G_el wurde durch Filtration durch ein Nylonfiltertuch als Kuchen isoliert. Der Kuchen wurde mit Wasser gespült. Die Untersuchung des erhaltenen Festkörpers unter dem Mikroskop ergab, daß er aus Perlen (0,42 bis 0,84 mm) bestand, die "SIRASU" als Kern im PS-l-Gel enthielten.

Als Cyanhalogenide, die als Aktivierungsmittel dienen, eignen sich normalerweise die Brom-, Chlor- und Jodverbindungen oder Gemische dieser Verbindungen.

Als Alkaliverbindungen eignen sich für die Zwecke der Erfindung beispielsweise Ätzalkalien, z.B. Natriumhydroxyd und Kaliumhydroxyd. Bevorzugt werden normaler-

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weise wässrige In- bis 5n-Lösungen. Das Alkali wird zweckmäßig bis zu einem pH-Wert von 9 bis 13 zugesetzt, wobei ein pH-Wert von etwa 11 besonders bevorzugt wird. Das Alkali wird allmählich so zugesetzt, daß Auflösung des in Wasser unlöslichen ß-l,3-Glucan verhindert wird. Die Zugabe erfolgt vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 0,2 bis 0,5 pH-Einheiten/Min.

Nachstehend wird die Aktivierungsreaktion eines in Wasser unlöslichen ß—1,3-Glucari mit einem Cyanhaiogenid als spezielles Beispiel beschrieben.

In 20 Saumteilen Wasser wurde 1 Teil eines pulverförmiger, in Wasser unlöslichen ß—1,3—Glucan suspendiert. Zur Suspension wurden 2ö Raumzelle Wasser gegeben, das O,l bis 3 Teile eines Cyanbalogenids enthielt. Unter Röhren bei einer beliebigen Temperatur von O° bis 5O°C wurde der pH-Wert des fieaktionsgemisches'durch tropfenweise Zugabe einer 2n-Natriujnhydroxydlösung mit einer Geschwindigkeit, bei der keine Auflösung des Glucans stattfindet {etwa O,5 pH-Sinbeiten/Min«) auf 11 erhöht» Das Reaktionsgemisch wurde dann 15 Minuten bei pH 11 gehalten, wodurch die Aktiv!erungsreaktion zur Vollendung gebracht wurde. Nach der Reaktion wurde die feste Fraktion abfiltriert und mit 100 Raumteilen Wasser gespült. Hierbei wurde ein pulverförmiges aktiviertes ß—1,3—Glucan erhalten. Dieses aktivierte ß-1,3-Gl^can ist in Wasser und Alkalilösungen unlöslich, Es ist thermisch nicht gelierbar una hydrophil.. Es besteht aus Teilchen, die eine solche Größe und Festigkeit haben, daß sie ausreichend fließfähig sind, wenn sie in Kolonnen gefüllt werden. Dieses ß-l,3-Glucan kann daher nach den nachstehend beschriebenen Verfahren zu wasserunlöslichen Enzymen, die ausgezeichnete Eigenschaften aufweisen, oder Iräger-Ligand-Produkten, die sich für die Affinitatschromatographie eignen, verarbeitet werdend

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Ein solches wasserunlösliches Enzym oder Trager-Ligand-Produkt für die Affinitätschromatographie wird beispiels weise durch Umsetzung des in der beschriebenen Weise aktivierten ß-l,3-Glucan mit einer Substanz, die primäre oder sekundäre Aminogruppen enthält, z.B. einem Enzym, Protein, Peptid, einer Aminosäure, einem Enzymsubstrat oder Inhibitor, Antigen, Antikörper, Hormon o.dgl., vorzugsweise in schwach alkalischer wässriger Lösung bei einer beliebigen Temperatur im Bereich von etwa 0° bis 50°C hergestellt.

Ein an aktiviertes ß-1,3—Glucan gebundenes Enzym kann in ein Bett oder in eine Schicht gepackt und als Reaktor für chemische Reaktionen verwendet werden. Hierbei kann eine Lösung eines Substrats durch das Enzymbett geleitet werden, um das Substrat in ein wertvolles Produkt umzuwandeln. Die Reaktion wird automatisch abgebrochen, wenn die Lösung das Bett verläßt. Das fest«; Enzym kann für lange Zeiträume in kontinuierlichem Betrieb verwendet werden.

Ein weiteres gutes Beispiel sind Antikörper, die an wasserunlösliche ß-l,3-Glucane gebunden sind. Diese Produkte können speziell mit dem entsprechenden Antigen, z.B. zur analytischen Bestimmung des Antigens, kombiniert werden.

Beispielsweise kann ein in Wasser unlösliches Enzym von a-Äminosäureesteirhydrolase hergestellt werden, indem eine durch einen Mikroorganismus gebildete oc-Aminosäureesterhydrolase kovalent an ein mit einem Cyanhalogenid aktiviertes, in Wasser unlösliches ß-l,3-Glucan gebunden wird.

Es ist bekannt, daß viele Bakterien der Familie Pseudomonadaceae. oc-Aminosäureester einschließlich 2-Phenylglycinmethylester zu hydrolysieren vermögen und in Gegenwart eines geeigneten Acyl Akzeptors eine Trans-

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acylierungsreaktion auslösen, und daß halbsynthetische Penicilline oder halbsynthetische Cephalosporine durch Ausnutzung des Vorteils dieser Bakterien hergestellt werden können («T. Takahashi und Mitarbeiter, J.Amer. Chem. Soc. 94 (1972) 4035; T.Takahashi und Mitarbeiter, Biochem.J. 137 (1974) 497 und US-PSen 3 749 642 und i 3 816 253). Da jedoch bei den bisher vorgeschlagenen Verfahren in jedem Fall Bakterienzellen für eine Enzymquelle erforderlich sind, findet Autolyse oder ein Aktivitätsverlust durch Alterung statt, wodurch die Zellen von einer wiederholten Verwendung völlig ausgeschlossen sind und das Enzym nur mit geringem Wirkungsgrad ausgenutzt wird. Ferner haben diese Verfahren den Nachteil, daß das Reaktionssystem verschmutzt oder in anderer Weise durch teilweise EIution oder Eindringen von Ze11komponenten in das System oder durch Infiltration der Bestandteile des Mediums, die sich häufig an die Bakterienzellen geheftet haben, verunreinigt wird. Die Folge ist_? daß bei der Herstellung von Penicillinen oder Cephalosporinen für die Verwendung in Injektionslösungen viel Zeit und Mühe für die Reinigung der hergestellten Verbindungen erforderlich ist*

In dem Bemühen_t die vorstehenden Nachteile auszuschalten, wurde von der Anmelderin ein Verfahren zur Umwandlung von a-Affiinosäureesterhydrolasen in eine in Wasser unlösliche Forro entwickelt«

Als Bakterien, die a-Aminosäureesterhydrolasen zu bilde vermögen, können für die Zwecke der Erfindung beispiels-i ■weise die Bakterien der folgenden Gattungen verwendet werdenϊ Xanthomorsas, Acetobacter, Gluconobacter, Pseu— domonas, Aeromonas, Protaminobacter, Mycoplana. Dieses Enzym ist ein hydrolytisches Enzym, das α—Aminosäureester, z.B. D-Phenylglycinmethy!ester, zu hydrolysieren vermag und gleichzeitig die Fähigkeit hat, Celphalexin aus D-Phenylglycinmethylester und T-Amino-S-desacetoxy-

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cephalosporansäure (nachstehend kurz als 7-ADCA bezeichnet) zu synthetisieren. Ferner hat dieses Enzym die ! Fähigkeit, Ampicillin und Amoxicillin aus D-Phenylglycinmethylester bzw. D-p-Hydroxyphenylglycinmethylester und 6-Aminopenicillansäure (nachstehend kurz als ■ 6-APA bezeichnet) zu synthetisieren sowie die Fähigkeit j racemische oc~Aminosäureester mit optischer Spezifität j zu hydrolysieren. Da das jeweilige Enzym intracellulär gebildet wird, ist es zunächst notwendig, die Zellen zu zerreißen und einen zellfreien Extrakt herzustellen. Dieses Zerreißen kann mit Hilfe eines der hierfür bekannten Verfahren, z.B. nach dem Lysocym-EDTA-Verfahren nach dem Ultraschallverfahren, nach dem French-Pressverfahren usw., oder mit Hilfe einer geeigneten Kombination von zwei oder mehreren dieser Verfahret· erreicht werden. Die erhaltene Suspension von zerrissenen Zellen wird zentrifugiert, wobei ein zellfreier Extrakt erhalten wird. Diese Flüssigkeit kann unmittelbar der Kupplungsreaktion mit einem in Wasser unlöslichen hochmolekularen Polysaccharid oder einer einfachen teilweisen Reinigung nach einem bekannten Enzymreinigungsverfahren unterworfen werden, bevor sie der Immobilisierungsreaktion unterworfen wird.

Es ist jedoch zu bemerken, daß nicht immer alle oc-Amino— säureesterhydrolasen für die erfindungsgemäßen Immobiliisierungsreaktionen in Form von rohen enzymatischen Produkten von geringer Reinheit verwendet werden. Die Auswahl der für diese Reaktion geeigneten oc-Aminosäureesterhydrolase erfolgt daher mit Hilfe des folgenden Tests: Zunächst wird ein in Wasser unlösliches Enzym nach dem nachstehend in Bezugsbeispiel 12 beschriebenen Verfahren hergestellt. Wenn die spezifische Aktivität dieses Enzyms nicht geringer ist als die zweifache spezifische Aktivität des ursprünglichen rohen Enzyms, gilt dieses Enzym als geeignet für die Zwecke dieser Reaktion.

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Die Kupplungsreaktion zwischen dem rohen Präparat des in dieser Weise gewählten Enzyms und dem aktivierten hochmolekularen Polysaccharid wird in einem wässrigen Medium, das schwach sauer, neutral oder schwach alkalisch sein kann, bei einer Reaktionstemperatur, die vorzugsweise 40°C nicht überschreitet, durchgeführt. . Die Reaktionszeit liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 2O Standen, hängt jedoch von der gewählten Reaktionstemperatur ab. Nach der Reaktion wird der erhaltene, in Wasser unlösliche enzymatische Formkörper abfiltriert und zur Entfernung von daran haftenden oder adsorbierten Verunreinigungen gespült.

Die Herstellung eines halbsynthetischen Penicillins oder Cephalosporins unter Verwendung des ±n dieser Weise hergestellten Formkörpers aus in Wasser unlöslicher oc-Aminosäureesterhydrolase kann nach beliebigen Chargenverfahren oder kontinuierlichen Reaktionsver— fahren erfolgen« Seim Chargenverfahren wird das in Wasser unlösliche enzymatische Produkt in einer Lösung der Substrate suspendiert_t worauf man die Reaktion bei optimalem pH—Viert und unter optimalen Tejsperaturbediri— gungen wahrend einer gegebenen Zeit stattfinden läßt· Das Reaktionsgemisch wird dann zur Rückgewinnung des in Wasser unlöslichen ensymatisehen Produkts filtriert oder zentrifugiert. In dieser Weise kann das in Wasser unlösliche ensyttiatische Produkt stets von neuem verwen- ; det werden.

Beim kontinuierlichen Reaktionsverfahren werden die in Wasser unlöslichen enzymatischen Formkörper in eine Kolonne gefüllt, durch die dann eine wässrige Lösung, die die Substrate, d.h. den a-Aroinosäureester und die 6—APA— oder 7—Aminocepheiwerbindung, enthält, geleitet wird. Bei dieser Arbeitsweise wird ein halbsynthetisches Penicillin oder Cephalosporin kontinuierlich in hoher Ausbeute erhalten. Das erhaltene Reaktionsprodukt-

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gemisch (Chargenreaktion) oder der Ablauf der Kolonne (kontinuierliche Reaktion) besteht ausschließlich aus der als Produkt gewünschten Verbindung, nicht umgesetzten Substraten und α—Aminosäure und Alkohol als Nebenprodukte. Es ist somit nicht nur leicht möglich, die gewünschte Verbindung von hoher- Reinheit herzustellen, sondern auch die Ausgangsmaterialien äußerst leicht zurückzugewinnen. Ferner erfährt das in die Kolonne gefüllte, in Wasser unlösliche Enzym keine wesentliche Verschlechterung der oc-Aminosäureesterhydrolaseaktivität, auch wenn es kontinuierlich für die Synthese von Cephalosporin bei 5°C für eine Zeit von 6 Monaten verwendet wird.

Im Falle dieses Beispiels war die durch das wasserunlösliche Enzym während der Zeit von 6 Monaten gebildete Cephalosporinmenge mit der Cephalosporinmenge vergleichbar, die bei Verwendung der Mikrobienzellen, die für die Herstellung des gleichen wasserunlöslichen Enzyms verwendet wurden, in ungefähr hundertfacher Wiederholung erhalten wurde. Dieses Beispiel läßt eindeutig erkennen, wie das kontinuierliche Syntheseverfahren zur Herstellung von Cephalosporin unter Verwendung der in Wasser unlöslichen enzymatischen Formkörper auch vom Standpunkt einer wirksamen Ausnutzung des Enzyms überlegen ist.

Die Erfindung wird durch die folgenden Bezugsbeispiele und Ausführungsbeispiele weiter erläutert.

Bezuqsbeispiel 1

Das pulverförmige PS-I, das perlförmige PS-I, das faserförmige PS-2 und das folienförmige PS-I, die mit Cyanbromid auf die in den Beispielen 1 und 4 bis 6 beschriebene Weise aktiviert worden waren, hatten die folgenden Eigenschaften: .

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1) Form

Das unbehandelte pulverförmige PS-I nahm beim Quellen in destilliertem Wasser eine Form ähnlich einem schlaffen, entleerten Gummiball mit einem Durchmesser ^ von 20 bis SOO μ an, wobei der größte mittlere Durch— besser etwa 5O u betrug» Es wurde gefunden, daß das aktivierte pulverförmlge PS-I in Form und Teilchengröße im wesentlichen identisch mit unbehandeltem pulverförmiger PS—1 war» i

In jedem Fall des perlförmigen PS-I, des faserformigen j PS-2 und des folienförmigen PS-I wurde praktisch keine Veränderung der Form zwischen dem nicht aktivierten Glucan und dem aktivierten Glucan festgestellt.

23 Thermische Gellerbarkeit

Im Gegensatz zu den entsprechenden nicht aktivierten Glucanen fehlte den aktivierten Glucanen völlig die Fähigkeit, thermisch zu gelieren. Selbst nach Erhitzen für 15 Minuten in siedendem Wasser fand keine Gelierung statt.

3) Löslichkeit

Im Gegensatz su d^n nicht aktivierten Glucanen konnten die aktivierten Glucane in wässrigen Lösungen von starken Alkalien, Dirnethylsulfoxyd und In konzentrlertej Harnstofflösungen {8-molar) überhaupt nicht gelöst werden.

4) Analyse auf Stickstoff

Die Bestimmung auf N durch Elementaranalyse ergab, daß die durch die Aktivierungsbehandlung eingeführten Zahler (Durchschnitt) von Stickstoffatomen 0,43 pro Glucose— rest im Falle von PS-1-Pulver, 0_f45 für PS-1-Perlen, O,36 für faserfertiges PS-2 und O,29 for PS-1-Folien betrug.

B 0 9 8 2 3 /

5) Infrarot-Absorptionsspektren (KBr)

ί Das Infrarotspektrum von unbehandeltem pulverförmigem ' PS-I ist in Fig.l und das entsprechende Spektrum von aktiviertem PS-I in Fig.2 dargestellt. Ein Vergleich der beiden Spektren ergab neue Absorptionsbanden bei '

— 1 '

1730, 1625 und 780 cm im Falle von aktiviertem pulverförmigem PS-I. Offensichtlich waren die Absorption bei j

—1 '

1730 cm auf das Carboxyamid und die Absorptionen bei 1625 und 780 cm auf das Imidocarbonat zurückzuführen.

Das perlförmige PS-I, das faserförmige PS-2 und das folienförmige PS-I zeigten außerdem stets Absorptionsmaxima, die für Carboxyamide (1730 cm ) und Imidocarbonate (1625 cm" , 780 cm"¹) charakteristisch sind.

6) Färbbarkeit

Die Färbbarkeit dieser aktivierten Glucane wurde unter Verwendung von wasserlöslichen Farbstoffen nach der Methode von Nakanishi und Mitarbeitern (Carbohydrate Research 32 (1974) 47-52) ermittelt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.

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Tabelle 1; Färbbarkeitstest

Farbstoff Anilin- Bril- Trypan- Kongo- Tolui- Methy-

blau liant- blau rot din- lenblau blauO blau

Probe

PS-1-Pulver

(unbehandelt) + + + + -

PS-1-Pulver (aktiviert) + - + " + -

PS-1-Perlen

(unbehandelt) + - - +

PS-1-Perlen

(aktiviert) + - + ■ +

PS-2-Fasern

(unbehandelt) + - +

PS-2-Faserii

(aktiviert) + - + +

PS-1-Folie

(unbeliaodelt) + + - + + +

PS-1-Folie

(aktiviert) + + + + + -

Bezuqsbeispiel 2

In destilliertem Wasser vwrde 1 q (Trockengewicht) des gemäß Beispiel 1 hergestellten aktivierten PS-I so suspendiert, daß 20 ml einer Suspension erhalten wurden Dieser Suspension wurden IO ml O,2—molarer Carbonat— puffer (pH 8,5}_f 2 ml einer 2O mq/ml enthaltenden Lösung von Pronase (Hersteller Kaken Kagaku K.K., Japan) und 8 ml destilliertes Wasser zugesetzt. Das Geraisch wurde 20 Stunden unter Rühren bei 5°C und pH 8,5 umgesetzt· Nach dieser Reaktion wurde das PS—1-Gel mit Hilfe eines Glasfilters isoliert und mit SO ml einer 0^2—mo—

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laren Glycinlösung, 80 ml einer 0,5-molaren Natriumchloridlösung und 40 ml destilliertem Wasser in der genannten Reihenfolge isoliert. Hierbei wurde ein in Wasser unlösliches enzymatisches Produkt von Pronase erhalten. Unter Verwendung des p-Toluolsulfonyl-L-argininmethylesters, der ein synthetisches Substrat ist, wurde die Pronaseaktivität des erhaltenen Produkts bei 25°C und pH 8,0 bestimmt. Das Ergebnis zeigte, daß 63% der bei der Kupplungsreaktion verwendeten Pronase in das in Wasser unlösliche Enzym umgewandelt worden waren.

Der Gesamtproteingehalt in den beim vorstehend beschriebenen Verfahren gewonnenen Waschflüssigkeiten wurde nach der Methode von Lowry (O.H. Lowry und Mitarbeiter,·; Biol.Chem. 193 (1951) 265) bestimmt und vom Proteingehalt der ursprünglich verwendeten Pronase subtrahiert. Die so berechnete Unlöslichmachung des Proteins betrug 77%.

Bezugsbeispiel 3

1 g des gemäß Beispiel 1 hergestellten aktivierten ' PS—1 wurde in einer solchen Menge destilliertem Wasser suspendiert, daß 20 ml einer Polysaccharidsuspension erhalten wurden. Dieser Suspension wurden 10 ml 0,2— molarer Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und 10 ml einer 2,5 mg/ml enthaltenden Lösung von kristalliner cx-Amylase (Hersteller Sankyo K.K., Japan) zugesetzt. Das Gemisch wurde 4 Stunden der Reaktion bei 5°C und pH 8,0 überlassen, worauf das G_el auf die in Bezugsbeispiel 2 beschriebene Weise gespült und eine in Wasser unlösliche a-Amylase erhalten wurde.

Die ot-Amylaseaktivität dieses Produkts wurde ermittelt, indem es mit löslicher Stärke als Substrat bei pH 5,3 und 37°C umgesetzt wurde. Die Unlöslichmachung der Aktivität wurde mit 59% und die Unlöslichmachung des

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Proteins mit 65% ermittelt.

Bezuqsbeispiel 4

1 g des gemäß Beispiel 1 hergestellten aktivierten PS-I wurde in einer solchen Menge destilliertem Wasser suspendiert, daß 20 ml einer Suspension erhalten wurdeni Zu dieser Suspension wurden 10 ml 0,2-molarer Phosphatpuffer (pH 8,0) und 10 ml einer 2,5 mg/ml enthaltenden Lösung von oc-Chymotrypsin (Hersteller Sigma, USA) gegeben. Die Kupplungsreaktion wurde bei 5°C und pH 8 durchgeführt. Die Reaktion war in 2 Stunden beendet. In dieser Weise wurden 78% des ursprünglichen Enzymproteins an das PS-I gekuppelt.

Unter Verwendung von L-Tyrosiriathylester als Substrat wurde die Esteraseaktivität in Gegenwart von 1O% Äthanol bei 27°€ xrnd pH 7,8 bestimmt» Die Uniöslichmachung der Aktivität wurde mit 64% ermittelt.

Bezuqsbeispiel 5

In 2Ό ib1 destilliertem Wasser wurde i g des geinlß Beispiel 1 hergestellten aktivierten PS-I suspendiert. Zur Suspension wurden IO ml 0,2-molarer Tris-HCl-Puffer (pH 8jO) ηηά IO ml einer 2,5 mg/nil enthaltenden Lösung von saurer Weizenkeimphosphatase ίHersteller Seikagaku Kogyo K.K., Japan) gegeben. Das Geraisdi wurde 18 Stunden bei 5°C und pH 8,0 unter Rüören umgesetzt. Nach dieser Zeit wurde ua.s erhaltene Reaktionsprodukt wie in Bezugsbeispiel 2 gespült, wobei eine in Wasser unlösliche saure Phospbaisse erhalten wurde. Unter Verwen- \ dung von 0—Carboxyphenylphosphat als Substrat wurde die Aktivität dieses Produkts bei 25°C und pH 5,0 bestimmt. Das Ergebnis seigte, daß 52% der ursprünglichen Aktivität des Enzyms unlöslich gensacht worden war» Die Unlöslichmachung des Proteins wurde mit 63% ermittelt, i

Bezuqsbeispiel 6

1 g des gemäß Beispiel 1 erhaltenen aktivierten PS-I wurde in einer solchen Menge destilliertem Wasser suspendiert, daß 20 ml einer Suspension erhalten wurden. Dieser Suspension wurden 5 mg einer ot-Aminosäureesterhydrolase, die aus den Zellen von Acetobacter turbidans ATCC 9325 extrahiert und teilweise gereinigt worden war (das Verfahren zur Herstellung des Enzyms und s.eine verschiedenen Eigenschaften werden von T.Takahashi und Mitarbeitern in Biochem. J. 137 (1974) 497 beschrieben) und 20 ml 0,1-molarer Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gegeben.

Das Gemisch wurde 4 Stunden der Reaktion bei 5°C und pH 8,0 unter Rühren überlassen. Nach dieser Reaktion wurde das PS-l-Gel abfiltriert und gespült, wie in Bezugsbeispiel 2 beschrieben. Das in dieser Weise erhaltene, in Wasser unlösliche Enzyms wurde in destilliertem Wasser suspendiert, wobei 40 ml einer Suspension erhalten wurden.

Unter Verwendung von D-Phenylglycinmethylester als Substrat wurde die Aktivität dieses suspendierten unlöslichen Enzyms bestimmt. Sie wurde mit 9,83 Einheiten/ml ermittelt. Das Ergebnis zeigte, daß 84% der ursprünglichen Aktivität des Enzyms unlöslich gemacht worden waren. Die Unlöslichmachung des Proteins wurde mit 69% ermittelt.

Unter Verwendung von 25 ml dieser Suspension des in Wasser unlöslichen Enzyms wurde eine kleine Säule mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt. Eine Substratlösung (pH 7,2), die 15 mg/ml D-Phenylglycinmethylester· hydrochlorid, 5 mg/ml^-Amino-S-desacetoxycephalosporansäure und 10% (Vol./Vol.) Methanol enthielt, wurde mit einer konstanten Durchflußgeschwindigkeit von 12 ml/Std durch die Säule geleitet. Das aus der Kolonne austretende Reaktionsgemisch enthielt 7,50 mg Cephalexin

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pro ml. Diese Reaktion wurde ununterbrochen 6 Monate durchgeführt. Es wurde festgestellt, daß die Aktivität der Kolonne zur Bildung von Cephalexin nach dieser Zeit völlig unverändert war.

Bezugsbeispiel 7

1 g des auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellten aktivierten PS-I wurde in einer solchen Menge destilliertem Wasser suspendiert, daß 20 ml einer Suspension erhalten wurden. Dieser Suspension wurden 20 ml eines 0,1-molaren Tris-HCl-Puffers (pH 8,0) zugesetzt, in dem 20 mg L-Leucylglycylglycin (Hersteller Mann Research Laboratories, USA) gelöst waren. Das Gemisch wurde 16 Stunden der Reaktion bei 5°C und pH 8 unter sachtem Rühren überlassen. Anschließend wurde das PS-l-Gel abfiltriert und gespült, wie in Bezugsbeispiel '<\ beschrieben.

Aus dem L-Leucylglycylglycingehalt der Waschflüssigkeiten wurde berechnet, daß 12,6 mg L-Leucylglycylglycin an das PS-I gekuppelt waren.

Die vorstehend beschriebene Reaktion wurde in der gleichen Weise wiederholt, wobei jedoch γ-Globulin von menschlichem Serum (Fraktion II, hergestellt von Sigma, USA) bzw. Insulin (Hersteller Sigma, USA) an Stelle von L-Leucylglycylglycin verwendet wurden. An das PS-I wurden in dieser Weise 15,1 mg γ-Globulin bzw. 11,0 mg Insulin gekuppelt.

Bezugsbeispiel 8 (auf Trockenbasis)
Zu je 1 g /der gemäß Beispiel 4 bis 6 hergestellten

aktivierten PS-1-Perlen, der aktivierten PS-2-Fasern und der aktivierten PS-1-Folie wurden 20 ml destilliertes Wasser, 10 ml einer wässrigen Lösung von 1 g p-Ami— nophenäthylalkohol in 100 ml Wasser und 10 ml 0,04-mo_ larer Phosphatpuffer (pH 6) gegeben. Die Reaktion wurde Stunden unter Rühren bei 5°C und pH 6 durchgeführt.

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-19- 255U38

Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und der Feststoff mit 200 ml 0,5-molarer wässriger NaCl-Lösung gespült.

Die bei dieser Reaktion gekuppelte Menge des p-Amino-

der
phenäthylalkohols wurde aus/im Filtrat zurückgewonnenen Menge des p-AminophenMthylalkohols ,berechnet. Die in dieser Weise gekuppelten Mengen des p-Aminophenäthylalkohols betrugen 47 mg im Falle von PS-1-Perlen, 33 mg bei PS-2-Fasern und 24 mg bei der PS-1-Folie (alle Zahlen auf je 1 g Träger bezogen). Es ist anzunehmen, daß diese Zahlen den Mengen von aktiven Gruppen (Imidocarbonatgruppe) entsprechen, die durch die Aktivierungsreaktion in den Träger eingeführt wurden.

Bezuqsbeispiel 9 1 g (auf Basis des Trockengewichts) der gemäß Beispiel 4 hergestellten aktivierten PS-1-Perlen wurden in 40 ml destilliertem Wasser suspendiert. Zur Suspension wurden 10 ml 0,2-molarer Carbonatpuffer (pH 8,5), 5 ml einer 20 mg/ml enthaltenden Lösung von Pronase (Hersteller Kaken Kagaku Kabushiki Kaisha, Japan) und 5 ml destilliertes Wasser gegeben. Die Reaktion wurde 6 Stunden unter ständigem Rühren bei 5°C und pH 8,5 durchgeführt. Nach der Reaktion wurde das perlförmige PS-l-Gel auf einem Glasfilter abfiltriert und mit 120 ml 0,2-molarer Glycinlösung, 120 ml 0,5-molarer Natriumchloridlösung und 80 ml destilliertem Wasser in dieser Reihenfolge gespült. Hierbei wurde wasserunlösliche· Pronase

erhalten. Unter Verwendung von p-Toluolsulfo— nyl-L-argininmethylester, einem synthetischen Substrat, wurde die Pronaseaktivität dieses Produkts bei 25°C und pH 8,0 bestimmt. Es wurde gefunden, daß 60% der ursprünglichen Pronaseaktivität durch die Kupplungsreaktion in das wasserunlösliche enzymatische Produkt übergegangen war.

Das Gesamtprotein in den genannten Waschflüssigkeiten wurde ebenfalls nach der Methode von Lowry bestimmt

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-20 - 255H38

(O.H.Lowry und Mitarbeiter, J.B-iol .Chem. 193 (1951) 265). Der gefundene Wert wurde vom Gesamtproteingehalt der ursprünglichen Pronase subtrahiert. Aus der so gefundenen Differenz wurde die Unlöslichmachung des Proteins mit 72% berechnet.

Bezugsbeispiel 10

In 20 ml destilliertem Wasser wurde 1 g der gemäß Beispiel 5 hergestellten aktivierten PS-2-Fasern suspendiert. Dieser Suspension wurden 10 ml 0,2-molarer Phosphatpuffer (pH 8,0) sowie 10 ml einer 2,5 mg/ml enthaltenden Lösung von kristallinem oc-Chymotrypsin (Hersteller Sigma, USA) zugesetzt. Diese Kupplungsreaktion wurde bei 5°C und pH 8,0 durchgeführt. Die Reaktion war in 4 Stunden beendet. Nach dieser Zeit wurde festgestellt, daß 65% des ursprünglich zugesetzten Enzymproteins mit dem Träger gekuppelt waren. Unter Verwendung von L-Tyrosinäthylester als Substrat in Gegenwart von 10% Äthanol wurde die Esteraseaktivität des Produkts bei 27°C und pH 7,8 bestimmt. Die Unlöslichmachung der Aktivität wurde mit 54% ermittelt.

Bezugsbeispiel 11

Zu 1 g der gemäß Beispiel 6 hergestellten aktivierten PS-1-Folie wurden 20 ml destilliertes Wasser sowie 5 ml einer l%igen Ureaselösung (hergestellt aus Jack-Bohnen (Jack bean), Hersteller Wako Junyaku Kabushiki Kaisha, Japan) und 5 ml 0,04-molarer Phosphatpuffer (pH 7,5) gegeben. Die Reaktion wurde 18 Stunden bei 5°C unter Rühren durchgeführt. Hierbei wurden 35% der ursprünglichen Enzymaktivität unlöslich gemacht. Die Unlöslichmachung des Proteins betrug 44%.

982 3/0-8=8^

-21- 255H38

Bezugsbeispiel 12

Stämme von Mikroorganismen mit a-Aminosäureesterhydrolase-Aktivität wurden verwendet, um jeweils einen 2 1-Schüttelkolben zu impfen, der 500 ml eines Mediums der in der Fußnote zu Tabelle 2 genannten Zusammensetzung enthielt. Die Schüttelkultur wurde 24 Stunden bei 28°C durchgeführt.

Das Kulturmedium wurde zentrifugiert. Den hierbei abgetrennten Zellen wurde 0,1-molarer Phosphatpuffer (pH 6,0) in einer solchen Menge zugesetzt, daß 50 ml Suspension erhalten wurden. Die Zellen in der Suspension wurden durch Ultraschallbehandlung bei 150 W für 50 Minuten zerrissen. Der erhaltene zellfreie Extrakt der a-Aminosäureesterhydrolase wurde zentrifugiert. Zum Überstand wurden je 0,1 Raumteil 1-molares sekundäres Kaliumphosphat und 1-molares Calciumacetat zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 5⁰C stehen gelassen. Das erhaltene Calciumphosphatgel wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, wobei ein Überstand erhalten wurde, j 1 ml dieses mit Calciumphosphat behandelten Überstandes wurde in ein kleines mit einem Stopfen verschlossenes Reagensglas gegeben, worauf 0,1 g des gemäß Beispiel 3 hergestellten aktivierten PS-I und 1 ml 2-molarer Phosphatpuffer (pH 8,0) zugesetzt wurden und mit destilliertem Wasser auf 4 ml aufgefüllt wurde. Die Reaktion wurde 4 Stunden unter Schütteln bei 5°C durchgeführt. Das PS-I wurde dann mit Hilfe eines Glasfilters abgetrennt und mit 18 ml 0,2-molarer Glycinlösung und 18 ml 0,5-molarer Natriumchloridlösung gespült. Hierbei wurden 40 ml Waschflüssigkeit gewonnen. Das erhaltene unlöslich gemachte Enzym wurde in 4 ml destilliertem Wasser suspendiert. Die enzymatische Aktivität wurde durch Messen der Hydrolysengeschwindigkeit mit einem "pH-stat" bei 27°C und pH 6,0 unter Verwendung von 20 mMol D-Phenylglycinmethylesterlösung

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als Substrat bestimmt. Die Enzymmenge, die 1 u-Mol des Substrats pro Minute hydrolysierte, wurde als Einheit (E) genommen. Die Proteinmenge in den vorstehend genannten Waschflüssigkeiten wurde bestimmt und die Menge an gebundenem Protein aus dem Prozentsatz der Rückgewinnung berechnet. Außerdem wurde die prozentuale Rückgewinnung der PS-1-gebundenen Aktivität durch die prozentuale Rückgewinnung von PS-1-gebundenem Protein dividiert. Dieser relative Wert stellte das Verhältnis der spezifischen Aktivität des immobilisierten Enzyms zur spezifischen Aktivität des Überstandes dar, der nach der Calciumphosphatbehandlung erhalten wurde. Wie Tabelle 2 zeigt, wurden als Enzyme, bei denen das oben erläuterte Verhältnis über zwei lag, die Enzyme der folgenden fünf Stämme von Mikroorganismen ausgewählt: Acetobacter pasteurianus (IFO 3223, ATCC 6033), Acetobacter turbidans (IFO 3225, ATCC 9325), Mycoplana sp. (IFO 13213, ATCC 21759), Gluconobacter suboxidans (IFO 3432, ATCC 621) und Xanthomonas sp. (IFO 13215, ATCC 21764).

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Tabelle 2

Medium

α co co

O OO CQ

Stamm

An PS-I gebundene An PS-I gebun-Aktivität denes Protein

Rückgewin-
nung, %

RUckgewinnung,?

Rückgewinnung der Aktivität in $ Rückgewinnung von Protein in %

Acetobacter pasteurianus (IFO 3223, ATCC 6033)

Acetobacter . turbidans (IFO 3225, ATCC 9325)

Mycoplana sp. (IFO I3213, ATCC 21759)

Gluconobacter suboxidans (IFO 34-32, ATCC 621)

Xanthomonas sp. (IFO I3215, ATCC 21764)

PY

1.20

3.20

0.60

66

0.95

0.90

0.81

0.32

1.35

31

28

■ 24

19

26

2.1

2.2

2.3

2.1

•PY-Medium: 10% rohe Kartoffeln, 1% Hefeextrakt, 1% T.G.C.-Medium (Daigo);
1,5% Glycerin; 0,3% Glucose; (pH 7,0).

•NG-Medium: 0,2% Natrium-L-Glutamat; 0,2% Hefeextrakt; 0,5% Pepton;
0,2% sekundäres Kaliumphosphat; 0,1% Magnesiumchlorid;
0,01% EisenCin-sulfat; 2,0% Saccharose; (pH 7,2).

- ²⁴ - 255H38

Bezuqsbeispiel 13

In 40 ml destilliertem Wasser wurde 1 g (auf Basis des Trockengewichts) des nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens aktivierten PS-I suspendiert. Zur Suspension wurden 20 ml 0,2-molarer Tris-HCl-Puffer (pH 8) und 20 ml des Überstandes gegeben, der durch Behandlung der zerrissenen Zellen von Xanthomonas sp. (IFO 13215, ATCC 21764) mit Calciumphosphat auf die in Bezugsbeispiel 12 beschriebene Weise erhalten worden waren. Die Reaktion wurde 20 Stunden unter Rühren bei 5°C und pH 8,0 durchgeführt. Nach dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch durch ein Glasfilter filtriert, um die feste Fraktion zu isolieren. Diese feste Fraktion wurde mit 100 ml 0,2-molarer Glycinlösung, 100 ml 0,5-molarer Natriumchloridlösung und 200 ml destilliertem Wasser in dieser Reihenfolge gespült. Das in dieser Weise erhaltene, in Wasser unlösliche Enzymprodukt wurde erneut in destilliertem Wasser in einer solchen Menge suspendiert, daß 40 ml Suspension erhalten wurdenJ Die Aktivität und die Menge an gebundenem Protein in dem erhaltenen wasserunlöslichen Enzymprodukt wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt.

Tabelle 3

Träger PS-I Unlöslich gemachte Aktivität

Ai-ml 6,38

Ausbeute 74% Unlöslich gemachtes Protein

mg/ml 3,53

Ausbeute 34%

Ausbeute an unlöslich·gemachter Aktivität/ Ausbeute an unlöslich gemachtem Protein 2,2

6 0 9823

- ²⁵ - 255H38

Bezuqsbeispiel 14

Zu 500 ml des flüssigen Überstc.ndes, der durch Behandlung von Acetobacter turbidans (IFO 3225, ATCC 9325) mit Calciumphosphat auf die in Bezugsbeispiel 12 beschriebene Weise erhalten worden war, wurden 25 g des mit Cyanbromid auf die in Beispiel 3 beschriebene Weise voraktivierten PS-2 und 250 ml 0,2-molarer Phosphatpuffer (pH 8,0) gegeben. Das Gemisch wurde mit destilliertem Wasser auf 1 1 aufgefüllt. Die Reaktion wurde 18 Stunden bei einer konstanten Temperatur von 5°C und einem konstanten pH-wert von 8,0 durchgeführt, worauf das Reaktionsgemisch durch ein Glasfilter filtriert wurde. Die feste Fraktion wurde mit 2 1 0,2-molarer Glycinlösung, 2 1 0,5-molarer Natriumchloridlösung und 2 1 destilliertem Wasser in dieser Reihenfolge gespült. Das erhaltene unlöslich gemachte Enzym wurde in 1 1 0,01-molarem Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Die Aktivität dieses Produkts betrug 8,30 u/ml und die Aktivitätsausbeute etwa 81%. Der Proteingehalt betrug 5,10 mg/ml und die Ausbeute an unlöslich gemachtem Protein 33%, d.h. die spezifische Aktivität war 2,5-fach gestiegen.

Bezugsbeispiel 15

Eine Kolonne mit einem Bettvolumen von 50 ml wurde unter Verwendung von 200 ml einer Suspension des auf die in Bezugsbeispiel 14 beschriebene Weise hergestellten, in Wasser unlöslichen Enzymprodukts vorbereitet. Dann wurde eine Substratlösung (auf pH 7,0 eingestellt), die 0,5% 7-Amino-3-desacetoxycephalosporansäure (7-ADCA), 1,5% D-Phenylglycinmethylesterhydrochlorid und 6% Äthanol enthielt, bei 5°C mit einer konstanten Durchlaufmenge von 100 ml/Std. durch die Säule geleitet. Hierbei wurde Cephalexin mit einem Umsatz von etwa 95% gebildet. Der Titer des Cephalexins wurde photometrisch unter Verwen-

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dung der Cephalosporinase bestimmt, die aus Aerobacter cloacae (IFO 12937) gebildet worden war (T.Takahashi und Mitarbeiter, J.Amer.Chem.Soc.94 (1972) 4035).

Das Reaktionsgemisch, das 7700 ug/ml Cephalexin enthielt, das bei dem oben beschriebenen kontinuierlichen Kolonnenverfahren erhalten worden war, wurde in einer Menge von 1650 ml in einem Rotationsverdampfer auf 1000 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde durch eine Aktivkohlesäule mit einem Bettvolumen von 250 ml geleitet, wobei das Cephalexin adsorbiert wurde. Die Säule wurde mit 2500 ml destilliertem Wasser gewaschen, worauf das Cephalexin mit 4%igem wässrigem Butanol eluiert wurde. Hierbei wurden 1600 ml Eluat erhalten. Das Eluat wurde im wesentlichen zur Trockene eingedampft. Die erhaltenen Kristalle wurden abfiltriert, mit 50 ml Methanol und 50 ml Äthyläther gespült und dann getrocknet. Die Kristalle wurden in einem Exsiccator, der Phosphorpentoxyd enthielt, weiter dehydratisiert. Hierbei wurden 10,3 g kristallines Cephalexin erhalten. Die Ausbeute an Cephalexin bei der Synthese betrug 95%, die Ausbeute aus der Reinigung 81% und die Gesamtausbeute 77%.

Bezuqsbeispiel 16

Aus 40 ml der gemäß Bezugsbeispiel 13 hergestellten Suspension des auf PS-1 aufgebrachten, Masser unlöslichen Enzyms wurde die Feststofffraktion abfiltriert. Diese feste Fraktion wurde zu 1OO si einer Substrat— lösung (pH 7,0) gegeben, die 0,5 g 6-APA pro 100 ml, 1,0 g D-Phenylglycinmethylester pro 1OO ml, 12 Vol.-% Methanol und SO tnMol Phosphatpuffer enthielt. Die Reaktion wurde 3 Stunden bei 25°C unter Röhren durchgeführt. Nach dieser Zeit wurde das in Wasser unlösliche Enzym abfiltriert. Das Reaktionsgeraisch enthielt 68OO lag/ml Ampicillin. Das gleiche wasserunlösliche Enzym..wurde wiederholt in der Ampicillin-Synthesereaktion unter den gleichen Bedingungen insgesamt fünfmal verwendet. Der

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Ampicillingehalt der Reaktionsgemische betrug 6850, 6780, 6820, 6730 bzw. 6750 ug/ml. Das Enzym hatte somit praktisch keine Deaktivierung erfahren.

In einem Rotationsverdampfer wurde 600 ml (Ampicillingehalt 6750 ug/ml) des in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Reaktionsgemisches auf etwa 200 ml eingedampft. Das Konzentrat wurde durch eine Säule (2,3 χ 35 cm) des Ionenaustauscherharzes "Amberlite XAD-2" (Hersteller Rohm and Haas Co., USA) geleitet, wobei das Ampicillin adsorbiert wurde. Die Säule wurde zuerst mit 150 ml 20%igem wässrigem Methanol gewaschen, worauf das Ampicillin mit 100 ml 50%igem wässrigem Methanol eluiert wurde. Das erhaltene Eluat wurde auf etwa 1/5 seines ursprünglichen_Volumens eingeengt und bei 5°C stehengelassen. Die hierbei gebildeten Ampicillinkristalle wurden abfiltriert und getrocknet. Auf diese Weise wurden 3,40 g kristallines Ampicillin erhalten (Gesamtausbeute 71%).

Bezuqsbeispiel 17

Eine Kolonne mit einem Bettvolumen von 50 ml wurde unter Verwendung von 200 ml einer Suspension des gemäß Bezugsbeispiel 14 hergestellten, in Wasser unlöslichen Enzymprodukt vorbereitet. Bei 5°C wurde eine Substratlösung (pH 6,5), die 0,5 g 6-APA pro 100 ml, 1 g D-p-Hydroxyphenylglycinmethylester pro 100 ml, 10 Vol.-% Äthanol und 75 mMol Phosphatpuffer (pH 6,5) enthielt, in einer Durchflußmenge von 200 ml/Tag durch die Säule geleitet. Auf diese Weise wurde ein Reaktionsgemisch gebildet, das 6000 Aig/ml Amoxicillin enthielt. In einem Rotationsverdampfer wurden 2 1 dieses Reaktionsgemische: auf ungefähr die Hälfte seines ursprünglichen Volumens eingedampft und gekühlt. Die erhaltenen weißen Kristalle wurden abfiltriert, und die Mutterlauge wurde weiter eingeengt, wobei eine weitere Ausbeute an glei-

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255U38

chen Kristallen erhalten wurde. Die Kristalle wurden zusammengegeben und mit geringen Mengen Wasser, Aceton und Äthyläther in dieser Reihenfolge gespült und dann über Phosphorpentoxyd getrocknet. Hierbei wurden 10,5 g Kristalle erhalten (Ausbeute 66%).

Die in dieser Weise erhaltenen Kristalle ergaben auf einem Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel) einen einzi-

25

gen Flecken und hatten einen /a_/_D -Wert von +250° ic = 0,1%, 0,05 n-HCl). Die Elementaranalyse und das NMR-Spektrum dieses Produkts ergaben, dass es sich um das Trihydrst von 6-^T3-a-An3inG-a<4-hydrGxyphenyl)—acet— axnidoj-peniciilansaure, d.h. Amoxicillin, handelte,

Bezucjsfagjspiel 18

Eine kleine Säule mit einem Bettvolumen von 5 ml wurde unter Verwendung von 2O ffll des gemäß Bezugsbeispiei 14 erhaltenen, in Wasser unlöslich gemachten Enzyms vorbereitet. Die Synthesereaktion zur Bildung van Cephalexin wurde bei 5°C durchgeführt, indem eine Substratlösung der in Bezugsbeispiel 15 genannten Zusammensetzung mit einer Durcnflußraenge von 10 ml/Stu, kontinuierlich durchgeleitet wurde. Nach 6 Monaten wurde festgestellt, daß die Ausbeute an Cephalexin konstant bei 93-97% geblieben war. Es hatte somit keinerlei Deaktivierung stattgefunden»

Beispiel 1

In ein 5OO ml—Becherglas wurden IO g weißes PS—!-Pulver gewogen, Nach Zugabe von 200 ml destilliertem Wasser wurde die Suspension mit einem Magnetrührer gerührt, bis das PS—1 genügend gequollen war. Dann wurden 2OO ml einer 5 g Cyanbromid pro 1OO ml enthaltenden wässrigen Lösung zugesetzt. Unter ständigem Rühren bei 25°C wurde eine 2n-Natriurohydroxydlösung mit einem automatischen Titriergerät so zugesetzt, daß der pH—Wert der Suspension

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mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 pH-Einheiten/Min stieg, bis ein pH-Wert von 11 erreicht war. Die Suspension wurde nach etwa 15 Stunden bei diesem pH-Wert gehalten, wodurch die Reaktion zur Vollendung gebracht wurde.

Nach der Reaktion wurden die PS-1-Teilchen vom Reaktionsgemisch abfiltriert und mit 1 1 destilliertem Wasser gespült. Hierbei wurden 10,05 g (Trockengewicht) aktiviertes PS-I erhalten.

Beispiel 2

Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wurden 10 g weißes PS-2-Pulver mit Cyanbromid aktiviert, wobei 10,08 g (Trockengewicht) aktiviertes PS-2 erhalten wurden.

Beispiel 3

Zu 1 g PS-I wurden 20 ml Wasser gegeben. Nachdem das Polysaccharid genügend gequollen war, wurden 20 ml einer wässrigen Lösung, die 5 g Cyanbromid pro 100 ml enthielt, zugesetzt. Unter Rühren bei Raumtemperatur wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches unter Verwendung eines automatischen Titriergeräts (pH-Stat.) mit einer Geschwindigkeit von 0,2 bis 0,5 pH-Einheiten/Min, auf 11 erhöht. Die Reaktion wurde 15 Minuten bei einem konstanten pH-Wert von 11 fortgesetzt. Nach dieser Zeit wurde die feste Fraktion abfiltriert und mit destilliertem Wasser gut gespült. In dieser Weise wurde ein aktiviertes PS-I erhalten.

Beispiel 4

Zu 125 ml PS-I in Form von Perlen (Teilchendurchmesser 50 bis 200 u) (entsprechend 5 g PS-I als Trockengewicht) wurden 100 ml Wasser und 100 ml 5%iges (Gew.-/Vol.) Cyanbromid gegeben. Bei 25⁰C wurde unter Rühren eine

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2n-Natriumhydroxydlösung mit einem automatischen Titriergerät in solchen Mengen zugetropft, daß der pH-Wert allmählich mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 pH-Einheiten/Minute stieg, bis ein End-pH-Wert von 11 erreicht war. Das Gemisch wurde etwa 15 Minuten bei diesem pH-Wert gehalten, wodurch die Reaktion zur Vollendung geführt wurde. Nach dieser Reaktion wurde der Feststoff abfiltriert und mit 500 ml destilliertem Wasser gespült. In der beschriebenen Weise wurde aktiviertes perlförmiges PS-I erhalten (Trockengewicht 5,1 g).

Beispiel 5

Auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise wurden 5 g faserförmiges PS-2 (Durchmesser etwa 0,2 bis 0,3 mm, Länge etwa 10 cm) gewogen und behandelt. Hierbei wurde ein faserförmiges aktiviertes PS-2 erhalten (Trockengewicht 5,15 g).

Beispiel 6

Auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise wurden 5 g PS-I in Form einer Folie (Dicke etwa 0,2 mm) behandelt. Hierbei wurde ein aktiviertes folienförmiges PS-I erhalten (Trockengewicht 4,95 g).

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Claims

/~\ Patentansprüche

( I)/Verfahren zur Herstellung von ß-1,3-Glucanderivaten, dadurch gekennzeichnet, daß man ,in Wasser unlösliche ß-1,3-Glucane mit einem Cyanhalogenid behandelt.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Gegenwart von Wasser unter Zusatz eines Alkalis in solchen Mengen durchführt, daß der pH—Wert des Reaktionsgemisches in einem genügenden Maße steigt, um Auflösung des in Wasser unlöslichen ß-1,3-Glucans zu verhindern.
3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert des Reaktionsgemisches um etwa 0,2 bis 0,5 pH-Einheiten/Min, erhöht.
4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Wasser unlösliches ß-l,3-Glucan in Form eines Pulvers verwendet.
5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das in Wasser unlösliche ß-l,3-Glucan

in Form von Fasern verwendet.
6) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das in Wasser unlösliche ß-l,3-Glucan

in Form von Folien verwendet.
7) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das in Wasser unlösliche ß-l,3-Glucan

in Form von Perlen verwendet.
8) Gemäß Anspruch 1 bis 7 hergestellte ß-1,3-Glucanderivate.
9) Träger-Ligand-Produkte, dadurch gekennzeichnet, daß - sie aus einem gemäß Anspruch 1 bis 7 hergestellten

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ß-l,3-Glucanderivat als Träger und einem kovalent an den Träger gebundenen Liganden, der primäre oder sekundäre Aminogruppen enthält, bestehen.
10) Träger-Ligand-Produkte nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Enzym ist.

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