JPS5843405B2 - ベ−タ −１ ３− グルカンユウドウタイノ セイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は粉末状のβ−１・３−グルカンにハロゲン化シ
アンを作用させて粉末状のβ−１・３グル力ン誘導体を
製造する方法に関する。

更に詳しくは粉末状の水不溶性β−１・３−グルカンに
ハロゲン化シアンを作用させて、水不溶性酵素調製ある
いは、アフイニテイ・クロマトグラフィ用カラム調製に
用いる為の反応性に富む粉末状の水不溶性担体を製造す
る方法に関する。

一般に多糖類をハロゲン化シアンで活性化して、第１級
または第２級アミノ基を有する物質と容易に共有結合を
結ぶような誘導体に導く方法は、たとえば、Ｎａｔｕｒ
ｅ 、２１４．１３０２ （１９６７）あるいは特公昭
４５−３８５４３等に記載されており、その方法に従っ
て水不溶性酵素などを調製する方法に関する文献になる
と枚挙にいとまがない。

しかし、それらの文献中でβ−１・３−グルカンを担体
として使用した例は皆無である。

ハロゲン化シアンによる活性化反応は通常ｐＨ１１付近
のアルカリ性で行われるのであるが、β１・３−グルカ
ンは該ｐＨ条件下では溶解する性質があるために、この
方法をそのままβ−１・３−グルカンに適用しても活性
化した粉末状の水不溶性β−１・３−グルカンを得るこ
とは不可能である。

本発明者らは粉末状の水不溶性β−１・３−グルカンを
ハロゲン化シアンで活性化する反応条件について研究を
重ねた結果、β−１・３−グルカンの粒状を保ったまま
、これを活性化することに成功し本発明を完成するに至
った。

本発明で使用される粉末状の水不溶性β−１・３−グル
カンとしては、たとえばアルカリ土類金属またはアグロ
バクテリウム属の菌が生産する多糖類が挙げられ、具体
的にはアルカリゲネス・フェカリス・バール・ミクソゲ
ネス菌株１０Ｃ３Ｋにより生産される多糖類（Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌＢ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ｖｏｌ １３０、ｐａｇｅ１９６（１９６６
）、アルカリゲネス・フェカリス・バール・ミクソゲネ
ス菌株１０Ｃ３にの変異株ＮＴＫ−ｕ（ＩＦＯ１３１４
０）Ｋより生産される多糖類（特公昭４８−３２６７３
）（以下ＰＳ−１と称する）、アグロバクテリウム・ラ
ジオバクター（ＩＦＯ１３１２７）およびその変異株Ｕ
−１９（ＩＦＯ１３１２６）により生産される多糖類（
特公昭４８−３２６７４）（以下ＰＳ−２と称する）、
生薬扶苓に含まれるパキマン、褐藻類の成分であるラミ
ナラン、あるいは、酵母の細胞壁成分であるグルカンが
挙げられる。

活性化剤として用いるハロゲン化シアンとしては通常ブ
ロム、クロルまたはヨード化合物あるいは随意にこれら
の混合物を使用することが出来る。

本発明に使用されるアルカリとしてはたとえば水酸化ナ
トリウムが挙げられ、通常１〜５Ｎの水溶液として使用
するのが好ましい。

アルカリはｐＨ値が９〜１３になるまで添加するのが好
ましく、特に１１付近が好ましい。

アルカリの添加は水不溶性β−１・３−グルカンが溶解
しないように徐々に加えられ、その添加速度は、一般に
約０．２〜０．５ｐＨ単位／分程度が好ましい。

水不溶性β−１・３−グルカンのハロゲン化シアンによ
る活性化の１例をより具体的に示せば次のとおりである
。

粉末状の水不溶性β−１・３−グルカン１容を水２０容
に懸濁し、・・ロゲン化シアン０．１〜３容を含む水２
０容を加え、０〜５０℃の任意の温度に於て攪拌しなが
ら反応液のｐＨを、２Ｎの水酸化ナトリウム溶液を滴下
することにより、ｐＨ１１まで該粉末が溶解しないよう
に（約０．５ｐＨ単位／分の速度で）上昇させ、ｐＨ１
１に１５分間保つことにより、活性化反応を完了させる
。

反応終了後、固形物を沢取し１００容の水で洗浄するこ
とにより、粉末状の活性化されたβ−１・３グルカンが
得られる。

得られた活性化β−１３−グルカンは水及びアルカリ溶
液に不溶、加熱非凝固性で且つ親水性があり、カラムに
充填して使用する際に充分な流速が得られるような大き
さと強度をもつ粒子であるため、たとえば次のような方
法によって優れた性状を有する水不溶性酵素あるいはア
フイニイテイ・クロマトグラフィ用の担体−リーガンド
結合物を調製することができる。

水不溶性酵素あるいはアフイニイテイ・クロマトグラフ
ィ用Ｏ担体−リーガンド結合物の調製は、たとえば該活
性化β−１・３−グルカンと第一級または第二級のアミ
ン基を有する物質、たとえば酵素、蛋白質、ペプタイド
、アミノ酸、酵素の基質あるいはインヒビター、抗原、
抗体、ホルモン等とを、好ましくは弱アルカリ性の水溶
液中、約Ｏ〜５０℃の任意の温度において反応させるこ
とによって行われる。

以下に、実施例および参考例をもって本発明を更に具体
的に説明する。

実施例 Ｉ ＰＳ−１の白色粉末１０１を５００ＴｆＬｌ容のビーカ
ーに取り、蒸留水２００ｍ１を加えマグネチツクスター
ラーで攪拌しＰＳ−１を充分膨潤させた後、５％（Ｗ／
Ｖ）ブロムシアン水溶液２００ｒｒＬｌを加え、２５℃
に於て攪拌を続けながら、白傷滴定装置を用いて２Ｎ水
酸化ナトリウム溶液を滴下して約０．５ｐＨ単位／分の
速度でｐＨを徐々に上昇させてｐＨを１１に達せしめ、
更にそのｐＨに、約１５分間保つことにより反応を完了
させた。

反応終了後、反応液からＰＳ−１粒子を沢取し、更に蒸
留水１１で洗浄して、活性化ＰＳ−１を得た。

（乾燥重量は１０．０５ｆ）。実施例 ２ ＰＳ−２の白色粉末１０１を実施例１の場合と同様な方
法を用いてブロムシアンで活性化し、活性化されたＰＳ
−２を得た（乾燥重量は１０．０８１）。

参考例 １ 実施例１で得た活性化ＰＳ−１は、次のような性質を示
した。

（１）形および粒度 無処理のＰＳ−１は、蒸留水中で膨潤させるとへこんだ
ゴムマリ状の形態を有し、直径は２０〜５００μで大き
さは一定でないが５０μ前後のものが最も多い。

活性化ＰＳ−１は形および粒度ともに無処理のＰＳ−１
と差異が認められなかった。

（２）熱凝固性 無処理のＰＳ−１は、特有の熱凝固性を示すが、活性化
ＰＳ−１の懸濁液を沸騰水で１５分間加熱したがゼリー
化は全く認められなかった。

（３）溶解性 活性化ＰＳ−１は、無処理のＰＳ−１と全く異なり、強
アルカリ溶液に溶けず、またジメチルスルフオキシドや
濃ウレア溶液（８Ｍ）にも全（溶解されなくなった。

（４）元素分析 元素分析の結果、Ｃ３９，３７％、Ｈ６，１４％、Ｎ３
．２９％であった。

この値から計算すると、この活性化ＰＳ−１には、グル
コース残基当り平均０．４３個のＮ原子が導入されてい
る。

（５）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）無処理のＰＳ
−１の赤外線吸収スペクトルは第１図に示すとおりであ
り、活性化ＰＳ−１の赤外線吸収スペクトルは第２図に
示すとおりである。

両者のスペクトルを比較すると活性化ＰＳ−１には、１
７３０ｃｍ、’ 、１６２５ＣｒｆＬ−１，７８０ｃｒ
ｒＬ−１に新しく吸収帯が見られた。

これらは、１７３０ｃｆｒＬ ’がカルボン酸ア＊ ミ
ドに、１６２５と７８０ｃｆｒＬ−１がイミノカーボネ
イトに由来する吸収帯であると考えられる。

（６）染色性 中間らの方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ。

３２．４７〜５２、（１９７４））に従って水溶性色素
による染色性を、無処理および活性化したＰＳ−１につ
いて調べた結果は第１表の通りである。

活性化の処理により、ブリリアントブルーに対する染色
性のみが変化した。

参考例 ２ 実施例１で得た活性化ＰＳ−１の１１（乾燥重量）を蒸
留水で２０ｍ１の懸濁液とし、これに０．２Ｍ炭酸バッ
ファー（ｐＨ８，５） １０ＴＬｌ、プロナーゼ（科研
化学株式会社製）の２０ ｍ９７ｍ１溶液２ｍｌおよび
蒸留水８７７１１を加えて、５℃、ｐＨ８，５で攪拌し
ながら２０時間反応させた。

反応後、ＰＳ１ゲルをグラスフィルターで戸取し、０．
２Ｍグリシン溶液８０ＴＬｌ、０．５Ｍ塩化ナトリウム
溶液８０献、および蒸留水４０ｒｒＬｌで順次洗浄し、
プロナーゼの水不溶性酵素を得た。

合成基質であるｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニ
ンメチルエステルを用いて２５℃、ｐＨ８，０でプロナ
ーゼ活性を測定したところ、カップリング反応に用いた
プロナーゼ活性の６３％が水不溶性酵素となっているこ
とが判明した。

また上記の洗浄液中の総蛋白量をローリ−法（０，Ｈ，
Ｌｏｗｒｙ ｅｔ ａｌ ： Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅ
ｍ。

１９３．２６５ （１９５１））で定量し、はじめに用
いたプロナーゼの蛋白量から差引いて、蛋白の水不溶化
率を計算すると７７％であった。

参考例 ３ 実施例１で得た活性化ＰＳ−１の１１を蒸留水で２０ｍ
１の懸濁液とし、これに０．２Ｍ）ＩＪス塩酸バッファ
＝（ｐＨｓ、ｏ ） １ ｏｒｕｉおよび結晶α−アミ
ラーゼ（三共株式会社製）の２．５■／ｍＡの溶液１０
Ｗｌｌを加えて５℃、ｐＨ８，０で４時間反応後、参考
例２の場合と同様に洗浄し水不溶化α−アミラーゼを得
た。

可溶性澱粉を基質とし、ｐＨ５，３，３７℃で反応させ
α−アミラーゼ活性を測定すると、活性の水不溶化率は
５９％であった。

また蛋白の水不溶化率は６５％であった。

参考例 ４ 実施例１で得た活性化ＰＳ−１の１１を蒸留水で２０ｍ
１の懸濁液とし、これに０．２Ｍリン酸バッファー（、
ｐＨ８，０） １０ｒＩＬｌおよび結晶ｃｌ −キーＥ
： ）リプシン（シグマ社製）の２．５ ｍ９／ｒｎｌ
溶液１０ｒｆＬｌを加え、５℃、ｐＨ８でカップリング
反応を行なった。

反応は２時間で終了し、はじめに加えた酵素蛋白の７８
％がＰＳ−１に結合した。

Ｌ−チロシンエチルエステルを基質にして、１０％エタ
ノール存在下に２７℃、ｐＨ７，８でエステラーゼ活性
を測定すると、活性の水不溶化率は６４％であった。

参考例 ５ 実施例１で得た活性化ＰＳ−１の１１を蒸留水２０ｍ１
に懸濁後、０．２Ｍ）リス塩酸バッファー（ｐＨ８，０
） １０ｒａｌおよび小麦胚芽の酸性フォスファターゼ
（生化学工業株式会社）の２．５ ｍ９／ｍｌ溶液１０
１ｒＬｌを加え、５℃、ｐｎｓ、ｏで攪拌しながら１８
時間反応後、参考例２と同様に洗浄して、水不溶性酸性
フォスファターゼを得た。

０−カルボキシフェニルフォスフエイトを基質にして、
２５℃、ｐＨ５，０で活性を測定すると、はじめに加え
た酵素活性の５２％が水不溶化された。

また蛋白の水不溶化率は６３％であった。

参考例 ６ 実施例１で得た活性化ＰＳ−１の１１を蒸留水で２０ｒ
ｒＬｌの懸濁液とし、これにアセトバクター・タービダ
ンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｂｉｄａｎｓ
）（ＡＴＣＣ９３２５）菌体から抽出し部分精製したα
−アミノ酸エステルヒドロラーゼ〔本酵素の調製法およ
び性質については、Ｔ 、 Ｔ ａｋａｈａｓｈ ｉｅ
ｔ ａｌ ： Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、Ｊ 、 １３７．
４９７（１９７４））５ｍ９と０．１ Ｍ ）リス塩酸
バッファ（ｐＨ８，０） ２０ｍｌを加え、５℃、ｐＨ
８，０で４時間攪拌下に反応させた。

反応終了後、ＰＳ１ゲルをｆ取し、参考例２と同様に洗
浄して得られた水不溶性酵素を蒸留水で４０ｍ１に懸濁
した。

Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルヲ基質にしてこの
水不溶性酵素懸濁液の活性を測定したところ、９．８３
ユニツト／ＴｆＬｌであった。

これは、はじめに加えた酵素活性の８４％が不溶化した
ことを示す。

また、蛋白の不溶化率は６９％であった。

上記の水不溶性酵素懸濁液２５ｍＡ’を用いて、床体積
５１１１１の小カラムを調製し、５℃に於てＤ−フェニ
ルクリシンメチルエステル塩酸塩１５ｒｎ９／ｍｌ、７
−アミノ−３−デアセトキシセファロスポラン酸５ ｍ
９／ｒｎｌおよびメタノール１０％（Ｖ／Ｖ）を含むｐ
Ｈ７，２の基質溶液を、１２Ｔｌｌ／ｈｒ の一定流速
でカラム内を通過させると、カラムから流出する反応液
には７．５０１１１９／ｗＬｌのセファレキシンが含ま
れていた。

この反応を６ケ月間連続して行なったが、このカラムの
セファレキシン合成活性は全く低下しなかった。

参考例 ７ 実施例１の方法と同様にして得た活性化ＰＳ１の１７を
蒸留水で２０Ｔｆｌｌの懸濁液とし、これにＬ−ロイシ
ルクリシルクリシン（マン・リサーチ・ラボラトリーズ
社製）２０■を溶解した０、ＩＲ１リス塩酸ノくツファ
ー（ｐＨ８，０） ２０ｍｌを加え、５℃、ｐＨ８で１
６時間ゆるく攪拌しながら反応させた後、ｐｓ−ｉゲル
を戸数し参考例２と同様に洗浄した。

洗浄液中に回収されたＬ−ロイシルグリシルグリシンの
含量から逆算すると、ＰＳ −１に結合したＬ−ロイシ
ルグリシルグリシンの量は１２．６■であった。

また、上記方法において、Ｌ−ロイシルグリシルグリシ
ンに代えて人血清カンマ・グロブリン（フラクション■
、シグマ社製）およびインシュリン（シグマ社製）を用
いてそれぞれ上記方法と同様に反応を行ったところＰＳ
−１に結合したカンマ・グロブリンの量は１５．１■で
あり、インシュリンの量は１１．０Ｔｎ９であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＰＳ−１の赤外線吸収スペクトルを、第２図は
活性化ＰＳ−１の赤外線吸収スペクトルをそれぞれ示す
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 粉末状の水不溶性β−１・３−グルカンと・・ロゲ
   ン化シアンを水の存在下に、アルカリを約０．２〜０．
   ５ｐＨ単位／分の速度で加えてｐＨを上昇させることに
   よって、反応させることを特徴とする粉末状のβ−１・
   ３−グルカン誘導体の製造法。