DE60009700T2

DE60009700T2 - Neue entgiftungsmittel auf der basis von triazin und ihre verwendung

Info

Publication number: DE60009700T2
Application number: DE60009700T
Authority: DE
Inventors: Christopher R. Lowe; Kim Hilary West Kensington LAWDEN
Original assignee: Prometic Biosciences Ltd
Current assignee: Prometic Bioseparations Ltd
Priority date: 1999-05-10
Filing date: 2000-05-09
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2020-05-10
Also published as: ES2214272T3; JP4712978B2; DE60009700D1; US6773599B1; EP1189692A1; CA2369442A1; AU4593700A; JP2002543898A; US20080096220A1; CN1128807C; GB9910807D0; CN1350476A; ATE263624T1; HK1046654A1; EP1189692B1; US7364656B1; US20050014678A1; DK1189692T3; WO2000067900A1; HK1046654B

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Affinitätsliganden, ihre Herstellung und Anbringung an Matrizes, die aus festen, halbfesten, teilchenförmigen oder kolloidalen Materialien oder löslichen Polymeren bestehen können. Die Erfindung betrifft weiter diese Affinitätsligand-Matrix-Konjugate und die Herstellung und Verwendung derselben bei der Bindung und Entfernung von Endotoxin aus verschiedenen Fluiden, wie Wasser, wässrigen Lösungen, Körperflüssigkeiten, Blut, Plasma, Lösungen von pharmazeutischen Produkten, Proteinen und anderen Verbindungen biologischen Ursprungs.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Endotoxine sind Lipopolysaccharide, die in der äußersten Membran von gram-negativen Bakterien, insbesondere pathogenen Bakterien der Klasse Enterobacteriaceae, Neisseriaceae und Chlamydiaceae gefunden werden. Endotoxine umfassen Lipid A, das an einem Polysaccharid mit variabler Struktur angebracht ist, die von seinem biologischen Ursprung abhängt. Die Polysaccharid-Komponente von Enterobacteriaceae-Endotoxin ist durch eine O-spezifische Kettenregion und eine Kernregion gekennzeichnet. Die O-spezifische Region umfasst bis zu 50 wiederkehrende Oligosaccharid-Einheiten, die so viel wie 8 verschiedene Zuckerreste enthalten. O-spezifische Ketten zeigen von Art zu Art eine große strukturelle Diversität, wohingegen die Kernregion, die in die äußere Kern- und innere Kernregion aufgeteilt ist, weniger variabel ist. Die innere Kernregion ist durch die Anwesenheit von ungewöhnlichen Zuckerresten, wie Heptose und 2-Keto-3-desoxyoctonsäure (KDO) gekennzeichnet, welche häufig mit Phosphat oder Phosphat-Derivaten substituiert sind. Lipid A, das ebenfalls an der inneren Kernregion angebracht ist, ist ein konserviertes biophosphoryliertes Glucosamindisaccharid, das mit 4 gesättigten primären Acylgruppen acyliert ist, von denen 2 sekundäre gesättigte Acylgruppen tragen. Die Kombination von hydrophoben Lipid A-Schwänzen mit der hydrophilen und anionischen Polysaccharid-Einheit liefert ein Endotoxin mit amphipathischen Eigenschaften.
Endotoxin, das aus der Zellwand von gram-negativen Bakterien freigesetzt wird, wird als die Hauptursache der vielen pathophysiologischen Ereignisse angesehen, die eine gram-negative Septikämie begleiten. Endotoxin bei pg/ml-Konzentrationen im Blut löst die Freisetzung einer Vielfalt von Cytokinen, einschließlich Interleukinen und TNF, aus. Eine Überstimulierung des Immunsystems durch Endotoxin führt zu einer massiven Freisetzung von Cytokinen, die letztendlich einen metabolischen Zusammenbruch und septischen Schock zur Folge hat. Beim septischen Schock werden die Komplement- und Koagulationskaskaden aktiviert, und die Gefäßpermeabilität nimmt zu. Dies kann zu verbreiteter intravaskulärer Koagulation und Mehrfachorganversagen führen, häufig mit tödlichen Konsequenzen. Der septische Schock entwickelt sich häufig wegen des Fehlens einer anfänglichen Antwort auf eine Infektion, welches ermöglicht, dass die Konzentration an im Blut vorhandenem Endotoxin kritische Konzentrationen erreicht.
Zusätzlich zu dem offensichtlichen Risiko, welches die Anwesenheit von lebenden gram-negativen Bakterien oder Zellwandtrümmern in parenteralen pharmazeutischen Produkten darstellt, ist die Anwesenheit von freiem Endotoxin in pharmazeutischen Präparaten ebenfalls ein Hauptproblem. Da Endotoxin so ein potenter Immunstimulator ist, können sehr niedrige Konzentrationen toxische Reaktionen, einschließlich pyrogener Wirkungen, verursachen. Endotoxin ist ein relativ stabiles Molekül, das nicht durch Routine-Autoklavieren oder Behandlung mit organischen Lösungsmitteln inaktiviert wird. Die Einwirkung von konzentriertem Natriumhydroxid oder verlängerter hoher Temperatur (250 °C) inaktiviert Endotoxin, obwohl derartige Verfahren für die meisten biologischen Produkte nicht geeignet sind. Weiter ist die Aufrechterhaltung einer vollständigen Sterilität während des gesamten Verfahrens von Biotherapeutika problematisch. Demgemäß ist ein hoch effizientes Abfangen und eine hoch effiziente Entfernung von Endotoxin aus parenteralen Pharmazeutika sehr wünschenswert, insbesondere in Situationen, in denen bekannt ist, dass sich Endotoxin mit Komponenten der therapeutischen Formulierung assoziiert.
Eine Vielfalt von Techniken ist verwendet worden, um Endotoxin aus wässrigen Lösungen zu entfernen, einschließlich Ultrafiltration, Aktivkohleadsorption, Kationenaustausch-Chromatographie und einer Vielfalt von immobilisierten Affinitätsliganden, einschließlich Polymyxin B und Endotoxin-bindenden Proteins. Alle diese Techniken weisen signifikante Unzulänglichkeiten auf, insbesondere im Fall der Endotoxin-Entfernung aus Verbindungen mit hohem Molekulargewicht, wie therapeutischen Proteinen. Ultrafiltration kann nur verwendet werden, um Endotoxin aus Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen, wohingegen Aktivkohleadsorption dazu neigt, die Bindungen der meisten organischen Verbindungen zu fördern. Kationenaustausch-Chromatographie ist bei der Entfernung von Endotoxin aus Wasser wirksam, aber bei Protein-haltigen Lösungen, insbesondere bei Proteinen mit sauren isoelektrischen Punkten, weniger wirksam. Polymyxin B, ein cyclisches Polypeptid-Antibiotikum, ist zu toxisch, um dessen Verwendung für die Reinigung von therapeutischen Produkten zu gestatten, wohingegen Endotoxin-bindendes Protein für kommerzielle Anwendungen zu teuer ist.
Immobilisierte kationische Aminosäuren (Histidin, Lysin und Arginin) sind ebenfalls für die Endotoxin-Entfernung verwendet worden (Tosa, T. et al., Molecular Interactions in Bioseparations, Hsg. Ngo, T.T., Plenum Press, New York, S. 323–332, 1993; Lawden, K.H. et al., Bacterial Endotoxins: Lipopolysaccharides From Genes to Therapy, Wiley-Liss Inc., S. 443–452, 1995). Derartige Materialien sind durch die direkte Anbringung von Aminosäuren an Epoxy-aktivierte chromatographische Matrizes hergestellt worden. Im Fall von Pyrosep^TM, einem kommerziell erhältlichen Material, das von Tanabe Seiyaku Company Limited, Osaka, Japan, hergestellt wird, ist eine einzige Histidingruppe durch einen Hexandiamin-Abstandshalterarm an einer Trägermatrix immobilisiert. Wiederum sind derartige Materialien für die Entfernung von Endotoxin aus Wasser oder Lösungen von Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht geeignet, aber ihre Leistung wird in Anwesenheit von Salz (> 50 mM) oder Proteinen, die eine Affinität für Endotoxin aufweisen, beeinträchtigt. Dementsprechend ist keines der verfügbaren Verfahren zur Endotoxin-Entfernung bei der Eliminierung von Endotoxin aus biotherapeutischen Verbindungen geeignet, die für die parenterale Verabreichung bestimmt sind. Dies gilt insbesondere für Protein-Therapeutika, wo es kein einziges wirksames und sicheres Verfahren zur Endotoxin-Entfernung gibt.
Die Entfernung von Endotoxin aus Blut oder Plasma kann einen wirksamen Ansatz bei der Handhabung von septischem Schock bereitstellen, insbesondere wenn sie in den frühen Stadien der Infektion oder prophylaktisch in Situationen angewendet wird, bei denen ein erhöhtes Risiko von septischem Schock vorausgesagt wird (z.B. großer Darm- oder Leberoperation). Mehrere Studien sind bezüglich der Verwendung von monoklonalen Antikörpern mitgeteilt worden, welche gegen Endotoxin oder Cytokine gerichtet sind, die in der anfänglichen Phase der Schockreaktion freigesetzt werden. Jedoch wurde gefunden, dass die meisten dieser Ansätze ineffektiv sind (Siegel J.P. Drug Information Journal, 30, S. 567–572, 1996). Im Gegensatz dazu ist eine extrakorporale Extraktion von Endotoxin aus Vollblut durch die Verwendung von Faser-immobilisiertem Polymyxin B bewerkstelligt worden (Aoki, H. et al., Nippon Geka Gakkai Zasshi (Japan), 94, S. 775–780, 1993), obwohl Bedenken bezüglich einer potentiellen Toxizität von Polymycin B-Auslaugungen verbleiben. Dementsprechend können Affinitätsadsorbenzien, die Endotoxin-bindende Liganden enthalten, welche eine hohe Affinität zu Endotoxin und eine geringe Toxizität aufweisen, auch für die Handhabung von Sepsis vorteilhaft sein.
Immobilisierte Aminosäuren sind ebenfalls als potentielle Endotoxin-entfernende Mittel untersucht worden, aber derartige Materialien binden Endotoxin schwach und nicht-spezifisch und sind bei der Extraktion von Endotoxin aus biologischen Fluiden und Lösungen von biologischen Verbindungen von begrenztem Wert. Verbindungen auf Triazin-Basis sind mitgeteilt worden, welche selektiv an Proteine binden. Jedoch sind derartige Liganden nicht für die Isolierung von Endotoxin anwendbar.
Die WO-A-97/10887 offenbart Affinitätsligand-Matrix-Konjugate auf der Basis einer Triazin-Struktur, von denen offenbart ist, dass sie ... aufweisen.
Burton et al., Journal of Molecular Recognition, 5: 55–68 (1992) offenbart eine Verbindung auf Triazin-Basis, die als Affinitätsabsorbens für die Reinigung von Trypsin-artigen Proteasen verwendet werden kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Entdeckung von synthetischen Affinitätsliganden-Strukturen, welche Endotoxine selektiv binden. Es wurde eine generische Gruppe von Affinitätsliganden gefunden, die eine hohe Affinität zu Endotoxin zeigt und allgemein für die Isolierung von Endotoxin aus einer Vielfalt von Quellen anwendbar ist.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Affinitätsligand mit der allgemeinen Formel (I):
in der ein X für N steht und das andere X für N, CCl oder CCN steht;
A₁ und A₂ jeweils unabhängig O, S oder N-R₁ sind und R₁ für H, (C_1-6)-Alkyl, (C_1-6)-Hydroxyalkyl, Benzyl oder β-Phenethyl steht;
B₁ und B₂ jeweils unabhängig eine gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoff-Verknüpfung sind, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält;
D₁ für H oder eine primäre Amino-, sekundäre Amino-, tertiäre Amino-, tertiäre Ammonium-, Imidazol-, Guanidino- oder Amidinogruppe steht; und
D₂ für eine sekundäre Amino-, tertiäre Amino-, quaternäre Ammonium-, Imidazol-, Guanidino- oder Amidinogruppe steht; oder
B₂–D₂ für -CHCOOH-(CH₂)_3-4-NH₂ steht;
p für 0 oder 1 steht; und
Z eine funktionelle Gruppe ist, die zu einer Reaktion mit einer festen Matrix in der Lage ist;
oder ein Konjugat des Affinitätsliganden und einer Matrix, die durch die Gruppe Z an den Liganden gebunden ist,
für die Entfernung, Abtrennung und Isolierung, Reinigung, Charakterisierung, Identifizierung oder Quantifizierung eines Endotoxins verwendet.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung sind neue Konjugate und Liganden die oben definierten, in denen p für 1 steht.
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines allgemeinen Werkzeugs für die Entfernung einer Endotoxin-Kontamination aus biologischen Materialien. Endotoxine binden sich außerordentlich eng an die Affinitätsligand-Matrix-Konjugate der Erfindung. Dieses Merkmal ermöglicht eine hoch effiziente Extraktion von Endotoxin aus Wasser und wässrigen Lösungen, wodurch ein Mittel für die Erzeugung von Pyrogen-freiem Wasser oder Pyrogen-freien Lösungen bereitgestellt wird. Affinitätsligand-Matrix-Konjugate der Erfindung sind insbesondere für die Entfernung von Endotoxin wertvoll, das an Proteine, Arzneistoffe oder andere biologische Verbindungen, die für medizinische oder pharmazeutische Anwendungen bestimmt sind, gebunden oder damit assoziiert ist. Gewisse biologische Verbindungen, insbesondere Proteine, binden Endotoxin häufig eng, und eine anschließende Entfernung durch vorhandene Mittel ist sehr schwierig, wenn nicht unmöglich. Affinitätsligand-Matrix-Konjugate der Erfindung können auch für die Entfernung von Endotoxin aus Blut oder Plasma verwendet werden und stellen so ein besonders nützliches Werkzeug für eine In-vitro- oder In-vivo-Entfernung von Endotoxin bereit, wobei die letztgenannte beispielsweise mittels einer extrakorporalen Endotoxin-Extraktionsvorrichtung erzielt werden kann. Eine derartige Vorrichtung kann insbesondere für die Entfernung von Endotoxin wertvoll sein, das bei bakteriellen Infektionen in den Blutstrom freigesetzt wird, wobei derartige Infektionen häufig lebensbedrohliche Krankheiten, wie Septikämie oder Meningitis, verursachen. Die Entfernung von im Blut vorhandenem Endotoxin kann bei der Behandlung dieser Krankheiten und bei der Verhütung und Handhabung von septischem Schock besonders vorteilhaft sein.
Affinitätsligand-Matrix-Konjugate, die von dieser Erfindung bereitgestellt werden, können anstelle von anderen Endotoxin-bindenden Materialien verwendet werden und sind in ihrer Verwendung bedeutend flexibler, sind robuster, weniger teuer herzustellen und bieten größere Endotoxinbindungs-Wirkungsgrade.
Ein Ligand der Erfindung kann über Z, gegebenenfalls durch einen Abstandshalterarm, der zwischen dem Liganden und der Matrix eingefügt ist, an eine Trägermatrix angebracht werden. Alternativ stellt Z in den neuen Liganden der Erfindung eine funktionelle Gruppe der Art dar, die zur Reaktion mit einer festen Matrix in der Lage ist, die aktiviert (falls erforderlich oder gewünscht) oder nicht aktiviert sein kann.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wenn er an eine Matrix konjugiert ist, wird der fakultative Abstandshalterarm vorzugsweise durch die allgemeine Formel (II): -T-[L-V]_m- (II) dargestellt, in der
T ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder eine Gruppe N-R₂ darstellt, worin R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe darstellt, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält;
V ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, eine Gruppe -COO-, eine Gruppe CONH oder eine Gruppe NHCO, eine Gruppe -PO₃H, eine NH-Arylen-SO₂-CH₂-CH₂-Gruppe oder eine Gruppe N-R₃ darstellt; worin R₃ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe darstellt, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält;
L eine gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoff-Verknüpfung darstellt, die 2 bis 20 Kohlenstoffatome enthält; und
m für 0 oder 1 steht.
Bei der Trägermatrix kann es sich um irgendeine Verbindung oder irgendein Material, teilchenförmig oder nicht-teilchenförmig, löslich oder unlöslich, porös oder nicht-porös, handeln, das in Verbindung mit Affinitätsliganden verwendet werden kann, um ein Affinitätsligand-Matrix-Konjugat zu bilden, und das ein zweckmäßiges Mittel zur Abtrennung der Affinitätsliganden von gelösten Stoffen in einer kontaktierenden Lösung bereitstellt.
Die vorliegenden Erfindung stellt Affinitätsligand-Matrix-Konjugate bereit, die bei der Isolierung oder Entfernung von Endotoxin aus Wasser, wässrigen Lösungen, Körperflüssigkeiten, Blut, Plasma, Lösungen von pharmazeutischen Produkten, Proteinen und anderen Verbindungen biologischen Ursprungs verwendet werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Affinitätsligand-Matrix-Konjugate durch die allgemeine Formel (III) dargestellt:
in der A₁, A₂, B₁, B₂, D₁, D₂, p, X, T, L, V, m, R₁, R₂ und R₃ die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen und M den Rest einer Trägermatrix darstellt, bei der es sich um irgendeine Verbindung oder irgendein Material, teilchenförmig oder nicht-teilchenförmig, löslich oder unlöslich, porös oder nicht-porös, handeln kann, das in Verbindung mit Affinitätsliganden verwendet werden kann, um ein Affinitätsligand-Matrix-Konjugat zu bilden, und das ein zweckmäßiges Mittel zur Abtrennung der Affinitätsliganden von gelösten Stoffen in einer kontaktierenden Lösung bereitstellt.
Man wird anerkennen, dass diese Erfindung unter anderem die Verwendung von Verbindungen betrifft, bei denen es sich um Pyrimidine, Diazine oder Triazine handelt, die einen Substituenten -T-[L-V]_0-1-M oder einer Vorstufe davon und andere Substituenten tragen, die über ein Heteroatom an den Ring geknüpft sind. Derartige Substituenten können jede nicht-störende Gruppe einschließen, die 0 bis 20 Kohlenstoffatome umfasst.
In der vorliegenden Beschreibung sollen, wann immer der Ausdruck Endotoxin im Plural- oder generischen Sinn verwendet wird, Endotoxine gemeint sein, die aus irgendeiner mikrobiologischen Quelle abstammen. Mit dem Ausdruck Endotoxin ist demgemäß auch Lipopolysaccharid von jeder Art, einschließlich Enterobacteriaceae, Neisseriaceae und Chlamydiaceae, gemeint. Da es bekannt ist, dass Endotoxin heterogen ist, schließt der Ausdruck „Endotoxin", wie hierin verwendet, alle natürlich vorkommenden Formen ein, die Lipid A kovalent an ein Polysaccharid geknüpft umfassen, einschließlich Analoga, Derivaten, Fragmenten und Vorstufen derselben.
Der Ausdruck „primäre Aminogruppe", wie allein oder in Kombination hierin verwendet, bezeichnet auf eine Gruppe -NH₂.
Der Ausdruck „sekundäre Aminogruppe", wie hierin allein oder in Kombination verwendet, bezeichnet eine Gruppe -NHR₄, worin R₄ eine gerade oder verzweigte Alkylgruppe darstellt, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält.
Der Ausdruck „tertiäre Aminogruppe", wie hierin allein oder in Kombination verwendet, bezeichnet eine Gruppe -NR₅R₆, in der R₆ und R₆ jeweils eine gerade oder verzweigte Alkylgruppe darstellen, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält.
Der Ausdruck „quaternäre Ammoniumgruppe", wie hierin allein oder in Kombination verwendet, bezeichnet eine Gruppe -NR₇R₈R₉ ⁺, in der R₇, R₈ und R₉ jeweils eine gerade oder verzweigte Alkylgruppe darstellen, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält.
Der Ausdruck „Alkylgruppe, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält", wie hierin allein oder in Kombination verwendet, bezeichnet eine gerade oder verzweigte gesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sek-Butyl, Isobutyl, tert-Butyl, n-Pentyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, n-Hexyl, 4-Methylpentyl, Neopentyl und 2,2-Dimethylpropyl.
Der Ausdruck „Hydroxyalkylgruppe, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält", wie hierin allein oder in Kombination verwendet, bezeichnet eine gerade oder verzweigte gesättigte Kohlenwasserstoff-Kette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, die mit einer oder mehreren Hydroxygruppen, vorzugsweise einer Hydroxygruppe, substituiert ist, wie beispielsweise Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, 3-Hydroxypropyl, 2-Hydroxypropyl, 4-Hydroxybutyl, 5-Hydroxypentyl und 6-Hydroxyhexyl.
Der Ausdruck „Alkoxygruppe, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält", wie hierin allein oder in Kombination verwendet, bezeichnet einen geraden oder verzweigten einwertigen Substituenten, der eine Alkylgruppe umfasst, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, der durch einen Ether-Sauerstoff verknüpft ist und seine freie Valenzbindung vom Ether-Sauerstoff aus aufweist und 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, z.B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy und Pentoxy.
Der Ausdruck „Halogen" bedeutet Fluor, Chlor, Brom oder Iod.
Der Ausdruck „Acyloxy oder Acylamino, das 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält", wie hierin verwendet, bezeichnet einen einwertigen Substituenten, der eine Alkylgruppe umfasst, die 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält, der durch eine Carbonyloxy- oder Oxycarbonyl-Gruppe, wie eine Methylcarbonyloxy-, Ethylcarbonyloxy-, Methyloxycarbonyl- oder Ethyloxycarbonyl-Gruppe, oder durch eine Carbonylamino- oder Aminocarbonyl-Gruppe, wie eine Methylcarbonylamino-, Ethylcarbonylamino-, Methylaminocarbonyl- oder Ethylaminocarbonyl-Gruppe, verknüpft ist.
Der Ausdruck „Alkylsulfonyl, das 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält", wie hierin verwendet, bezeichnet einen einwertigen Substituenten, der eine Alkylgruppe umfasst, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, und der durch eine Sulfonylgruppe verknüpft ist, wie beispielsweise Methylsulfonyl, Ethylsulfonyl, n-Propylsulfonyl, Isopropylsulfonyl, n-Butylsulfonyl, sek-Butylsulfonyl, Isobutylsulfonyl, tert-Butylsulfonyl, n-Pentylsulfonyl, 2-Methylbutylsulfonyl, 3-Methylbutylsulfonyl, n-Hexylsulfonyl, 4-Methylpentylsulfonyl, Neopentylsulfonyl und 2,2-Dimethylpropylsulfonyl.
Der Ausdruck „ein oder mehrere Substituenten, die unabhängig ausgewählt sind aus" soll sich bevorzugter auf 1–3 Substituenten beziehen. Der Ausdruck soll sich weiter bevorzugt auf 1–2 Substituenten und am bevorzugtesten auf einen Substituenten beziehen.
Der Ausdruck „gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoff-Verknüpfung, die 2 bis 20 Kohlenstoffatome enthält", wie hierin verwendet, bezeichnet eine oder mehrere lineare oder verzweigte Alkylketten, die gegebenenfalls beispielsweise mit Hydroxy- oder Alkoxygruppen substituiert sind, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten, und gegebenenfalls durch Amino-, Ether-, Thioether-, Ester-, Amid- oder Sulfonamid-Bindungen zusammengeknüpft sind, wobei eine Kette bereitgestellt wird, die 2 bis 20 Kohlenstoffatome enthält. Der Aufbau ist bevorzugt flexibel. Der Aufbau derartiger gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoff-Verknüpfungen ist beispielsweise in Lowe, C.R., und Dean, P.D.G, 1974, Affinity Chromatography, John Wiley & Sons, London, beschrieben, was hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Der Ausdruck „gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoff-Verknüpfung, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält", wie hierin allein oder in Kombination verwendet, bezeichnet eine lineare oder verzweigte Kohlenwasserstoff-Kette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert ist, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Carboxylgruppen, vorzugsweise einer Carboxylgruppe, und Hydroxylgruppen. Die Kohlenwasserstoff-Verknüpfung kann beispielsweise eine Alikyl-, Phenyl-, Naphthyl- oder Cyclohexylgruppe sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt R₁ ein Wasserstoffatom dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt R₂ ein Wasserstoffatom dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt R₃ ein Wasserstoffatom dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt R₄ eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe oder eine Propylgruppe dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt R₅ eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe oder eine Propylgruppe dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt R₆ eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe oder eine Propylgruppe dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt R₇ eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe oder eine Propylgruppe dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt R₈ eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe oder eine Propylgruppe dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt R₉ eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe oder eine Propylgruppe dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung steht A₁ für N-R₁, worin R₁ wie oben definiert ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung steht A₂ für N-R₁, worin R₁ wie oben definiert ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt B₁ eine Gruppe -CHCOOH-CH₂-, eine Gruppe -CHCOOH-(CH₂)₂-, eine Gruppe -CHCOOH-(CH₂)₃-, eine Gruppe -CHCOOH-(CH₂)₄-, eine Ethylgruppe, eine Propylgruppe, eine 2-Hydroxypropylgruppe, eine Butylgruppe, eine Pentylgruppe, eine Hexylgruppe oder eine Phenylgruppe dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt B₂ eine Gruppe -CHCOOH-CH₂-, eine Gruppe -CHCOOH-(CH₂)₂-, eine Gruppe CHCOOH-(CH₂)₃-, eine Gruppe -CHCOOH-(CH₂)₄-, eine Ethylgruppe, eine Propylgruppe, eine 2-Hydroxypropylgruppe, eine Butylgruppe, eine Pentylgruppe, eine Hexylgruppe oder eine Phenylgruppe dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt D, Wasserstoff, eine Aminogruppe, eine Imidazolgruppe, eine Guanidinogruppe, eine Amidinogruppe, eine Trimethylammoniumgruppe, eine Triethylammoniumgruppe, eine Dimethylaminogruppe, eine Diethylaminogruppe, eine Methylaminogruppe oder eine Ethylaminogruppe dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt D₂ eine Aminogruppe, eine Imidazolgruppe, eine Guanidinogruppe, eine Amidinogruppe, eine Trimethylammoniumgruppe, eine Triethylammoniumgruppe, eine Dimethylaminogruppe, eine Diethylaminogruppe, eine Methylaminogruppe oder eine Ethylaminogruppe dar. D₂ (und häufig auch D₁) ist vorzugsweise eine stark geladene Spezies. Beispielsweise kann D₂ von Lysin oder Ornithin abgeleitet sein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellen beide X ein Stickstoffatom dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt T ein Sauerstoffatom oder bevorzugter ein NH-Gruppe dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt L eine Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl-, Decyl- oder Dodecylgruppe dar und sind V und m wie oben definiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt V ein Sauerstoffatom, eine Gruppe -COO-, eine Gruppe PO₃H- oder eine Gruppe N-R₃ und bevorzugter ein Sauerstoffatom oder eine NH-Gruppe dar und sind L und m wie oben definiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung steht m für 1 und sind L und V wie oben definiert.
Der Ausdruck „ganze Zahl zwischen x und y" kann die Werte x (einschließlich 0) und y einschließen.
Affinitätsligand-Matrix-Konjugate zur Verwendung in oder gemäß der Erfindung können durch ein Verfahren hergestellt werden, welches die Umsetzung in irgendeiner Reihenfolge von

(i) einer halogenheterocyclischen Verbindung der allgemeinen Formel (IV):
in der die Symbole X die vorstehend angegebene Bedeutung aufweisen und W ein Halogenatom darstellt, mit
(ii) einer Verbindung der allgemeinen Formel (V): D₁-[B₁]_p-A₁-H (V)in der die Symbole D₁, B₁, A₁ und p die vorstehend angegebenen Bedeutungen aufweisen und H für Wasserstoff steht,
(iii) einer Verbindung der allgemeinen Formel (VI): D₂-B₂-A₂-H (VI)in der die Symbole D₂, B₂ und A₂ die vorstehend angegebenen Bedeutungen aufweisen und H für Wasserstoff steht,
(iv) mit entweder einer gegebenenfalls derivatisierten Trägermatrix der allgemeinen Formel (VII): H-T-[L-V]_m-M (VII)in der die Symbole T, L, V, m und M die vorstehend angegebenen Bedeutungen aufweisen und N für Wasserstoff steht, oder mit einer Verknüpfungseinheit der allgemeinen Formel (VIII): H-T-L-V-H (VIII)in der die Symbole T, L, V die vorstehend angegebenen Bedeutungen aufweisen, umfasst, um eine Verbindung der allgemeinen Formel (IX):

₁

₂

₁

₂

₁

₂

₁

₂

₃

₄

₅

₆

₇

₈

₉

Als Beispiele für halogenheterocyclische Verbindungen der allgemeinen Formel (IV) kann man 5-Chlor-2,4,6-trifluorpyrimidin, 5-Cyano-2,4,6-trichlorpyrimidin, Cyanurfluorid, Cyanurbromid und vor allem Cyanurchlorid erwähnen.
Als Beispiele für Verbindungen der allgemeinen Formel (V) kann man Ammoniak, Wasser, Arginin, Lysin, Histidin, α,γ-Diaminobuttersäure, m-Aminobenzamidin, p-Aminobenzamidin, m-Amino benzoltrimethylammoniumbromid, p-Aminobenzoltrimethylammoniumbromid, 2-(Diethylamino)ethylamin, (2-Aminoethyl)trimethylammoniumchlorid, Histamin, Agmatin, Ethylendiamin, 1,3-Diaminopropan, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan, 1,4-Diaminobutan, 1,5-Diaminopentan und 1,6-Diaminohexan erwähnen.
Als Beispiele für Verbindungen der allgemeinen Formel (VI) kann man Arginin, Lysin, Histidin, α,γ-Diaminobuttersäure, m-Aminobenzamidin, p-Aminobenzamidin, m-Aminobenzoltrimethylammoniumbromid, p-Aminobenzoltrimethylammoniumbromid, 2-(Diethylamino)ethylamin, (2-Aminoethyl)trimethylammoniumchlorid, Histamin, Agmatin, Ethylendiamin, 1,3-Diaminopropan, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan, 1,4-Diaminobutan, 1,5-Diaminopentan, 1,6-Diaminohexan erwähnen.
Als Beispiel für Trägermatrizes, deren Rest durch M dargestellt wird, kann man unlösliche Trägermatrizes, wie natürlich vorkommendes Polymer, z.B. ein Polypeptid oder Protein, wie vernetztes Albumin, oder ein Polysaccharid, wie Agarose, Alginat, Carrageenan, Chitin, Cellulose, Dextran oder Stärke; synthetische Polymere, wie Polyacrylamid, Polystyrol, Polyacrolein, Polyvinylalkohol, Polymethylacrylat oder Perfluorkohlenstoff; anorganische Verbindungen, wie Siliciumdioxid, Glas, Kieselgur, Aluminiumoxid, Eisenoxid oder andere Metalloxide, oder Copolymere erwähnen, die aus irgendeiner Kombination von 2 oder mehr eines natürlich vorkommenden Polymers, synthetischen Polymers oder anorganischer Verbindungen bestehen. Ebenfalls in die Definition von Trägermatrizes, deren Rest durch M dargestellt wird, sind lösliche Trägermatrizes, die Polymere wie Dextran, Polyethylenglycol, Polyvinylalkohol oder hydrolysierte Stärke umfassen und Affinitätsligand-Matrix-Konjugate zur Verwendung in der Flüssigkeitsverteilung bereitstellen; oder Trägermatrizes eingeschlossen, die Verbindungen wie Perfluordecalin umfassen, die Affinitätsligand-Matrix-Konjugate zur Verwendung bei der Bildung von Affinitätsemulsionen bereitstellen. Zur Vermeidung jeglichen Zweifels ist eine Trägermatrix hierin als irgendeine Verbindung oder irgendein Material, ob teilchenförmig oder nicht-teilchenförmig, löslich oder unlöslich, porös oder nicht-porös, definiert, welches verwendet werden kann, um eine neues Affinitätsligand-Matrix-Konjugat gemäß der Erfindung zu bilden und ein zweckmäßiges Mittel zur Abtrennung des Affinitätsliganden aus gelösten Stoffen in einer kontaktierenden Lösung bereitstellt.
Ebenfalls eingeschlossen in der Definition von Trägermatrizes, deren Rest durch M dargestellt wird, sind Trägermatrizes wie Agarose, Cellulose, Dextran, Stärke, Alginat, Carrageenan, synthetische Polymere, Siliciumdioxid, Glas und Metalloxide, die durch Behandlung mit einem Aktivierungsmittel vor oder während der Anbringung des Liganden modifiziert worden sind oder modifiziert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt M gegebenenfalls aktivierte(s) Agarose, Siliciumdioxid, Cellulose, Dextran, Glas, Toyopearl, Hydroxyethylmethacrylat, Polyacrylamid, Styroldivinylbenzol, Hyper D, Perfluorkohlenstoffe, Polysulfon, Polyethersulfon, Polyvinylidenfluorid, Nylon und Polyvinylchlorid dar. Vorzugsweise stellt M gegebenenfalls Tresyl-aktivierte, Sulfonylchlorid-aktivierte, Tosyl-aktivierte, Vinylsulfon-aktivierte oder Epoxy-aktivierte Agarose dar.
Es gibt eine beträchtliche Anzahl an Aktivierungsmitteln, die für den allgemeinen Zweck der Anbringung von Liganden an Trägermatrizes Verwendung gefunden haben. Diese Verbindungen und ihre Verfahren zur Verwendung sind dem Fachmann wohlbekannt, und da der Kernpunkt der vorliegenden Erfindung in der Natur des Liganden liegt, der an der Matrix angebracht ist, und nicht in der Anbringungsweise, wird jedes dieser Aktivierungsmittel bei der Herstellung der neuen Matrix-Ligand- Konjugate der Erfindung dienlich sein. Als nicht-beschränkenden Beispiele für derartige Aktivierungsmittel können verschiedene Verbindungen, wie Bromcyan, Cyanurchlorid, Epichlorhydrin, Divinylsulfon, p-Toluolsulfonylchlorid, 1,1'-Carbonyldiimidazol, Natriummetaperiodad, 2-Fluor-1-methylpyridiniumtoluol-4-sulfonat, Glycidoxypropyltrimethoxysilan und 2,2,2-Trifluorethansulfonylchlorid erwähnt werden. Wie oben angegeben, sind die Verfahren, durch welche derartige Aktivierungsschritte durchgeführt werden, dem Fachmann wohlbekannt.
Ähnlich kann eine große Vielfalt von Kondensationsmitteln verwendet werden, um die Verbindungen der allgemeinen Formeln (VIII) und (IX) an Trägermatrizes, wie Agarose, Cellulose, Dextran, Stärke, Alginat, Carrageenan, Siliciumdioxid oder Glas, anzubringen. Wiederum sind diese Verbindungen und ihr Verfahren zur Verwendung dem Fachmann wohlbekannt und wiederum wird, da der Kernpunkt der vorliegenden Erfindung in der Natur des Liganden und nicht in der Weise der Anbringung liegt, jedes dieser Kondensationsmittel bei der Herstellung der neuen Matrix-Ligand-Konjugate der Erfindung dienlich sein. Als nicht-beschränkende Beispiele für derartige Kondensationsmittel können N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin, Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid erwähnt werden.
Als Beispiele für Verknüpfungseinheiten der allgemeinen Formel (VIII), die verwendet werden können, um Verbindungen der allgemeinen Formel (IX) zu erzeugen, können Diamine, wie Ethylendiamin, N,N'-Dimethylethylendiamin, N-Ethylethylendiamin, N-(β-Hydroxyethyl)ethylendiamin, Propylendiamin, N-Methylpropylendiamin, N-(β-Hydroxyethyl)propylendiamin, 1,4-Diaminobutan, 1,5-Diaminopentan, 1,6-Diaminohexan, 1,7-Diaminoheptan, 1,8-Diaminooctan, 1,9-Diaminononan, 1,10-Diaminodecan, 1,12-Diaminododecan, Piperazin, 3-Hydroxy-1,5-diaminopentan, m- und p-Phenylendiamin, m- und p-Aminobenzylamin; Aminoalkohole, wie Ethanolamin, N-Methylethanolamin, N-Propylethanolamin, Diethanolamin, 3-Hydroxypropylamin, 2,3-Dihydroxypropylamin, Isopropanolamin, 5-Aminopentan-1-ol und 6-Aminohexan-1-ol; Aminophenole, wie o-, m- und p-Aminophenol, Aminocarbonsäuren, wie Glycin, N-Methylglycin, 3- und 4-Aminobuttersäure, 3-Aminoisobuttersäure, 3-Aminovaleriansäure, 6-Aminocapronsäure, 7-Aminoheptansäure, m- und p-Aminobenzoesäure; Aminophosphonsäuren, wie m-Aminobenzolphosphonsäure und p-Aminobenzylphosphonsäure; und Aminoarylenvinylsulfon-Vorstufen, wie Anilin-3-β-sulfatoethylsulfon und Anilin-4-β-sulfatoethylsulfon, erwähnt werden.
Die Umsetzung von halogenheterocyclischen Verbindungen der allgemeinen Formel (IV) mit Verbindungen der allgemeinen Formeln (V), (VI) und (VII) oder (VIII) kann in einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar ist, oder in einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser mischbar ist, oder in einer Mischung von Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel durchgeführt werden. Beispiele für geeignete organische Lösungsmittel, die nicht mit Wasser mischbar sind, sind Toluol, Xylol oder Chlorbenzol; Beispiele für geeignete organische Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar sind, sind Aceton, Methylethylketon oder Dioxan. Die erste Umsetzung der halogenheterocyclischen Verbindung kann bei Temperaturen zwischen 0 °C und 25 °C, ideal zwischen 0 °C und 5 °C durchgeführt werden. Die zweite Umsetzung kann bei Temperaturen zwischen 20 °C und 50 °C, ideal zwischen 30 °C und 45 °C durchgeführt werden, und die dritte Umsetzung bei Temperaturen zwischen 20 °C und 100 °C. Bei derartigen Umsetzungen wird die anorganische Säure, wie Chlorwasserstoffsäure oder Fluorwasserstoffsäure, die erzeugt wird, durch die Verwendung eines säurebindenden Mittels, wie Natriumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Calciumhydroxid oder Calciumcarbonat, neutralisiert.
Zusätzlich können Verbindungen der allgemeinen Formel (IX) mit einem reaktiven polymerisierbaren Monomer unter Bildung einer polymerisierbaren Verbindung der allgemeinen Formel (X) umgesetzt werden:
in der A₁, A₂, B₁, B₂, D₁, D₂, p, X, T, L, V, m, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ und R₉ die vorstehend angegebenen Bedeutungen aufweisen; R₁₁ ein Wasserstoffatome oder eine Alkylgruppe darstellt, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält; R₁₀ eine Carbonylgruppe, eine Methylengruppe, eine Gruppe -NH-CH₂- oder eine Gruppe -S-CH₂- darstellt. Beispiele für reaktive polymerisierbare Monomere umfassen Acryloylchlorid, Methacryloylchlorid, Allylbromid, Allylamin oder 3,4-Epoxybuten. Polymerisierbare Verbindungen der allgemeinen Formel (X) können gegebenenfalls in Anwesenheit von weiteren polymerisierbaren Monomeren polymerisiert werden, um Affinitätsligand-Matrix-Konjugate der allgemeinen Formel (III) zu bilden. Derartige Polymerisationsverfahren sind dem Fachmann wohlbekannt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung neue Affinitätsligand-Matrix-Konjugate der allgemeinen Formel (XI):
in der A₁, A₂, B₁, B₂, D₁, D₂, p, X, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ und R₉ die vorstehend angegebenen Bedeutungen aufweisen und Halogen ein Fluor-, Chlor- Brom- oder Iodatom darstellt.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Anbringung von Affinitätsliganden der allgemeinen Formel (XI), wie oben definiert, an eine Matrix der allgemeinen Formel (VII), wie oben definiert, durch Umsetzung der Affinitätsliganden mit der Matrix bei Temperaturen zwischen 0 °C und 100 °C, gegebenenfalls in Anwesenheit eines säurebindenden Mittels.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Affinitätsliganden der allgemeinen Formel
in der A₁, A₂, B₁, B₂, D₁, D₂, p, X, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ und R₉ die vorstehend angegebenen Bedeutungen aufweisen und j eine ganze Zahl zwischen 2 und 20 ist.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Affinitätsliganden durch Umsetzen einer Verbindung der obigen allgemeinen Formel (XI) mit einem Alkylendiamin der allgemeine Formel H₂N-(CN₂)_i-NH₂ bei Temperaturen zwischen 0 °C und 100 °C, gegebenenfalls in Anwesenheit eines säurebindenden Mittels.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Affinitätsliganden der allgemeinen Formel
in der A₁, A₂, B₁, B₂, D₁, D₂, p, X, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ und R₉ die vorstehend angegebenen Bedeutungen aufweisen; j eine ganze Zahl zwischen 2 und 20 ist und q für 0 oder 1 steht.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Anbringung von Affinitätsliganden der allgemeinen Formel (XIII), wie oben definiert, an eine Matrix der allgemeinen Formel (VII), wie oben definiert, durch Umsetzung der Affinitätsliganden mit der Matrix bei Temperaturen zwischen 0 °C und 100 °C in Anwesenheit eines Kondensationsmittels. Als nicht-beschränkende Beispiele für derartige Kondensationsmittel können N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin, Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid erwähnt werden.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Affinitätsliganden der obigen allgemeinen Formel (XIII) durch Umsetzen einer Verbindung der Formel H₂N-(CH₂)_i-(CO)_q-OH bei Temperaturen zwischen 0 °C und 100 °C, gegebenenfalls in Anwesenheit eines säurebindenden Mittels.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Affinitätsliganden der obigen allgemeinen Formel (X), in der A₁, A₂, B₁, B₂, D₁, D₂, p, X, T, L, V, m, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ und R₉ die vorstehend angegebenen Bedeutungen aufweisen; R₁₀ ein Wasserstoffatom oder ein Alkylgruppe darstellt, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält; R₁₁ eine Carbonylgruppe, eine Methylengruppe, eine Gruppe -NH-CH₂- oder eine Gruppe -S-CH₂- darstellt; L vorzugsweise eine Alkylgruppe ist, die 4 bis 10 Kohlenstoffatome enthält, T vorzugsweise eine Gruppe -NH- darstellt, V vorzugsweise eine Gruppe -NH- darstellt und m vorzugsweise 1 ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Affinitätsliganden der allgemeinen Formel (XIV):
in der A₁, A₂, B₁, B₂, D₁, D₂, p und R₁ die vorstehend angegebenen Bedeutungen aufweisen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Affinitätsliganden der allgemeinen Formel (XV):
in der A₁, A₂, B₁, B₂, D₁, D₂, p und R₁ die vorstehend angegebenen Bedeutungen aufweisen und j eine ganze Zahl zwischen 2 und 20 ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Affinitätsliganden der allgemeinen Formeln (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV) und (XV), worin D₁ und D₂ beide unabhängig eine Guanidinogruppe, eine Imidazolgruppe, eine primäre Aminogruppe, eine Diethylaminogruppe, eine Trimethylammoniumgruppe oder eine Triethylammoniumgruppe darstellen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Affinitätsliganden der allgemeinen Formeln (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV) und (XV), worin p für 1 steht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Affinitätsliganden der allgemeinen Formeln (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV) und (XV), worin B₁ und B₂ beide unabhängig eine Gruppe -CHCOOH-(CH₂)₃-, eine Gruppe -CHCOOH-(CH₂)₄-, eine Butylgruppe, eine Pentylgruppe oder eine Phenylgruppe darstellen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Affinitätsliganden der allgemeinen Formeln (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV) und (XV), worin A₁ und A₂ beide unabhängig eine Gruppe -NH- darstellen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Affinitätsliganden der allgemeinen Formeln (IX), (X), (XI), (XII) und (XIII), worin X ein Stickstoffatom darstellt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Affinitätsliganden der allgemeinen Formel (XII), (XIII) und (XV), worin j zwischen 4 und 10 ist.
Bevorzugte Affinitätsliganden gemäß der Erfindung sind:
Eine nützliche Gruppe von Affinitätsligand-Matrix-Konjugaten wird durch die allgemeine Formel (XXVII) dargestellt:
in der B₁, B₂, D₁, D₂, p, M, R₁, R₂ und R₃ die vorstehend angegebenen Bedeutungen aufweisen und j eine ganze Zahl zwischen 4 und 10 ist.
Eine besonders nützliche Gruppe von Affinitätsligand-Trägermatrizes wird durch die allgemeine Formel (XXVIII) dargestellt: i
in der B₁, B₂, D₁, D₂, p, X, R₁, R₂, R₃ und M die vorstehend angegebenen Bedeutungen aufweisen.
Typisch erzeugt die Umsetzung von Verbindungen der allgemeinen Formel (XXIX):
mit 3-Propoxy-(1,2-epoxy)-derivatisierten Matrizes bei Temperaturen zwischen 10 °C und 30 °C in Anwesenheit eines säurebindenden Mittels neue Affinitätsligand-Matrix-Konjugate, die von herausragender Nützlichkeit bei der Bindung von Endotoxin aus Wasser, wässrigen Lösungen, Proteinen, Arzneistoffen, Blut und Plasma sind.
Bevorzugte Affinitätsligand-Matrix-Konjugate gemäß der Erfindung sind:

worin M wie oben definiert ist.
Die Erfindung deckt weiter die Verwendung aller derartigen Affinitätsligand-Trägermatrizes bei der Abtrennung, Isolierung, Reinigung, Quantifizierung, Identifizierung und Charakterisierung von Endotoxin oder Analoga, Fragmenten, Derivaten desselben und Vorstufen ab.
Endotoxine sind eine Familie von Lipopolysacchariden, häufig als LPS abgekürzt, denen eine gemeinsame Struktur eigen ist. Endotoxine liegen in einer Anzahl von Formen vor, z.B. umfassen die bedeutendsten Endotoxin-Arten Lipid A, das an einer Kern-Polysaccharid-Komponente angebracht ist, die auch mit einem Polysaccharid mit O-spezifischer Kette verknüpft sein kann. Die Kern-Polysaccharid-Komponente kann aus einem inneren Kern, einem inneren Kern, der an einem äußeren Oligosaccharid angebracht ist, oder einem inneren Kern, der an einem äußeren Kern angebracht ist, bestehen. Es ist bekannt, dass Endotoxin äußerst heterogen ist, insbesondere bezüglich des Polysaccharids mit O-spezifischer Kette und des äußeren Kern-Polysaccharids. Da es bekannt ist, dass Endotoxin heterogen ist, schließt der Ausdruck „Endotoxin", wie hierin verwendet, alle natürlich vorkommenden Formen ein, welche Lipid A umfassen, das kovalent an ein Polysaccharid geknüpft ist, einschließlich Analoga, Derivaten, Fragmenten und Vorstufen derselben, und alle derartigen Formen, unabhängig von deren Quelle, fallen in den Bereich der Ansprüche dieser Erfindung.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Anbringung der Affinitätsliganden der allgemeinen Formeln (IX), wie oben definiert, (X), wie oben definiert, (XII), wie oben definiert, (XV), wie oben definiert, und (XXIX), wie oben definiert, an Kohlehydrat- oder organische Polymer-Matrizes durch Umsetzung des Kohlehydrats oder der organischen Polymer-Matrix mit einem aktivierenden Mittel, gefolgt von der Umsetzung der aktivierten Matrix mit dem neuen Affinitätsliganden, gegebenenfalls in Anwesenheit eines säurebindenden Mittels. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Anbringen der Affinitätsliganden der allgemeinen Formel (XIII), wie oben definiert, an Kohlehydrat- oder organische Polymer-Matrizes durch Kondensation mit der Matrix. Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Anbringung der Affinitätsliganden der allgemeine Formeln (IX), wie oben definiert, (X), wie oben definiert, (XII), wie oben definiert, (XV), wie oben definiert, und (XXIX), wie oben definiert, an Metalloxid-, Glas- oder Siliciumdioxid-Matrizes, die gegebenenfalls mit einem organischen Polymer beschichtet sind, durch Umsetzung der gegebenenfalls beschichteten Metalloxid-, Glas- oder Siliciumdioxid-Matrix mit einem aktivierenden Mittel, gefolgt von der Umsetzung der aktivierten Matrix mit dem Affinitätsliganden, gegebenenfalls in Anwesenheit eines säurebindenden Mittels. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Anbringen der Affinitätsliganden der allgemeinen Formel (XIII), wie oben definiert, an Metalloxid-, Glas- oder Siliciumdioxid-Matrizes, die gegebenenfalls mit einem organischen Polymer beschichtet sind, durch Kondensation mit der Matrix. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Anbringen von Affinitätsliganden der allgemeinen Formeln (XI), wie oben definiert, (XIV), wie oben definiert, und (XVI–XXVI), wie oben definiert, an eine Matrix der allgemeinen Formel (VII), wie oben definiert, durch Umsetzung der Affinitätsliganden mit der Matrix bei Temperaturen zwischen 0 °C und 100 °C, gegebenenfalls in Anwesenheit eines säurebindenden Mittels. Die Erfindung betrifft auch alle Affinitätsligand-Matrix-Konjugate, die wie in den obigen Verfahren hergestellt sind.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der Affinitätsliganden gemäß der Erfindung und der Affinitätsligand-Matrix-Konjugate gemäß der Erfindung für die Abtrennung, Isolierung, Reinigung, Charakterisierung, Identifizierung oder Quantifizierung von Endotoxin. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung jedes Verfahren, durch welches Endotoxin-haltige Lösungen oder Flüssigkeiten bei einem pH im Bereich von 1,0 bis 13,0 auf Affinitätsligand-Matrix-Konjugate gemäß der Erfindung aufgebracht werden. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Isolierung von Endotoxin aus verschiedenen Fluiden, wie Wasser, wässrigen Lösungen, Körperflüssigkeiten, Blut, Plasma, Lösungen von pharmazeutischen Produkten, Proteinen und anderen Verbindungen biologischen Ursprungs mittels Durchführung von Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Liganden der allgemeinen Formel (I), wie oben definiert, als biospezifischer Ligand.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von Affinitätsliganden gemäß der Erfindung und Affinitätsligand-Matrix-Konjugaten gemäß der Erfindung, die derartige Liganden umfassen, für die extrakorporale Entfernung von Endotoxin aus Vollblut oder Plasma, das einem Donor entnommen wurde und nach der Behandlung in denselben Donor oder einen anderen Empfänger reinfundiert wird.
Die Erfindung wird nun in weiterer Einzelheit mit Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben. Die Beispiele werden für erläuternde Zwecke angegeben und sollten nicht als Beschränkung des Bereichs der Erfindung auf irgendeine Weise angesehen werden.
Beispiel 1
Dieses Beispiel erläutert die Synthese eines typischen Affinitätsliganden der allgemeinen Formel (XIV), die durch die Umsetzung einer halogenheterocyclischen Verbindung der allgemeinen Formel (IV) mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (V) und (VI) definiert ist.
Eine Lösung von 1 Teil Cyanurchlorid in 10 Teilen Aceton wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung gegeben, die 2 Teile L-Arginin in 100 Teilen Wasser enthielt. Die Mischung wurde 2 Stunden bei 0 – 5 °C gerührt, wonach die Lösung auf 30 °C erwärmt wurde und das Mischen weitere 16 Stunden fortgesetzt wurde. Der pH wurde durchwegs durch Titration mit 1 M Natriumhydroxid-Lösung innerhalb des Bereichs von 5,0–7,0 gehalten. Das Reaktionsprodukt wurde durch die Zugabe von festem Natriumchlorid auf eine Endkonzentration von 20 % (Gew./Vol.) gefällt, abfiltriert und im Vakuum getrocknet. TLC-Analyse (THF/Propan-2-ol/Wasser(1:2:1 bezüglich Vol.)-Lösungsmittel) enthüllte die Anwesenheit eines einzigen Reaktionsprodukts (R_f 0,42). Das Molekulargewicht der isolierten Verbindung wurde durch Massenspektroskopie bestimmt, und man fand, dass es mit einer Verbindung in Einklang stand, die Cyanurchlorid umfasste, das mit 2 Molekülen Arginin derivatisiert war (berechnet M_f = 459,5; Molekülion (positiv FAB) = 460,3, (negativ FAB) = 458,4). Das ¹H-NMR-Spektrum stand mit einer Verbindung in Einklang, die Arginin enthielt.
Beispiel 2
Dieses Beispiel erläutert die Synthese einer gegebenenfalls derivatisierten Trägermatrix der allgemeinen Formel (VII).
Eine Lösung von 1 Teil 1,6-Diaminohexan in 12 Teilen Wasser wurde zu einer gerührten Suspension gegeben, die 29 Teile Epoxy-aktivierte Agarose-Perlen (30 μMol Epoxid-Gruppen pro g Agarosegel) in 48 Teilen Wasser umfasste, und 24 Stunden bei 30 °C gerührt. Das Aminohexyl-Agarosegel wurde filtriert und anschließend mit 12 × 29 Teilen Wasser gewaschen und nach Beendigung des letzten Waschens unter Schwerkraft ablaufen gelassen. Die Analyse der resultierenden Aminohexyl-Agarose bezüglich der Anwesenheit von primären Aminen (TNBS-Assay) und Epoxidgruppen (Thiosulfat/Natriumhydroxid-Titration) enthüllte eine vollständige Reaktion der Epoxidgruppen mit 1,6-Diaminohexan.
Beispiel 3
Beispiel 2 wurde wiederholt, indem man 1,6-Diaminohexan durch 1,4-Diaminobutan, 1,5-Diaminopentan, 1,7-Diaminoheptan, 1,8-Diaminooctan, 1,9-Diaminononan und 1,10-Diaminodecan ersetzte. In allen Fällen wurden Aminoalkyl-derivatisierte Agarose-Matrizes erhalten.
Beispiel 4
Dieses Beispiel erläutert die Umsetzung einer gegebenenfalls derivatisierten Träger-Matrix der allgemeinen Formel (VII) mit einer halogenheterocyclischen Verbindung der allgemeinen Formel (IV).
Eine Lösung von 1 Teil Cyanurchlorid in 10 Teilen Aceton wurde zu einer vorgekühlten (0–4 °C) Suspension von 40 Teilen Aminohexyl-Agarose-Matrix, hergestellt gemäß Beispiel 2, in 40 Teilen 0,5 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,0, gegeben. Die Mischung wurde 1 Stunde bei 0–4 °C gerührt, filtriert und anschließend mit 5 × 40 Teilen einer Lösung, die 1 Teil Aceton und 1 Teil Wasser umfasste, 5 × 40 Teilen Wasser, 5 × 40 Teilen einer Lösung, die 1 Teil Aceton und 1 Teil Wasser umfasste, und 10 × 40 Teilen Wasser gewaschen. Die Analyse der resultierenden Dichlortriazin-aktivierten Agarose-Matrix bezüglich der Anwesenheit von Aminen (TNBS-Assay) und Freisetzung von Chloridionen nach Behandlung mit 1M Natriumhydroxid enthüllte eine vollständige Reaktion von Cyanurchlorid mit den primären Aminogruppen auf der Aminohexyl-Agarose-Matrix.
Beispiel 5
Beispiel 4 wurde wiederholt, indem man das gemäß Beispiel 2 hergestellte Produkt durch die gemäß Beispiel 3 hergestellten Produkte ersetzte. Die Analyse der resultierenden Dichlortriazin-aktivierten Agarose-Matrizes bezüglich der Anwesenheit von Aminen (TNBS-Assay) und der Freisetzung von Chloridionen nach Behandlung mit 1 M Natriumhydroxid enthüllte in allen Fällen die vollständige Reaktion von Cyanurchlorid mit den primären Aminogruppen auf der Aminoalkyl-Agarose-Matrix.
Beispiel 6
Dieses Beispiel erläutert die Umsetzung des gemäß Beispiel 4 hergestellten Produkts mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (VI) und einer Verbindung der allgemeinen Formel (V), um Affinitätsligand-Matrix-Konjugate der allgemeinen Formel (III) zu erzeugen. Alle Lösungen wurden mit Pyrogen-freiem Wasser hergestellt.
Ein Teil Arginin wurde zu einer Suspension gegeben, die 35 Teile des gemäß Beispiel 4 hergestellten Produkts in 105 Teilen 0,1 M Natriumcarbonat-Puffer, pH 10,25, enthielt. Die Mischung wurde 24 Stunden bei 30 °C gerührt, filtriert und anschließend mit 12 × 35 Teilen 0,1M Natriumcarbonat-Puffer, pH 10,25, gewaschen und unter Schwerkraft ablaufen gelassen. Dieses Material wurde wieder in 105 Teilen 0,1 M Natriumcarbonat-Puffer, pH 10,25, aufgeschlämmt.
Ein Teil N-ε-t-BOC-L-lysin wurde zu der Agarose-Aufschlämmung gegeben, und die Mischung wurde 72 Stunden bei 85 °C gerührt. Die Suspension wurde filtriert und anschließend mit 12 × 35 Teilen Wasser gewaschen und unter Schwerkraft ablaufen gelassen. Die Mischung wurde in 35 Teilen 0,1M Trifluoressigsäure resuspendiert, 1 Stunde bei 20 °C gerührt, filtriert und anschließend mit 3 × 35 Teilen Methanol, 12 × 35 Teilen Wasser gewaschen und unter Schwerkraft ablaufen gelassen. Dieses Verfahren ist erforderlich, um die t-BOC-Schutzgruppe zu entfernen.
Beispiele 7 bis 14
Tabelle 1 liefert weitere Beispiele für die Synthese von neuen Affinitätsligand-Matrix-Konjugaten der Erfindung, die durch das obige Verfahren, aber unter Ersatz von Arginin durch die in Spalte II von Tabelle 1 angeführte Aminverbindung und unter Ersatz von N-ε-t-BOC-L-lysin durch die in Spalte III von Tabelle 1 angeführte Aminverbindung hergestellt wurden. Die Nummer des Beispiels ist in Spalte 1 von Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Beispiel 15
Dieses Beispiel erläutert die Fähigkeit von Affinitätsligand-Matrix-Konjugaten der allgemeine Formel (III), Endotoxin aus Wasser zu binden.
Affinitätsliganden-Matrix-Konjugat (150 μl), hergestellt gemäß Beispiel 6, wurden zu Wasser (1,5 ml) gegeben, das Escherichia coli #055:B5-Endotoxin (1,5 × 10⁴ EE) enthielt, und 1 Stunde bei 20 °C gerührt. Die Probe wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde bezüglich der Anwesenheit von Endotoxin mittels des Limulus Amoebocyte Lysate Chromogenic Test getestet. Es wurden nur 0,1 EE/ml (äquivalent zu 10 pg/ml) in dem Überstand nachgewiesen, was eine mehr als 99,99%-ige Entfernung des Endotoxins aus Wasser anzeigte.
Beispiele 16 bis 23
Tabelle 2 gibt weitere Beispiele für die Fähigkeit der neuen Affinitätsligand-Matrix-Konjugate der Erfindung an, Endotoxin zu binden. Das oben beschriebene Verfahren wurde durchgeführt, außer dass das Affinitätsligand-Matrix-Konjugat gemäß der Beispielzahl synthetisiert wurde, die in Spalte II von Tabelle 2 angegeben ist. Die Menge an Endotoxin, die im Überstand verblieb (EE/ml), ist in Spalte III der Tabelle 2 angegeben, und die Menge an Endotoxin, die durch das Affinitätsligand-Matrix-Konjugat adsorbiert wurde (%), ist in Spalte IV von Tabelle 2 angegeben. Die Nummer des Beispiels ist in Spalte I von Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2
Beispiel 24
Dieses Beispiel erläutert die Fähigkeit von Affinitätsligand-Matrix-Konjugaten der allgemeinen Formel (III), Endotoxin aus Protein-haltigen Lösungen, die mit Endotoxin kontaminiert sind, zu isolieren. Affinitätsligand-Matrix-Konjugat (150 μl), hergestellt gemäß Beispiel 6, wurde zu Wasser (1 ,5 ml) gegeben, das Escherichia coli #055:B5-Endotoxin (1,5 × 10⁴ EU) und Human-Serumalbumin (15 mg) enthielt, und 1 Stunde bei 20 °C gerührt. Die Probe wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde bezüglich der Anwesenheit von Endotoxin mittels des Limulus Amoebocyte Lysate Chromogenic Test getestet, welcher so kalibriert worden war, dass er Endotoxin in Anwesenheit von 10 mg/ml Human- Serumalbumin nachwies. Im Überstand wurde Endotoxin bei einer Konzentration von 50 EE/ml nachgewiesen, was eine 99,5%-ige Entfernung von Endotoxin aus einer Lösung anzeigte, die 10 mg/ml Human-Serumalbumin enthielt.
Beispiele 25 bis 32
Tabelle 3 gibt weitere Beispiele für die Fähigkeit der neuen Affinitätsligand-Matrix-Konjugate der Erfindung an, Endotoxin aus Protein-haltigen Lösungen, die mit Endotoxin kontaminiert sind, zu isolieren. Das oben beschriebene Verfahren wurde durchgeführt, außer dass das Affinitätsligand-Matrix-Konjugat gemäß der Beispielzahl synthetisiert wurde, die in Spalte II von Tabelle 3 angegeben ist; die Menge an Endotoxin, die im Überstand verblieb (EE/ml) ist in Spalte III von Tabelle 2 angegeben, und die Menge an Endotoxin, die durch das Affinitätsligand-Matrix-Konjugat adsorbiert wurde (%) ist in Spalte IV von Tabelle 3 angegeben. Die Nummer des Beispiels ist in Spalte I von Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3
Beispiel 33
Dieses Beispiel erläutert die Fähigkeit der neuen Affinitätsligand-Matrix-Konjugate der allgemeinen Formel (III), Endotoxin in Anwesenheit von Protein zu binden. Affinitätsligand-Matrix-Konjugat (150 ml), hergestellt gemäß Beispiel 6, wurde zu Wasser (1,5 ml) gegeben, das Escherichia coli #055:B5-Endotoxin (7,5 × 10³ EE bis 1,5 × 10⁵ EE) und Human-Serumalbumin (15 mg) enthielt, und 1 Stunde bei 20 °C gerührt. Die Proben wurden zentrifugiert, und die Überstände wurden bezüglich der Anwesenheit von Endotoxin mittels des Limulus Amoebocyte Lysate Chromogenic Test getestet, welcher so kalibriert worden war, dass er Endotoxin in Anwesenheit von 10 mg/ml Human-Serumalbumin nachwies. Die Gesamtmenge an in der Aufnahmemischung vorliegendem Endotoxin und die Menge an adsorbiertem Endotoxin ist in Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4
Diese Ergebnisse demonstrieren, dass 1 g neues Affinitätsligand-Matrix-Konjugat der allgemeinen Formel (III) in der Lage ist, 1 × 10⁶ EE (100 μg Endotoxin) in Anwesenheit von 10 mg/ml Human-Serumalbumin mit einer Extraktionseffizienz von mehr als 99 % zu binden.
Beispiel 34
Dieses Beispiel erläutert die Fähigkeit der neuen Affinitätsligand-Matrix-Konjugate der allgemeinen Formel (III), Endotoxin in Anwesenheit von Protein und Puffer mit variierender Ionenstärke zu binden. Affinitätsligand-Matrix-Konjugate (150 μl), hergestellt gemäß Beispiel 6, wurde zu Wasser (1,5 ml) gegeben, das Escherichia coli #055:B5-Endotoxin (7,5 × 10⁴ EE), Human-Serumalbumin (15 mg) und PBS-Puffer (0 bis 200 mM) enthielt, und 1 Stunde bei 20 °C gerührt. Die Proben wurden zentrifugiert, und die Überstände wurden mittels des Limulus Amoebocyte Lysate Chromogenic Test, der so kalibriert worden war, dass er Endotoxin in Anwesenheit von 10 mg/ml Human-Serumalbumin nachwies, bezüglich der Anwesenheit von Endotoxin getestet. Bei allen untersuchten Konzentrationen des PBS-Puffers wurden mehr als 99 % des anwesenden Endotoxins adsorbiert. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass neue Affinitätsligand-Matrix-Konjugate der allgemeinen Formel (III) in der Lage sind, Endotoxin mit hoher Effizienz und unabhängig von der Ionenstärke oder der Anwesenheit von Protein zu binden.

Claims

Verwendung eines Affinitätsliganden mit der allgemeinen Formel (I):
in der ein X für N steht und das andere X für N, CCl oder CCN steht; A₁ und A₂ jeweils unabhängig O, S oder N-R₁ sind und R₁ für H, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Hydroxyalkyl, Benzyl oder β-Phenylethyl steht; B₁ und B₂ jeweils unabhängig eine gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoff-Verknüpfung sind, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält; D₁ für H oder eine primäre Amino-, sekundäre Amino-, tertiäre Amino-, quaternäre Ammonium-, Imidazol-, Guanidino- oder Amidinogruppe steht; und D₂ eine sekundäre Amino-, tertiäre Amino-, quaternäre Ammonium-, Imidazol-, Guanidino- oder Amidinogruppe ist; oder B₂–D₂ für -CHCOOH-(CH₂)_3-4-NH₂ steht; p für 0 oder 1 steht; und Z eine funktionelle Gruppe ist, die zur Reaktion mit einer festen Matrix befähigt ist; oder eines Konjugats des Affinitätsliganden und einer Matrix, die durch die Gruppe Z an den Liganden konjugiert ist; für die Entfernung, Abtrennung, Isolierung, Reinigung, Charakterisierung, Identifikation oder Quantifizierung eines Endotoxins.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der das Endotoxin von einem gramnegativen Bakterium abstammt.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 für die Entfernung eines Endotoxins aus Wasser oder einer wässrigen Lösung, Körperflüssigkeit, Blut, Plasma, Lösung von pharmazeutischen Produkten, Protein oder einer anderen Verbindung biologischen Ursprungs.
Verwendung nach Anspruch 3, welche die Verwendung des Konjugats für die extrakorporale Entfernung von Endotoxin aus Vollblut oder Plasma vor der Reinfusion in den Donor oder einen anderen Empfänger umfasst.
Verwendung nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, bei der eine Endotoxin-haltige Lösung oder Flüssigkeit bei einem pH von 1,0 bis 13,0 auf das Konjugat aufgebracht wird.
Verwendung eines Konjugats nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, bei der Z für -T-[L-V]_m- (II)steht, worin T für O, S oder NR₂ steht und R₂ für H oder C_1-6-Alkyl steht; V für O, S, -COO-, CONH, NHCO, -PO₃H-, NH-Arylen-SO₂-CH₂-CH₂- oder N-R₃ steht und R₃ für H oder C_1-6-Alkyl steht; L eine gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoff-Verknüpfung ist, die 2 bis 20 Kohlenstoffatome enthält; und m für 0 oder 1 steht.
Verwendung nach Anspruch 6, bei der R₂ und R₃ jeweils H sind.
Verwendung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, bei der T für O oder NH steht.
Verwendung nach Anspruch 8, bei der T für NH steht.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 6 bis 9, bei der m für 1 steht und L eine zweiwertige Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl-, Decyl- oder Dodecylgruppe ist.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 6 bis 10, bei der m für 1 steht und V für O, -CONH-, -NHCO- oder N-R₃ steht.
Verwendung nach Anspruch 10, bei der V für O oder NH steht.
Verwendung nach Anspruch 12, bei der V für NH steht.
Verwendung nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, bei der Z-M (wobei M die Matrix ist) für -NH-(CH₂)_4-10-NH-M steht.
Verwendung eines Liganden nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei der Z für F, Cl, Br oder I steht.
Verwendung eines Liganden nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei der Z für -NH-(CH₂)_2-20-NH₂ steht.
Verwendung eines Liganden nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei der Z für -NH-(CH₂)_2-20-(CO)_0-1-OH steht.
Verwendung eines Liganden nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei der Z für -T-[L-V]_m-R₁₀-CR₁₁=CH₂ steht, worin T, L, V und m wie in irgendeinem der Ansprüche 6 bis 13 definiert sind; R₁₀ für CO, CH₂, -NH-CH₂- oder -S-CH₂- steht; und R₁₁ für H oder C_1-6-Alkyl steht.
Verwendung nach Anspruch 15, bei der Z für Cl steht und jedes X für N steht.
Verwendung nach Anspruch 15, bei der jedes X für N steht.
Verwendung eines Konjugats nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, bei der jedes X für N steht.
Verwendung nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, bei der A₁ und A₂ jeweils unabhängig N-R₁ sind, worin R₁ wie in Anspruch 1 definiert ist.
Verwendung nach Anspruch 22, bei der A₁ und A₂ jeweils NH sind.
Verwendung nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, bei der B₁ und B₂ jeweils unabhängig -CHCOOH-(CH₂)_1-4- oder eine zweiwertige Ethyl-, Propyl-, 2-Hydroxypropyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Phenyl-, Naphthyl- oder Cyclohexylgruppe sind.
Verwendung nach Anspruch 24, bei der B₁ und B₂ jeweils unabhängig -CHCOOH-(CH₂)_3-4- oder eine zweiwertige Butyl-, Pentyl- oder Phenylgruppe sind.
Verwendung nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, bei der D₁ für H, Amino, Imidazolyl, Guanidino, Amidino, Trimethylammonium, Triethylammonium, Dimethylamino, Diethylamino, Methylamino oder Ethylamino steht.
Verwendung nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, bei der D₂ für Imidazolyl, Guanidino, Amidino, Trimethylammonium, Triethylammonium, Dimethylamino, Diethylamino, Methylamino oder Ethylamino steht.
Verwendung nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, bei der p für 1 steht.
Verwendung nach Anspruch 28, bei der B₁ und B₂ jeweils unabhängig -CHCOOH-(CH₂)_3-4- sind.
Konjugat wie in Anspruch 1 definiert, in dem p für 1 steht.
Konjugat nach Anspruch 30, in dem B₁ und B₂ jeweils unabhängig -CHCOOH-(CH₂)_3-4- sind.
Konjugat mit irgendeiner der Formeln XXX bis XXXX
Ligand wie in Anspruch 1 definiert, in dem p für 1 steht.
Ligand nach Anspruch 33, in dem B₁ und B₂ jeweils unabhängig -CHCOOH-(CH₂)_3-4- sind.
Ligand mit irgendeiner der Formeln XVI bis XXVI