ES2214272T3 - Nuevos agentes de destoxificacion a base de triazina y su uso. - Google Patents

Nuevos agentes de destoxificacion a base de triazina y su uso.

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ES2214272T3
ES2214272T3 ES00927543T ES00927543T ES2214272T3 ES 2214272 T3 ES2214272 T3 ES 2214272T3 ES 00927543 T ES00927543 T ES 00927543T ES 00927543 T ES00927543 T ES 00927543T ES 2214272 T3 ES2214272 T3 ES 2214272T3
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Christopher R. Inst. Biotechnology LOWE
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Abstract

Uso de un ligando de afinidad que tiene la fórmula general (I): en la que uno de X es N y el otro de X es N, CCl o CCN; A1 y A2 son cada uno independientemente O, S o N-R1 y R1 es H, alquilo C1-6, hidroxialquilo C1-6, bencilo o - feniletilo; B1 y B3 son cada uno independientemente un enlace hidrocarbonado opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 10 átomos de carbono; D1 es H o un grupo amino primario, amino secundario, amino terciario, amonio cuaternario, imidazol, guanidino o amidino; y D2 es un grupo amino secundario, amino terciario, amonio cuaternario, imidazol, guanidino o amidino; o B2-D2 es -CHCOOH-(CH2)3-4-NH2; p es 0 ó 1; y Z es un grupo funcional capaz de reaccionar con una matriz sólida; o un conjugado del ligando de afinidad y una matriz conjugada al ligando mediante el grupo Z; para la eliminación, separación, aislamiento, purificación, caracterización, identificación o cuantificación de una endotoxina.

Description

Nuevos agentes de destoxificación a base de triazina y su uso.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a ligandos de afinidad, a su preparación y unión a matrices que pueden consistir en materiales sólidos, semisólidos, en partículas o coloidales, o polímeros solubles. La invención se refiere además a estos conjugados de ligando de afinidad-matriz, y a la preparación y uso de los mismos en la unión y eliminación de endotoxinas de diversos fluidos tales como agua, disoluciones acuosas, fluidos corporales, sangre, plasma, disoluciones de productos farmacéuticos, proteínas y otros compuestos de origen biológico.
Antecedentes de la invención
Las endotoxinas son lipopolisacáridos encontrados en la membrana más externa de las bacterias gram-negativas, particularmente bacterias patógenas de la clase enterobacterias, neisserias y clamidias. Las endotoxinas comprenden lípido A unido a un polisacárido de estructura variable que depende de su origen biológico. El componente de polisacárido de la endotoxina de enterobacteriáceas se caracteriza por una región de cadena específica O y una región central. La región específica O comprende hasta 50 unidades de oligosacáridos que se repiten, que contienen tantos como 8 restos diferentes de azúcares. Las cadenas específicas O muestran una gran diversidad estructural de una especie a otra, mientras que la región central, dividida en las regiones de núcleo externo y de núcleo interno, es menos variable. La región del núcleo interno se caracteriza por la presencia de restos inusuales de azúcares, tales como heptosa y ácido 2-ceto-3-desoxioctónico (KDO), que frecuentemente están sustituidos con fosfato o derivados de fosfato. También unido a la región del núcleo interno, el lípido A es un disacárido glucosamínico bifosforilado conservado, que está acilado por 4 grupos acilo primarios saturados de los cuales 2 tienen grupos acilo saturados secundarios. La combinación de las colas del lípido A hidrófobas con la unidad hidrófila y aniónica del polisacárido proporciona la endotoxina con propiedades anfipáticas.
Se considera que la endotoxina liberada de la pared celular de las bacterias gram-negativas es la causa principal de muchas apariciones patofisiológicas que acompañan a la septicemia por gram-negativas. La endotoxina, a concentraciones de pg/ml en sangre, dispara la liberación de una variedad de citoquinas, incluyendo interleuquinas y TNF. La sobreestimulación del sistema inmune mediante la endotoxina conduce a una liberación masiva de citoquinas lo que finalmente da como resultado el colapso metabólico y el choque séptico. Durante el choque séptico se activan las cascadas de complemento y coagulación, y aumenta la permeabilidad vascular. Esto puede conducir a una coagulación intravascular diseminada y al fallo multiorgánico, a menudo con consecuencias fatales. El choque séptico se desarrolla a menudo debido a la falta de una respuesta inicial a la infección, permitiendo que el nivel de endotoxina en sangre alcance niveles críticos.
Además del riesgo obvio presentado por la presencia de bacterias gram-negativas vivas o de desecho de pared celular en productos farmacéuticos parenterales, también es un problema importante la presencia de endotoxina libre en preparaciones farmacéuticas.
Debido a que la endotoxina es un potente inmunoestimulador, concentraciones muy bajas pueden provocar reacciones tóxicas, que incluyen efectos pirógenos. La endotoxina es una molécula relativamente estable que no se inactiva al someterla rutinariamente a autoclave o por tratamiento con disolventes orgánicos. La exposición a hidróxido de sodio concentrado, o a una temperatura elevada (250ºC) prolongada, inactivará a la endotoxina, aunque tales métodos no son apropiados para la mayoría de los productos biológicos. Además, el mantenimiento de una esterilidad completa durante la fabricación de productos bioterapéuticos es problemático. En consecuencia, es muy deseable la captura y eliminación altamente eficaz de la endotoxina a partir de productos farmacéuticos parenterales, particularmente en situaciones en las que se sabe que la endotoxina se asocia con componentes de la formulación terapéutica.
Se ha usado una variedad de técnicas para eliminar endotoxina de disoluciones acuosas, incluyendo ultrafiltración, adsorción con carbón, cromatografía de intercambio catiónico, y una variedad de ligandos de afinidad inmovilizados que incluyen polimixina B y proteína de unión a endotoxina. Todas estas técnicas muestran fallos significativos, particularmente en el caso de la eliminación de endotoxina de compuestos con peso molecular elevado, tales como proteínas terapéuticas. La ultrafiltración sólo se puede usar para eliminar endotoxina de compuestos con peso molecular bajo, mientras que la adsorción con carbón tiende a promover la unión de la mayoría de los compuestos orgánicos. La cromatografía de intercambio catiónico es eficaz eliminando endotoxina de agua, pero es menos eficaz para disoluciones que contienen proteínas, particularmente proteínas con puntos isoeléctricos ácidos. La polimixina B, un antibiótico polipeptídico cíclico, es demasiado tóxica para permitir su uso para la purificación de productos terapéuticos, mientras que la proteína de unión a endotoxina es demasiado cara para aplicaciones comerciales.
También se han usado aminoácidos catiónicos inmovilizados (histidina, lisina y arginina) para la eliminación de endotoxina (Tosa, T. et al., Molecular Interactions in Bioseparations, Ed. Ngo, T. T., Plenum Press, New York, p. 323-332, 1993; Lawden, K. H. et al., Bacterial Endotoxins: Lipopolysaccharides From Genes to Therapy, Wiley-Liss Inc., p. 443-452, 1995). Tales materiales se han preparado mediante unión directa de aminoácidos a matrices cromatográficas activadas con grupos epoxi. En el caso de Pyrosep^{TM}, un material comercialmente disponible fabricado por Tanabe Seiyaku Company Limited, Osaka, Japón, se inmoviliza un único grupo de histidina a una matriz soporte mediante un brazo espaciador de hexanodiamina. Nuevamente, tales materiales son adecuados para la eliminación de endotoxina de agua o de disoluciones de compuestos de bajo peso molecular, pero su comportamiento se ve comprometido en presencia de sal (> 50 mM) o de proteínas que tienen una afinidad por endotoxina. En consecuencia, ninguno de los métodos existentes de eliminación de endotoxinas son adecuados para la eliminación de endotoxina de compuestos bioterapéuticos destinados a la administración parenteral. Esto es especialmente cierto para compuestos terapéuticos proteínicos en los que no existe ningún método eficaz y seguro para la eliminación de endotoxina.
La eliminación de endotoxina a partir de sangre o de plasma puede proporcionar un enfoque eficaz para el tratamiento del choque séptico, particularmente si se aplica en las etapas tempranas de la infección, o profilácticamente en situaciones en las que se anticipa un aumento del riesgo de choque séptico (por ejemplo, cirugía de hígado o de intestino principal). Se ha informado de varios estudios en cuanto al uso de anticuerpos monoclonales dirigidos contra endotoxina o citoquinas liberadas en la fase inicial de la reacción de choque. Sin embargo, se ha encontrado que la mayoría de estos enfoques son ineficaces (Siegel J. P., Drug Information Journal, 30, p. 567-572, 1996). Por el contrario, se ha logrado la extracción extracorpórea de endotoxina a partir de sangre entera, mediante el uso de polimixina B inmovilizada en fibra (Aoki, H. et al., Nippon Geka Gakkai Zasshi (Japón), 94, p. 775-780, 1993), aunque existen preocupaciones con respecto a la toxicidad potencial de lixiviados de polimixina B. En consecuencia, los adsorbentes de afinidad que incorporan ligandos de unión a endotoxina, que tienen una elevada afinidad por endotoxina y baja toxicidad, también pueden ser beneficiosos para el tratamiento de la septicemia.
También se han investigado a los aminoácidos inmovilizados como agentes potenciales de eliminación de endotoxina, pero tales materiales se unen a endotoxina débilmente y de forma no específica, y son de un valor limitado en la extracción de endotoxina a partir de fluidos biológicos y de disoluciones de compuestos biológicos. Se han dado a conocer compuestos a base de triazina que se unen selectivamente a proteínas; sin embargo, tales ligandos no son aplicables al aislamiento de endotoxina.
El documento WO-A-97/10887 describe conjugados de ligando de afinidad-matriz, basados en una estructura de triazina.
Burton et al., Journal of Molecular Recognition, 5:55-68 (1992), describe un compuesto a base de triazina que se puede usar como un absorbente de afinidad para la purificación de proteasas de tipo tripsina.
Sumario de la invención
Esta invención se refiere al descubrimiento de estructuras sintéticas de ligandos de afinidad que se unen selectivamente a endotoxinas. Se ha encontrado un grupo genérico de ligandos de afinidad, que muestra afinidad elevada por endotoxina y son generalmente aplicables al aislamiento de endotoxina de una variedad de fuentes.
Según un primer aspecto de la presente invención, se usa un ligando de afinidad que tiene la fórmula general (I):
1
en la que un X es N y el otro X es N, CCl o CCN;
A_{1} y A_{2} son cada uno independientemente O, S o N-R_{1} y R_{1} es H, alquilo C_{1-6}, hidroxialquilo C_{1-6}, bencilo o \beta-feniletilo;
B_{1} y B_{2} son cada uno independientemente un enlace hidrocarbonado opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 10 átomos de carbono;
D_{1} es H o un grupo amino primario, amino secundario, amino terciario, amonio cuaternario, imidazol, guanidino o amidino; y
D_{2} es un grupo amino secundario, amino terciario, amonio cuaternario, imidazol, guanidino o amidino; o
B_{2}-D_{2} es -CHCOOH-(CH_{2})_{3-4}-NH_{2};
p es 0 ó 1; y
Z es un grupo funcional capaz de una reacción con una matriz sólida;
o un conjugado del ligando de afinidad y una matriz conjugada al ligando mediante el grupo Z;
para la eliminación, separación, aislamiento, purificación, caracterización, identificación o cuantificación de una endotoxina.
Según un segundo aspecto de la invención, los nuevos conjugados y ligandos son los definidos anteriormente, en los que p es 1.
Una característica de la presente invención es la provisión de una herramienta general para la eliminación de la contaminación por endotoxina de materiales biológicos. La endotoxina se une sobradamente fuerte a conjugados de ligando de afinidad-matriz de la invención. Esta característica permite la extracción altamente eficaz de endotoxina de agua y de disoluciones acuosas, proporcionando un medio para generar agua exenta de pirógenos o disoluciones exentas de pirógenos. Los conjugados de ligando de afinidad-matriz de la invención son especialmente valiosos para la eliminación de endotoxina que está unida o asociada con proteínas, fármacos u otros compuestos biológicos destinados a aplicaciones médicas o farmacéuticas. Ciertos compuestos biológicos, particularmente proteínas, se unen a menudo de forma fuerte a endotoxina, y la eliminación subsiguiente es muy difícil, si no imposible, por los medios existentes. Los conjugados de ligando de afinidad-matriz de la invención también se pueden aplicar a la eliminación de endotoxina de sangre o plasma, y así proporcionan una herramienta especialmente útil para la eliminación in vitro o in vivo de endotoxina, lográndose ésta última, por ejemplo, por medio de un dispositivo de extracción extracorpórea de endotoxina. Tal dispositivo puede ser especialmente valioso para la eliminación de endotoxina que se libera en el torrente sanguíneo durante infecciones bacterianas, provocando tales infecciones a menudo enfermedades que amenazan a la vida, tales como septicemia o meningitis. La eliminación de endotoxina en sangre puede ser particularmente beneficiosa en el tratamiento de estas enfermedades y en la prevención y manejo del choque séptico.
Los conjugados de ligando de afinidad-matriz, proporcionados por esta invención, se pueden usar en lugar de otros materiales de unión a endotoxinas, y son significativamente más flexibles en su uso, son más robustos, más baratos de producir y a menudo tienen mayores eficacias de unión a endotoxina.
Se puede unir un ligando de la invención a una matriz soporte vía Z, opcionalmente a través de un brazo espaciador interpuesto entre el ligando y la matriz. Como alternativa, en los nuevos ligandos de la invención, Z representa un grupo funcional del tipo capaz de reaccionar con una matriz sólida que se puede activar (si es necesario, o se desea) o inactivar.
Descripción de la invención
Cuando se conjuga a una matriz, el brazo espaciador opcional se representa preferiblemente por la fórmula general (II):
(II)-T-[L-V]_{m}-
en la que T representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo N-R_{2}, en el que R_{2} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono;
V representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo -COO-, un grupo CONH o un grupo NHCO, un grupo -PO_{3}H, un grupo NH-arilen-SO_{2}-CH_{2}-CH_{2}- o un grupo N-R_{3}, en el que R_{3} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono;
L representa un enlace hidrocarbonado opcionalmente sustituido que contiene de 2 a 20 átomos de carbono; y
m es 0 ó 1.
La matriz soporte puede ser cualquier compuesto o material, en partículas o no, soluble o insoluble, poroso o no poroso, que se puede usar en combinación con ligandos de afinidad para formar un conjugado de ligando de afinidad-matriz, y que proporciona un medio conveniente para separar los ligandos de afinidad de solutos en una disolución de contacto.
La presente invención proporciona conjugados de ligando de afinidad-matriz los cuales se pueden usar en el aislamiento o eliminación de endotoxina de agua, disoluciones acuosas, fluidos corporales, sangre, plasma, disoluciones de productos farmacéuticos, proteínas y otros compuestos de origen biológico.
En una realización preferida, los conjugados de ligando de afinidad-matriz se representan mediante la fórmula general (III):
2
en la que A_{1}, A_{2}, B_{1}, B_{2}, D_{1}, D_{2}, p, X, T, L, V, m, R_{1}, R_{2} y R_{3} tienen los significados especificados anteriormente; y M representa el resto de una matriz soporte que puede ser cualquier compuesto o material, en partículas o no, soluble o insoluble, poroso o no poroso, que se puede usar en combinación con ligandos de afinidad para formar un conjugado de ligando de afinidad-matriz, y que proporciona un medio conveniente para separar los ligandos de afinidad de los solutos en una disolución de contacto.
Se apreciará que esta invención se refiere, entre otros, al uso de compuestos que son pirimidinas, diazinas, o triazinas, que tienen un sustituyente -T-[L-V]_{0-1}-M, o el precursor de las mismas, y otros sustituyentes enlazados al anillo vía un heteroátomo. Tales sustituyentes pueden incluir cualquier grupo que no interfiera que comprende 0 a 20 átomos de carbono.
En la presente memoria descriptiva, siempre que se use el término endotoxina en un sentido plural o genérico, se quiere decir endotoxinas que se originan a partir de cualquier fuente microbiológica. Por el término endotoxina también se quiere decir de este modo lipopolisacárido procedente de cualquier especie que incluye enterobacterias, neisserias y clamidias. Puesto que se sabe que la endotoxina es heterogénea, el término "endotoxina", como se usa en este documento, incluye todas las formas de origen natural, que comprenden lípido A enlazado covalentemente a un polisacárido, incluyendo análogos, derivados, fragmentos y precursores del mismo.
La expresión "grupo amino primario", como se usa en este documento, sola o en combinación, se refiere a un grupo -NH_{2}.
La expresión "grupo amino secundario", como se usa en este documento, sola o en combinación, se refiere a un grupo -NHR_{4}, en el que R_{4} representa un grupo alquilo lineal o ramificado que contiene de 1 a 6 átomos de carbono.
La expresión "grupo amino terciario", como se usa en este documento, sola o en combinación, se refiere a un grupo -NR_{5}R_{6}, en el que R_{5} y R_{6} representa cada uno un grupo alquilo lineal o ramificado que contiene de 1 a 6 átomos de carbono.
La expresión "grupo amonio cuaternario", como se usa en este documento, sola o en combinación, se refiere a un grupo -NR_{7},R_{8},R_{9}^{+}, en el que R_{7}, R_{8} y R_{9} representan cada uno un grupo alquilo lineal o ramificado que contiene de 1 a 6 átomos de carbono.
La expresión "grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono", como se usa en este documento, sola o en combinación, se refiere a una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada, saturada, que tiene 1 a 6 átomos de carbono, tal como, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, n-pentilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, n-hexilo, 4-metilpentilo, neopentilo y 2,2-dimetilpropilo.
La expresión "grupo hidroxialquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono", como se usa en este documento, sola o en combinación, se refiere a una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada, saturada, que tiene 1 a 6 átomos de carbono, sustituida con uno o más grupos hidroxi, preferiblemente un grupo hidroxi, tal como, por ejemplo, hidroximetilo, 2-hidroxietilo, 3-hidroxipropilo, 2-hidroxipropilo, 4-hidroxibutilo, 5-hidroxipentilo y 6-hidroxihexilo.
La expresión "grupo alcoxi que contiene de 1 a 6 átomos de carbono", como se usa en este documento, sola o en combinación, se refiere a un sustituyente monovalente, lineal o ramificado, que comprende un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono enlazado mediante un oxígeno de tipo éter que tiene su enlace de valencia libre del oxígeno de tipo éter, y que tiene 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi y pentoxi.
El término "halógeno" significa flúor, cloro, bromo o yodo.
La expresión "aciloxi o acilamino que contiene de 1 a 6 átomos de carbono", como se usa en este documento, se refiere a un sustituyente monovalente que comprende un grupo alquilo, que contiene de 1 a 5 átomos de carbono, enlazado a través de un grupo carboniloxi u oxicarbonilo, tal como un grupo metilcarboniloxi, etilcarboniloxi, metiloxicarbonilo o etiloxicarbonilo, o enlazado mediante un grupo carbonilamino o aminocarbonilo, tal como un grupo metilcarbonilamino, etilcarbonilamino, metilaminocarbonilo o etilaminocarbonilo.
La expresión "alquilsulfonilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono", como se usa en este documento, se refiere a un sustituyente monovalente que comprende un grupo alquilo, que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, enlazado mediante un grupo sulfonilo, tal como, por ejemplo, metilsulfonilo, etilsulfonilo, n-propilsulfonilo, isopropilsulfonilo, n-butilsulfonilo, sec-butilsulfonilo, isobutilsulfonilo, terc-butilsulfonilo, n-pentilsulfonilo, 2-metil-butilsulfonilo, 3-metilbutilsulfonilo, n-hexilsulfonilo, 4-metilpen-tilsulfonilo, neopentilsulfonilo, y 2,2-dimetil-propilsulfonilo.
La expresión "uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de" se debe referir más preferiblemente a de 1-3 sustituyentes. La expresión se debe referir adicionalmente de forma preferible a 1-2 sustituyentes, y lo más preferible se refiere a un sustituyente.
La expresión "enlace hidrocarbonado opcionalmente sustituido que contiene de 2 a 20 átomos de carbono", como se usa en este documento, se refiere a una o más cadenas de alquilo lineales o ramificadas, opcionalmente sustituidas con, por ejemplo, grupos hidroxi o alcoxi, que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, y opcionalmente enlazadas juntas mediante enlaces amino, éter, tioéter, éster, amida o sulfonamida proporcionando una cadena que contiene de 2 a 20 átomos de carbono. La construcción es preferiblemente flexible. La construcción de tales enlaces hidrocarbonados opcionalmente sustituidos se describe, por ejemplo, en Lowe, C.R. y Dean, P.D.G., 1974, Affinity Chromatography, John Wiley & Sons, Londres, que se incorpora aquí como referencia.
La expresión "enlace hidrocarbonado opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 10 átomos de carbono", como se usa en este documento, sola o en combinación, se refiere a una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que tiene 1 a 10 átomos de carbono, opcionalmente sustituida con uno o más grupos funcionales, incluyendo pero sin limitarse a grupos carboxilo, preferiblemente un grupo carboxilo, y grupos hidroxilo. El enlace hidrocarbonado puede ser, por ejemplo, un grupo alquilo, fenilo, naftilo o ciclohexilo.
En una realización preferida de la invención, R_{1} representa un átomo de hidrógeno.
En otra realización preferida de la invención, R_{2} representa un átomo de hidrógeno.
En otra realización preferida de la invención, R_{3} representa un átomo de hidrógeno.
En otra realización preferida de la invención, R_{4} representa un grupo metilo, un grupo etilo o un grupo propilo.
En otra realización preferida de la invención, R_{5} representa un grupo metilo, un grupo etilo o un grupo propilo.
En otra realización preferida de la invención, R_{6} representa un grupo metilo, un grupo etilo o un grupo propilo.
En otra realización preferida de la invención, R_{7} representa un grupo metilo, un grupo etilo o un grupo propilo.
En otra realización preferida de la invención, R_{8} representa un grupo metilo, un grupo etilo o un grupo propilo.
En otra realización preferida de la invención, R_{9} representa un grupo metilo, un grupo etilo o un grupo propilo.
En otra realización preferida de la invención, A_{1} representa N-R_{1} en el que R_{1} es como se define anteriormente.
En otra realización preferida de la invención, A_{2} representa N-R_{1} en el que R_{1} es como se define anteriormente.
En otra realización preferida de la invención, B_{1} representa un grupo -CHCOOH-CH_{2}-, un grupo -CHCOOH-(CH_{2})_{2}-, un grupo -CHCOOH-(CH_{2})_{3}-, un grupo -CHCOOH-(CH_{2})_{4}-, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo 2-hidroxipropilo, un grupo butilo, un grupo pentilo, un grupo hexilo o un grupo fenilo.
En otra realización preferida de la invención, B_{2} representa un grupo -CHCOOH-CH_{2}-, un grupo -CHCOOH-(CH_{2})_{2}-, un grupo -CHCOOH-(CH_{2})_{3}-, un grupo -CHCOOH-(CH_{2})_{4}-, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo 2-hidroxipropilo, un grupo butilo, un grupo pentilo, un grupo hexilo o un grupo fenilo.
En otra realización preferida de la invención, D_{1} representa hidrógeno, un grupo amino, un grupo imidazol, un grupo guanidino, un grupo aminidino, un grupo trimetilamonio, un grupo trietilamonio, un grupo dimetilamino, un grupo dietilamino, un grupo metilamino o un grupo etilamino.
En otra realización preferida de la invención, D_{2} representa un grupo amino, un grupo imidazol, un grupo guanidino, un grupo aminidino, un grupo trimetilamonio, un grupo trietilamonio, un grupo dimetilamino, un grupo dietilamino, un grupo metilamino o un grupo etilamino. D_{2} (y también a menudo D_{1}) es preferiblemente una especie fuertemente cargada. Por ejemplo, D_{2} puede derivar de lisina u ornitina.
En otra realización preferida de la invención, ambos X representan un átomo de nitrógeno.
En otra realización preferida de la invención, T representa un átomo de oxígeno o, más preferiblemente, un grupo NH.
En otra realización preferida de la invención, L representa un grupo butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo o dodecilo, y V y m son como se definen anteriormente.
En otra realización preferida de la invención, V representa un átomo de oxígeno, un grupo -COO-, un grupo -PO_{3}H o un grupo N-R_{3}, y más preferido un átomo de oxígeno o un grupo NH, y L y m son como se definen anteriormente.
En otra realización preferida de la invención, m representa 1 y L y V son como se definen anteriormente.
La expresión "número entero entre x e y" puede incluir los valores x (incluyendo cero) e y.
Los conjugados de ligando de afinidad-matriz, para uso en la invención o según ella, se pueden preparar mediante un método que comprende hacer reaccionar, en cualquier orden,
(i) un compuesto halogenoheterocíclico de fórmula general (IV):
3
en la que los símbolos X tienen los significados anteriormente especificados aquí, y W representa un átomo de halógeno, con
(ii) un compuesto de fórmula general (V):
(V)D_{1}-[B_{1}]_{p}-A_{1}-H
en la que los símbolos D_{1}, B_{1}, A_{1} y p tienen los significados especificados aquí anteriormente, y H es hidrógeno,
(iii) un compuesto de fórmula general (VI):
(VI)D_{2}-B_{2}-A_{2}-H
en la que los símbolos D_{2}, B_{2} y A_{2} tienen los significados especificados aquí anteriormente, y H es hidrógeno, y
(iv) con una matriz soporte opcionalmente derivatizada, de fórmula general (VII):
(VII)H-T-[L-V]_{m}-M
en la que los símbolos T, L, V, m y M tienen los significados especificados aquí anteriormente, y H es hidrógeno,
o con una unidad enlazante de fórmula general (VIII):
(VIII)H-T-L-V-H
en la que los símbolos T, L, V tienen los significados especificados aquí anteriormente, para dar un compuesto de fórmula general (IX):
4
en la que A_{1}, A_{2}, B_{1}, B_{2}, D_{1}, D_{2}, p, X, T, L, V, m, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} tienen los significados especificados aquí anteriormente; el compuesto de fórmula general (IX) se hace reaccionar entonces posteriormente con una matriz soporte cuyo resto se representa por M, usando procedimientos de activación y de acoplamiento bien conocidos por los expertos en la técnica.
Como ejemplos de compuestos halogenoheterocíclicos de fórmula general (IV), se pueden mencionar a 5-cloro-2,4,6-trifluoropirimidina, 5-ciano-2,4,6-tricloropirimidina, fluoruro cianúrico, bromuro cianúrico y, por encima de todos, cloruro cianúrico.
Como ejemplos de compuestos de fórmula general (V), se pueden mencionar amoníaco, agua, arginina, lisina, histidina, ácido \alpha,\gamma-diaminobutírico, m-aminoben-zamidina, p-aminobenzamidina, bromuro de m-aminobencenotrimetilamonio, bromuro de p-aminobencenotrimetilamonio, 2-(dietilamino)-etilamina, cloruro de (2-aminoetil)trimetila-monio, histamina, agmatina, etilendiamina, 1,3-diaminopropano, 1,3-diamino-2-hidroxipro-pano, 1,4-diaminobutano, 1,5-diamino-pentano y 1,6-diaminohexano.
Como ejemplos de compuestos de fórmula general (VI), se pueden mencionar arginina, lisina, histidina, ácido \alpha,\gamma-diaminobutírico, m-aminobenzamidina, p-aminoben-zamidina, bromuro de m-aminobencenotrimetilamonio, bromuro de p-aminobencenotrime-tilamonio, 2-(dietilamino)etilamina, cloruro de (2-aminoetil)trimetilamonio, histamina, agmatina, etilendiamina, 1,3-diaminopropano, 1,3-diamino-2-hidroxi-propano, 1,4-diami-nobutano, 1,5-diaminopentano, 1,6-diaminohexano.
Como ejemplo de matrices soportes cuyo resto se representa por M, se pueden mencionar las matrices soportes insolubles tales como un polímero de origen natural, por ejemplo un polipéptido o proteína, tal como albúmina reticulada, o un polisacárido, tal como agarosa, alginato, carragenano, quitina, celulosa, dextrano o almidón; polímeros sintéticos, tales como poliacrilamida, poliestireno, poliacroleína, poli(alcohol vinílico), poli(acrilato de metilo) o perfluorocarbono; compuestos inorgánicos, tales como sílice, vidrio, kieselguhr, alúmina, óxido de hierro u otros óxidos metálicos, o copolímeros que consisten en cualquier combinación de dos o más polímeros de origen natural, polímeros sintéticos o compuestos inorgánicos. También se incluyen, dentro de la definición de matrices soportes cuyo resto está representado por M, las matrices soportes solubles que comprenden polímeros tales como dextrano, polietilenglicol, poli(alcohol vinílico) o almidón hidrolizado, que proporcionan conjugados de ligando de afinidad-matriz para uso en reparto de líquidos; o matrices soportes que comprenden compuestos tales como perfluorodecalina, que proporcionan conjugados de ligando de afinidad-matriz para uso en la formación de emulsiones de afinidad. Para evitar dudas, una matriz soporte se define en este documento como cualquier compuesto o material, ya sea en partículas o no, soluble o insoluble, poroso o no poroso, que se puede usar para formar un nuevo conjugado de ligando de afinidad-matriz según la invención, y que proporciona un medio conveniente para separar el ligando de afinidad de los solutos en una disolución de contacto.
También se incluyen, dentro de la definición de matrices soportes cuyo resto está representado por M, las matrices soportes tales como agarosa, celulosa, dextrano, almidón, alginato, carragenano, polímeros sintéticos, sílice, vidrio y óxidos metálicos que se han modificado o se modifican por tratamiento con un agente activante antes, o durante, la unión del ligando.
En una realización preferida de la invención, M representa opcionalmente agarosa activada, sílice, celulosa, dextrano, vidrio, toyopearl, metacrilato de hidroxietilo, poliacrilamida, estirendivinilbenceno, Hyper D, perfluorocarbonos, polisulfona, polietersulfona, poli(fluoruro de vinilideno), nailon, y poli(cloruro de vinilo). Preferiblemente, M representa agarosa activada con tresilo, activada con cloruro de sulfonilo, activada con tosilo, activada con vinilsulfona o activada con epoxi.
Existe un número considerable de agentes activantes que han encontrado uso para el fin general de unir ligandos a matrices soportes. Estos compuestos, y su método de uso, son bien conocidos por los expertos en la técnica, y, puesto que la esencia de la presente invención reside en la naturaleza del ligando unido a la matriz y no en el modo de unión, cualquiera de estos agentes activantes servirá en la preparación de los nuevos conjugados de matriz-ligando de la invención. Como ejemplos no limitantes de tales agentes activantes, se pueden mencionar diversos compuestos tales como bromuro de cianógeno, cloruro cianúrico, epiclorhidrina, divinilsulfona, cloruro de p-toluenosulfonilo, 1,1'-carbonildiimidazol, metaperyodato de sodio, toluen-4-sulfonato de 2-fluoro-1-metilpiridinio, glicidoxipropiltrimetoxisilano y cloruro de 2,2,2-trifluoroetanosulfonilo. Como se ha indicado anteriormente, los procedimientos por los cuales se llevan a cabo tales etapas activantes son bien conocidos por los expertos en la técnica.
De forma similar, se puede usar una amplia variedad de agentes de condensación para unir los compuestos de fórmulas generales (VIII) y (IX) a matrices soportes, tales como agarosa, celulosa, dextrano, almidón, alginato, carragenano, sílice o vidrio. Nuevamente, estos compuestos, y su método de uso, son bien conocidos por los expertos en la técnica, y, nuevamente, puesto que la esencia de la presente invención reside en la naturaleza del ligando y no en el modo de unión, cualquiera de estos agentes de condensación servirá en la preparación de los nuevos conjugados de matriz-ligando de la invención. Como ejemplos no limitantes de tales agentes de condensación, se pueden mencionar N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina, diciclohexilcarbodiimida y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.
Como ejemplos de unidades enlazantes de fórmula general (VIII), que se pueden usar para producir compuestos de fórmula general (IX), se pueden mencionar diaminas tales como etilendiamina, N,N'-dimetiletilendiamina, N-etil-etilendiamina, N-(\beta-hidroxie-til)etilendiamina, propilendiamina, N-metilpropilendiamina, N-(\beta-hidroxietil)propilen-diamina, 1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano, 1,6-diaminohexano, 1,7-diami-nohep-tano, 1,8-diaminooctano, 1,9-diaminononano, 1,10-diaminodecano, 1,12-diaminodode-cano, piperazina, 3-hidroxi-1,5-diaminopentano, m- y p-fenilen-diamina, m- y p-aminoben-cilamina; aminoalcoholes, tales como etanolamina, N-metiletanolamina, N-propiletanola-mina, dietanolamina, 3-hidroxipropilamina, 2,3-dihidroxipropil-amina, isopropanolamina, 5-aminopentan-1-ol y 6-aminohexan-1-ol; aminofenoles, tales como o-, m- y p-aminofenol; ácidos aminocarboxílicos tales como glicina, N-metilglicina, ácido 3- y 4-aminobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 5-aminovalérico, ácido 6-aminocaproico, ácido 7-amino-heptanoico, ácido m- y p-aminobenzoico; ácidos aminofosfónicos, tales como ácido m-aminobencenofosfónico y ácido p-aminobencilfosfónico; y precursores de aminoarilenvinilsulfona, tales como anilin-3-\beta-sulfatoetilsulfona y anilin-4-\beta-sulfatoetilsul-fona.
La reacción de los compuestos halogenoheterocíclicos de fórmula general (IV) con compuestos de fórmulas generales (V), (VI) y (VII) o (VIII), se puede llevar a cabo en un disolvente orgánico que no sea miscible con agua, o en un disolvente orgánico que sea miscible con agua, o en una mezcla de agua y un disolvente orgánico miscible en agua. Ejemplos de disolventes orgánicos adecuados, que no son miscibles con agua, son tolueno, xileno o clorobenceno; ejemplos de disolventes orgánicos adecuados, que son miscibles con agua, son acetona, metiletilcetona o dioxano. La primera reacción del compuesto halogenoheterocíclico se puede llevar a cabo a temperaturas entre 0ºC y 25ºC, idealmente entre 0ºC y 5ºC; la segunda reacción se puede llevar a cabo a temperaturas entre 20ºC y 50ºC, idealmente entre 30ºC y 45ºC; y la tercera reacción, a temperaturas entre 20ºC y 100ºC. Durante tales reacciones, el ácido inorgánico, tal como ácido clorhídrico o ácido fluorhídrico, que se produce, se neutraliza mediante el uso de un agente de unión a ácidos, tal como hidróxido de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, hidróxido de calcio o carbonato de calcio.
Adicionalmente, los compuestos de fórmula general (IX) se pueden hacer reaccionar con un monómero polimerizable reactivo para formar un compuesto polimerizable de fórmula general (X):
5
en la que A_{1}, A_{2}, B_{1}, B_{2}, D_{1}, D_{2}, p, X, T, L, V, m, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} tienen los significados especificados aquí anteriormente; R_{11} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono; R_{10} representa un grupo carbonilo, un grupo metileno, un grupo -NH-CH_{2}- o un grupo -S-CH_{2}-. Los ejemplos de monómeros polimerizables reactivos incluyen cloruro de acriloilo, cloruro de metacriloilo, bromuro de alilo, alilamina o 3,4-epoxibuteno. Los compuestos polimerizables de fórmula general (X) se pueden polimerizar, opcionalmente en presencia de otros monómeros polimerizables, para formar conjugados de ligando de afinidad-matriz de fórmula general (III). Tales procedimientos de polimerización son bien conocidos por los expertos en la técnica.
En otra realización, la invención se refiere a nuevos conjugados de ligando de afinidad-matriz, de fórmula general (XI):
6
en la que A_{1}, A_{2}, B_{1}, B_{2}, D_{1}, D_{2}, p, X, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} tienen los significados especificados aquí anteriormente, y Halógeno representa un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo.
Adicionalmente, la invención se refiere a un método para unir ligandos de afinidad, de fórmula general (XI) como se define anteriormente, a una matriz de fórmula general (VII), como se describe anteriormente, haciendo reaccionar los ligandos de afinidad con la matriz a temperaturas entre 0ºC y 100ºC, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos.
En otra realización, la invención se refiere a ligandos de afinidad, de fórmula general (XII):
7
en la que A_{1}, A_{2}, B_{1}, B_{2}, D_{1}, D_{2}, p, X, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} tienen los significados especificados aquí anteriormente, y j es un número entero entre 2 y 20.
Adicionalmente, la invención se refiere a un método para preparar ligandos de afinidad haciendo reaccionar un compuesto de la fórmula general (XI) anterior con una alquilendiamina de fórmula general H_{2}N-(CH_{2})_{j}-NH_{2}, a temperaturas entre 0ºC y 100ºC, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos.
En otra realización, la invención se refiere a ligandos de afinidad de la fórmula general (XIII):
8
en la que A_{1}, A_{2}, B_{1}, B_{2}, D_{1}, D_{2}, p, X, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} tienen los significados especificados aquí anteriormente, j es un número entero entre 2 y 20, y q es 0 ó 1.
Adicionalmente, la invención se refiere a un método para unir ligandos de afinidad, de fórmula general (XIII) como se define anteriormente, a una matriz de fórmula general (VII), como se define anteriormente, haciendo reaccionar los ligandos de afinidad con la matriz a temperaturas entre 0ºC y 100ºC, en presencia de un agente de condensación. Como ejemplos no limitantes de tales agentes de condensación, se pueden mencionar N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina, diciclohexilcarbodiimida y 1-etil-3-(3-dimetilami-nopropil)-carbodiimida.
Adicionalmente, la invención se refiere a un método para preparar ligandos de afinidad, de la fórmula general (XIII) anterior, haciendo reaccionar un compuesto de la fórmula H_{2}N-(CH_{2})_{j}-(CO)_{q}-OH, a temperaturas entre 0ºC y 100ºC, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos.
En otra realización, la invención se refiere a ligandos de afinidad de la fórmula general (X) anterior, en la que A_{1}, A_{2}, B_{1}, B_{2}, D_{1}, D_{2}, p, X, T, L, V, m, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} tienen los significados especificados aquí anteriormente, R_{10} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, R_{11} representa un grupo carbonilo, un grupo metileno, un grupo -NH-CH_{2}- o un grupo -S-CH_{2}-, preferiblemente L es un grupo alquilo que contiene de 4 a 10 átomos de carbono, preferiblemente T representa un grupo -NH-, preferiblemente V representa un grupo -NH-, y m es preferiblemente 1.
En una realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de la fórmula general (XIV):
9
en la que A_{1}, A_{2}, B_{1}, B_{2}, D_{1}, D_{2}, p y R_{1} tienen los significados especificados anteriormente.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de fórmula general (XV):
10
en la que A_{1}, A_{2}, B_{1}, B_{2}, D_{1}, D_{2}, p y R_{1} tienen los significados especificados anteriormente y j es un número entero entre 2 y 20.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las fórmulas generales (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV) y (XV), en las que D_{1} y D_{2} representan ambos independientemente un grupo guanidino, un grupo imidazol, un grupo amino primario, un grupo dietilamino, un grupo trimetilamonio o un grupo trietilamonio.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las fórmulas generales (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV) y (XV), en las que p es 1.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las fórmulas generales (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV) y (XV), en las que B_{1} y B_{2} representan ambos independientemente un grupo -CHCOOH-(CH_{2})_{3}-, un grupo -CHCOOH-(CH_{2})_{4}-, un grupo butilo, un grupo pentilo o un grupo fenilo.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las fórmulas generales (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV) y (XV), en las que A_{1} y A_{2} representan ambos independientemente un grupo -NH-.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las fórmulas generales (IX), (X), (XI), (XII) y (XIII), en las que X representa un átomo de nitrógeno.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las fórmulas generales (XII), (XIII) y (XV), en las que j está entre 4 y 10.
Los ligandos de afinidad preferidos según la invención son:
11
12
120 
\vskip1.000000\baselineskip
13
130
Un grupo valioso de conjugados de ligando de afinidad-matriz se representa por la fórmula general (XXVII):
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que B_{1}, B_{2}, D_{1}, D_{2}, p, M, R_{1}, R_{2} y R_{3} tienen los significados especificados aquí anteriormente, y j es un número entero entre 4 y 10.
Un grupo especialmente valioso de ligando de afinidad con matrices soporte se representa por la fórmula general (XXVIII):
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que B_{1}, B_{2}, D_{1}, D_{2}, p, X, M, R_{1}, R_{2}, R_{3} y M tienen los significados especificados aquí anteriormente.
Típicamente, la reacción de compuestos de fórmula general (XXIX):
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16 
\vskip1.000000\baselineskip
con matrices derivatizadas con 3-propoxi-(1,2-epoxi), a temperaturas entre 10ºC y 30ºC en presencia de un agente de unión a ácidos, produce nuevos conjugados de ligando de afinidad-matriz que son de un notable valor en la unión de endotoxina de agua, disoluciones acuosas, proteínas, fármacos, sangre y plasma.
Los conjugados preferidos de ligando de afinidad-matriz, según la invención, son:
17
18
19
en las que M es como se define anteriormente.
La invención se refiere además al uso de todos los conjugados de ligando de afinidad-matrices soporte en la separación, aislamiento, purificación, cuantificación, identificación y caracterización de endotoxina o análogos, fragmentos, derivados de la misma y precursores.
Las endotoxinas son una familia de lipopolisacáridos, a menudo abreviado como LPS, que comparten una estructura común. Las endotoxinas existen en un número de formas, por ejemplo los tipos más significativos de endotoxinas comprenden lípido A unido a un componente de polisacárido central que también puede estar enlazado a un polisacárido de cadena específica O. El componente de polisacárido central puede constar de un núcleo interno, un núcleo interno unido a un oligosacárido externo, o un núcleo interno unido a un núcleo externo. Se sabe que la endotoxina es extremadamente heterogénea, particularmente con respecto al polisacárido de cadena específica O y el polisacárido de núcleo externo. Puesto que se sabe que la endotoxina es heterogénea, el término "endotoxina", como se usa en este documento, incluye todas las formas de origen natural, que comprenden lípido A enlazado covalentemente a un polisacárido, incluyendo análogos, derivados, fragmentos y precursores de las mismas, y todas las citadas formas, independientemente de su fuente, son el objeto de las reivindicaciones de esta invención.
Además, la invención se refiere a un método para unir los ligandos de afinidad de las fórmulas generales (IX), como se define anteriormente, (X), como se define anteriormente, (XII), como se define anteriormente, (XV), como se define anteriormente, y (XXIX), como se define anteriormente, a matrices de hidratos de carbono o de polímero orgánico, haciendo reaccionar la matriz de hidrato de carbono o de polímero orgánico con un agente activante, seguido de la reacción de la matriz activada con el nuevo ligando de afinidad, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos. La invención también se refiere a un método para unir los ligandos de afinidad de las fórmulas generales (XIII), como se define anteriormente, a matrices de hidratos de carbono o de polímeros orgánicos mediante condensación con la matriz. La invención se refiere además a un método para unir los ligandos de afinidad de las fórmulas generales (IX), como se define anteriormente, (X), como se define anteriormente, (XII), como se define anteriormente, (XV), como se define anteriormente, y (XXIX), como se define anteriormente, a matrices de óxidos metálicos, vidrio o de sílice, opcionalmente revestidas con un polímero orgánico, haciendo reaccionar la matriz de óxido metálico, vidrio o sílice, opcionalmente revestida, con un agente activante, seguido de la reacción de la matriz activada con el ligando de afinidad, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos. Otra realización de la invención se refiere a un método para unir los ligandos de afinidad de las fórmulas generales (XIII), como se define anteriormente, a matrices de óxidos metálicos, vidrio o sílice, opcionalmente revestidas con un polímero orgánico, mediante condensación con la matriz. En otra realización, la invención se refiere a un método para unir ligandos de afinidad de las fórmulas generales (XI), como se define anteriormente, (XIV), como se define anteriormente, y (XVI-XXVI), como se definen anteriormente, a una matriz de fórmula general (VII), como se define anteriormente, haciendo reaccionar los ligandos de afinidad con la matriz a temperaturas entre 0ºC y 100ºC, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos. La invención también se refiere a todos los conjugados de ligando de afinidad-matriz, preparados como se describe en los métodos anteriores.
En otra realización, la invención se refiere al uso de los ligandos de afinidad, según la invención, y a los conjugados de ligando de afinidad-matriz, según la invención, para la separación, aislamiento, purificación, caracterización, identificación o cuantificación de endotoxina. En otra realización, la invención se refiere a cualquier procedimiento por el cual se aplican disoluciones o líquidos que contienen endotoxina a conjugados de ligando de afinidad-matriz, según la invención, a un pH en el intervalo de 1,0 a 13,0. La invención también se refiere a un procedimiento para el aislamiento de endotoxina de diversos fluidos, tales como agua, disoluciones acuosas, fluidos corporales, sangre, plasma, disoluciones de productos farmacéuticos, proteínas y otros compuestos de origen biológico, llevando a cabo la cromatografía de afinidad usando, como el ligando bioespecífico, un ligando de la fórmula general (I) como se define anteriormente.
Otra realización de la invención se refiere al uso de ligandos de afinidad, según la invención, y a conjugados de ligando de afinidad-matriz que comprenden tales ligandos según la invención, para la eliminación extracorpórea de endotoxina a partir de sangre completa o plasma que se toma de un donante y se reinfunde nuevamente en el mismo donante u otro receptor tras el tratamiento.
La invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos. Los ejemplos se proporcionan confines ilustrativos, y no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención, de ninguna manera.
Ejemplo 1
Este ejemplo ilustra la síntesis de un ligando típico de afinidad, de fórmula general (XIV), definida por la reacción de un compuesto haloheterocíclico de fórmula general (IV) con un compuesto de fórmula general (V) y (VI).
Se añadió gota a gota una disolución de 1 parte de cloruro cianúrico en 10 partes de acetona a una disolución agitada que comprende 2 partes de L-arginina en 100 partes de agua. La mezcla se agitó durante 2 horas a 0-5ºC, con lo que la disolución después se calentó hasta 30ºC, y continuó el mezclamiento durante 16 horas adicionales. El pH se mantuvo dentro del intervalo de 5,0-7,0 mediante titulación con disolución de hidróxido sódico 1 M. El producto de reacción se precipitó por adición de cloruro de sodio sólido hasta una concentración final de 20% (p/v), se filtró y se secó a vacío. El análisis mediante TLC (disolvente de THF/2-propanol/agua (1:2:1 en volumen)) reveló la presencia de un único producto de reacción (R_{f} 0,42). La masa molecular del compuesto aislado se determinó mediante espectroscopía de masas, y se encontró que era consistente con un compuesto que contiene cloruro cianúrico derivatizado con 2 moléculas de arginina (M_{t} calculada = 459,5; ion molecular (+ve FAB) = 460,3, (-ve FAB) = 458,4). El espectro de ^{1}H NMR fue consistente con un compuesto que contiene arginina.
Ejemplo 2
Este Ejemplo ilustra la síntesis de una matriz soporte, opcionalmente derivatizada, de fórmula general (VII).
Se añadió una disolución de 1 parte de 1,6-diaminohexano en 12 partes de agua a una suspensión agitada que comprende 29 partes de perlas de agarosa activadas con epoxi (30 \mumoles de grupos epóxido por g de gel de agarosa) en 48 partes de agua, y se agitó durante 24 h a 30ºC. El gel de aminohexilagarosa se filtró y se lavó consecutivamente con 12 x 29 partes de agua, y se dejó drenar por gravedad hasta terminación del lavado final. El análisis de la aminohexilagarosa resultante para determinar la presencia de aminas primarias (ensayo de TNBS) y de grupos epóxido (valoración con tiosulfato/hidróxido de sodio) reveló la reacción completa de los grupos epóxido con 1,6-diamino-hexano.
Ejemplo 3
Se repitió el Ejemplo 2 sustituyendo 1,6-diaminohexano con 1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano, 1,7-diaminoheptano, 1,8-diaminooctano, 1,9-diaminononano y 1,10-diaminodecano. En todos los casos se obtuvieron matrices de agarosa derivatizadas con aminoalquilo.
Ejemplo 4
Este Ejemplo ilustra la reacción de una matriz soporte de fórmula general (VII), opcionalmente derivatizada, con un compuesto halogenoheterocíclico de fórmula general (IV).
Se añadió una disolución de 1 parte de cloruro cianúrico en 10 partes de acetona a una suspensión preenfriada (0-4ºC) de 40 partes de matriz de aminohexilagarosa preparada según el Ejemplo 2 en 40 partes de tampón de fosfato de potasio 0,5 M, pH 7,0. La mezcla se agitó durante 1 hora a 0-4ºC, se filtró y se lavó consecutivamente con 5 x 40 partes de una disolución que comprende 1 parte de acetona y 1 parte de agua, 5 x 40 partes de agua, 5 x 40 partes de una disolución que comprende 1 parte de acetona y 1 parte de agua, y 10 x 40 partes de agua. El análisis de la matriz de agarosa resultante activada con diclorotriazina para determinar la presencia de aminas (ensayo de TNBS), y liberación de iones cloruro después del tratamiento con hidróxido de sodio 1 M, reveló la reacción completa de cloruro cianúrico con los grupos amino primarios en la matriz de aminohexilagarosa.
Ejemplo 5
Se repitió el Ejemplo 4 sustituyendo el producto preparado según el Ejemplo 2 con los productos preparados según el Ejemplo 3. El análisis de las matrices de agarosa resultantes activadas con diclorotriazina, para determinar la presencia de aminas (ensayo de TNBS) y liberación de iones cloruro después del tratamiento con hidróxido de sodio 1 M, reveló, en todos los casos, la reacción completa de cloruro cianúrico con los grupos amino primarios en la matriz de aminoalquilagarosa.
Ejemplo 6
Este Ejemplo ilustra la reacción del producto, preparado según el Ejemplo 4, con un compuesto de fórmula general (VI) y un compuesto de fórmula general (V), para producir conjugados de ligando de afinidad-matriz de fórmula general (III). Todas las disoluciones se prepararon con agua libre de pirógenos.
Se añadió una parte de arginina a una suspensión que contiene 35 partes del producto preparado según el Ejemplo 4 en 105 partes de tampón de carbonato de sodio 0,1 M, pH 10,25. La mezcla se agitó durante 24 horas a 30ºC, se filtró y se lavó consecutivamente con 12 x 35 partes de tampón de carbonato de sodio 0,1 M, pH 10,25, y se dejó drenar por gravedad. Este material se volvió a suspender en 105 partes de tampón de carbonato de sodio 0,1 M, pH 10,25.
Se añadió una parte de N-\varepsilon-t-BOC-L-lisina a la suspensión de agarosa, y la mezcla se agitó durante 72 horas a 85ºC. La suspensión se filtró y se lavó consecutivamente con 12 x 35 partes de agua, y se dejó drenar por gravedad. La mezcla se resuspendió en 35 partes de ácido trifluoroacético 0,1 M, se agitó durante 1 hora a 20ºC, se filtró y se lavó consecutivamente con 3 x 35 partes de metanol, 12 x 35 partes de agua, y se dejó drenar por gravedad. Este procedimiento se requiere para eliminar el grupo protector t-BOC.
Ejemplos 7 a 14
La Tabla 1 da ejemplos adicionales de la síntesis de nuevos conjugados de ligando de afinidad-matriz de la invención, que se prepararon mediante el método anterior, pero sustituyendo la arginina por el compuesto amínico enumerado en la Columna II de la Tabla 1, y sustituyendo la N-\varepsilon-t-BOC-L-lisina por el compuesto amínico enumerado en la Columna III de la Tabla 1. El número del Ejemplo se da en la Columna I de la Tabla 1.
TABLA 1
I II III
7 Arginina Arginina
8 Arginina Amoníaco
9 N-im-Tritil-L-histidina Arginina
10 N-\varepsilon-t-BOC-L-lisina N-im-Tritil-L-histidina
11 N-\varepsilon-t-BOC-L-lisina N-\varepsilon-t-BOC-L-lisina
12 N-im-Tritil-L-histidina N-im-Tritil-L-histidina
13 N-im-Tritil-L-histidina Amoníaco
14 N-\varepsilon-t-BOC-L-lisina Amoníaco
Ejemplo 15
Este Ejemplo ilustra la capacidad de los conjugados de ligando de afinidad-matriz, de fórmula general (III), para unirse a endotoxina procedente de agua.
Se añadió el conjugado de ligando de afinidad-matriz (150 \mul), preparado según el Ejemplo 6, a agua (1,5 ml) que contiene endotoxina #055:B5 de Escherichia coli (1,5 x 10^{4} UE), y se agitó durante 1 hora a 20ºC. La muestra se centrifugó, y el sobrenadante se analizó para determinar la presencia de endotoxina, mediante el ensayo cromogénico de lisado de amebocito de Limulus. Sólo se detectaron 0,1 UE/ml (equivalente a 10 pg/ml) [(UE = unidades de endotoxina)] en el sobrenadante, indicando una eliminación mayor de 99,99% de endotoxina procedente de agua.
Ejemplos 16 a 23
La Tabla 2 da ejemplos adicionales de la capacidad de los nuevos conjugados de ligando de afinidad-matriz de la invención para unirse a endotoxina. Se realizó el procedimiento descrito anteriormente, excepto que el conjugado de ligando de afinidad matriz se sintetizó según el número del Ejemplo dado en la Columna II de la Tabla 2, la cantidad de endotoxina que queda en el sobrenadante (UE/ml) se da en la Columna III de la Tabla 2, y la cantidad de endotoxina adsorbida (%) mediante el conjugado de ligando de afinidad-matriz se da en la Columna IV de la Tabla 2. El número del Ejemplo se da en la Columna I de la Tabla 2.
TABLA 2
I II III IV
16 7 1,2 99,99
17 8 1,1 99,99
18 9 1,1 99,99
19 10 7,3 99,93
20 11 0,4 >99,99
21 12 0,1 >99,99
22 13 1,4 99,99
23 14 1,0 99,99
Ejemplo 24
Este ejemplo ilustra la capacidad de los conjugados de ligando de afinidad-matriz, de fórmula general III, para aislar endotoxina procedente de disoluciones que contienen proteínas, contaminadas con endotoxina.
Se añadió conjugado de ligando de afinidad-matriz (150 \mul), preparado según el Ejemplo 6, a agua (1,5 ml) que contiene endotoxina #055:B5 de Escherichia coli (1,5 x 10^{4} UE) y a albúmina de suero humano (15 mg), y se agitó durante 1 hora a 20ºC. La muestra se centrifugó, y el sobrenadante se analizó para determinar la presencia de la endotoxina mediante el ensayo cromogénico de lisado de amebocito de Limulus, que se había calibrado para detectar endotoxina en presencia de 10 mg/ml de albúmina de suero humano. Se detectó en el sobrenadante la endotoxina a una concentración de 50 UE/ml, indicando una eliminación de 99,5% de endotoxina a partir de una disolución que contiene 10 mg/ml de albúmina de suero humano.
Ejemplos 25 a 32
La Tabla 3 da ejemplos adicionales de la capacidad de los nuevos conjugados de ligando de afinidad-matriz de la invención para aislar endotoxina a partir de disoluciones que contienen proteínas, contaminadas con endotoxina. Se realizó el procedimiento descrito anteriormente, excepto que el conjugado de ligando de afinidad-matriz se sintetizó según el número del Ejemplo dado en la Columna II de la Tabla 3, la cantidad de endotoxina que queda en el sobrenadante (UE/ml) se da en la Columna III de la Tabla 3, y la cantidad de endotoxina adsorbida (%) mediante el conjugado de ligando de afinidad-matriz se da en la Columna IV de la Tabla 3. El número del Ejemplo se da en la Columna I de la Tabla 3.
TABLA 3
I II III IV
25 7 790 92,1
26 8 169 98,3
27 9 127 98,7
28 10 81 99,2
29 11 90 99,1
30 12 277 97,2
31 13 54 99,5
32 14 66 99,3
Ejemplo 33
Este Ejemplo ilustra la capacidad de nuevos conjugados de ligando de afinidad-matriz, de fórmula general (III), para unirse a endotoxina en presencia de proteína. Se añadió conjugado de ligando de afinidad-matriz (150 \mul), preparado según el Ejemplo 6, a agua (1,5 ml) que contiene endotoxina #055:B5 de Escherichia coli (7,5 x 10^{3} UE a 1,5 x 10^{5} UE) y a albúmina de suero humano (15 mg), y se agitó durante 1 hora a 20ºC. Las muestras se centrifugaron, y los sobrenadantes se analizaron para determinar la presencia de endotoxina mediante el ensayo cromogénico de lisado de amebocito de Limulus, que se había calibrado para detectar endotoxina en presencia de 10 mg/ml de albúmina de suero humano. La cantidad total de endotoxina presente en la mezcla de captación, y la cantidad de endotoxina adsorbida, se da en la Tabla 4.
TABLA 4
Endotoxina total (UE) Endotoxina unida (%)
7,5 x 10^{3} >99,9
1,5 x 10^{4} 99,5
3 x 10^{4} 99,7
TABLA 4 (continuación)
Endotoxina total (UE) Endotoxina unida (%)
4,5 x 10^{4} 99,6
7,5 x 10^{4} 99,6
1,5 x 10^{5} 99,3
Estos resultados demuestran que 1 g del nuevo conjugado de ligando de afinidad-matriz, de fórmula general (III), es capaz de unirse a 1 x 10^{6} UE (100 \mug de endotoxina) en presencia de 10 mg/ml de albúmina de suero humano, con una eficacia de extracción mayor que 99%.
Ejemplo 34
Este Ejemplo ilustra la capacidad de los nuevos conjugados de ligando de afinidad-matriz, de fórmula general (III), para unirse a endotoxina en presencia de proteína y de tampón de fuerza iónica variable. Se añadió conjugado de ligando de afinidad-matriz (150 \mul), preparado según el Ejemplo 6, a agua (1,5 ml), que contiene endotoxina #055:B5 de Escherichia coli (7,5 x 10^{4} UE), albúmina de suero humano (15 mg) y tampón de PBS (0 a 200 mM), y se agitó durante 1 hora a 20ºC. Las muestras se centrifugaron, y los sobrenadantes se analizaron para determinar la presencia de endotoxina mediante el ensayo cromogénico de lisado de amebocito de Limulus, que se había calibrado para detectar endotoxina en presencia de 10 mg/ml de albúmina de suero humano. Más del 99% de la endotoxina presente fue adsorbida por todas las concentraciones de tampón de PBS investigadas. Estos resultados demuestran que los nuevos conjugados de ligando de afinidad-matriz, de fórmula general (III), son capaces de unirse a endotoxina con una eficacia elevada e independientemente de la fuerza iónica o de la presencia de proteína.

Claims (35)

1. Uso de un ligando de afinidad que tiene la fórmula general (I):
20
en la que uno de X es N y el otro de X es N, CCl o CCN;
A_{1} y A_{2} son cada uno independientemente O, S o N-R_{1} y R_{1} es H, alquilo C_{1-6}, hidroxialquilo C_{1-6}, bencilo o \beta-feniletilo;
B_{1} y B_{3} son cada uno independientemente un enlace hidrocarbonado opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 10 átomos de carbono;
D_{1} es H o un grupo amino primario, amino secundario, amino terciario, amonio cuaternario, imidazol, guanidino o amidino; y
D_{2} es un grupo amino secundario, amino terciario, amonio cuaternario, imidazol, guanidino o amidino; o
B_{2}-D_{2} es -CHCOOH-(CH_{2})_{3-4}-NH_{2};
p es 0 ó 1; y
Z es un grupo funcional capaz de reaccionar con una matriz sólida;
o un conjugado del ligando de afinidad y una matriz conjugada al ligando mediante el grupo Z;
para la eliminación, separación, aislamiento, purificación, caracterización, identificación o cuantificación de una endotoxina.
2. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1, en el que la endotoxina se origina de una bacteria gram-negativa.
3. Uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para la eliminación de una endotoxina a partir de agua o una disolución acuosa, fluido corporal, sangre, plasma, disolución de productos farmacéuticos, proteína u otro compuesto de origen biológico.
4. Uso según la reivindicación 3, que comprende usar el conjugado para la eliminación extracorpórea de endotoxina procedente de sangre completa o plasma, antes de la reinfusión en el donante u otro receptor.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se aplica una disolución o líquido que contiene endotoxina al conjugado, a un pH de 1,0 a 13,0.
6. Uso de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores , en el que Z es
(II)-T-[L-V]_{m}-
en la que T es O, S o N-R_{2}, y R_{2} es H o alquilo C_{1-6};
V es O, S, -COO-, CONH, NHCO, -PO_{3}H, NH-arilen-SO_{2}-CH_{2}-CH_{2}- o N-R_{3}, y R_{3} es H o alquilo C_{1-6};
L es un enlace hidrocarbonado opcionalmente sustituido, que contiene de 2 a 20 átomos de carbono; y
m es 0 ó 1.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que R_{2} y R_{3} son cada uno H.
8. Uso según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que T es O o NH.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que T es NH.
\newpage
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que m es 1 y L es un grupo divalente butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo o dodecilo.
11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que m es 1 y V es O, -CONH-, -NHCO- o N-R_{3}.
12. Uso según la reivindicación 10, en el que V es O o NH.
13. Uso según la reivindicación 12, en el que V es NH.
14. Uso según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que Z-M (siendo M la matriz) es -NH-(CH_{2})_{4-10}-NH-M.
15. Uso de un ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que Z es F, Cl, Br o I.
16. Uso de un ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que Z es -NH-(CH_{2})_{2-20}-NH_{2}.
17. Uso de un ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que Z es -NH-(CH_{2})_{2-20}-(CO)_{0-1}-OH.
18. Uso de un ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que Z es
-T-[L-V]_{m}-R_{10}-CR_{11}=CH_{2}
en la que T, L, V y m son como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13;
R_{10} es CO, CH_{2}, -NH-CH_{2}- o -S-CH_{2}-; y
R_{11} es H o alquilo C_{1-6}.
19. Uso según la reivindicación 15, en el que Z es Cl, y cada uno de X es N.
20. Uso según la reivindicación 15, en el que cada uno de X es N.
21. Uso de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que cada uno de X es N.
22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que A_{1} y A_{2} son cada uno independientemente N-R_{1}, en el que R_{1} es como se define en la reivindicación 1.
23. Uso según la reivindicación 22, en el que A_{1} y A_{2} son cada uno NH.
24. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que B_{1} y B_{2} son cada uno independientemente -CHCOOH-(CH_{2})_{1-4}- o un grupo divalente etilo, propilo, 2-hidroxipropilo, butilo, pentilo, hexilo, fenilo, naftilo o ciclohexilo.
25. Uso según la reivindicación 24, en el que B_{1} y B_{2} son cada uno independientemente -CHCOOH-(CH_{2})_{3-4}- o un grupo divalente butilo, pentilo o fenilo.
26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que D_{1} es H, amino, imidazolilo, guanidino, aminidino, trimetilamonio, trietilamonio, dimetilamino, dietilamino, metilamino o etilamino.
27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que D_{2} es imidazolilo, guanidino, aminidino, trimetilamonio, trietilamonio, dimetilamino, dietilamino, metilamino o etilamino.
28. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que p es 1.
29. Uso según la reivindicación 28, en el que B_{1} y B_{2} son cada uno independientemente -CHCOOH-(CH_{2})_{3-4}-.
30. Conjugado según la reivindicación 1, en el que p es 1.
31. Conjugado según la reivindicación 30, en el que B_{1} y B_{2} son cada uno independientemente -CHCOOH-(CH_{2})
\hbox{ _{3-4} -.}
32. Conjugado que tiene cualquiera de las fórmulas XXX a XXXX
21
22 
\vskip1.000000\baselineskip
220 
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\vskip1.000000\baselineskip
33. Ligando según se define en la reivindicación 1, en el que p es 1.
34. Ligando según la reivindicación 33, en el que B_{1} y B_{2} son cada uno independientemente -CHCOOH-(CH_{2})_{3-4}-.
35. Ligando que tiene cualquiera de las fórmulas XVI a XXVI
24
250
25
ES00927543T 1999-05-10 2000-05-09 Nuevos agentes de destoxificacion a base de triazina y su uso. Expired - Lifetime ES2214272T3 (es)

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GB9910807 1999-05-10
GBGB9910807.8A GB9910807D0 (en) 1999-05-10 1999-05-10 Novel detoxification agents and their use

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