JPS5936102A - シアル酸又はシアル酸含有物質の分離・精製法 - Google Patents
シアル酸又はシアル酸含有物質の分離・精製法Info
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- JPS5936102A JPS5936102A JP57145563A JP14556382A JPS5936102A JP S5936102 A JPS5936102 A JP S5936102A JP 57145563 A JP57145563 A JP 57145563A JP 14556382 A JP14556382 A JP 14556382A JP S5936102 A JPS5936102 A JP S5936102A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、特異的吸着体及びそれを用いるシアル酸又は
シアル酸含有物質の分離・精製法に関する。
シアル酸含有物質の分離・精製法に関する。
動物のホルモン及び神経伝達物質と考えられている
次式（■）：
で示されるセロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン喜
以下［５−ＨＴＪという。）は牛脳ガングリオシド類の
ミセル構造、ガングリオシド類を含むりぎシーム、フェ
ツイン特のシアル酸含有物質と結合することが知られて
いる（Ｊ。
以下［５−ＨＴＪという。）は牛脳ガングリオシド類の
ミセル構造、ガングリオシド類を含むりぎシーム、フェ
ツイン特のシアル酸含有物質と結合することが知られて
いる（Ｊ。
Ｎｅｕｒｏｃｈｅ・ｍ・、、２６．１１９３（１９７６
））。また、５−ＨＴとサル脳ガングリオシド類との間
に、特異的な相互作用があることも知られている。
））。また、５−ＨＴとサル脳ガングリオシド類との間
に、特異的な相互作用があることも知られている。
従来、シアル階含有タンパク質のアフィニティークロマ
トグラフィーによる精製には、高価なアメリカ産カブト
ガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈ−ｅｍｕｓ ）の
レクチン又は小麦胚芽凝集素（以下「ＷＧＡ」という。
トグラフィーによる精製には、高価なアメリカ産カブト
ガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈ−ｅｍｕｓ ）の
レクチン又は小麦胚芽凝集素（以下「ＷＧＡ」という。
）等を用いねばならず、その利用範囲が非常に制限され
ている。特に、ＷＧＡはＮ−アセチルグルコサミンとも
結合するという欠点もある。また、最近、インド産カブ
トガニ（Ｃａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓ ｒｏｔｕ
ｎｄａｃａｕｄａ ） のレクチンを不溶化してシア
ル酸含有物質を吸着させている報告（Ａｎａ Ｉ 、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、。
ている。特に、ＷＧＡはＮ−アセチルグルコサミンとも
結合するという欠点もある。また、最近、インド産カブ
トガニ（Ｃａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓ ｒｏｔｕ
ｎｄａｃａｕｄａ ） のレクチンを不溶化してシア
ル酸含有物質を吸着させている報告（Ａｎａ Ｉ 、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、。
１１５．１３０（１９８１））もあるが、他のレクチン
と同様の問題点を有している。これらの問題点を解決す
るために、５−ＨＴを固定化してシアル酸含有物質を特
異的に吸着し、精製する方法Ｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄ、Ｒ
ｅｓ、、１０３（２） 、２１３ （１９８２）〕が開
発されたが、セロトニンは動物ホルモンとしての活性を
有するが、不安定で酸化され易い。従って、クレアチン
酸との複合体としてでなければ直ちに分解してしまい、
遊離の状態では入手困難であり、クレアチン酸を除失し
てから使用されているが、不安定なため調製が難しく、
工業的には不適である。
と同様の問題点を有している。これらの問題点を解決す
るために、５−ＨＴを固定化してシアル酸含有物質を特
異的に吸着し、精製する方法Ｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄ、Ｒ
ｅｓ、、１０３（２） 、２１３ （１９８２）〕が開
発されたが、セロトニンは動物ホルモンとしての活性を
有するが、不安定で酸化され易い。従って、クレアチン
酸との複合体としてでなければ直ちに分解してしまい、
遊離の状態では入手困難であり、クレアチン酸を除失し
てから使用されているが、不安定なため調製が難しく、
工業的には不適である。
本発明者らは、前述の問題点を解消するため鋭意研究を
重ねた結果、 次式（■）： で示される５−ヒドロキシインドール酢酸又は次式（■
）： で示される５−ヒドロキシトリプトファンが固定化され
た不溶性高分子を得ることに成功し、更に、これらを吸
着体として用いることにより、前述の問題点を解消でき
ることを見出し、本発明を完成するに至った。
重ねた結果、 次式（■）： で示される５−ヒドロキシインドール酢酸又は次式（■
）： で示される５−ヒドロキシトリプトファンが固定化され
た不溶性高分子を得ることに成功し、更に、これらを吸
着体として用いることにより、前述の問題点を解消でき
ることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ水素原子又はア
シル基を表わし＋Ｒ４は水酸基、アシルオキシ基、アミ
ノ基又はアシルアミノ基を表わす。） で示される５−ヒドロキシインドール誘導体残基を有す
ることを特徴とする不溶性高分子、並びにそれを用いる
ことを特徴とするシアル酸又はシアル酸含有物質の分離
・精製法である。
シル基を表わし＋Ｒ４は水酸基、アシルオキシ基、アミ
ノ基又はアシルアミノ基を表わす。） で示される５−ヒドロキシインドール誘導体残基を有す
ることを特徴とする不溶性高分子、並びにそれを用いる
ことを特徴とするシアル酸又はシアル酸含有物質の分離
・精製法である。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明に用いる５−ヒドロキシインドール酢酸及び５−
ヒドロキシトリプトファンは、５−）ＩＴと同様に５−
ヒドロキシインドール骨格を有するが、５−ＨＴに比し
著しく安定であり、遊離体が容易、かつ、安価に人手し
得るという長所を有する。更に、５−ヒドロキシトリプ
トファンは、担体と結合し得る官能基として、カルボキ
シル基と７ミノ基とを有するので、アミノ基又はヒドラ
ジノ基を有する担体とも、ホルミル基又はカルボキシル
基を有する担体とも結合させることができ、適用範囲が
広いという長所をも有する。また、両者のＮ−アセチル
ノイラミン酸（以下「ＮＡＮＡＪという。）との親和力
を紫外線吸収法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、劫、６２８（
１９４６））により測定したところ、５−ＨＴとＮＡＮ
Ａとの親和定数（Ｋａ）が４．２Ｘ１０ Ｍ−であるの
に対し、５−とドロキシインドール酢酸では１．９Ｘ１
０’Ｍ−１，５−ヒドロキシトリプトファンでは１．５
Ｘ１０ Ｍ であった。
ヒドロキシトリプトファンは、５−）ＩＴと同様に５−
ヒドロキシインドール骨格を有するが、５−ＨＴに比し
著しく安定であり、遊離体が容易、かつ、安価に人手し
得るという長所を有する。更に、５−ヒドロキシトリプ
トファンは、担体と結合し得る官能基として、カルボキ
シル基と７ミノ基とを有するので、アミノ基又はヒドラ
ジノ基を有する担体とも、ホルミル基又はカルボキシル
基を有する担体とも結合させることができ、適用範囲が
広いという長所をも有する。また、両者のＮ−アセチル
ノイラミン酸（以下「ＮＡＮＡＪという。）との親和力
を紫外線吸収法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、劫、６２８（
１９４６））により測定したところ、５−ＨＴとＮＡＮ
Ａとの親和定数（Ｋａ）が４．２Ｘ１０ Ｍ−であるの
に対し、５−とドロキシインドール酢酸では１．９Ｘ１
０’Ｍ−１，５−ヒドロキシトリプトファンでは１．５
Ｘ１０ Ｍ であった。
本発明の５−ヒドロキシインドール誘導体が固定化され
た不溶性高分子（以下［固定化５−ＨＩＪという。）の
うち、前記式（ＩＶ）又はＭで示される５−ヒドロキシ
インドール誘導体残基（以−上ｌ−５−）（Ｉ残基」と
いう。）を有するものは以下のようにして得ることがで
きる。
た不溶性高分子（以下［固定化５−ＨＩＪという。）の
うち、前記式（ＩＶ）又はＭで示される５−ヒドロキシ
インドール誘導体残基（以−上ｌ−５−）（Ｉ残基」と
いう。）を有するものは以下のようにして得ることがで
きる。
即チ、アカロース、セルロース、キチン、マンナン、ポ
リアクリルアミド系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂
等の水酸基を有する不溶性高分子を、既知の方法（有機
合成化学、第３８巻、１２８〜１３８頁（１９８０年）
〕に従い、エピクロルヒドリン、エビブロムヒドリン等
のエビハロヒドリン蓼又は、エチレングリコールジグリ
シジルエーテル、１．３−プロパンジオールジグリシジ
ルエーテル、１．４−ブタンジオールジグリシジルエー
テル、１．５−ベンタンジオールジグリシジルエーテル
、１，６−ヘキサンシオールジグリシジルエーテル等の
ビスオキシラン化合物；で処理することにより得られる
エポキシ活性化不溶性高、分子を濃アンモニア水で処理
してアミノ化するか、又は、特願昭５７−１２２８３５
号記載の方法に従い、ヒドラジン水化物、ヒドラジン水
化物塩、ヒドラジン硫酸塩等のヒドラジン類；又はシュ
ウ酸ジヒドラジド、マロン酸ジヒドラジド、コハク酸ジ
ヒドラジド、グルタル酸ジヒドラジド、アジピン酸ジヒ
ドラジド、ピメリン酸ジヒドラジド、スペリン醜ジヒド
ラジド、アゼライン酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒド
ラジド等の炭素数２〜１２の直鎖状飽和ジカルボン酸ジ
ヒドラジド寥マレイン酸ジヒドラジド、７マル酸ジヒド
ラジド等の不飽和ジカルボン酸ジヒドラジド蓼及び７タ
ル酸ジヒドラジド、テレフタル酸ジヒドラジド等の芳香
族ジカルボン酸ジモドラジド等のジヒドラジド化合物で
処理することによりヒドラジノ化する。この時、エポキ
シ化の時間又はジヒドラジド化合物の種類等を適宜選択
することによって、基剤とリガンドとを結びつける腕（
スペーサー）の長さを調節することができる。とのよう
にして得たアミノ化担体又はヒドラジノ化担体に、カル
ボジイミド化合物の存在下において、５−ヒドロキシイ
ンドール酢酸又は５−ヒドロキシトリプトファンを、−
３〜８、好ましくは、−１４〜６の条件下で、室温で５
０〜５００時間、好ましくは、１００〜３００時間反応
させることにより目的とする固定化５−）（Ｉを得るこ
とができる。溶媒としては、一般には、水が用いられて
、必要に応じて、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩
を、好ましくは、０．１〜２モル濃度、更に好ましくは
、０．３〜１モル濃度にあるように添加してもよい。カ
ルボジイミド化合物としては、１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（以
下「ＥＤＣＪという。）、１−シクロヘキシル−３−（
２−モルホリノエチル）カルボジイミド・メソ−ｐ−）
ルエンスルホン酸塩、ジシクロへキシルカルボジイミド
等が単独で又は二種以上の混合物として用いられる。こ
のようにして得た固定化５−ＨＩは、未反応の（５−ヒ
ドロキシインドール誘導体が固定化されていない）アミ
ン基又はヒドラジ７基を無水酢酸等でアシル化して不活
性化することが好ましい。
リアクリルアミド系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂
等の水酸基を有する不溶性高分子を、既知の方法（有機
合成化学、第３８巻、１２８〜１３８頁（１９８０年）
〕に従い、エピクロルヒドリン、エビブロムヒドリン等
のエビハロヒドリン蓼又は、エチレングリコールジグリ
シジルエーテル、１．３−プロパンジオールジグリシジ
ルエーテル、１．４−ブタンジオールジグリシジルエー
テル、１．５−ベンタンジオールジグリシジルエーテル
、１，６−ヘキサンシオールジグリシジルエーテル等の
ビスオキシラン化合物；で処理することにより得られる
エポキシ活性化不溶性高、分子を濃アンモニア水で処理
してアミノ化するか、又は、特願昭５７−１２２８３５
号記載の方法に従い、ヒドラジン水化物、ヒドラジン水
化物塩、ヒドラジン硫酸塩等のヒドラジン類；又はシュ
ウ酸ジヒドラジド、マロン酸ジヒドラジド、コハク酸ジ
ヒドラジド、グルタル酸ジヒドラジド、アジピン酸ジヒ
ドラジド、ピメリン酸ジヒドラジド、スペリン醜ジヒド
ラジド、アゼライン酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒド
ラジド等の炭素数２〜１２の直鎖状飽和ジカルボン酸ジ
ヒドラジド寥マレイン酸ジヒドラジド、７マル酸ジヒド
ラジド等の不飽和ジカルボン酸ジヒドラジド蓼及び７タ
ル酸ジヒドラジド、テレフタル酸ジヒドラジド等の芳香
族ジカルボン酸ジモドラジド等のジヒドラジド化合物で
処理することによりヒドラジノ化する。この時、エポキ
シ化の時間又はジヒドラジド化合物の種類等を適宜選択
することによって、基剤とリガンドとを結びつける腕（
スペーサー）の長さを調節することができる。とのよう
にして得たアミノ化担体又はヒドラジノ化担体に、カル
ボジイミド化合物の存在下において、５−ヒドロキシイ
ンドール酢酸又は５−ヒドロキシトリプトファンを、−
３〜８、好ましくは、−１４〜６の条件下で、室温で５
０〜５００時間、好ましくは、１００〜３００時間反応
させることにより目的とする固定化５−）（Ｉを得るこ
とができる。溶媒としては、一般には、水が用いられて
、必要に応じて、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩
を、好ましくは、０．１〜２モル濃度、更に好ましくは
、０．３〜１モル濃度にあるように添加してもよい。カ
ルボジイミド化合物としては、１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（以
下「ＥＤＣＪという。）、１−シクロヘキシル−３−（
２−モルホリノエチル）カルボジイミド・メソ−ｐ−）
ルエンスルホン酸塩、ジシクロへキシルカルボジイミド
等が単独で又は二種以上の混合物として用いられる。こ
のようにして得た固定化５−ＨＩは、未反応の（５−ヒ
ドロキシインドール誘導体が固定化されていない）アミ
ン基又はヒドラジ７基を無水酢酸等でアシル化して不活
性化することが好ましい。
また、前記（ＶＩ）又は（■）で示される５−ＨＩ残基
を有する不溶性高分子は以下のようにして得ることがで
きる。
を有する不溶性高分子は以下のようにして得ることがで
きる。
即ち、前述のアミノ化担体又はヒドラジノ化担体を、無
水コハク酸で処理し、スクシニル化担体とした後、前記
カルボジイミド化合物の存在下において、５−ヒドロキ
シトリプトファンと反応させることにより目的とする固
定化５−ＨＩを得ることができる。また、アミノ化担体
又はヒドラジノ化担体を、水素化シアノホウ素ナトリウ
ムの存在下において、グリオキサール、プロパンジアー
ル、ブタンジアール、グルタルアルデヒド（ペンタンジ
アール）、デカンジアール等のジアルデヒド化合物で処
理して、ホルミル化担体とした後、水素化シアノホウ素
ナトリウムの存在下において、５−とドロ、キシトリプ
トファンと反応させても、目的とする固定化５−ＨＩを
得ることができる。
水コハク酸で処理し、スクシニル化担体とした後、前記
カルボジイミド化合物の存在下において、５−ヒドロキ
シトリプトファンと反応させることにより目的とする固
定化５−ＨＩを得ることができる。また、アミノ化担体
又はヒドラジノ化担体を、水素化シアノホウ素ナトリウ
ムの存在下において、グリオキサール、プロパンジアー
ル、ブタンジアール、グルタルアルデヒド（ペンタンジ
アール）、デカンジアール等のジアルデヒド化合物で処
理して、ホルミル化担体とした後、水素化シアノホウ素
ナトリウムの存在下において、５−とドロ、キシトリプ
トファンと反応させても、目的とする固定化５−ＨＩを
得ることができる。
以上のようにして得られた固定化５− ＨＩは、洗浄後
、適当に緩衝化することにより、チログロブリン、ゴナ
ドトロピン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、下垂体黄体
化ホルモン（１） Ｌ Ｉ−１）、エリスロボエチン（
ＥＰＯ）等のシアロクルコホルモン、及びセルロプラス
ミン、フェツイン、フィブリノーゲン、α１−グリフプ
ロティン、ハプトグロブリン、α２−マクログロブリン
、トランスフェリン、オロソムフイド等の血中タンパク
質の分離・精製冨これらの化合物をプロテアーゼ等を用
いてシアル酸を含む糖鎖が外れないように分解して生ず
る各種シアーロペプチドとシアル酸を含まないペプチド
との分離寥シアロペブチド間におけるシアル酔含有喰の
差による相互分Ｎ６ ＋コロミン酸、シアリルラクトー
ス等のシアル酸含有多糖、オリゴ糖及びシアル酸そのも
のの分離・精製Ｉ細胞中のシアル酸を含む細胞器官及び
細胞断片の分離・精製；細胞表面におけるシアル酸含有
喰の差による血球及び培養細胞等の分離・精製を等に広
く利用できる。
、適当に緩衝化することにより、チログロブリン、ゴナ
ドトロピン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、下垂体黄体
化ホルモン（１） Ｌ Ｉ−１）、エリスロボエチン（
ＥＰＯ）等のシアロクルコホルモン、及びセルロプラス
ミン、フェツイン、フィブリノーゲン、α１−グリフプ
ロティン、ハプトグロブリン、α２−マクログロブリン
、トランスフェリン、オロソムフイド等の血中タンパク
質の分離・精製冨これらの化合物をプロテアーゼ等を用
いてシアル酸を含む糖鎖が外れないように分解して生ず
る各種シアーロペプチドとシアル酸を含まないペプチド
との分離寥シアロペブチド間におけるシアル酔含有喰の
差による相互分Ｎ６ ＋コロミン酸、シアリルラクトー
ス等のシアル酸含有多糖、オリゴ糖及びシアル酸そのも
のの分離・精製Ｉ細胞中のシアル酸を含む細胞器官及び
細胞断片の分離・精製；細胞表面におけるシアル酸含有
喰の差による血球及び培養細胞等の分離・精製を等に広
く利用できる。
固定化５− ＨＩに吸着したシアル酸又はシアル酸含有
物質を溶離するには、一般には、１μＭ〜４Ｍの濃度範
囲のサリチル酸、サリチル酢塩、（Ｎ Ｉ（＋ ） ２
ＣＯ３、ＮＨ４１１ＣＯ３を含有する水溶液又緩衝液が
用いられる。
物質を溶離するには、一般には、１μＭ〜４Ｍの濃度範
囲のサリチル酸、サリチル酢塩、（Ｎ Ｉ（＋ ） ２
ＣＯ３、ＮＨ４１１ＣＯ３を含有する水溶液又緩衝液が
用いられる。
本発明によれば、容易、かつ、安価に高いリガンド濃度
を有する固定化５−ＨＩを得ることができ、更に、これ
を用いることにより、シアル酸又はシアル酸含有物質を
効率よく分離・精製することができる。
を有する固定化５−ＨＩを得ることができ、更に、これ
を用いることにより、シアル酸又はシアル酸含有物質を
効率よく分離・精製することができる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は、本発明の範囲を何隻制限するものでは
ない。
れらの実施例は、本発明の範囲を何隻制限するものでは
ない。
実施例１
アガロースとしてファルマシア社製のセファロースＣＬ
６Ｂを用いた。グラスフィルター上で水でよく洗浄後、
吸引濾過したアガロース３０りをフラスコに入れ、水４
５ｄ、２ＭＮａＯＨ水溶液１９．５−及びエピクロルヒ
ドリン４．５−を順次加えた。懸濁液を４Ｏｒのインキ
ュベーター中で３時間振盪後、グラスフィルター上で水
で充分に洗浄してエポキシ活性化アガロースを得た。こ
のエポキシ活性化アガロースに導入されたエポキシ基の
量をＮ ａ ２ Ｓ ２０３を用いる中和滴定法により
測定したところ、層重１１１１ｊ’当たり、６７．２μ
ｍｏｌｅのエポキシ基が導入されていた。
６Ｂを用いた。グラスフィルター上で水でよく洗浄後、
吸引濾過したアガロース３０りをフラスコに入れ、水４
５ｄ、２ＭＮａＯＨ水溶液１９．５−及びエピクロルヒ
ドリン４．５−を順次加えた。懸濁液を４Ｏｒのインキ
ュベーター中で３時間振盪後、グラスフィルター上で水
で充分に洗浄してエポキシ活性化アガロースを得た。こ
のエポキシ活性化アガロースに導入されたエポキシ基の
量をＮ ａ ２ Ｓ ２０３を用いる中和滴定法により
測定したところ、層重１１１１ｊ’当たり、６７．２μ
ｍｏｌｅのエポキシ基が導入されていた。
このエポキシ活性化アガロースに８０％ヒドラジン水化
物水溶液３０Ｌ／を加え、４０Ｃのインキュベーター中
で２時間振盪した。反応後、グラスフィルター上で水で
充分に洗浄してヒドラジノ化アガロースを得た。
物水溶液３０Ｌ／を加え、４０Ｃのインキュベーター中
で２時間振盪した。反応後、グラスフィルター上で水で
充分に洗浄してヒドラジノ化アガロースを得た。
（１）で得たヒドラジノ化アガロース９ｙを０．５ＭＮ
ａＣ１水溶液ｉｓｙに懸濁した後、５−ヒドロキシイン
ドール酢酸１００■とＥＤＣｏ、３Ｆを加え、…を５に
調整し、室温で１４０時間反応させた。次いで、水で充
分に洗浄した後、無水酢酸を加えて、ＯＣで３０分間、
更に室温で３０分間処理して、未反応の（５−ヒドロキ
シインドール酢酸が固定化されていない）ヒドラジ７基
をアセチル化した。反応後、充分に洗浄して目的とする
固定化５−ヒドロキシインドール酢酸を得た。この固定
化５−ヒドロキシインドール酢酸に固定化された５−ヒ
ドロキシインドール酢酸の級を紫外部吸収測定法により
測定したところ、層重１１ｙ当たり５１．６μｍｏｌｅ
の５−ヒドロキシインドール酢酸が固定化されているこ
とが判明した。
ａＣ１水溶液ｉｓｙに懸濁した後、５−ヒドロキシイン
ドール酢酸１００■とＥＤＣｏ、３Ｆを加え、…を５に
調整し、室温で１４０時間反応させた。次いで、水で充
分に洗浄した後、無水酢酸を加えて、ＯＣで３０分間、
更に室温で３０分間処理して、未反応の（５−ヒドロキ
シインドール酢酸が固定化されていない）ヒドラジ７基
をアセチル化した。反応後、充分に洗浄して目的とする
固定化５−ヒドロキシインドール酢酸を得た。この固定
化５−ヒドロキシインドール酢酸に固定化された５−ヒ
ドロキシインドール酢酸の級を紫外部吸収測定法により
測定したところ、層重１１ｙ当たり５１．６μｍｏｌｅ
の５−ヒドロキシインドール酢酸が固定化されているこ
とが判明した。
（２）で得た吸着体ＩＰ（湿重量）をミニカラム（９″
′ｇφＸ１０％）（生化学工業■製、セパコールミニカ
ラム（商品名）〕に充填し、水洗後、１ ｔｔ ｍｏｌ
ｅＳＯＮＡＮ Ａ水溶液（ｐＨ３，６）を過剰量を流し
た後、水洗し、次いで１０ ｍＭ （ＮＨ４）２ＣＯ３
水溶液（＋）Ｈ９，１）で溶出した。溶出液中のＮＡＮ
Ａをレゾルシン法により測定したところ、湿重量ＩＰ当
たり４３．４μｍｏｌｅのＮＡＮＡが吸着されていたこ
とが判明した。
′ｇφＸ１０％）（生化学工業■製、セパコールミニカ
ラム（商品名）〕に充填し、水洗後、１ ｔｔ ｍｏｌ
ｅＳＯＮＡＮ Ａ水溶液（ｐＨ３，６）を過剰量を流し
た後、水洗し、次いで１０ ｍＭ （ＮＨ４）２ＣＯ３
水溶液（＋）Ｈ９，１）で溶出した。溶出液中のＮＡＮ
Ａをレゾルシン法により測定したところ、湿重量ＩＰ当
たり４３．４μｍｏｌｅのＮＡＮＡが吸着されていたこ
とが判明した。
実施例２
シアログリコペブチドの分離・精製
実施例１（２）で得た吸着体１ｙ（湿重量）を実施例１
（３）と同様のミニカラムに充填し、水洗後、ブタ甲状
腺のチログロブリンをプロテアーゼで分解して得たグリ
コペプチド混合物２．５ ｗＵｉの水溶液を流した後、
水洗し、素通り画分として、シアル酸の検出されないグ
リコペプチド（マンノースに換算して約２６０μりの糖
を含む）を得た。次いで、１０ｍＭＮＨ４ＨＣＯ３水溶
液で溶出したところ、初めにシアル酸含有暇の少ないシ
アログリコペプチド（マンノースに換算して３７０μｍ
の糖及びシアル酸１００μ７ を含む）が得られ、次い
でシアル酸含有級の多いシアログリコベプチド（マンノ
ースに換算して４９０μ）の糖及びシアル酸１５０μノ
を含む）が得られた。
（３）と同様のミニカラムに充填し、水洗後、ブタ甲状
腺のチログロブリンをプロテアーゼで分解して得たグリ
コペプチド混合物２．５ ｗＵｉの水溶液を流した後、
水洗し、素通り画分として、シアル酸の検出されないグ
リコペプチド（マンノースに換算して約２６０μりの糖
を含む）を得た。次いで、１０ｍＭＮＨ４ＨＣＯ３水溶
液で溶出したところ、初めにシアル酸含有暇の少ないシ
アログリコペプチド（マンノースに換算して３７０μｍ
の糖及びシアル酸１００μ７ を含む）が得られ、次い
でシアル酸含有級の多いシアログリコベプチド（マンノ
ースに換算して４９０μ）の糖及びシアル酸１５０μノ
を含む）が得られた。
実施例３
ビニル系クロマト基剤［Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ
６５（商品名））１０ｙを水１５＋１！４！に懸濁した
後、２ＭＮａＯＨ水溶液６．５ ｍｌ及びエピクロルヒ
ドリン２、３ ｍｌを順次加えた。懸濁液を４０Ｃのイ
ンキュベーター中で３時間振盪後、グラスフィルター上
で水で充分に洗浄してエポキシ活性化基剤を得た。これ
に、アジピン酸ジヒドラジド１．２Ｆ Ｉ Ｏ，Ｉ Ｍ
Ｎａ２ＣＯ３水溶液８ｍｌに懸濁しタモノを加え、４
０Ｃで一夜反応させた。途中、…を９に調整した。反応
後、グラスフィルター上で水で充分に洗浄してヒドラジ
ノ化基剤を得た。
６５（商品名））１０ｙを水１５＋１！４！に懸濁した
後、２ＭＮａＯＨ水溶液６．５ ｍｌ及びエピクロルヒ
ドリン２、３ ｍｌを順次加えた。懸濁液を４０Ｃのイ
ンキュベーター中で３時間振盪後、グラスフィルター上
で水で充分に洗浄してエポキシ活性化基剤を得た。これ
に、アジピン酸ジヒドラジド１．２Ｆ Ｉ Ｏ，Ｉ Ｍ
Ｎａ２ＣＯ３水溶液８ｍｌに懸濁しタモノを加え、４
０Ｃで一夜反応させた。途中、…を９に調整した。反応
後、グラスフィルター上で水で充分に洗浄してヒドラジ
ノ化基剤を得た。
（１）で得たヒドラジノ化基剤を０．５ Ｍ ＮａＣ１
水溶液に懸濁した後、５−ヒドロキシインドール酢酸３
００■とＥＤＣ１１！を加え、…を５に調整し、室温で
３００時間反応させた。次いで、水で充分に洗浄した後
、無水酢酸を加えて、ＯＣで３０分間、更に室温で３０
分間処理して、未反応のヒドラジノ基をアセチル化した
。反応後、充分に洗浄して目的とする固定化５′−ヒド
ロキシインドール酢酸を得た。
水溶液に懸濁した後、５−ヒドロキシインドール酢酸３
００■とＥＤＣ１１！を加え、…を５に調整し、室温で
３００時間反応させた。次いで、水で充分に洗浄した後
、無水酢酸を加えて、ＯＣで３０分間、更に室温で３０
分間処理して、未反応のヒドラジノ基をアセチル化した
。反応後、充分に洗浄して目的とする固定化５′−ヒド
ロキシインドール酢酸を得た。
（２）で得たビニル系吸着体１０ｙ（湿重量）をカラム
（１３へφ×８０％）〔生化学工業■製、プラクティ・
カラム（商品名）〕に充填し、７エライン及びノイラミ
ニダーゼ（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来を生化学工
業側部）処理したフェツインの混合物１０■の水溶液を
流した後、水洗し、素通り画分として、約半吸のタンパ
ク質を得た。
（１３へφ×８０％）〔生化学工業■製、プラクティ・
カラム（商品名）〕に充填し、７エライン及びノイラミ
ニダーゼ（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来を生化学工
業側部）処理したフェツインの混合物１０■の水溶液を
流した後、水洗し、素通り画分として、約半吸のタンパ
ク質を得た。
このタンパク質はアシアロ７エツインであることが、シ
アル酸の測定結果から判明した。次いで、ｔ ｏ ｍＭ
ＮＨ，ＨＣＯ３水溶液で溶出して、更に、約半歌の７エ
ツインを得た。
アル酸の測定結果から判明した。次いで、ｔ ｏ ｍＭ
ＮＨ，ＨＣＯ３水溶液で溶出して、更に、約半歌の７エ
ツインを得た。
実施例４
（１） 固定化５−ヒドロキシトリプトファンの調製
−一一−１−一一一、−ｍ−− 顆粒状セルロース系ゲル濾過剤〔セルロファインＧＣ７
００（商品名）〕のヒドラジノ化体１２りを０．５ Ｍ
ＮａＣ１水溶液１８ｍに懸濁した後、無水コハク酸０
．９６ｊ’を加え、…を４に調整し、室温で２時間振盪
攪拌した。水洗後、ｏ、１ＭＮａＯＨ水溶液１８ｔｎｌ
を加え、室温で３０分間放置して、スクシニル化担体を
得た。このスクシニル化担体５ｙ（層重１りに、５−ヒ
ドロキシ） ！Ｊ ７’ ） ７７ンｌＱＱｍｐを水１
３−に溶解した４０を加えた後、ＮａＣ１Ｏ，３８Ｆト
ＥＤＣ０，１７ｙを加えてよく攪拌し、…を５に調整し
て室温で２００時間反応させた後、充分に洗浄して目的
とする固定化５−ヒドロキシトリプトファンを得た。
−一一−１−一一一、−ｍ−− 顆粒状セルロース系ゲル濾過剤〔セルロファインＧＣ７
００（商品名）〕のヒドラジノ化体１２りを０．５ Ｍ
ＮａＣ１水溶液１８ｍに懸濁した後、無水コハク酸０
．９６ｊ’を加え、…を４に調整し、室温で２時間振盪
攪拌した。水洗後、ｏ、１ＭＮａＯＨ水溶液１８ｔｎｌ
を加え、室温で３０分間放置して、スクシニル化担体を
得た。このスクシニル化担体５ｙ（層重１りに、５−ヒ
ドロキシ） ！Ｊ ７’ ） ７７ンｌＱＱｍｐを水１
３−に溶解した４０を加えた後、ＮａＣ１Ｏ，３８Ｆト
ＥＤＣ０，１７ｙを加えてよく攪拌し、…を５に調整し
て室温で２００時間反応させた後、充分に洗浄して目的
とする固定化５−ヒドロキシトリプトファンを得た。
（２）細胞分化因子の分離・精製
（１）で得た固定化５−ヒドロキシトリプトファン５Ｆ
（層重軟）をカラム（１３瓢φＸ４０％）〔生化学工業
■製、プラクティ・カラム（商品名）〕に充填し、細胞
分化因子を含有するヒト尿を透析、ゲル濾過等で尿素、
塩類及び単糖、オリゴ糖、その他の低分子化合物を除失
し、濃縮したもの５＊ｌ（々ンパク質濃度１０ｑ／ｍ／
）を流して、水洗後、１０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ｐＩ（
７）を流して、アルブミン等の夾雑タンパク質の一部を
溶出除去した。次いで、１０〜１００ｍＭサリチル酸ナ
トリウムを含む０．１ Ｍリン酸緩衝液で溶出すること
により、タンパク質当たりの比活性を約５倍上昇させる
ことができた。
（層重軟）をカラム（１３瓢φＸ４０％）〔生化学工業
■製、プラクティ・カラム（商品名）〕に充填し、細胞
分化因子を含有するヒト尿を透析、ゲル濾過等で尿素、
塩類及び単糖、オリゴ糖、その他の低分子化合物を除失
し、濃縮したもの５＊ｌ（々ンパク質濃度１０ｑ／ｍ／
）を流して、水洗後、１０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ｐＩ（
７）を流して、アルブミン等の夾雑タンパク質の一部を
溶出除去した。次いで、１０〜１００ｍＭサリチル酸ナ
トリウムを含む０．１ Ｍリン酸緩衝液で溶出すること
により、タンパク質当たりの比活性を約５倍上昇させる
ことができた。
実施例５
（１） 固定化５−ヒドロキシインドール酢酸（７）
＃ｉｌ顆粒状セルロース系ゲルｐ過剤〔セルロファイン
Ｇ Ｃ１５ｍ （商品名））１０ｙを水１５ｍに懸濁し
た後、２ Ｍ ＮａＯＨ７ｍｌ 及びエピクロルヒドリ
ン２．５−を順次加えた。懸濁液を４０ｃツインキユベ
ーター中で４時間振盪後、グラスフィルター上で水で充
分に洗浄してエポキシ活性化基剤を得た。これに、アジ
ピン酸ジヒドラジド１．２ｙを０．１ Ｍ Ｎ ａ ２
ＣＯ３水溶液ｆ３ｔｔｔｌニ懸濁したものを加え、声
を９に調整し、４０ｃで一夜反応させた。反応後、グラ
スフィルター上で水で充分に洗浄してヒドラジノ化基剤
を得た。
＃ｉｌ顆粒状セルロース系ゲルｐ過剤〔セルロファイン
Ｇ Ｃ１５ｍ （商品名））１０ｙを水１５ｍに懸濁し
た後、２ Ｍ ＮａＯＨ７ｍｌ 及びエピクロルヒドリ
ン２．５−を順次加えた。懸濁液を４０ｃツインキユベ
ーター中で４時間振盪後、グラスフィルター上で水で充
分に洗浄してエポキシ活性化基剤を得た。これに、アジ
ピン酸ジヒドラジド１．２ｙを０．１ Ｍ Ｎ ａ ２
ＣＯ３水溶液ｆ３ｔｔｔｌニ懸濁したものを加え、声
を９に調整し、４０ｃで一夜反応させた。反応後、グラ
スフィルター上で水で充分に洗浄してヒドラジノ化基剤
を得た。
これを０．５ Ｍ ＮａＣ］水溶液に懸濁した後、５−
ヒドロキシインドール酢酸３００〜とＥＤｃｌりを加え
、…を５に調整し、室温で２００時間反応させた。次い
で、水で充分に洗浄した後、無水酢酸を加えて、ＯＣで
３０分間、更に室温で３０分間処理して、未反応のヒド
ラジノ基をアセチル化した。反応後、充分に洗浄して目
的とする固定化５−ヒドロキシインドール酢酸を得た。
ヒドロキシインドール酢酸３００〜とＥＤｃｌりを加え
、…を５に調整し、室温で２００時間反応させた。次い
で、水で充分に洗浄した後、無水酢酸を加えて、ＯＣで
３０分間、更に室温で３０分間処理して、未反応のヒド
ラジノ基をアセチル化した。反応後、充分に洗浄して目
的とする固定化５−ヒドロキシインドール酢酸を得た。
（２） ヒト赤血球の分離・精製
（１）で得た固定化５−ヒドロキシインドール酢酸１り
（層重蔽）を、ノイラミニダーゼ処理したヒト０型赤血
球及び未処理ヒ）０型赤血球の等量混合懸濁液（ＰＢＳ
中計４％含有）２＊ｌに加え、室温に１０分間置く。こ
の間、数回軽く振盪して吸着を促進した。次いで、３３
０〜３５０メツシユ（３０〜３５μｍ）のナイロン又は
ポリエチレンメツシュで濾過し、ＰＨ１で洗浄すると、
血球の一部が濾過され、一部は吸着剤に結合していた。
（層重蔽）を、ノイラミニダーゼ処理したヒト０型赤血
球及び未処理ヒ）０型赤血球の等量混合懸濁液（ＰＢＳ
中計４％含有）２＊ｌに加え、室温に１０分間置く。こ
の間、数回軽く振盪して吸着を促進した。次いで、３３
０〜３５０メツシユ（３０〜３５μｍ）のナイロン又は
ポリエチレンメツシュで濾過し、ＰＨ１で洗浄すると、
血球の一部が濾過され、一部は吸着剤に結合していた。
血球が吸着されている吸着剤（赤色）を１０ｍＭサリチ
ル酸ナトリウムを含む１０Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液（
岨８．５）で洗浄したところ、血球が脱離した。それぞ
れの血球についてビーナツツレクチンによる凝集性を調
べたところ、吸着されない血球は凝集せず、吸着後脱離
した血球は凝集した。以上のことから細胞表面にシアル
酸を有する細胞と有さない細胞と力（本発明の吸着体に
より分離できることが判明した。
ル酸ナトリウムを含む１０Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液（
岨８．５）で洗浄したところ、血球が脱離した。それぞ
れの血球についてビーナツツレクチンによる凝集性を調
べたところ、吸着されない血球は凝集せず、吸着後脱離
した血球は凝集した。以上のことから細胞表面にシアル
酸を有する細胞と有さない細胞と力（本発明の吸着体に
より分離できることが判明した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （式中、Ｒ，Ｒ及び几はそれぞれ水素原子又はアシル基
を表わし、几は水酸基、アシルオキシ基、アミ７基又は
アシルアミノ基を表わす。） で示される５−ヒドロキシインドール誘導体残基を有す
ることを特徴とする不溶性高分子。 ２ 次式： （式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ水素原子又はア
シル基を表わし、 Ｒ４は水酸基、アシルオキシ基、ア
ミノ基又はアシルアミノ基を表わす。） で示される５−ヒドロキシインドール誘導体残基を有す
る不溶性高分子を、吸着体として用いることを特徴とす
るシアル酸又はシアル酸含有物質の分離・精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57145563A JPS5936102A (ja) | 1982-08-24 | 1982-08-24 | シアル酸又はシアル酸含有物質の分離・精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57145563A JPS5936102A (ja) | 1982-08-24 | 1982-08-24 | シアル酸又はシアル酸含有物質の分離・精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5936102A true JPS5936102A (ja) | 1984-02-28 |
| JPH0214924B2 JPH0214924B2 (ja) | 1990-04-10 |
Family
ID=15388025
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57145563A Granted JPS5936102A (ja) | 1982-08-24 | 1982-08-24 | シアル酸又はシアル酸含有物質の分離・精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5936102A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007011055A1 (ja) * | 2005-07-19 | 2007-01-25 | Otsuka Chemical Co., Ltd. | 糖鎖誘導体の製造方法、構造解析方法、及び糖鎖誘導体 |
-
1982
- 1982-08-24 JP JP57145563A patent/JPS5936102A/ja active Granted
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007011055A1 (ja) * | 2005-07-19 | 2007-01-25 | Otsuka Chemical Co., Ltd. | 糖鎖誘導体の製造方法、構造解析方法、及び糖鎖誘導体 |
| AU2006270732B2 (en) * | 2005-07-19 | 2010-06-24 | Glytech, Inc. | Process for producing sugar chain derivative, structure analysis method, and sugar chain derivative |
| AU2010202058B2 (en) * | 2005-07-19 | 2011-10-06 | Glytech, Inc. | Process for producing sugar chain derivative, structure analysis method, and sugar chain derivative |
| AU2010202058C1 (en) * | 2005-07-19 | 2012-07-26 | Glytech, Inc. | Process for producing sugar chain derivative, structure analysis method, and sugar chain derivative |
| JP5011108B2 (ja) * | 2005-07-19 | 2012-08-29 | 大塚化学株式会社 | 糖鎖誘導体の製造方法、構造解析方法、及び糖鎖誘導体 |
| US8318694B2 (en) | 2005-07-19 | 2012-11-27 | Otsuka Chemical Co., Ltd. | Process for producing sugar chain derivative, structure analysis method, and sugar chain derivative |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0214924B2 (ja) | 1990-04-10 |
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