FR2574808A1 - Procede d'enlevement des acides nucleiques et des bases purines de la gelatine - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION A POUR OBJET UN PROCEDE D'ENLEVEMENT DES ACIDES NUCLEIQUES ET DES BASES PURINES DE LA GELATINE PAR LEQUEL : A.ON AJOUTE UN POLYMERE EN PERLES DE CYCLODEXTRINE (GRANULOMETRIE 20 A 600 M, TENEUR EN CYCLODEXTRINE 30 A 70 ET TENEUR EN ALCOOL POLYVINYLIQUE DE 0,3 A 0,5 A LA SOLUTION DE GELATINE EN UN RAPPORT PONDERAL DE 1:1 A 10:1 CALCULE SUR LA QUANTITE DE GELATINE PUIS ON FILTRE LE POLYMERE DE CYCLODEXTRINE OU; B.ON FAIT PASSER LA SOLUTION DE GELATINE A TRAVERS UNE COLONNE D'UN TEL POLYMERE DE SORTE QUE LA QUANTITE DE GELATINE EST DE 5 A 50 DU POIDS DE LA CHARGE DE LA COLONNE; ET ENSUITE ON ELUE LES ACIDES NUCLEIQUES ET LES BASES PURINES DU POLYMERE EN PERLES DE CYCLODEXTRINE.
Description
La présente invention concerne un procédé d'en-
lèvement des acides nucléiques et des bases purines de
la gélatine en utilisant des polymères en perles de cyclo-
dextrine. La gélatine contient de nombreux microcomposants minéraux et organiques soit initialement soit en raison de sa production. Parmi les microcomposants organiques, on peut citer notamment les acides nucléiques et les bases purines qui limitent la croissance des cristaux et le développement de la sensibilité à la lumière dans la
gélatine contenant des émulsions photographiques d'halo-
génures d'argent (T.H James:-The Theory of the Photographic
Process, McMillan New York, 1977). La présence de ces inhi-
biteurs est fréquemment indésirable de sorte que leur élimi-
nation a pris de l'importance depuis fort longtemps déjà.
Pour enlever les acides nucléiques et leurs dérivés on utilisait des résines échangeuses d'ions. On utilisait couramment les résines polystyrène/divinylbenzène
échangeuses de cations (par exemple du type Amberlite).
L'inconvénient de ces résines est qu'elles enlèvent seulement l'adénine et la guanine tandis que
les acides nucléiques restent dans la gélatine (T. Ohno-
H.Irie: J. Soc.Phot. Sci. Techn. Japon, 39 ú9767 146).
Plus récemment, on a utilisé des dérivés de dextrane
d'une structure différente (par exemple du type Sephadex).
Par leur emploi, on peut enlever environ 75% des acides
nucléiques de la gélatine Lf. Masuda -H. Kimura: J. Phot.
Sci. 30, (1982) 1247. Pour éliminer tous les inhibiteurs, il faut envisager la-possibilité de la décomposition par la nucléase des acides nucléiques en leurs constituants et
qu'ensuite les bases purines soient éliminées par les ré-
sines échangeuses de cations. Ce procédé est toutefois oné-
reux. On peut également hydrolyser les acides nucléiques avec du HCl mais, dans ce cas, la gélatine se décompose également de sorte qu'il est impossible d'employer cette technique
dans la production de la gélatine.
La présente invention a pour but d'élaborer un procédé par lequel on peut éliminer en totalité et de façon économique aussi bien les acides nucléiques que
les bases purines sans aucun endommagement de la gélatine.
Selon le procédé de l'invention, on utilise dans ce but
des polymères en perles de cyclodextrine.
Les cyclodextrines sont des oligosaccharides cycliques, non réducteurs, contenant 6, 7 ou 8 motifs de glucopyranose et on peut les préparer par décomposition enzymatique de l'amidon. Dans la pratique, on les utilise principalement en raison de leur aptitude à former des complexes d'inclusion (Szejtli J.: Cyclodextrins and
their Inclusion Complexes, Akadémiai Kiado, Budapest 1982).
Dans des expériences antérieures D-offmann, J. L - Bock, R.M: Biochemistry, 9 (1974) 9097, on a établi par spectroscopie U.V différentielle que, entre autres, les monophosphates d'adénosine, de cytosine, de guanine et d'uridine ne réagissent pas avec l'alphacyclodextrine et seuls les monophosphates d'adénosine et d'inosine réagissent
avec la bêta-cyclodextrine. L'interaction avec les dinu-
cléotides est plus faible et on ne peut constater aucune
interaction entre les polynucléotides et les cyclo-dextrines.
Il est donc surprenant que la cyclodextrine puisse lier les
acides nucléiques et les bases purines à partir des solu-
tions aqueuses diluées à un degré tel que ces substances
puissent être enlevées sélectivement.
L'invention est basée sur la constatation qu'un polymère en perles de cyclodextrine peut agir à la fois comme une substance formant un complexe d'inclusion et comme un adsorbant et qu'en conséquence, il convient pour enlever les bases purines d'une masse de petites molécules et les
macromolécules d'acides nucléiques.
Les polymères en perles de cyclodextrine sont pro-
duits à partir de la cyclodextrine avec un réactif bifonc-
tionnel approprié (par exemple l'épichlorhydrine ou l'éther diépoxypropylique d'éthylène-glycol) en présence d'acétate de polyvinyle par réticulation (brevet hongrois 177.419, 1978). Leur teneur en cyclodextrine peut Varier entre 30 et 70%, de préférence, entre 50 et 60%; leur teneur en alcool polyvinylique peut être comprise entre 0,3 et 0,5%;
leur granulométrie peut être-de 20 à 600 microns, de pré-
férence, de 90 à 300 microns.
Selon le procédé de l'invention, on ajoute un poly-
mère en perles de cyclodextrine ayant une teneur en cyclo-
dextrine de 30 à 70%, une teneur en alcool polyvinylique de 0,3 à 0,5% et une granulométrie de 20 à 600- microns à la solution de gélatine dans un rapport pondérai de 1: 1 à : 1 calculé par rapport au poids de la gélatine, puis
on sépare par filtration le polymère de perles de cyclodex-
trine ou bien on fait passer la solution de gélatine à travers une colonne de polymères de perles de cyclodextrine la quantité de gélatine étant de 5 à 50% par rapport au - poids sec de la charge de la colonne, et ensuite on élue les acides nucléiques et les bases purines du polymère
de perles de cyclodextrine.
Selon le procédé de l'invention, on élimine
le polymère en perles de la solution après que le traite-
ment de la gélatine ait été terminé. Une fois que la solu-
tion de gélatine est exempte des éléments de restriction,
on poursuit son traitement de façon usuelle.
Selon l'invention, on peut utiliser le polymère en perles également comme charge de la colonne et, dans
ce cas, on ne l'ajoute pas à la solution de gélatine.
Dans ce cas, on laisse une solution de gélatine de 5 à % s'écouler à travers la colonne à une température de à 60 C de sorte qu'on traite dans la colonne une quantité de gélatine sèche qui est de 5 à 50%, de préférence, de
à 30% du poids sec de la charge de la colonne.
Par le traitement, aussi bien les acides nucléiques que les bases purines sont enlevés de la gélatine. On peut faire suivre ce procédé d'un examen néphélométrique. Cet examen est basé sur le fait que les plus petits cristaux diffusent la lumière à un degré moindre que les plus gros cristaux de sorte que la suspension dans la gélatine aqueuse de ces derniers est beaucoup plus trouble (la densité optique mesurée à = 546 nm est plus élevée). Dans une suspension préparée avec une solution de gélatine contenant un agent de restriction, les cristaux se développent à peine, si bien qu'après un temps défini, on obtient une basse densité par traitement- thermique (mûrissement d'Ostwald). Cependant, quand on enlève les agents de restriction, les cristaux deviennent plus grands et ainsi au bout du même temps, la suspension
présente une plus forte densité.
Le Tableau I ci-après montre que la gélatine active contenant une proportion relativement élevée d'agents de restriction (700 ppm d'ADN, 60 ppm d'adénine) empêche fortement la croissance des cristaux; après le traitement de la gélatine, les cristaux croissent tout aussi rapidement que dans le cas de la gélatine inerte ne
contenant pas d'agents de restriction.
TABLEAU I
Durée du trai- D 546 tement thermique Gélatine active Gélatine inerte à 60 C min. avant après traitement
0,13 0,40 0,51
0,20 0,68 0,80
0,27 0,97 1,11
0,33 1,18 1,30
80 0,34 1,19 1,32
D Pour régénérer les polymères en perles de cyclodextrine qu'on utilise selon l'invention, on élimine les acides nucléiques et les bases purines par élution ou par mélange du polymère en perles dans environ 5 fois sa quantité de solution éluante, filtration, ou écoulement de la même quantité de l'éluant à travers la colonne. On laisse s'écouler à partir de l'éluant une telle quantité à travers la colonne pendant 1 heure ce qui correspond à
à 40% de la charge de la colonne.
A titre d'éluants, on utilise des solutions-tampons de pH 7,5 à 10,5 et qui peuvent aussi contenir de 0,1
à 2 moles par litre de chlorure de sodium.
- La gélatine qui a été adsorbée sur les particules du polymère est enlevée par lavage à l'eau chaude et/ou un traitement enzymatique (protéase) qu'on fait suivre
d'un lavage à l'eau.
Les avantages du procédé de l'invention peuvent
être résumés comme suit.
1 En utilisant des polymères en perles de cyclodextrine, on élimine en une seule opération aussi
bien les acides nucléiques que les bases purines.
2 Le polymère en perles de cyclodextrine possède une plus grande aptitude à lier ADN et la base purine
que les résines à base de dextrane.
3 L'utilisation d'un polymère en perles de cyclodextrine est beaucoup plus économique que celle des
résines à base de dextrane.
Les exemples suivants dans, lesquels toutes les proportions sont en poids, servent à illustrer l'invention:
EXEMPLE 1
Dans un récipient chemisé d'eau de 300 ml de volume, qu'on maintient à 45 C à l'aide d'un ultra-thermostat, on introduit un polymère en perles de bêta-cyclodextrine (granulométrie d = 90 à 300 microns) contenant 15 g de substance sèche et ayant subi un gonflement préalable dans un tampon d'acétate de sodium/acide acétique (pH = 3,4), puis 100 ml d'une solution d'ADN de 0,025 g/l et
on agite pendant 1 heure.
Dans un autre test, on utilile le Molselect G-50 (d = 100 à 320 microns) ou le Sephadex G-50 (d = 50 à 150 microns respectivement comme polymères en perles contenant 15 g de substances sèches que l'on soumet à un
gonflement préalable dans un tampon KH2PO4 (pH = 7,5).
On élimine les particules du polymère des disper-
sions dans les trois cas par filtration et on les agite pour élution avec 5 x 100 ml de tampon KH2PO4/NaOH,(pH = 10,5) contenant 0,2 mole/litre de chlorure de sodium pendant 30 minutes, puis on filtre. La teneur en agents de restriction dans les éluats est déterminée par voie spectrophotométrique. On répète les examens avec les trois polymères en perles mais on remplace la solution d'ADN par
ml d'une solution de 0,015 g/litre d'adénine.
Les résultats sont indiqués dans le Tableau II.
TABLEAU II
Inhibiteur Teneur en inhibiteur, mg Cyclodextrine Molselect Sephadex
B K K B K K B K K
B 'B
ADN 2,5 2,3 0,92 2,5 1,57 0,63 2,5 1,8 0,72
AD 1,5 1,35 0,91 1,5 1,07 0,71 1,5 1,14Q76
Remarque: B = substance introduite- K = substance enlevée AD = adénine Les données du Tableau montrent que-le polymère de cyclodextrine lie l'ADN et l'adénine mieux que les
substances à base de dextrane.
EXEMPLE 2
En procédant comme dans l'exemple 1, on dissout En procédant comme dans l'exemple 1, on dissout 2,5 mg d'ADN et 5 g de gélatine inerte exempte d'agent de restriction dans 100 ml d'un tampon acétate de sodium/acide acétique (pH = 3,4). A la solution, on ajoute un polymère en perles de bêta-cyclodextrine {d = 90 à 300 microns) contenant 15 g de substances sèches et ayant subi un gonflement préalable dans un tampon d'acétate
de sodium/acide acétique (pH = 3,4) et on agite la disper-
sion résultante pendant trois heures.
Dans d'autres essais, on utilise un polymère en perles de Molselect G-50 (d=100 à 320 microns) et un
tampon KH2PO4 (pH = 7,5).
2 4 De la dispersion, on enlève les particules du polymère dans les deux cas et on les agite pour élution avec 5 x 100 ml de tampon KH2PO4/NaOH (pH = 10,5) contenant 0,2 mole/litre de chlorure de sodium pendant 30 minutes, puis on filtre. La teneur en agents de restriction des
éluats est mesurée par voie spectrophotométrique.
On répète les examens avec les deux polymères en
perles mais on utilise 1,5 mg d'adénine au lieu d'ADN.
Les résultats sont résumés dans le Tableau III.
TABLEAU III
Inhibiteur Teneur en inhibiteur, mg Cyclodextrine Molselect
B K K B K K
B B
ADN 2,50 2,30 0,92 2,50 1,80 0,72
AD 1,50 1,36 0,91 1,50 1,00 0,66
Remarques: B = substance introduite, K = substance enlevée AD = adénine Les données du Tableau montrent que le polymère de cyclodextrine élimine les agents de restriction de la
solution de gélatine mieux que la substance à base de dex-
trane.
EXEMPLE 3
Dans une colonne à chemisé d'eau (30 cm de hauteur et 3 cm de diamètre) maintenue à 55 C à l'aide d'un
ultra-thermostat, on charge un polymère en perles de bêta-
cyclodextrine contenant 30 g de substance sèche et préala- blement gonflée dans un tampon acétate de sodium/acide
acétique (pH = 3,4).
On fait passer la solution de gélatine à traiter
à travers la colonne (on prépare cette solution de géla-
tine en dissolvant 2,5 mg d'ADN et 5 g de gélatine inerte exempte d'agent de restriction dans 100 ml de tampon
d'acétate de sodium/acide acétique CpH = 3,4j).
On élue la charge de la colonne avec 500 ml de tampon KH2PO4/NaOH (pH = 10,5) qui contient 0,2 mole/litre de chlorure de sodium (débit de passage: 100 ml/h). On effectue également des examens mais en utilisant 1, 5 g d'adénine au lieu d'ADN respectivement de Molselect au lieu du polymère de cyclodextrine avec l'ADN et respectivement l'adénine.
Les résultats sont indiqués dans le Tableau IV.
TABLEAU IV
Inhibiteur Teneur en inhibiteur, mg Cyclodextrine Molselect
B K K B K K
B B
ADN 2,50 2,35 0,94 2,50 1,00 0,40
AD 1,50 1,46 0,97 1,50 0,96 0,64
On voit dans ce Tableau que quand on utilise le polymère de cyclodextrine comme charge de la colonne, il est
également plus efficace que la substance à base de dextrane.
Claims (3)
1 - Procédé d'élimination des acides nucléiques et des bases purines à partir de la gélatine, caractérisé en ce qu'il comprend: a) l'adjonction d'un polymère en perles de cyclodextrine d'une granulométrie de 20 à 600 microns, d'une teneur en cyclodextrine de 30 à 70% et d'une teneur en alcool polyvinylique de 0,3 à 0,5%, à la solution de gélatine dans un rapport pondéral de 1:1 à 10:1, calculé par rapport à la quantité de la gélatine, puis la séparation par filtration du polymère de cyclodextrine; ou b) le fait de faire passer la solution de gélatine à travers une colonne de polymère en perles de cyclodextrine de manière que la quantité de gélatine soit de 5 à 50% du poids de la charge de la colonne, puis le fait d'éluer les acides nucléiques et les bases
purines du polymère en perles de cyclodextrine.
2 - Procédé selon la revendication la), caracté-
risé en ce qu'on utilise un polymère de cyclodextrine d'une
granulométrie de 90 à 300 microns et d'une teneur en cyclo-
dextrine de 50 à 60%.
3 - Procédé selon la revendication lb), caractérisé en ce qu'on utilise la gélatine de 10 à 30% par rapport
au poids sec de la charge de la colonne.
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