JPH04507193A

JPH04507193A - 固定化リパーゼ調製品およびエステル合成のための該調製品の使用

Info

Publication number: JPH04507193A
Application number: JP2509935A
Authority: JP
Inventors: ペデルセン，スベン; エイグトベド，ペーター
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1989-06-21
Filing date: 1990-06-15
Publication date: 1992-12-17
Also published as: DK306189D0; ES2044604T3; DE69002459D1; DE69002459T2; WO1990015868A1; EP0478685A1; EP0478685B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】固定化リパーゼ調製品およびエステル合成のための該調製品の使用本発明が属する技術分野には、固定化リパーゼ調製品およびエステル合成のための該調製品の使用が含まれる。

リパーゼを固定化する方法の一つは、水性溶液からリパーゼに対して親和性を有する粒状の多孔質担体に吸着させることを含んでなる。担体の選択は、デリケートな問題である：第１に担体は水性溶液中問題の特別のリパーゼに対し高度の選択的親和性を示さなければならない；第２に製造された固定化リパーゼ調製品は使用条件下、高い活性と安定性を示さなければならず、その際使用条件はエステル合成又はエステル加水分解であってよい；第３にもしも同定化リパーゼ調製品が工業的規模で用いるべき場合、担体は比較的安価でなげればならない；更に第４に担体は非毒性でなければならず更に食品に是認されなければならない。

カンジダ　アンタルクチ力（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）　リパーゼＡおよびカンジダ　アンタルクチ力リバーゼＢは、公知のリパーゼあり（例えば、ＥＰ２８７゜６３４参照）、更にまたＥＰ２８７，６３４中には、これらのリパーゼはシュオライド（Ｄｕｏ　１　ｉ　ｔ　ｅ、登録商標）タイプのアニオン交換樹脂によって固定化され得る旨記載されている。しかし、エステル合成の目的に対しては、これらの従来技術の調製品は満足できない。と言うのは、これらのエステル合成活性が極めて低いからである。

かくして、本発明の目的はリパーゼの水性溶液から担体上にリパーゼを吸着させることによって調製される固定化リパーゼ調製品を提供することにあり、ここにおいてリパーゼはカンジダ　アンタルクチ力　リパーゼＡおよびカンジダ　アンタルクチ力　リパーゼＢから選ばれるリパーゼの一方又は双方であり、ここにおいて固定化リパーゼ調製品はこの種の従来技術の固定化リパーゼ調製品の使用条件下でのエステル合成活性よりも、使用条件下でより高いエステル合成を示すべきである。

今や、驚くべきことに以下の内容が見出された。すなわち、広範数の担体カテゴリーから選ばれた特定の担体カテゴリーを選択し次いで選択された担体の特定の予備的処理を選択することにより本発明の目的を達成することが可能となる。

従って、本発明に係るエステル合成用の固定化リパーゼ調製品は、リパーゼがカンジダ　アンタルクチ力　リパーゼＡおよびカンジダ　アンタルクチ力　リパーゼＢから成る群から選ばれるリパーゼの一方又は双方であり、更に固定化が水性溶液から粒状多孔質脂肪族オレフィン系ポリマー上に吸着することによって行なわれ、該ポリマーは極性の有機の水混和性溶剤によって予備処理され、この溶剤中ではポリマーは不溶性であり更にリパーゼを失活させないことを特徴とする。

驚くべきことに、以下の内容が見出された。すなわち、本発明に係る固定化リパーゼ調製品のエステル合成活性は、従来技術のエステル合成活性よりもはるかにより高いものであり、このことは本明細書の後半において詳しく説明されるであろう。

ＥＰ２３２，９３３を参照されたい。このＥＰ２３２．９３３には、他のカテゴリーの担体と共に本発明で用いられる特別のカテゴリーの担体が記載されている。また、ＥＰ２３２．９３３にはカンジダ　シリンダルシア（Ｃａｎｄｉｄａｃｙ　Ｉ　１ｎｄｒａｃｅａ）が使用できることが示されている。

カンジダ　アンタルクチ力　リパーゼＡおよびカンジダ　アンタルクチ力　リパーゼＢの使用可能性を示唆する記載は存在しない。構造および性質に関して、カンジダ　シリンダルシア由来のリパーゼは、カンジダ　アンタルクチ力Ａ′Ｊ６よび／又はＢ由来のリパーゼとは完全に異なる。更に、ＥＰ特許は、脂肪の加水分解にのみ関係しており、すなわち高い水分濃度での反応システムに関係している。一方、本発明はエステル合成、すなわち低い水分濃度から極度の低い水分濃度までを用いたシステムに関係している。

ＷＯ公開特許出願８９１０２９１６中には、アクリレートタイプ（「レワチトＪ　（Ｌｅｗａｔ　ｉ　ｔ））の吸着性樹脂に固定化されたカンジダ　リパーゼは、フェノールタイプ樹脂およびアニオン交換樹脂に吸着されて固定化されたカンジダリパーゼよりもより高いエステル交換活性を示すことが記載されている。

しかし、以下の内容が見出された。すなわち、本発明に係る固定化リパーゼ調製品、特にカンジダ　アンタルクチカリパーゼを用いた本発明に係る固定化リパーゼ調製品は、低濃度（０〜１％ｗ　／　ｗ　）で、レワチトに固定化された従来の調製品のエステル交換活性よりもはるかにより高いエステル交換活性を示す（以下の例６参照）。エステル交換プロセスに関し、相当する副生成物の形成の故に、低い水分濃度でプロセスを行うことが極めて優列である。

本発明中用語は次の意味を表わす。

語句「多孔性」は担体粒子が気孔を示すことを意味する。

気孔は小さければ小さい程良い。何故なら、より小さい気孔はより大きな表面積に相当するからである。しかし、気孔は好ましくは直径１００八よりもより小さいものであってはならない。何故なら、リパーゼ分子がこのような小さな気孔に入るためには余りに大きくなりすぎる傾向となるからである。

従って、ｒｃｏｌｌｏｉｄ　ａｎｄ　１ｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊ（ボルド　アンド　ボルド、１９８３年、アディソンーウエスレ　バブリジングカンパニー）の１０１頁に記載される定義に従い、固定化リパーゼ調製品中の好ましい気孔構造は、マクロポアおよび／又はメソポアとして分類できる。

語句「エステル合成」は、あらゆる種類のエステル合成、例えばアルコールと酸との反応、エステルとアルコールとの反応（アルコールシス）、２種のエステル間の反応（エステル交換）又はエステルと酸との反応（アシドリシス）を含むものである。

語句「エステル交換」は、エステル交換、アシドリシス、およびアルコリシスを包含するものである。

語句「エステル合成」は糖脂質合成、すなわち、アルコールグルコースと脂肪酸との反応」をも包含する。

脂肪加水分解に関して活性の評価のために用いられるリパーゼ単位であるＬＵは、出版物ＡＦ９５１５−ＧＢ　（これは、要求に応じ、ノボノルディスクＡ／Ｓ　（ノボアレー、ＤＫ−２８８０、バズグバエルト、デンマーク国）より入手可能である）中に記載されている。

エステル交換活性に関する評価のために用いられるリパーゼ単位であるＢＩＵは、出版物ＡＦ２０６−２　（これは、要求に応じ、ノボノルディスクＡ／Ｓ　（ノボアレー、ＤＫ−２８８０、バズグバエルト、デンマーク国）より入手可能である）中に記載されている。

エステル合成活性の評価に対して用いられるリパーゼ単位であるＰＬＵは、次のように行われる。

原理：活性は、ｎ−プロピルラウレート形成のは）゛初期の速度として測定される。

リパーゼ調製品：カンジダ　アンタルクチ力　リパーゼＡおよび／又はカンジダ　アンタルクチ力　リパーゼＢの固定化調製品は、１０％ｗ　／　ｗまで水和される（−夜）。

基質：２５０ｍｇの酵素調製品（乾燥物質）４０ミリモルのラウリン酸（８，０１ｇ）４０ミリモルのｎ−プロパツール（２，４０ｇ）反応：６０℃、２０分、２０ｍ１のガラス製バイアル中で振とう（ＢＩＢ＝分析に関する如く）活性の計算：基質の酸価（ＡＶ）は、反応の前後で測定される。エステル形成の程度を計算し次いで初期活性を見積る。

本発明に係る固定化リパーゼ調製品の好ましい態様において、担体はポリプロピレンである。実際の実験により、このオレフィン性ポリマーは担体として極めて満足できることが判明した。

本発明に係る固定化リパーゼ調製品の好ましい態様において、９０％以上の粒子が１００〜１０００μｍの粒径を示す。

もしも粒径が１００μｍ未満の場合、カラム内の圧力損失は余りに大きいものとなる傾向にあり、更にもしも粒径が１０００μｍを超える場合、拡散抑制が余りに高い傾向になる。

本発明は又、本発明に係る固定化リパーゼ調製品のエステル合成の使用を含む。

本発明に係る使用の好ましい態様において、リパーゼはカンジダ　アンタルクチ力　リパーゼＡであり、更にエステル合成はエステル交換である。固定化収率およびエステル交換活性は最も満足できるものであることが見出された。

本発明に係る使用の好ましい態様において、リパーゼはカンジダ　アンタルクチ力　リパーゼＢであり、更にエステル合成はアルコールと酸の反応である。固定化収率およびエステル合成活性は最も満足できることが見出された。

本発明に係る使用の好ましい態様において、リパーゼはカンジダ　アンタルクチ力　リパーゼＢであり、更にエステル合成はエステル交換である。低い水分濃度でのエステル交換活性は最も満足できるものであることが見出された。

本発明は、以下の実施例により更に説明されるだろう。これらの実施例において、カンジダ　アンタルクチ力の３種の調製品が研究・開発された。すなわち、カンジダ　アンタルクチ力　リパーゼＡ　（ＬＡと略）、カンジダ　アンタルクチ力　リパーゼＢ　（ＬＢと略）および混合調製品（Ｌ　（Ａ＋Ｂ）と略）の３種である。ＬＡおよびＬＢは、ＥＰ２８７，６３４に記載されかつ特徴づけられている。

本発明に従って用いられる担体および対照担体は、それぞれタイプアキュレル（ＡＣＣＵＲＥＬ、登録商標）およびシュオライド　＜ＤＵＯＬ　ＩＴＥ、登録商標）に属する。アキュレル（これは粒状のポリプロピレンである）は、アクゾ社、繊維およびポリマー部門、アキュレルシステムのデータシートに記載されており、エンカ社（ボストファハＤ−８７５３オーベンベルク、西ドイツ）より入手可能である。

シュオライドは、アニオンおよびカチオン交換樹脂並びに樹脂吸着剤に対するロームアンドハース社の登録商標である。

例１比較シュオライドＥＳ−５６８Ｎ４．０ｇ　（乾燥分）の懸濁液をｐ）１７に調節し、次いで脱イオン水に溶解した０、８０ｇのＬＡ　（２２２，８００Ｌ口／ｇ）（ＬＡ溶液の全重量１２ｇ）を添加した。ｐＨを７に再調整し、次いで懸濁液を室温で２時間撹拌した。生成物を濾過し次いで６０ｍ１の脱イオン水および６０ｍ１の冷アセトンで洗浄した。生成物を４０℃で真空乾燥した。

固定化収率＝３４％（Ｌｉｔ測定から計算）吸着量＝乾燥分１ｇ当たり１５．７００ＬＵＢＩＢ／ｇ＝７　；　ＰＬＵ／ｇ＝０例２本発明４．０ｇ（乾燥分）のアキュレルＥＰ１００を９６％エタノール中でスラリー化する。過剰のエタノールを吸引除去する（残留エタノール９ｇ）。脱イオン水に溶解した０、８０ｇのＬＢ　（２２２，８００Ｌ口／ｇ）（ＬＢ溶液の全量は２０ｇである）を添加する。ｐＨを７に調節し、次いで懸濁液を室温で２時間撹拌する。生成物を濾過し、６０ｍ１の脱イオン水で洗浄する。生成物を４０℃で真空乾燥する。

固定化収率＝９６％（ＬＵ測測定ら計算）吸着量＝乾燥分１ｇ当たり３８．０００ＬＩＩＢＩＩＪ／ｇ＝５６　；　ＰＬＬＩ／ｇ＝０例１および例２より、本発明に係る固定化リパーゼ調整品は吸着量およびエステル交換活性に関し対応する従来技術の調整品に比較してはるかに秀れている。

例３本発明１０、Ｏｇ（乾燥分）のアキュレルＥＰ１００を９６％エタノール中でスラリー化する。過剰のエタノールを吸引除去する（残留エタノール２３ｇ）。脱イオン水に溶解した３４゜７ｇのＬＢ　（１４，４００ＬＵ／ｇ）（ＬＢ温溶液全量は５０ｇである）を添加する。ｐＨを７に調節し、次いで懸濁液を一夜撹拌し、合計１８時間撹拌する。生成物を濾過し、１００ｍ１の脱イオン水で洗浄する。生成物を４０℃で真空乾燥する。

固定化収率＝１００％（ＬＵ測測定ら計算）吸着量＝乾燥分１ｇ当たり４８，２００Ｌ口ＢＩ［Ｉ／ｇハ約０；ＰＬロ／ｇ＝３７０シュオライドをアキュレルの代りに用いた同様の実験では、はるかにより低い固定化収率とはるかにより低いエステル合成活性を示した。

例４比較シュオライドＥＳ−５６８Ｎ４．０ｇ（乾燥分）の懸濁液をｐＨ７に調節し、次いで橢イオン水に溶解した１、８７ｇのＬ　（Ａ十Ｂ）（８５，６００ＬＵ／ｇ）（Ｌ　（Ａ＋Ｂ）溶液の全重量１２ｇであった）を添加した。ｐＨを７に再調整し、次いで懸濁液を一夜、合計１７時間撹拌した。生成物を濾過し次いで６０ｍ１の脱イオン水で洗浄した。生成物を４０℃で真空乾燥した。

固定化収率−１３％（１口に基づき計算）吸着量＝乾燥分１ｇ当たり５，４００ＬＵＢＩＵ／ｇ＝８　；　ＰＬＵ／ｇ＝０．　２例５１゜Ｏｇ（乾燥分）のアキュレルＥＰ１’ＯＯを、９６％エタノール１０ｍ１と混合し、引き続き真空濾過する。５ｍｌの脱イオン水に溶解した０、４ｇのＬ　（Ａ＋Ｂ）’　（１４２，０００ＬＵ／ｇ）を添加する。ｐＨを６．５に調節し、次いで懸濁液を一夜撹拌する。生成物を濾過し、５０ｍＩの脱イオン水で洗浄する。生成物を室温で真空乾燥する。

固定化収率＝９８％（ＬＵ測測定ら計算）吸着量＝乾燥分１ｇ当たり５５．９００ＬＵＢｌ口／ｇ＝６　１　；　ＰＬＵ／ｇ＝３　４　６例４および例５より、本発明に係る固定化リパーゼ調整品は、吸着量およびエステル交換活性の双方に関し、対応する従来技術の調整品に比較してはるかに秀れている。

例６本発明この例は、エステル交換に対しＬＡおよびＬＢの使用を説明する。

手順は例３に記載する手順と同じである。但し、次の変更を行い、結果を得た。

４、ＯｇのアキュレルＥＰ１００に対し４．４３ｇのＬＢ（１１２，９００ＬＵ／ｇ）固定化収率−１００％吸着量＝１ｇの乾燥分当たり４５’、’　２０　ＯＬ口　′ＰＬＵ／ｇ＝３７０　（例３と同じ）２５ｇのアキュレルＥＰ１００５．６１ｇのＬＡ　（２２２，８００ＬＤ／ｇ）固定化収率＝９９％吸着量＝１ｇの乾燥分当たり４４．７００ＬＵＢＩＵ／　ｇ　＝　５９エステル交換活性を０〜１０％の触媒水和で測定した：エステル交換活性（Ｂｌ口／ｇ）固定化ＬＢ　１４　１０　０−１　０−ＩＬＢによるエステル交換が極めて低い水和レベルで可能であることが注目される。

例７本発明この例は、湿潤剤としてエタノールおよびイソプロパツールを用いポリエチレン粉末、アキュレルＥＰ４００に対するＬＢの固定化の例を示す。

例３からの変更は次の通りである：４．１ｇのアキュレルＥＰ４００／エタノールに対し０゜３３８ｇのＬＢ　（３６０，ＯＯＯＬＵ／ｇ）固定化収率＝３０％吸着量＝乾燥分１ｇ当たり９．２００ＬロＰＬｔｌ／ｇ＝３６９４．１ｇのアキュレルＥＰ４６０／イソプロパツールに対し０．３４１ｇのＬＢ　（３６０，０ＯＯＬＵ／ｇ＞固定化収率＝２２％吸着量＝乾燥分１ｇ当たり６．８００ＬＵＰＬ口／ｇ＝２９４国際調査報告１゜１１４ｆｉｊｌｌ。ｓｏｌ　Ａｅ、、’ｊｌ１１゜、い　ρＣＴ／ＤＫ　９０１００１．５２

Claims

【特許請求の範囲】

１．エステル合成用固定化リパーゼ調製品であって、リパーゼがカンジダアンタルクチカリパーゼＡおよびカンジダアンタルクチカＢから成る群から選ばれるリパーゼの一方又は双方であり、更に固定化が水性溶液より、粒状多孔質脂肪族オレフィン系ポリマーに吸着により行われており、該ポリマーが極性の有機の水混和性溶剤で予備処理されており、この溶剤にポリマーは不溶性であり更にリパーゼを失活しないものである、前記固定化リパーゼ調整品。
２．ポリマーがポリプロピレンである、請求の範囲第１項記載の固定化リパーゼ調整品。
３．９０％以上の粒子が、１００〜１０００μｍの粒径を示すものである、請求の範囲第１又は第２項記載の固定化リパーゼ調整品。
４．エステル合成用の請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の固定化リパーゼ調整品の使用。
５．リパーゼがカンジダアンタルクチカリパーゼＡであり、更にエステル合成がエステル交換である、請求の範囲第４項記載の使用。
６．リパーゼがカンジダアンタルクチカリパーゼＢであり、更にエステル合成がアルコールと酸との反応である、請求の範囲第４項記載の使用。
７．リパーゼがカンジダアンタルクチカリパーゼＢであり、エステル合成がエステル交換である、請求の範囲第４項記載の使用。