JPS6098984A - 固定化リパ−ゼ調製品の製造方法 - Google Patents

固定化リパ−ゼ調製品の製造方法

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JPS6098984A
JPS6098984A JP59183881A JP18388184A JPS6098984A JP S6098984 A JPS6098984 A JP S6098984A JP 59183881 A JP59183881 A JP 59183881A JP 18388184 A JP18388184 A JP 18388184A JP S6098984 A JPS6098984 A JP S6098984A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は、固定化す・ヤーゼ調製品の製法およびその使
用に関する。
（２）従来の技術および発明がＨ結する問題点脂肪のエ
ステル交換に対する固定化ＩＪ　／４１−ゼ調製品は、
公知である。すなわち、デンマーク特許出願第５６３／
７７号（米国特許４，２７５．０８１に対応する）には
、固定化酵素調製品が開示されており、それによってリ
パーゼかりグブス属、ジオトリクム属又はアスペルギル
ス属に帰属する種を発酵することによって生産され更に
それによシリパーゼが、珪藻土又はアルミナであシ更に
非常に高い比表面積を示す中性の個々の粒子から成る担
体上に吸着させる。必要な高酵素活性を得るためには、
非常に高い比表面積（すなわち、小さくかつ多孔性の担
体、粒子）を有する固定化り・々−ゼ調製品を用いるこ
とが必要であると考えられてキタ。エステル交換は、こ
の固定化酵素を用い無溶剤で回分式で行うことができる
が、しかし、この固定化酵素調製品を用いたカラム内の
連続エステル交換は、後に除去されねばならぬ溶剤の存
在なしで、工業的規模で行うことはできない。なぜなら
、該調製品が小粒子からカリ、これはカラム操作中許容
できない程の高い圧力降下を発生させるという、事実が
存うるからである。また、Ｅｎｚ、Ｅｎｇ、６　＋カシ
コジマ（日本）、２０〜２５．９月（１９８１年）およ
びＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ａｐｐｌｉ
ｅｄ　’Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌｏｇｙ並びにＢｌｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、４１４　、１〜５　頁（１９８２）年
に示された広告は、リゾプスデルマー由来のリパーゼお
よび強アニオン交換樹脂（第４級アミノ基を有する）を
含んでなる固定化酵素調製品が、溶剤としてれ一ヘキサ
ンを用いエステル交換反応に用いられることを示してい
る。しかし、これらの文献によシ酵素の回収は、極めて
低い。また、公告番号００６９５９９をもって公告され
たヨーロッ・臂特許出願には、脂肪の酵素的転位が記載
され、これによシ、アスにルギルス種、リゾゲス種、ム
コールヤバニクス、又はムコールマイヘイ起源のり・臂
−ゼが、エステル交換酵素として用いられる。酵素は、
担体、例えばセライトに担持される。
カラム内の連続エステル交換に関する該ヨーロツノ（特
許出願Ｖこおける全実施例において、溶剤が用いられて
いる。
かくして、先行技術のプロセスにあっては、カラム操作
を可能な限シスムースに行うため、脂肪の出発物質の粘
度を低下させるため、溶剤が用いられる。工業的スケー
ルでのこれらの連続エステル交換プロセスにおいて、溶
剤を避けるこトハ、実際不可能であるとこれまで考えら
れてへた。なぜなら、たとえこれらのエステル交換プロ
セスから、溶剤を除去することに関連する技術的利点が
全く自明であるとしてもカラム内で高い圧力降下がおこ
るからである。
公告番号３５，８３３をもって公告されたヨーロッ・や
特許出願ｔこおいては、脂肪のエステル交換を目的とす
る固定化酵素調製品が、微生物す・母−ゼの水溶液と、
個々の粒子から成る、不活性担体と接触させ次いで乾燥
させることによって得られることを開示している。この
ようにして得られた固定化ＩＪ、４’−ゼ調製品は、脂
肪のエステル交換に対して使用できる。ただし、脂肪が
脂肪酸の比較的高価な低級アルキルエステル（これらの
エステルは、溶剤を避けるため助剤として用いられる）
、例えばメチル・９ルミテートと混合される場合ＶＣ限
る。さもなければ、溶解性および粘度低下の問題が生じ
る。
（３）問題点をＭ鈷するだめの手段および作用かくして
、本発明の目的は固定化り・平−ゼ調製品の製造方法を
提供することＶこあり、この方法は溶剤又は他の高価な
助剤なしで経済的に実行できる方法で連続エステル交換
を実施できる可能性をきり開いたものである。
いまや、おどろくべきことＫ、以下の事実が見出された
。すなわち、本発明によれば、非常に容易に実施できる
固定化り・（−ゼ調製品の製造方法、すなわち、す・ｌ
−ゼの水溶液とイオン交換樹脂を単に混合することによ
るものであｐ更にこれは、特定のカテゴリーのイオン交
換樹脂および最終固定住酵素における水の特定割合の特
定組合わせからなるものであるが、前記方法は溶剤又は
他の高価な助剤なしで経済的（Ｃ実施可能な方法で連続
エステル交換の実施の可能性を切シ開くものである。
かくして、脂肪のエステル交換を意図した固定化リパー
ゼ調製品の製造に対する本発明に係る方法は、微生物リ
パーゼの水溶液を、個々の粒子から成る、巨視的多孔性
の弱アニオン交換樹脂であって第一級および／又は第二
級および／又は第三級アミノ基を含有し更に過剰の圧力
降下なしでカラム操作に対して適当な比較的大きな平均
粒径を示す該樹脂と、所望量のリパーゼがアニオン交換
樹脂を結合するのに十分な時間、該す・母−ゼがアニオ
ン交換樹脂を結合するような条件のもとで接触させ、し
かる後得られた固定化酵素を水相から分離し次いで分離
された固定化酵素を約２〜４０チの水分合間に乾燥する
ことを含んでなる。ドイツ公開公報路２．９０５，６７
１号および第２．８０５，９５０号、日本特許公開公報
５４−７６８、９２号および同５７−１５２８８６号、
米国特許４，１７０，６９６およびＣｈｅｍ、Ａｂｓ　
、　８２巻。
２７８１９ｄにはりＡ？−ゼを含む酵素が個々のアニオ
ン交換樹脂によって固定化され得ることが一般的に示さ
れている。しかし、まず第一に全ての酵素および全ての
基質に対し適した普遍的な固定化方法は存在せず、特異
的固定化方法は、特異的酵素および特異的基質に対し考
案されねばならず、この基質に酵素が作用する。次に、
す・サーゼは、酵素活性が二相間の相間で作用するとい
う意味で全く異常な酵素であシ、これはす・母−ゼの固
定が非常にデリケートな問題であることを意味し、この
ことはす・ヤーゼ固定を含む分野において公知の固定化
方法の概念を著るしく制限している（Ｊ。
Ｌａｖａｙｒｅ　ｅｔ　ａｌ、＋ｐｒｅｐａｒａｔ１ｏ
ｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆ　１ｍｍｏｂｌ
ｌｌｚ＠ｄ　Ｌｉｐａｇｓｓ＋Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ　ａｎｄＢｌｏｓｎｇＩｎｅｓｒｌｎｇ＋Ｖｏｌ　
、）ｉコ（夏Ｖ、１００７−１０１３負（１９８２）　
、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｓｙ　＆　８ｏｎｓ参照）第三に
、リパーゼおよび個々の粒子から成る巨視的多孔の弱ア
ニオン交換樹脂の組合わせは、先に説明した文献のいず
れにも示されておらず、むしるこの新規な組合わせは溶
剤又は他の高価な助剤なしで連続エステル化に関し驚く
べき技術的効果をもたらすものである。
また、ヨシハルキムラ等の論文、ｒＡｐｐＨｅａｔｌｏ
ｎｏｆ　Ｉｍｍｏｂｌｌｌｚｅｄ　Ｌｉｐａｓｓ　ｔｏ
　Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｏｆＴｒｉａｅｙｌｇｌｙｅ
ｅｒｉｄｅ　Ｊ％Ｅｕｒ　、Ｊ　、Ａｐｐｌ　、Ｍｉａ
ｒｏｂｉｏｌ。
ＢｌｏＬｅｃｈｎｏｌ、（１９８３）１７　：１０７−
１１２から、アニオン交換樹脂に固定化されたリパーゼ
調製品が脂肪の加水分解に対して用いられてきているよ
うである。第一の場合において、本発明方法によって生
産された固定化す・母−ゼ調製品の主適用はニスチル交
換でｓｂ、一方脂肪の加水分解および脂肪の合成は、本
発明による適用として重要性が低く、これらは、本発明
中抜に詳説される。第二の場合は、論文から、活性収率
は、本発明方法によシ得られた固定化リパ−ゼ調製品に
関し活性収率は典型的には８０％以上であるのに比較し
、１−以下である（１０９頁第１表参照）。これは、す
・９−ゼの固定が非常にデリケ°−トな問題であると、
先に述べた我々の説明を確認するものである。
［比較的に大きい平均粒径」とはオランダ特許出願第５
６３７７７号に開示された製品の平均粒径に関するよう
に意図したものであシ、＃製品の内、大部分の粒子は、
約５０μｍ以下の粒径を有する。以下の内容が見出され
た。すなわち、温度は活性収率には大なる影響は有しな
い。なぜなら、実験的に明らかなように、活性収率は固
定化中の温度が５〜３５℃に保持されている場合、実質
的に温度に依存しないからである。
酵素を失活させないため、従来のエステル交換は、比較
的低温度で行なわれる。これは、比較的高い融点を有す
る脂肪を溶解することができる、溶剤の存在によって可
能となる。驚くべきことに、以下の内容が見出された。
すなわち、本発明方法によって生産される固定化り・臂
−ゼ調製品は、比較的より高い温度を有する溶融脂肪に
おいて十分な安定性を有する、ということである。また
本発明方法によって得られる固定化す・ヤーゼ調製品を
充填したエステル交換カラム内の圧力降下は、円滑な操
作をなさしむるに十分に低いものである。又、驚くべき
ことに以下の内容が見出された。すなわち、無溶剤で使
用を意図した固定化リパーゼ調製品を得るための全ての
これまでの試みに反し、接触条件、イオン交換樹脂およ
び水分含量の独得の組合わせによシ、特異的高リパーゼ
活性が得られる、ということである。
更に、デンマーク特許出願５６３／７７に開示された種
類の方法は、使用可能な固定化調製品を得るため精製す
・仲ゼ番要求しているが、驚くべきことに、本発明に係
る固定化リパーゼ調製品は、むしろ粗製リノや−ゼ製品
をもとに製造できる。また、該デンマーク特許出願５６
３／７７に開示された種類の従来方法はりノ母−ゼを担
体に吸着させるため有機溶剤の使用を含むが、本発明に
よる固定化リパーゼ調製品の製造に対しては、そのよう
な有機溶剤は必要とされず、該調製品は担体およびす・
９−ゼ水溶液を混合することによって極めて容易に得る
ことができる。更に、リパーゼ活性は極めて容易に流失
するか、又はデンマーク特許５６３／７７に開示された
種類の従来の製法によシ消失せしめられるが、一方、本
発明方法によって得られる固定化す・ターゼ鯛製品中の
リパーゼは、もしも不利な化学もしくは物理的処理、例
えば不利な声および温度条件に委ねられない場合、調製
品から除去することが事実上不可能であることが見出さ
れた。最後に、次の内容が見出された。すなわち、本発
明方法によって得られる固定化すｔ＃−リノ母−ゼ調製
品が、高い酵素回収率でもって製造でき、これは従来の
エステル交換よりもより安価な連続エステル交換の可能
性を切シ開く、ということである。
本発明方法の好ましい態様において、す・４−ゼは熱安
定性す・平−ゼである。これ１こよシ、よシ高い温度の
エステル交換が可能となり、従って生産性が高い。更に
、この態様により、より高温の溶融脂肪のエステル交換
に十分適した固定化り・９−ゼＰＪＩ４ａ品を得ること
が可能でおる。
本発明の好ましい態様において、微生物す・ヤーゼが高
熱性ムコール種、特にムコールマイヘイから産生される
。ムコールマイヘイは、１，３−特異リパーゼの良好で
グロデーーザーであシ、従って安価な生産物を得ること
ができる。
本発明方法の好ましい態様において、巨視的な多孔性弱
アニオン交換樹脂の９０チ以上の粒子は、平均粒径１０
０−１０００／Ａｍ、好ましくは２００〜４００μｍを
有する。この間の粒径において、高いエステル交換活性
と低い圧力降下間の良好な折衷点が得られる。
本発明の好ましい態様において、微生物ソノ９−ゼの水
溶液の黄と弱アニオン交換樹脂の重量との割合は、イオ
ン交換樹脂ＩＩ！（乾燥型−ｔ）当たり５．０００〜５
０．０００　ＬＵに相当する。この方法で、イオン交換
樹脂に対し十分なリパーゼが与えられる。
本発明方法にある好ましい態様において、微生物リパー
ゼは高温性ムコール種、特にムコールマイヘイから産生
され、更にイオン交換樹脂と水溶液の接触中の−は５〜
７である。この方法で、リパーゼとイオン交換樹脂間の
強い結合並びに良好な安定性および活性度が確保される
。
本発明の好ましい１Ｍ様において、接触時間は０．５〜
８時間である。このようにして、す・譬−ゼとの飽和状
態が得られるか又はそれに近づけられる。
本発明の好ましい態様において、簡単なろ過失により分
離を行うことができる。この方法は簡単であυかつ工業
的実施に十分適合で救る。
本発明の好ましい態様において、水の約５〜２０チの水
分含量までに乾燥を行う。乾燥操作は、真空中、流動床
又は大規模操作に適した他の乾燥手段によシ行うことが
できる。これによシ、高エステル活性を有する最終リパ
ーゼ調製品を得る。
本発明の好ましい態様において、個々の粒子から成る、
巨視的多孔性の弱アニオン交換樹脂を、該樹脂と微生物
リパーゼの水溶液との接触前、接触中又は接触後架橋剤
水溶液、好ましくはｏ、ｉ〜１、　Ｑ　％　ｗ／ｗのグ
ルタルアルデヒド水溶液と一緒にし、しかる後残存架橋
剤溶液を分離する。架橋剤のために酵素活性が少し減少
したとしても、このような処理は特異的適用に対し水性
媒体中リノ！−ゼ調製品の安定性を上昇させることが見
出された。エステル交換試剤として固定化酵素調製品の
使用に関し、す・ヤーゼ調製品の安定性を改良する必要
はない。と言のは、この安定性は、この適用に対し、本
発明方法によって得られたす・臂−ゼにおいて本来的に
秀れたものであるからである。しかして、以下の内容が
見出された。すなわち、本発明方法によって得られた固
定化リパーゼ調製品は、脂肪の加水分解に対しても使用
することができ、更にこの適用に対しリパーゼ調製品の
安定性の改良はぜひほしいものである。おそらく、これ
は反応混合物中の比較的高い濃度の水と高温度の組合わ
せのためであシ、工業的に行なわれる脂肪加水分解グロ
セスに対し必要である。
また、本発明は、脂肪をエステル交換する方法である、
本発明によって得られる固定化リパーゼ調製品の使用を
含んでなり、ここにおいて、溶融遊離脂肪酸と任意に混
合された溶融脂肪を、無溶剤で、又は他の高価な補助剤
なしで、又は実質的に溶剤なしでもしくは他の高価な補
助剤なしで、本発明に係る方法によって得られる固定化
ジノ４−ゼ調製品と接触させる。
本発明によシ任意に混合せられる脂肪と共に、遊離脂肪
酸は、高価な補助剤としては考えられていない。脂肪は
、純粋なトリグリセリド又は多くの起源の１つから得ら
れるトリグリセリドの混合物である。
本発明は又、脂肪の加水分解である、本発明方法によっ
て得られる固定化酵素調製品の他の使用も含んでなシ、
ここにおいて、トリグリセライドおよび水のエマルシロ
ンを、無溶剤で又は他の高価な助剤なしで、又は実質的
に溶剤なしでもしくは実質的に他の高価な助剤なしで本
発明によって得られる固定化す・母−ゼ調製品と接触さ
せる。
また、本発明は、本発明方法によって得られる固定化リ
パーゼ！１ｌｌｉ！製品の別の使用を含んでなシ、これ
は脂肪の合成方法であシ、ここにおいてグリセロールお
よび遊離脂肪酸の混合物を、無溶剤又は他の高価な助剤
なしで又は実質的に溶剤なしでもしくは実質的に他の高
価な助剤なしで、本発明によって得られる固定化ＩＪ／
４’−ゼ調製品と接触させる。。
一本発明を以下の例によって説明する。
以下の例で用いられるムコールマイヘイ＋）Ａ−ゼは、
請求によシ、ノビインダストリーＡ／Ｓ（ノブオアレイ
。
２８８０　、パスグバード、デンマーク国）より入数可
能である（酵素製品５Ｐ２２５）。このムコールマイヘ
イリパーゼは、デンマーク特許出願４２３４７７７の記
載　“に従って得ることができる。
例中で示されるリパーゼ活性活位（ＬＵ）は、ノボイン
ダストリーＡ／Ｓ（ノブオアレイ、２８８０．７（スダ
ノ（−ド、デンマーク国）から入数可能な、刊行物８３
−０１−０３のＡＦ９５．１／２−ＧＢの記載に従って
決定される。
固定化リパーゼ調製品のエステル交換活性を次′の反応
に基づくパッチアッセイによって決定される：ｏｏｏ＋
ｐｖ−ｐｏｏ＋。
ｐｏｏ＋ｐ、−ｐｏｐ＋。
ここでＯはオレイン酸を意味し、Ｐは・々ルミチン酸を
意味し、更にｏｏｏ、ｐｏｏおよびｐｏｐは示された順
に示された脂肪酸を含有する脂肪であシ、０００はトリ
オレインである。
固定化すａＪ？−ゼ調製品２５０ｆＩＱを、ねじ込キャ
ップを備えた２０ｍｅのガラス管中、（トロリラムスピ
リット（温度８０〜１００Ｃ）１２−に溶解したトリオ
ン４７６００ｍ９Ｃ０，６８ミリモル）およびパルミチ
ン酸１７４ｍ９ＣＯ１６８ミリモル）と混合する。管を
４０℃の腸溶中０．５．１又は３時間インキ−ベートす
る。
反応混合物を冷却し、ろ過し次いで蒸発させる。
ｏｏｏ、ｐｏｏおよびｐｏｐの相対的な量をＨＰＬＣに
よシ決定し、更に導入されたＰの／４１−センテーゾを
、導入されたＰ（％）＝免４“と＋２Ｘ％ＰＯＰとして
計算する。
入されたＰである。
いくつかの次の例において、エステル交換はノ（ッチ操
作として無溶剤又は溶剤を用いて行なわれる。比較試験
によシ以下の内容が確立された。すなわち、バッチエス
テル交換試験によって実征される如く、満足なエステル
交換活性および安定性を有し、更に満足なカラム操作に
要求される粒径分布および物理強度を有する、固定化り
・ギーゼ酵素は、無溶剤又は溶剤を用いて、カラムの連
続操作においても同様に満足に機能する。かくして、こ
のような条件のもとての満足なノクツチテストは、満足
な連続カラムテストが問題の固定化す・（−ゼこの例は
、エステル交換活性に対する、ムコールマイヘイの吸着
中のＰ）１の効果を示す。
９３．０００　ＬＵ／１１のムコールマイヘイリノ母−
ゼ２、ＯＩ！を、水２０ゴに溶解し、次いで水洗デュオ
ライト（ＤｕｏｌＩｔｅ　）　Ｅ８５６２アニオン交換
樹脂１０Ｉ！（乾燥重量８．５．１を懸濁させる。
これらの三つの部分を、それぞれｐＨ５，０，６，０お
よび７．０に調整し次いで約５℃で４時間、電磁攪拌し
た。
３個の部分をろ過した。ろ通抜、三種のる液（洗浄前）
中の加水分解活性（ＬＵ）の量は、全体の初期量（１８
６，０００ＬＵ　）の１０〜１７％であった。
引き続き、少量の水で水洗し、しかる後調製品を室温で
真空下−夜乾燥した。
結果を次表に示す。
５．０　９．２０　９．５　２４．５　６．２　１２．
３６．０　９．５６　８，２　２６．５　６．６　１３
．２７．０　９．４１　８．０　２１．２　５．２　１
０．５例２ １０ＪｉＦづつの三種の湿イオン交換樹脂、デュライト
ＥＳ５６２　（乾燥重量８．３５．９）を、水５０ｄに
懸濁させ次いで−が６．０に安定化するまで４ＮのＮａ
ＯＨを添加した。次いで、それ部分な水で洗浄し、プフ
ナロートでドレインしたが、ドレインされた重量は約１
６．Ｆであった。
二徘の１０１Ｉづつの各々に、水２５−に溶解したムコ
ールマイへイリノ！−ゼ２．５ｇ（活性度９３．０００
１．Ｕ／ｉ　）溶液を添加し、次いで−１を６．０に調
整した。
第三部分に、水５０ｍ１に溶解した上記のムコールマイ
へイリパーゼ２．５ｇの溶液を添加し、Ｐ）′ｌヲ６．
０に調整した。
混合物を室温（２５℃）で２時間ゆっくシ攪拌した。し
かる後、液体をブフナーロートでろ過した。
２５ｒｎ！、のす・ヤーゼ溶液の一つの部分を、更に水
２５−で２回洗浄した。固定化調製品を、真空乾燥した
。
エステル交換アッセイに対し、２５０ダ（乾燥重量）の
固定化す・母−ゼ調製品を、基質と混合する前に２０μ
ｐの水で湿潤せしめた。
２．５１ この例は、未結合り・９−ゼを除去するための、次の水
洗が高エステル交換活性を得るのに必須であることを証
明しており、−刃固定化中、リパーゼが溶解している水
の量は余シ重要でない。
例３ ５０．９の湿イオン交換樹脂、デュライトＥＳ５６２（
乾燥ｍ１４ｔ、ｓ　Ｉ　）　ヲ、ｐ）ｆ　６．　ＯＫ調
整し、次いで例２における如く洗浄した。
この湿イオン交換樹脂（〜５！ｉの乾燥重量）１０．６
．９部を、表に従いムコールマイヘイリＡ？−ゼ（８１
，０００１，Ｕ／１１　）の１０％溶液の種々の量と混
合した。
反応後、リノ臂−ゼをプフナーロートでろ別し、次いで
リパーゼ鯛製品を水２５ｍ／で２回洗浄し、次いで真空
で約９７％の乾燥物質にまで乾燥させた。
アッセイ用の固定化調製品の乾燥重量２５０ｍ９の試料
を、アッセイに洗立ち２０μｌの水で湿潤させた。
以下余白 この例は、す／母−ゼの最逼用量が反応時間に依存する
ことを示している。
例４ 例３からの８ＩｌｌＪＩｉＩ品の２ｆｊ！を、水の添加
量を変えて再び分析した。すなわち、１２゜５１１のリ
パーゼ溶液のサンプルおよび２５ＪｉＪのリパーゼ溶液
のサンプルであり、双方とも反応時間け２時間である。
エステル交換活性に対する水分率の効果は次の表から明
ら”１ある・　リ４下余白 この例は、最適水分含量が約１０％であることを示して
いる。
例５ 例３で得られた調製品の１種を、添加水量を変えて再び
分析した。２５ＩＩのリパーゼ溶液の試料を用い、反応
時間は４時間であった。
以下余白 ２２．８Ｆの湿イオン交換樹脂ジュライトＡ３６１（８
８，２チの乾燥物質）を、−６，０に調製し次いで洗浄
した。
ジュライトＡ３６１の別の試料２２．８．Ｐを、１シ１
調整前に乳鉢でその一部を砕き次いで洗浄した。
これらの各部分に、−６に調整した水２００Ｉに溶解し
た１０１！のムコールマイヘイリ・々−ゼ（９３，０Ｏ
ＯＬＵ／Ｌ）溶液を添加した。反応は室温で２時間行れ
た。
固定化リパーゼを、水ｌ、ｅで洗浄し次いで真空乾燥し
た。
乾燥後未粉細試料を乳鉢で砕き、次いで双方の試料を篩
別した。
（ス、下〉テ＋白 上記表から明らかなように、最大エステル交換活性を得
るには、細かな篩を用いるのが有利であるが、低い圧力
カラム降下に対する要求のため妥協が必要となる。
例７ この例は、固定化り・や−ゼｖ４Ｍ品のパッチエステル
交換活性に対する、種々のカテゴリーの巨視的多孔性の
弱アニオン交換樹脂（マトリックスタイプ、官能基、粒
径）の効果を説明する。
デュオライト（Ｄｕｏｌｌｔｅ）　ＥＳ　５６２　、デ
ュオライトＡ　５６１　、デュオライトＡ７．アンバー
ライ）　（Ａｍｂ＠ｒｌｌｔｅ　）　ＩＲＡ　９３　、
およびアンバーリスト（Ａｍｂ＊ｒｌｙｓｔ　）　Ａ　
２１の場合に、４．２５．ｆの乾燥樹脂を水で洗浄し、
水２０ｄｌこ添加したムコールマイヘイソノ４−ゼ（９
３，０００ＬＵ／ＩＩ）　ＩＩと混合し、混合物を−１
６，０に調整し、次いで室温で２時間ゆりくυ回転した
。ろ通抜、各調整品を２５０−の水で洗浄した。デュオ
ライ）　Ａ　３７８の場合に、８．５１１　ｔ　！Ｊ　
／＃−ゼ２１と混合し、最後・こ水２５０−で洗浄した
。全てを室温で減圧乾燥した。デュオライトＡ３６５、
デュオライト８５８７、およびダウエックス（Ｄｏｗｅ
ｘ　）　ＭＷＡ　−１の場合、４２５ｇの乾燥重量樹脂
を、水約１０ｄ中、ムコールマイヘイリパーゼ（１２４
，０ＯＯＬＵ／＃）１　Ｎと、室温で２時間回転させる
ことによシ混合した（レバティ）　（Ｌｅｗａｔｌｔ　
）の場合には、リパーゼ０．５を用いた）。ろ過し次い
で２溶の水で洗浄後、調製品を室温で真空乾燥した。固
定化酵素の特性例８ ３（ｌのデーオライドイオン交換樹脂タイプｇｓ５６２
を、約７５　ｍｌ−の水に懸濁させ、次いで４　Ｎ　Ｎ
ａＯＨでｌｌ１１を６．０に調整した。イオン交換樹脂
を吸引ろ過器を用い水で洗浄し、次いで吸引除去した。
湿潤イオン交換樹脂（約４５ｇ）を３等部分に分は九〇 最初の１／３　を、ｐＨ６，０に調整した水２０−に溶
解したムコールマイヘイリ／４’−ゼ（２１０，０００
ＬＵ／ｌ／）１１の溶液と混合した。混合後、−を６．
０に再調整し、次いで混合物を電磁攪拌しながら５℃で
４時間反応させた。この時間中、Ｐ１＋は５．４５に低
下した。混合物を、２．３−の水を用いてグフナーｏ　
−）に移し次いで可能な限シの溶液を吸引ろ過した（１
４＋＋＋／）。更に樹脂を水分含量１０．０％溶量に乾
燥した。収率は８．２７ＪＦであった。
湿潤樹脂の第二のｌ／３を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐｆ４６．０）２０ゴに溶解した、予じめ指示さ
れたリパーゼ１ｇの溶液と混合した。混合物のＰＨを、
６に再調整し次いで混合物を磁気攪拌しながら５℃で４
時間反応させた。この時１田中、Ｐｌｌは５，８３に低
下した。湿潤イオン交換樹脂の最初の１／３に関して、
水滴された如く別の手続を行ない、ろ液２１　ｍｌおよ
び９．５−の水分含量を有する乾燥調製品９．１０ＩＩ
を得た。
樹脂の第三の１７３を、前述の如くリパーゼ溶液と混合
したが、ＩＮのＮａＯＨ０，５８ｍｌを添加することに
よｊり、ｐＨを５℃で４時間のカップリング時間中６．
０に保持した。混合物を他の１７３　の樹脂と同様に処
理し、２８−のる液と８．９チの水分を含有する乾燥！
１ｌＡＩ製品８．９５．？を得た。三種のる液は、初期
の全活性の１〜５％を含んでいた。
４０℃で３０分の反応時ｔｎＩ後の、２５０　ｍ９の固
定化＋７　／’Ｐ−ゼ訓製品によるエステル交換活性を
、次表に示す。
ルζ手）１ミ臼 上記表から明らか々ように、手順間においてはわずかに
差異があるのみであった。
例９ この例は、エステル交換活性の固定中、濃度０〜０．５
Ｍの二種の塩の存在の効果を示す。
活性度９３，０００　ＬＵ／１１を有する、膜ろ過し更
に凍結乾燥した、ムコールマイへイリパーゼｉ、ｏ。
ｇの５個の部分を以下の溶液２０ゴに溶解した：１）脱
鉱水 ２）　０．０５Ｍの燐酸ナトリウム　Ｐｔ＋　６．　Ｑ
３）０．５Ｍの燐酸ナトリウム　Ｐｌ五６．０４）０．
０５Ｍの塩化ナトリウム ５）　０．５Ｍの塩化ナトリウム 他の５個の５．２５１１部分（乾燥重量４．２５１１）
のデュオライ）　ｇｓ　５６２イオン交換樹脂を、前記
ｌ）〜５）の２０ゴで平衡化した。デカント後、対応す
るり・千−ゼ溶液を、Ｐ）（６゜０にｆＩＡ整した湿潤
イオン交換樹脂粒子に添加し、次いで容器ヲ２５０で２
時間にわたってゆっくり回転させた。次いで沈殿物をろ
過して集め更に各々を２５０Ｈの脱鉱水で洗浄し次いで
２５℃でＸ全乾燥した（６４時間）。エステル交換活性
のア、セイ結果を次に示す： 以下余白 例１０ この例は、調製品のエステル交換活性に対し、すｔ４−
上固定中の酢酸ナトリウムの高濃度の効果を示す。
膜ろ過し更に凍結乾燥した９　３，０００　ＬＵ／１１
のムコールマイヘイリ／４’−９５個の１　＃部分ヲ、
　別別に次の液体成分に溶解した。
■）脱鉱水 ２）０．０５の酢酸ナトリウム、ｐｌ（６，０３）　１
．０Ｍの酢酸ナトリウム、ｐ）１６．０４）　２．０Ｍ
の酢酸ナトリウム、ｐｉ−１６，０５）４．０Ｍの酢酸
ナトリウム、ｐＨ６，０５個の４．２５．９（乾燥重量
）部分のジェオライ）　Ｅ８５６２イオン交換樹脂を洗
浄し次いで上記５種の溶ｆＩｉ、１）〜５）と混合し、
次いで１５分間振とうした。対応するす・マーゼ溶液お
よび洗浄したイオン交換樹脂を混合し、−６，０に調整
し次いで室温で２時間ゆりくシ回転させた。各調製品を
ろ過し、水２５０ｍ１！、で洗浄し更に室温で真空乾燥
した。調製品をバッチエステル交換活性に対し分析し、
結果を次表に示す。
以下余白 例１１ この例は、ムコールマイヘイリ・ヤーゼ以外の他の微生
物リパーゼの固定を示す。
デンマーク特許出願第２９９９／８４、例２３中に記載
された如＜ｌ１８！製した７サリアムオキシスボラムリ
パーゼを、８８，０００　ＬＵ／１１のリノぐ一ゼロ、
７２１および洗浄しかつ一調整したデーオライドＥＳイ
オン交換樹脂の乾物４．２５．９を−（６，０の水２５
ｄ中で混合し、次いで室温で２時間攪拌することによシ
固定化した。次いで水２５−で２回洗浄し、真空乾燥に
よ多水分含量８．１％を有する調製品４．９３Ｆを得た
。
ろ液中に残存する活性度は最初の活性度の１８チに相当
する。
ツク°オ社から入堆できる商業的製品パラターゼ（Ｐａ
ｌａｔａｓｓ）を限外ろ過することにより、アスペルギ
ルスナイガーエステラーゼを得り。２７９０ＬＵ／−の
ＰＡＬＡＴＡ８１１５−を、上記のｇ８５６２の４．２
５Ｆに固定させこれによ多水分７．６％を有する固定化
ｖＩ４製品４．７７ＪＰを得た。ろ液は最初のＬＵ−活
性度の１３チを有する。
４．２５．９のＦＪｓ　５６２とアマノリパーゼＯＦ１
．４０Ｉを水１５ｍ／中ｐ１４６．０で混合することに
より、アマノから大砲できるカンゾイダ・シリントラシ
ア（ｃａｎｄｉｄ’ａ　ｃｙｌｌｎｄｒａｅｅａ）すｔ
４−ゼ（タイプＯＦ）を固定化した。収量は水分６．５
％を有する固定化調製品４．６２であり更に０．２％の
活性がろ液中に残った。
３種の調製品を次の如く特徴づけた： １）４０℃の標準パッチアッセイによシ、２）３．００
．！９のトリオレイン（０００）　、　０．６００９の
デカン酸（０）および約１０％の水分までに水和した乾
燥リパーゼ調製品２５０ｍ９を用い６０℃で溶剤なしで
トリオレイン（０００）／ｒデカン酸Ｄ）パッチエステ
ル交換による。
例１３に記載した如く、比較のためムコールマイヘイリ
・や−ゼ調製品に対する結果を同様に掲げる。
以下余白 先の例に関連し、より良い概括を得るために、次の表を
参照されたい。
この（これらの）例は、表の左側の事項に起因した、本
発明方法によって得られた固定化ジノ４−ゼ調製品のエ
ステル交換活性に対する影響を示す′。
例番号 ｔ、ｓ　ＰＦ（ ２連続洗浄 ３　反応時間に関しリパーゼ結合 ４−５　水分の）４−センチ−シ ロ　粒径 ７　樹脂のタイプ ８−１Ｏリ／’Ｐ−ゼ溶液中のイオン強度１１　リ・臂
−ゼの微生物源 本発明方法によって得られる固定化ＩＪ　／’？−ゼ調
製品の有用性を実証するため、後に示す如く、本発明方
法によって得られた固定化リノ臂−ゼ調製品を、例１２
に示す如く、溶剤又は他の高価な補助剤を用いず、脂肪
の連続エステル交換Ｖこ用いた。
例１２ この例は、本発明方法によって得られた固定化す・ｆ−
ゼｐ＋製品を用い、充填床反応器内で溶剤又は他の高価
な補助剤を用いず脂肪を連続エステル交換する例を示す
。
固定化 ２．２０１１のムコールマイへイリパーゼ（８１，００
０Ｌｕ／Ｅｌ　）を、水２０ｒｎｔに溶解し、８０％以
上が２００〜４００μｍの粒径を有する、洗浄されたイ
オン交換樹脂ジュオライ）　Ｆ；８５６２の１０５１（
乾燥型Ｊｔ８．５．！７）と混合した。混合物を、ｐｌ
＋５□０に調整し、次いで電磁攪拌しながら５０℃で４
時間放置した。ろ過し次いで少量の水で洗浄後、調製品
を室温で真空乾燥した。収量は９．０５　、Ｐでメジ、
水分９．３％を含有した。ろ液中に残存する活性は全初
期量の８チであった。パッチエステル交換活性は０．５
時間目に３０．６％のｐｏｏ、７ゴ優のＰＯＰ又は１５
．３％の導入Ｐでめった。
カラム試験 この固定化ジノ４−ゼ調製品２ｇをカラムに装入し次い
で２．５対１　（ｗ／ｗ）のオリブ油／／４ルミチン酸
からなる溶岬なしの基質を、６０℃で連続的に供給した
。す・２−ゼ調製品の性能を下記の表に示す。
以下余白 導入されたＰの・母−センテージは脂肪酸メチルエステ
ルのＧＬＣによって測定される。
変換率ｘ＝（％Ｐ−チＰ０）／（チＰ０９−チＰ。ズあ
る。
Ｐ、Ｐ　はオリーブ油基質内で導入されたＰの）臂ｏ　
ｏｑ −センテージ（Ｐ　）であ夛更に平衡状態でＴＧ−混合
物内で導入され九Ｐの・や−センテーノある（Ｐｏ９）
。
コメント ２０８．５時間および４７５時間の結果を基に、半対数
方眼紙にグロットすることから始まる外挿法は、対応す
る変換率Ｘ＝２８％を有する初期活性（フロー）　３．
２１９　ＴＧ／ｈ／ｌ　Ｉ！の酵素を示す。推定の半減
期は、無溶剤でかつオリーブ油／Ｐが２１　／　２　：
　１　（ｗ／ｗ）であ１ｉＯｃである場合５００〜６０
０時間である。圧力降下の問題は生じなかった。オラン
ダ特許出願５６３／７７に記載された種類のセライト−
吸着リパーゼをカラム内で通過させるより先の試みは、
不可能であった。
例１３ この例は、カラム内での固定化り・々−ゼ調製品ノ・母
イロットプラントスケール生産並びに該調製品を、溶剤
なしで６０〜７０℃で基質を装入したカラム内での連続
エステル交換に適用する例を示す。
固定化 ６．０ｋｇ（８１１０乾物）ｆ”−第５イ）　ｇｓ　５
６２イオン交換樹脂を、製造業者の情報（−ｙ′−オラ
イドテクニカルイン７オメーシ曹ン０ＩＩＯＡ）Ｋ従が
い調製した。これは、酸−塩基サイクリング並びにこの
場合には又エタノール洗浄（食品処理において最大純度
を確保するため）を含み、ＰＨを０．１Ｍの酢酸塩緩衝
液中６．０に調製した。懸濁液をカラムに充填し次いで
定着した樹脂（１８，、ｇ）を水７２ｇで洗浄した。
ｐ！（６，０に！ＩＡＩ整した１８Ａのムコールマイへ
イリノや一ゼ（１０、１００ＬＵ／ｍ！　）を、ｐ！（
をコントロールしながら３０．６／ｈで６時間再循環さ
せた。
水２０−で置き代えた後、３７−ｅの合した量は、９７
％の固定化収率に相当する１　２６　ｔ、ｔｒ／ｒｎｌ
を含有していた。更にカラムを別の水２ｏ−で洗浄し、
次いで調製品を室温で真空乾燥し、これによ、９６．０
ｋ１７（９７％の乾物）の固定化リノ々−ゼ調製品を得
た。バッチエステル交換活性は、０．５時間で３０．２
−〇ＰＯ０，６，９％のｐｏｐ又は１４．７チのＰｌｎ
ｃであった。
適用例１ ４、ＯＩの固定化リノや一ゼ調製品を、内径１５１Ｍの
水ジャケット伺カラムに充填した。カラム温度を、６０
℃に保持した。組成２．５７１　（ｗ／ｗ）のオリーブ
油／デカン酸基質を、イオン交換水２１ｍ１で飽和した
３０．１７のデュオライ）８５６１を含有するブレカラ
ムにボング導入し次いで更に固定化Ｉ７１４−ゼ調製品
を含有する主カラムにボング導入した。約６５−の変換
率、すなわち最終トリグリセリドにおいて２３チのＤＯ
Ｏ（ＤＯＯは１個のデカン酸単位（外側にある）および
２個のオレイン酸単位を有するトリグリセリドを意味す
る）に相当する値に出口の組成を保つように、流速を制
御した。
固定化り・や−ゼの活性の減少が第一次反応に続くと仮
定した場合、半減期は３２００時間に推定できる。２．
４Ｉｉのトリグリセリド／時間／酵素調製品Ｉ１１の初
期活性を有し、生産性は２部期間の操作時間を仮定して
蝉素ｐｌ製品１ｋｌ？当たり約８．３トンのトリグリセ
リドである。
第１図は、流速に対する対数を、時間に対してプロット
した図である。
適用例２ 先の適用例１と同じ実験を、６０℃の代りに７０℃で行
った。半減期は１３００時間であることが判明し更に初
期活性は、酵素調製品１　ｋｇ当たりトリグリセリド３
．２トンの生産性に対応する、２．３１のトリグリセリ
ド／時間／酵素調製品１１！であることが判明した。流
速に対する対数を、第２図中時間に対しプロットとした
。
例１４ この例は、溶剤もしくは他の補助剤なしで、牛脂および
大豆油の組成からなる高融点トリグリセリド混合物の連
続エステル交換に対し、本発明に係る方法で得られた固
定化リパーゼ調製品の可能性を説明する。同様のプロセ
スが、水添および化学的エステル交換を用いず特別に脂
肪の製造に対し有用であシ更にマーガリン又は関連製品
にも適当である。
固定 ８０チ以上の粒子が４００〜８５０μｍの粒径を有する
、湿潤（８６，０％の乾物）シュオライド５６１イオン
交換樹脂１９．８．Ｐを、水性懸濁液中ｐｌ（６，０に
調整し次いで水で洗浄した。ムコールマイへイリノ母−
ゼ（７４００ＬＵ／＊＋瓜８％乾物）５０−を、樹脂と
混合し、ｐｌ（’ｉ　６．０に調整した。室温で２時間
攪拌後、ろ過し次いで５０ゴの水で２回洗浄し、調製品
を室温で真空乾燥した。収量は、８．５チの水分を含有
し、１９．１１であった。ろ液中に残存する活性度は全
体の、初期量の３４チであった。
バッチエステル交換活性は、２５．４％のＰｏｏ。
０．５時間目に６．０％のｐｏｏ又は１２．５％のＩｎ
ｃ　。
Ｐであった。
エステル交換活性の分析 自生Ｊｌｉｊ、および新鮮な精製大豆油を地方の市場か
ら入手した。基質は牛脂１．５部および大ヴ油１部から
なシ、これらを７０℃で混合した。ＢＨＴ抗酸化剤を０
．１チ濃度で添加した。個々の成分を特徴づけかつエス
テル交換反応をたどるため、ｆ（ＰＬＯを用い基質成分
のトリグリセリド成分、初期混合物およびエステル化混
合物を分析した。２．７５ｇの固定化ムコールマイへイ
リパーゼ調製品、２４ｇの牛脂および１６ｇの大豆油の
初期バッチ反応を、６５℃で１６．５時間行った。ＨＰ
ＬＣは、混合物中ＬＬＬ−）リグリセリドに対するＬＰ
Ｏ−（Ｌ：リルイック、　ｐ　：　ｉ！ルミチック、０
ニオレイツク）の割合が０．６２から１．１６に増加す
ることを示し、後者は恐らく平衡割合に近いであろう。
エステル交換された混合物の融点 エステル交換による融点の変化を、公的Ｉ　ＵＰＡＣ−
法（ＩＵＰＡＣ：５ｔａｎｄａｒｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｆｏｒ　ｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｏｌｌ＋　ｆ
ａｔｌＩ、ａｎｄ　ｄ＠ｒｉｖａｔｉｖｅｓ。
第６版、　ｍｅｔｈｏｄ　＆２．１４１　（１９７９）
りこよる膨張により分析した。結果を次表に示すが、対
照は、牛脂および大豆油の対応する非エステル化混合物
（１，５：１）である。
カラム試験 連続プロセスを実証するため、小さなサーモスタット制
御のカラムシステムを、２日間操作した。
説明した固定化リパーゼ調製品４．０．９を、力２ムに
装入した。又、湿潤デ瓢オライ）Ａ５６１樹脂（５０チ
乾物）５Ｉを含有するグレーカラムを用いた。１．５　
：　１　（ｗ／ｖ）の割合の牛脂／大豆油を、６７℃で
カラムシステムに連続的に供給した。固定化すｔ！−ゼ
調製品の性能を次表に示す。
以下余白 １８時間目の製品　２．１０　０．９０　５２４１時間
目の製品　１．６３　０．９３　５４平衡（バッチ）　
−１，１６１００ 例１５ この例は、脂肪加水分解に対する、本発明に係る固定化
リパーゼの適用を示す。
純粋な牛脂および水のｌ：１混合物（各々４０Ｉ）に、
例１３で説明した如く調製した固定化リパーゼを、１０
０　ＬＵ／脂肪ＩＩに相当する量を、又は固定化リバー
９１ｇ当、り　３０，０００　ＬＵの負荷を仮定しつつ
、固定化酵素す・ヤーゼ調製品０，１３Ｉを加えた。４
８Ｃで磁気攪拌することによシ、有効な混合を得た。水
相中の初期ｐＨヲ８．０に調節した。４日後、酵素を分
離後次いで加水分鮮度（ＤＨ）に対し脂肪相を分析した
。二重反復試験を行った。回収した固定化酵素を、第２
回目の試験に対し用い更に脂肪ｌＩｉ当たシ１００１．
Ｕに相当する量で添加された、可溶性ソノ４−ゼによる
比較実験を行った。この場合、水相を第２回目の実験に
用いた。三種の試験を、可溶性リノーーゼについて行っ
た。
固定化リノや−ゼ　１　３０　３１ 可溶性リノ母−ゼ　１　６１　５ ２　５５　８ ｐｉ（値は、固定化酵素を用いた場合約６．８に降下し
、更に可溶性１）ノ４−ゼを用いた場合、第１回目試験
では約６．３に第２回目試験では約７．４に降下した。
ＤＨ（釣を、ケン化価（ＳＶ）によって除した酸価（Ａ
Ｖ）として計算した。
【図面の簡単な説明】
第１図および第２図は、流速に対する対数を時間に対し
プロットしたグラフである。 特許出願人 ／Ｎ　インダストリ　アクテイーゼルスヵゾ特許出願代
理人 弁理士青水　朗 弁理士西舘和之 弁理士内田幸男 弁理士　山　口　昭　之 弁理士西山雅也

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、脂肪のエステル交換を意図する固定化リノ町−ゼ調
    製品の製造方法であって、微生物り・母−ゼの水溶液を
    、個々の粒子から成る、巨視的多孔性の弱アニオン交換
    樹脂であって第一級および／又は第二級および／又は第
    三級アミノ基を含有し更に過剰の圧力降下なしでカラム
    操作に対して適当な比較的大きな平均粒径を示す該樹脂
    と、所望量のり／４−ゼがアニオン交換樹脂と結合する
    のに十分な時間、該す・臂−ゼがアニオン交換樹脂を結
    合するような条件のもとで接触させ、しかる後得られた
    固定化酵素を水相から分離し次いで分離された固定化酵
    素を約２〜４０チの水分含量に乾燥することを含んでな
    る、前記方法０２、前記リパーゼが、熱安定性す・や−
    ゼである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記微生物ソノ４−ゼが、高温性ムコール種、特に
    ムコールマイヘイ（Ｍｕａｏｒ　ｍ１ｅｈｓｉ）から由
    来する、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４、前記巨視的多孔性の弱アニオン交換樹脂の９０％以
    上の粒子が１００〜１０００μｍの粒径、好ましくは約
    ２００〜４００μｍの粒径を有する、特許請求の範囲第
    １〜第３項のいずれかに記載の方法。 ５、前記微生物リノ母−ゼの水溶液の量と弱アニオン交
    換樹脂の重量の割合が、イオン交換樹脂ＩＩ（乾燥重量
    ）当たシ、５，０００〜５０．０００１．Ｕである、特
    許請求の範囲第１〜第４項のいずれかに記載の方法。 ６、前記イオン交換樹脂と水溶液との接触−Ｉが５〜７
    である、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ７、前記接触時間が０．５〜８時間である、特許請求の
    範囲第１〜第６項のいずれかＶＣ記載の方法。 ８、前記分離が簡単なろ過失によシ行なわれる、特許請
    求の範囲第１〜第７項のいずれかに記載の方法。 ９、前記乾燥を、５〜２０％の水分含量まで行なう、特
    許請求の範囲第１〜第８項のいずれかに記載の方法。 ｉｏ、前記側々の粒子から成る、巨視的多孔性の弱アニ
    オン交換樹脂を、該樹脂と微生物リパーゼの水溶液との
    接触前、接触中又は接触後、架橋剤水溶液、好ましくは
    ０．１　＝　１．　Ｏ％　ｗ／ｗのグルタルアルデヒド
    水溶液と一緒にし、しかる後残存架橋剤溶液を特徴する
    特許請求の範囲第１〜第９項のいずれかに記載の方法。 １１　脂肪のエステル交換方法であって、溶融遊離脂肪
    酸と任意ＶＣ混合された溶融脂肪を、無溶剤で、又は他
    の高価な補助剤なしで、又は実質的に溶剤又は他の高価
    な補助剤なしで、微生物す・母−ゼの水溶液を、個々の
    粒子から成る、巨視的多孔性の弱アニオン交換樹脂であ
    って第一級および／又は第二級および／又は第三級アミ
    ン基を含有し更に過剰の圧力降下なしでカラム操作に対
    して適当が比較的大きな平均粒径を示す該樹脂と、所望
    量のす・ソーゼがアニオン交換樹脂を結合するのに十分
    な時間、該リパーゼがアニオン交換樹脂を結合するよう
    な条件のもとで接触させ、しかる後得られた固定化酵素
    を水相から分離し次いで分離された固定化酵素を約２〜
    ４０％の水分含量に乾燥することを含んでなる、脂肪の
    エステル交換を意図する固定化り・９−ゼ調製品の製造
    方法ｅこよって製造された固定化酵素と接触させること
    を含んでなる、前記方法。 １２、脂肪を加水分解する方法であって、トリグリセリ
    ドおよび水のエマルションを、無溶剤で又は他の高価な
    助剤なしで、又は実質的に溶剤なしでもしくは実質的に
    他の高価な助剤なしで、微生物り・や−ゼの水溶液を、
    個々の粒子から成る、巨視的多孔性の弱アニオン交換樹
    脂であって第一級および／又は第二級および／又は第三
    級アミノ基を含有し更に過剰の圧力降下なしでカラム操
    作に対して適当な比較的大金な平均粒径全庁す該樹脂と
    、所望量のリパーゼがアニオン交換樹脂全結合するのに
    十分な時間、該り・！−ゼがアニオン交換樹脂を結合す
    るような条件のもとで接触させ、しかる後得られた固定
    化酵素を水相から分離し次いで分離された固定化酵素を
    約２〜４０％の水分含量に乾燥することを含んでなる、
    脂肪のエステル交換を意図する固定化リパーゼ調製品の
    製造方法によって製造された固定化リパーゼ調製品と接
    触させることを含んでなる、前記方法。 １３、脂肪の合成方法であって、グリセロールおよび遊
    離脂肪酸の混合物を、無溶剤又は他の高価な助剤なしで
    又は実質的に溶剤なしでもしくは実質的に他の高価な助
    剤なしで、微生物リパーゼの水溶液を、個々の粒子から
    賊る、巨視的多孔性の弱アニオン交換樹脂で心って第一
    級および／又は第二級および／又は第三級アミ７基を含
    有し更ｅこ過剰の圧力降下なしで力２ム操作に対して適
    当な比較的大きな平均粒径を示す該樹脂と、所望量のり
    ・９−ゼがアニオン交換樹脂を結合するのに十分な時間
    、該り・母−ゼがアニオン交換樹脂を結合するような条
    件のもとで接触させ、しかる後得られた固定化酵素を水
    相から分離し次いで分離された固定化酵素を約２〜４０
    ％の水分含量に乾燥することを含んでなる、脂肪のエス
    テル交換を意図する固定化す・４−ゼ調製品の製造方法
    によって製造された固定化リパーゼ調製品と接触させる
    ことを含んでなる、前記方法。 １４、微生物リパーゼの水溶液を、個々の粒子から成る
    、巨視的多孔性の弱アニオン交換樹脂と接触させること
    によって得る、ことのできる、溶剤もしくは他の高価な
    補助剤の使用なしで、脂肪のエステル交換、脂肪の加水
    分解および／又は脂肪の合成用の固定化り・臂−ゼ調製
    品であって、交換樹脂が第一級および／又は第二級およ
    び／又は第三級アミノ基を含有し更に過剰の圧力降下な
    しでカラム操作に対して適当な比較的大きな平均粒径全
    庁す該樹脂と、所望量のリパーゼがアニオン交換樹脂を
    結合するのに十分な時間、該リノ（−ゼがアニオン交換
    樹脂を結合するような売件のもとで接触させ、しかる後
    得られた固定化酵素を水相から分離し次いで分離された
    固定化酵素を約２〜４０チの水分含量に乾燥することを
    含んでなる、前記固定化リノＪ？−ゼ調製品。 以下余白
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