JPS63254989A - トリパルミトレイルグリセライドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野ン パルミトレイン酸（以下、ＰＯＡと略す）は広く生物界
に存在する不飽和脂肪酸の１つで、従来、抗腫瘍剤、虫
歯菌抑制、健康老化との関係、さらに化粧品分野利用、
また最近では高血圧性疾患における血管障害を防護する
作用（特開昭５９−１７５４２５）等が報告され、優れ
た薬理作用、生理作用を示すことが明らかにされている
が、ＰＯＡのトリグリセライド（以下、ＴＧと略す）の
形であるＰＯＡ−ＴＧは今後広く化粧品、医薬品用途へ
の開発が期待される。

〈従来の技術〉 前述のとおり、ＰＯＡは広く自然界に存在するが、その
多くがＴＧの形であり、それらＴＧの分離・精製法は広
く知られているが、ＰＯＡ−ＴＧはほとんど存在しない
ため、約６０％のＰＯＡ含量が限界である。一方、ＴＧ
の合成法としては、脂肪酸を活性化してグリセロールと
反応させる方法が知られている。活性化脂肪酸としては
、（１）脂肪酸を酸クロリド化して用いる方法カナディ
アン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー・アンド
・フイジオロジ−（Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、主１．９５３　（１９５３）　
、（２１脂肪酸をイミダゾール塩として用いる方法（特
開昭５１−９１２１３．１１ｅｒｍｅＬｔｅｒ　らケミ
ストリー・アンド・フィジックス・オブ・リビズ（ＣＩ
＋ｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ）　１９８１年１
１．１ｆｔ’ｒ、および（３）脂肪酸を酸無水物として
用いる方法（Ｒｅｇｅｎ　ら、ジャーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサエティ　（ＪＡＣ３）１９８２
年、１０４．７９１）が知られている。しかしながら、
工業的レベルでのＰＯＡ−ＴＧ製造方法については報告
されていない。

（発明が解決しようとする問題点〉 しかしながら、かかる脂肪酸活性化法は、（１）二重結
合がハロゲン化される、（２）試薬が端価、（３）加熱
等の条件が過激、などのＰＯＡ等の不飽和脂肪酸からの
工業的規模におけるＴＧ合成には不都合な点が多い。ま
た、従来の活性化脂肪酸とグリセロールの合成反応も加
熱するなど好ましくない点が多い。

本発明の目的は、以上のような問題点を解決するための
もので、ＰＯＡとグリセロールにリパーゼを作用させる
ことにより、ＰＯＡ−ＴＧ合成反応を行わしめることに
ある。而して本発明の方法による反応を利用すれば、Ｐ
ＯＡ−ＴＧを常温付近、常圧、中性付近の温和な反応条
件下で効率よく高純度、高品質な状態で製造でき、化学
的合成法に比べて工業的規模において酒易かつ経済的に
製造することができる利点がある。

く問題点を解決するための手段及び作用〉本発明者らは
鋭意研究の結果、有ｍｔ８媒および・特定水分の存在下
でＰＯＡとグリセロールにリパーゼを作用させることに
より、上記の目的が達成されることを見い出した。

本発明は、かかる知見に基いて完成されたものであり、
即ち、リパーゼとある特定の水分を含んだグリセロール
をＰＯＡの有機溶媒溶液と効率よく接触せしめることに
よりＰＯＡ−ＴＧ合成反応を起こさせることを特徴とす
るＰＯＡ−ＴＧの製造方法である。

本発明に用いるＰＯＡは微生物、植物油、魚油などの天
然物から抽出・精製されたものでもよいし、化学合成の
ものでもよい。天然物の代表的な微生物の例としては、
サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サツカロミセス・カー
ルスベルゲンシス（５ａｃｃｈａｒｏ＋＊ｙｃｅｓｃａ
ｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）　、サツカロミセス・デル
ブリッキー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｌｂｒ
ｕｅｃｋｉｉ）　、キャンデイダ・ニーティリス（Ｃａ
ｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）、ロドトルラ・グルティリ
ス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｇｌｕｔｉｌｉｓ）など
があげられ、また植物油の例としては、マカダミアナッ
ツ油、米ぬか油などがあげられ、また魚油の例としでは
ニシン油、イワシ油、鯨油などを示すことができるが、
いずれもこれらによって限定されるものではない。

本発明に用いるグリセロールは、天然物であっても、ま
た合成品であっても良い。

次に本発明で用いられる有機溶媒は、低極性の疎水性を
存するものであり、これらを単独または混合して使用し
ても何ら差支えない、該有機溶媒としてはｎ−ヘキサン
、ｎ−ヘプクン、ｎ−ペンタン、ｎ−オクタン、イソオ
クタン、シクロヘキサン、イソプロピルエーテル５　ジ
エチルエーテルがあるが、価格等の点でｎ−ヘキサンが
最も好ましい。

本発明で用いられるリパーゼの種類は特に限定するもの
ではないが、一般的にはシュードモナス属、キャンデイ
ダ属、クロモバクテリウム属、アスペルギルス属、ペニ
シリウム属、ムコール属。

ジオトリカム属、リゾプス属、アルスロバクタ−属、ヒ
コミセス属、スタフィロコッカス属などの微生物あるい
はこれらを起源とするリパーゼ、すい臓などの動物臓器
より得られるリパーゼ、ひま種子などの植物種子より得
られるリパーゼ等が使用できる。また、これらリパーゼ
は精製した酵素標品ばかりだけでなく、未精製品でも用
いることができ、その純度については特に限定するもの
ではない。

リパーゼ生産菌について１例をあげると、シュードモナ
ス・フルオレシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆ　Ｉ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ）　、キャンデイダ・
リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ）
、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　
ｎｉｇｅｒ）　、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕｓ）、ペニシリウム・ロク
エホルテイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｒｏｔｕｅｆｏ
ｒｔｉ）、リゾプス・ジャバニカス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ
　ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプス・デレマル（Ｒｈｉ
ｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｓａｒ）、リゾプス・ニベウス（
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　Ｎ１ｖｅｕｓ）　、リゾプス・オリ
ゴスポラス（ＲｈｉｚｏｐｕＳｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ
）、リゾプス・アルヒザス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ａｒｒ
ｈｉｚｕｓ）　、ムコール・スフ（Ｍｕｃｏｒ　５ｕｆ
ｕ）、ムコール°ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒｊａｖａｎ
ｉｃｕｓ）、ヒコミセス・ニテス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅ
ｓｎｉｔｅｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　などが
あげられる。

さらに、本発明では、かかるリパーゼを使用する反応系
において、該リパーゼを固定化物とみなした形態で利用
できる。一般に、酵素はｐＨおよび安定性改良、活性維
持、再使用などを目的として固定化することがあるが、
固定化用担体としてはセルロース、デキストラン、ポリ
スチレン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール
、イオン交換樹脂、磁性体、活性炭、アルミナ、光架橋
性樹脂、アルギン酸塩、各種ゲル化剤などが使用される
。本発明ではこれらの固定化爪体に該リパーゼを吸着、
イオン結合、共有結合あるいは包括させて粒状、膜状も
しくはシート状の固定化リパーゼとなし、使用すること
ができる。

本発明でＰＯＡとグリセロールを前述のリパーゼにより
反応させる場合に、水分量をグリセロールに対して０．
１〜２０％、好ましくは１〜１０％の範囲に限定するこ
とが好ましく、これによりＰＯＡ−ＴＧ合成反応を一層
効率よく進行させることができる。

本発明の方法により、ＰＯＡとグリセロールとを反応さ
せるには次のようにする。すなわち、ＰＯＡを適当な攪
拌機のついた容器に採り、これを、使用したＰＯＡの０
．５〜１０倍容量程度の有機溶媒に溶解させる。ついで
グリセロールを、使用したＰＯＡに対して０．２〜２倍
重量加える。

さらに対ＰＯＡ０．１％〜１０重量％のリパーゼを粉末
状、粒状、もしくは水溶液として加える。

反応系に必要な水は、緩衝液などの水溶液の水分として
通常供給される。従って、これらの水分量は本発明に規
定する量、すなわちグリセロールに対して０．１〜２０
％となるように予め計算しておくことが必要である０次
いで、攪拌機で内容物を混合状態となし、ｐＨ４〜８、
好ましくはｐＨ５〜７．５．２０〜５０℃、好ましくは
３０〜４５℃で約１２〜１５０時間反応を行なわしめる
。

反応終了後、を機溶媒相とグリセロール相とを分離し、
有機溶媒相を濃縮し、これにシリカゲルあるいはアルミ
ナなどの吸着カラムクロマトグラフィー、溶剤分別など
の精製処理を施して目的物を得ることができる１分離し
たグリセロール相及び未反応のＰＯＡ、反応中間物であ
るモノグリセライド、ジグリセライドはそれぞれ次回の
反応に原料としてて加えることができる。

〈発明の効果〉 本発明の方法によるＰＯＡ−ＴＧの製造方法は、熱履歴
が少なく、簡易な反応であるため、高純度、高品質な目
的物を安定して経済的に得ることができる。

〈実施例〉 以下、実施例により具体的に説明する。

実施例１ ガラス製三角フラスコ（２００ｍｆ）にＰＯＡ（酵母由
来、純度９８％）１５ｇを採り、ヘキサン４０ｍｆで溶
解した。さらにグリセロール６ｇを添加し、リン酸塩緩
衝液（ｐＨ７，０）０．２ｍｌで湿潤状態にしたリパー
ゼ（天野製薬停荀製、Ｐｓｅｕｄｏａ＋ｏｎａｓ　Ｎｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｓ由来）ｌｏｏｍｇを加えた、３５℃で
マグネチツクスタラーで攪拌しながら４８時間反応させ
た。反応液のヘキサン相の一部をヘキサン／エーテル／
酢酸（８０；４０：１）を展開溶媒としたＴＬＣ（メル
ク社製Ｆ２５４）にカケ、クロマトスキャナー（島津Ｃ
Ｆ−９３０）で各スポットを定量したところ、ＰＯＡ−
ＴＯが約２０％含まれていた。溶媒分別及びカラムクロ
マトグラフィーにより、はぼ純粋なＰＯＡ−Ｔ（１；が
得られた。

実施例２ ジャーファーメンタ−（５Ｒ）中にＰＯＡ　（酵母由来
、純度９８％）５５０ｇを係り、ヘキサン１４００ｍｆ
で熔解した。さらにグリセロール２５０ｇ、リン酸塩緩
衝液（ｐＨ７，０）１ｍ！！、、実施例１で使用したリ
パーゼ３．５ｇを加え、４０℃で撹拌（８００ｒｐｍ）
Ｌながら１２０２０時間反応た０反応物の各割合をＴＬ
Ｃで分析した結果、次の通りであった。

Ｔ’ＯＡ　　　　　　　２７％（重量、以下同じ）モノ
、グリセライド　　４％ ジグリセライド　　２１％ ＰＯＡ−ＴＧ　　　　４８％ 実施例３ 生理食塩水１００ｍｊ！に４．６％濃度になるように加
熱溶解させたに一カラギーナン溶液と５％リパーゼ（実
施例１で使用したもの）水溶液２０ｍ１ｌを４０℃で混
合し、３％塩化カリウム水溶液中に攪拌上滴下すること
により、包括リパーゼ粒子ゲルを形成させた。これを減
圧乾燥することにより固定化リパーゼを得た。

ＰＯＡ　（実施例１で用いたもの）１００ｇ、グリセロ
ール５０ｇに対してｎ−ヘキサン３００ｍ１を加えて基
質溶液を調整し、これに上記の固定化リパーゼ１ｇとリ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）２ｉｎｌを加え、３５℃、
７２時間撹拌してエステル合成反応を行なった０反応生
成物組成は、実施例１と同様の操作にてａＮクロマトグ
ラフィーにより図１の結果を得た。７２時間後の最終反
応率は７８％であった。

実施例４ グルコース０．１％、ペプトン１％、イーストエキス０
．５％、塩化ナトリウム０．５％を含む培地（ｐＨ７，
０）を用いて３０℃で２４時間培養したシュードモナス
・フルオレセンスＣＰｓｅｕｄｏｔｓｏｎａｓ　ｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｓ）　Ｉ　Ｆ　Ｏ３５０？菌体を凍結乾
燥した。

ＰＯＡ　（実施例１で用いたもの）５０ｇ、グリセロー
ル２５ｇに対してｎ−ヘキサン１５０ｍＡを加えて基質
溶液を調整し、これに上記乾燥菌体Ｉｇとリン酸塩緩衝
液（ｐＨ７，０）２ｍＡを加え、３５℃７２時間攪拌し
てエステル合成反応を行なった。反応生成物組成は、実
施例１と同様の操作にて薄層クロマトグラフィーにより
次の通りであった。

ＰＯＡ　　　　　　　３６％ モノグリセライド　１９％ ジグリセライド　　２９％ ＰＯＡ−ＴＧ　　　　１６％ 実施例５ 実施例４で用いた乾燥菌体を５０％濃度になるように生
理食塩水に懸濁し、更に４倍量の６！ｉ１％アルギン酸
ナトリウム水溶液と混合して菌体の懸濁液を調整した。

これを０．５モル濃度の塩化カルシウム水溶液中に撹拌
下滴下させ、包括菌体粒子ゲルを形成させた。これを減
圧乾燥することにより固定化菌体を得た。この固定化菌
体２ｇを実施例４の乾燥菌体の代りに用いて、実施例４
と□同様の条件、操作によりエステル合成反応を行なっ
て、次の結果を得た。

ＰＯＡ　　　　　　　３３％ モノグリセライド　１７％ ジグリセライド　　２９％ ＰＯＡ−ＴＧ　　　　２１％

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明実施例３における反応生成物の組成を示
す図表である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）パルミトレイン酸とグリセロールを、リパーゼ又
   は、リパーゼを生産する微生物と有機溶媒の存在下で反
   応させることを特徴とするトリパルミトレイルグリセラ
   イド（以下、 ＰＯＡ−ＴＧと略す）の製造方法。
2. （２）パルミトレイン酸が、酵母等の微生物、マカダミ
   アナッツ、米ぬか等の植物、鯨、いわし等の魚油からの
   抽出・精製による天然物由来のパルミトレイン酸である
   特許請求の範囲第１項記載の製造方法。
3. （３）有機溶媒が、ｎ−ヘキサン、ｎ−ペタン、ｎ−ヘ
   プタン、ｎ−オクタン、イソオクタン、シクロヘキサン
   、イソプロピルエーテルまたはジエチルエーテルである
   特許請求の範囲第１項記載の製造方法。
4. （４）リパーゼが固定化物である特許請求の範囲第１項
   記載の製造方法。
5. （５）固定化リパーゼを充填したカラムを用いる特許請
   求の範囲第４項記載の製造方法。
6. （６）微生物が固定化物である特許請求の範囲第１項記
   載の製造一方法。
7. （７）固定化微生物を充填したカラムを用いる特許請求
   の範囲第６項記載の製造方法。