JPS5840086A - 酵素剤の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、エステル交換活性の、ｉＩＩい酵素剤、特
に乾燥した系中において該活性を（、（する酵素剤及び
その製造法に関するものである。

脂質分解酵素は、消化薬、酵素フレーバー、皮なめし、
洗剤、化粧品、醸造、グリセリドのｆＭ　ｔｌ’ｉ分析
等多くの用途が開発され利用さｔ］ている。これらの用
途は酵素が脂質を分解する性ｔσ［１こ係わるものであ
ることからも明らかな通り、一般に酵素の脂質を分解す
る力価（脂質分解油１１１）が、酵素の価格を左右し或
いは酵素調製における当然の尺度となっている。

ところで、近年脂′ｎ分解酵素のエステル交換への利用
に着［１した（す１究が散見されるようになり、本発明
片もそイ冒こ１比ねって来たが、脂質分解酵素によるエ
ステル交換（（は水が必要であること、すなわちエステ
ル交換反応は分解反応と合成反応のり逆反応のＸ、Ｌｌ
果てう）前反応をＩＩ′ｉｊ提とすること、との７６え
方が当初からあり、従ってそこにおいても酵素のとり扱
いは従来通り脂質分解活性を重要な尺ｊ則の一つとして
いた。

しかし、本発明者は上述の研究を進める中で、エステル
交換を利用して得る目的物によっては、反応糸の水分を
むしろ１１Ｔ及的低下ざ庁ることの重要性と、それによ
って生じる反応速Ｊ廷の低Ｆをカバー−Ｊ−る別の方途
の検討が必要であることに想到した。そして、脂質分解
活性のある酵素でも、特に糸の水分か１１（いときには
、エステル交換を行う１１１（力が（Ｊとんどないもの
が少なくないこと、或いはエステル交換のｌ占性をツバ
ず同ロットの酵素から利用し易い製剤を数種調製した際
に、φ９剤の脂質分解活性が同等であるにもかかわらず
、酵素のエステル交換を行う活性は異なることがあるこ
と等脂質分解活性とエステル交換活性の不相応の現ψを
見出し、エステル交換２１（７性についての明確な概念
規定の検討と、特に水分の低い系でも１１１常的１こ高
いエステル交換活性を肉くず酵素剤を４’＋ｒる方／）
２について研究を深め、遂には既存の酵素に（Ｊ認ぬら
れないエステル交換高活性の製剤をｌ：ｌｌ’ｌｌ製で
きることを見出すにいたり、酵素剤及びぞのｌｌＩ！造
法についての提案を行った（特願昭５５−２９７１１７
）。

すなわち先の発明は、既存の／＃累でｌ：ｌ　Ｍ　Ｌ、
　ｉｆかったエステル交換高活性の酵素剤に関するイ）
θ）であり、また、脂質分解酵素を担体ととも１こ水和
し、これを充分緩慢な初期速＋ｉで誠庄乾燥することを
骨子とするエステル交換活性を賦活乃至増大さく！。

た酵素剤の製造法に関するものである。

しかしながら、本発明者ＩＪ１さらに検ｉ・１を進める
中で、上記乾燥は、充分緩慢な明期速度で乾燥するとい
う条件を満足する限り、減圧手段のみに依存する必要は
なく、より広範な手段を採用し得ることを見出した。

ずｆ（わち、この発明は、脂質分解酵素を担体とともに
水和１７、エステル交換活性（Ｋ、ｒ値〕を賦活乃至増
大−１１−１，むるに充分緩慢な乾燥速度て、これを乾
燥（減圧手段による場合を除く）することを・ＩＩ４・
子とする酵素剤の製造法である。

以ドこの発明を説明するが、まずエステル交省活γ１に
ついて説明する。

ｉ−なわら、一般に反応亭がＸ（但し完全に反応した状
カ１；か］、干反応の状態をｏ）、反応時間が１て、１
．＃、　Ｌ６．＼４ノＱ　ｄｘ／ｒｌＬは（１−Ｘ）ｉ
こ比例するとして、比１ダ１定数ｋ　＝−ｖｌｎ　Ｔマ
である。エステル交換を行なわせる反応系は低水分とし
、エステル交換活性の測定１．１、適当な標品脂肪酸を
定め、その分布状況を測定することにより行なうことと
する。

ここで「完全に反応した状態」とは、充分な反応時間を
とって１ｊ１１肪酸分布が実質的に一定した状態のこと
をいうか、酵素の特異性の有無及びその内容が明らかで
あるときは、理論的に［完全に反応した状態」を設定す
る方が簡便−Ｃあり、才だ支障がない。例えば、グリセ
リドの１，３位に対して選択的に作用する（２位に対し
て作用しない）ことが明らかな酵素を用いるとき、グリ
セリドの２位を除く脂肪酸分布が完全にランダム化した
状態をもって「完全に反応した状態」とみなすこととす
る。そしてエステル交換活性〔絶対値）　Ｋａは比例定
数ｋに基′Ａｊｆｔ／酵素剤１ｎを乗じたものとする。

エステル交換活性〔相対値）　Ｉ（ｒ　ｌ；ｌ、　Ｋａ
を酵素剤１ｇｒの脂質分解活性でＫａを除するものとす
る。

この発明で、エステル交換活性の標ｇｌ的１１１１１〆
ｉ！方法についてより詳細な説明すると次の通りである
。

ヤシ浦（日本薬局方所載規格）とステアリン酸メチルエ
ステル（主としてＣ１７１１３５αＸ）ＣＩ　Ｊ３　　
及びｃ１５ｕ３□ｃｏＯｃｔｉ３（！：　カラｆ、Ｋ　
リＣ１１１１２３ＣＵＯＣＩＩ３　ヲ含”Ｊ、　すい）
との等宙ｍ混合物（但し水分α０２重量％以下であるこ
と）　２０　ｇｒ及び、（湿っているものは真空乾燥に
より可及的水分をＦげた）酵素剤１　ｇｒ　（系中水分
の合計は０．０８±０，０２％の範囲内）を３００−容
の栓付マイヤーに仕込み、窒素ガスで空気を５− ｔ１’＋’、　１１！／、！　（’ｋ　３００−５００
　ｒｐ＋ｎで攪拌しなから４０’Ｃｃ２４時間（１１，
１）反応させる。得た反応物を約２時採取し、助層クロ
マトグラムに７／！ｍして脂肪酸メチルＣステル区分を
分取し、ガスクロマトグラムによりこの区分の脂肪１ｌ
ｌＩ２組成を求める。８識脂肪酸はラウリン酸とし、メ
チルエステル区分における椋ａ　ｌ１ｌ（肪酸の構成側
音の値について、完全に反応した状態の値をａ、ｔ−１
（日）における値を５１【−０における値をＣとして、 Ｉ］ ｘ　＝丁、　ｋ　＝　Ｉｎ−、、−”４ｇ−、Ｋａ　＝
　２０１ｎ響である。

ここで、酵素の特異性か明らかであるときａは、＋＋ｉ
Ｊ掲例〔ハ如くグリセリドの１．３位に対して特異性を
有する酵素で例・Ｊζ１−ると、ヤシ浦トリグリセリド
の１．３（＼ｒの反応部位（脂肪酸基）とステアリン酸
メチルエステルの反応部位（同）の重量相に対する１、
３位に結合しているラウリン酸基の市鼠割今として求め
ることができる。また例えばグリセリドの位１？７に対
する選択性が実質的に認められない酵素の場合は、グリ
セリド及びメチルエステルの全反応部位に対する全ラウ
リン酸基の割６− 合として求めることができる。脂質分解活性ＩＪ使用酵
素剤１ｇｒが毎分生成する脂肪酸の／ＬＮ１で表ンバす
るものとし、幅木らの、Ｊ　、Ｇｅｎ、　Ａｐｐ　ｌ　
、〜１ｉｃｒｒ市ｉｏ１．。

９、３５３　（１９６３）　　に記載された力冒去に塾
して測定する。

次に酵素剤の製造υミについて説明する。

原料となる酵素力全酵素含有物（ｊ１脂貴公解活性を呈
するものを使用する。ｌｌ１Ｖ質分解活性を星（。

てエステル交換活性を呈しないものにはエステル交換活
性を賦活できるが、脂質分解活性のないものは、いかに
加工してもエステル交換ｌ＋Ｉｉ　Ｍを賦活できない。

エステル交換反応は少くともＭ′ＬＬ１分解活性部位を
必要とすると解される。本発明と”が入手した市販酵素
を検討した限りにおいてｔＪｌある種の菌体内酵素のよ
うに、弱いながらも少しはエステル交換活性を示すもの
もあるが、他の脂質分解酵素は単独ではほとんどエステ
ル交換活性を、Ｙ≦さない傾向にある。使用する酵素又
は酵素含（１・杓の起源、精製度、選択性について特に
問うところでなく、起源的には細菌や酵ＩＭ等の脂質分
解酵素から高’＝’ｒ　ｉｌ’ｌＪ値物のＩＩＲ？ｊ分
解酵素まで広く使用できるが、酵素に、１；るエステル
交換で選択性が皆無であるとアルカリ金属廻；媒等を用
いるエステル交換反応に対する格別な優位性を見出し難
いので、実用的には何らかの選択性、例えばグリセリド
に結合する位置の選択性とか、脂肪酸の種類に対する選
択性とかを有す−るものがよい。

脂］％ｔ　分解活性を有する酵素乃至酵素含有物は、オ
、Ｊ−１ＩＩＩ体とともに水和させることが必要であり
、酵素を１１１に乾燥ｊ７た状態で担体と混合するだけ
ではエステル交換１１り性が賦活乃至増大されない。こ
こで水ｍ　ｌｅｔ水性媒体例えば、水、緩衝ｍ液、アセ
トン水溶Ｍ’、アルコール水溶液等が、破水和物の全体
に行きわたる状態におくことをいい、後の乾燥工稈の時
曲を短かくするには、酵素乃至酵素含有物と（］１体の
保水能力を越える水性媒体の鼠は町及的少ｊｆ、　（す
るのが好ましい。このような水か多く４ｆりすきないた
ｙ）の水和の方法としては、酵素　　　□乃至酵刺含自
−物を先に水性媒体に溶解し次いで保水１４の強い担体
を添加混合する方法、乾燥した酵素乃至酵素７（作物と
（（３体を混合しこれに水性媒体を噴霧する方法等が適
当であるが、水が多ずぎることは、この発明の本質をト
１１害するものではなく、物理的方法：こよる過剰の水
の脱水も可能である。

担体は公知のものの中から選択することがでへる。ケイ
ソウ士。カオリナイト、パーライト、シリカゲル。セル
ロースパウダー３炭酸］Ｊルシウム等のように保水力が
強く且つ吸ｔ’ｔ　１ｆｌｉ　ｉ：Ｉ低い１１１体１．
ｉ本発明に用いて一般に優れており、無ｊ１Ｆに使用す
ることができる。吸着能の強い］」１体や、酵素と結き
する担体の中には、エステル交換反応の活性中心となる
べき部分を封鎖したり破壊したり４−ることかあるため
か、エステル交換活性の賦活乃至増大の程度が少なかっ
たり殆んど困離なものがあるから、吟味して選択するの
がよい。また保水力の低い担体は、酵素溶液で担体を水
相するのに多１渡を必要とする等酵素の担体上への分布
が良好Ｃないためか、活性の賦活乃至増大は、ｌａシて
弱い。担体の形態は粉状、繊維状等種々使用でき、。ま
た最終的に酵素を色情（エントラップ）する型となる９
− もの−Ｃあっ−Ｃもよいが、製品酵素剤を連続的反応に
（ｊ（する場合は、′１１１′１粒状のものを使用する
のが操作］−簡便である。

酵素乃至酵素含汀物と担体の比率は、担体の保水力や用
いる酵素力価により異なるが、概ね２対１〜１対２０が
適している。

担体とともに水和させた酵素剤は次に乾燥するが、この
］−程は特別の配慮が必要であり、単に脂質分解活性を
保持する範囲で可及的速く乾燥する思想では、この発明
の目的を到底達することができない。すなわち、’　＋
’＋ｉｉ述Ｋｒ値を賦活乃至増大せしむるには乾燥初期
、ずなわぢ水和状態からある程度水分が低下するまでの
乾燥速度を緩慢にすることが必要なのである。Ｋｒ値を
調定する緩慢な初期速度及び「初期」の期間は、使用し
た酵素含有物中の酵素以外の成分や、使用される担体の
種類、担体の状態、及び処理装置と処理機の関係等によ
り異なり一律に（Ｊ定められないか、次の要領により実
験的に定めることができる。すなわち、最初敬神の乾燥
速１（１−で全Ｉ程を乾燥して、逸する緩慢ｌＯ− な乾燥速度を求め、次に、途中で乾燥地１すを速くして
もよい時期を求めればよいのである。もらろん作業効率
をさほど問題としないで、全上程を緩慢な速度で乾燥す
ることはこの発明の態様に含まれる緩慢な乾燥速度は、
１時間あたりｃノ）含水率の低下でいって、一般的には
０．５　」：′り遅いことが必要であるが、担体の状態
に依存するところもあって、保水性の強い担体の場合で
、わ）状の４）のは１時間に０．３以下の含水率の低下
、粒径２部程ＩＱ：の顆粒状のものは１時間に０．２５
以ドの含水率の低下より速くないことが概して必要であ
る。製品酵素剤の品質上液も好ましい緩慢きは一般的に
いって０．１の低下より遅い範囲にある。

この発明で、乾燥方法は、先の提案と１ＪＬｉｎする手
段（減圧手段）による場合を除き、−１−述のような緩
慢な乾燥速度に制御が１り能である」ミ段、すなわち、
水和した酵素と担体から水を緩慢な速度で取り去ること
のできる手段を包含するが、当業りに容易に理解される
通り、これらは乾燥のための流体との接触を伴なうのが
通常である。流体が気体の（（４合、空気、窒素、或い
はその他の不活外気１トが使用され、所謂、＋１０風乾
燥、送風乾燥、透気乾燥、熱風乾悟１周の技術が利用で
き、流体が液体の場合Ｃ：１、グリ士リン、プロピレン
クリコール、ソルビット、′、ｑｖ）ように蛋白質を変
性ぜず且つ水と一定の＋１１溶性ある流イ４１、等を用
いることかできる。

乾燥地＋ｆｃを制４１１１する手段としては、・ＩＪ２
：燥に用いる流体との飽差を調＋ｒｌ）’ｉｔ−る（該
流体中の湿分を調節・１−る））ｊ法や、ＩＩ＋１＋、
体の被乾燥物表面での流動状態を調整１＝る（流（１・
を＄、’、Ｉ製する）、乾燥流体才たは被乾燥物に与え
る熱コーネルギーを調整計る方法なとがあけられる。し
かし乾煽時の熱供給は、被乾燥′向のＷｎｌ　ＩＬＩ：
が１−昇して酵素が失活するような過剰をｉｌ！ｔ　Ｈ
るべきで＝ｒ）るのは当然で、乾燥初期においＣｔ＾、
ｔ　Ｉす（Ｊ通常５０Ｃ以ドが好ましい。

乾１．−４の程ｊロー（□１、酵素剤製品を利用する目
的により異なるか、−股に（」水分１０％程度以下−が
よく、１１ｋに１縛晶を水分の低い系中で使用するには
例えは水分２％以ド（こするなと、より低Ｆざぜるのが
好ましい。

斯くして、乾燥した系においてエステル仝換活性を呈し
ない酵素に、該活性を賦活でき、或い１ｊ弱い活性を増
大させ、従来の酵素剤には認められなかった低水分ド乃
至乾燥した系でのエステル交換高活性の酵素剤が得られ
るのである。因み１こ、本発明者らの確認している範囲
内におし）で、市販リパーゼを担体と一体的に水和し　
ＩＪ　／（’−ゼ活性を残存させることのできる急速１
（乾燥力θ、では１（ｒ値がＯ，（１０５以」−も増大
することができなか−）た。

先に提案した方法及び本願発明にお＋）　６緩慢ｆ（初
期速度による乾燥の効果は意外である。

以下この発明を実施例で説明する。

実施例１ 市販リパーゼ（リヅーブス・ニベウス起ｉ１＋Ｘ　）　
１部を冷水３．５部に分散し、この分散物１こカオリナ
イト２．５部をさらに分散することにＪ：す、す／ｆ−
ゼ汝ひカオリナイトを水和した。これをカラムに充填し
、カラム中に２０℃、湿度５Ｑｌ玲の、空気をＳＶ　ｔ
ｔｏ。

（／ｂｒ）で通過させること番こより、７２時間で水分
３．０％の酵素剤を得た。

一１３＝ 比較としてｉ’！１ｉ！度０％、温１９２０℃の乾燥空
気をＳＶｌ　２　（１０（１／ｌｔｒで同）■（カラ１
１中を通過させる場合も行ったが、これ（ｊ水分３％の
酵素剤とするのに約４時間であった。

結果はド友のＪ）ＩＩＩり 実施例２ 乾燥開始から２４時間経過後通気鼠を上げて５ｖ４４０
０／ｂｒにする速い乾燥速度で２４時間乾燥を継続″す
る仙は実施例１と同様に乾燥酵素剤を得た。Ｋｒ値は３
１．７Ｘ１（１”であった。

実施例３ ホリビニルアルコール２ｇｒをブロムシアナイドでシア
ン化１−１水洗後０．ＩＭＩＪン酸緩衝液（Ｐム（７，
５）５０−と市販リパーゼ（リヅープス。ニベウム起源
）ｓｇｒを加え、５℃において一夜攪拌後、ろ過し、１
４− これを実施例１と同し）ｊ／１．で乾燥ｊ７て水分２．
＋１％の酵素剤を得た。このもののＫｒ値は２８．８　
Ｘ　１０−’−ｃあった。

１５−

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）脂質分解酵素を１１１体とともに水相し、エステ
   ル交換活性［Ｋｒ値〕を賦活乃至」１９人ＩＪ！７むる
   に充分緩慢な乾燥速度で、これを乾燥（減圧手段による
   場合を除く）することを特許と４る酵素剤の製造法。
2. （２）　　（Ｋｒ値１の賦活乃至増大が０．００５ｊ−
   〉Ｌｌ−である特許請求の範囲第１項記載の１刈造θｔ
   ０