JPS6322795B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、エステル交換活性の高い酵素剤、
特に乾燥した系中において該活性を呈する酵素剤
及びその製造法に関するものである。 脂質分解酵素は、消化薬、酵素フレーバー、皮
なめし、洗剤、化粧品、醸造、グリセリドの構造
分析等多くの用途が開発され利用されている。こ
れらの用途は酵素が脂質を分解する性質に係わる
ものであることからも明らかな通り、一般に酵素
の脂質を分解する力価（脂質分解活性）が、酵素
の価格を左右し或いは酵素調製における当然の尺
度となつている。 ところで、近年脂質分解酵素のエステル交換へ
の利用に着目した研究が散見されるようになり、
本発明者もそれに携わつて来たが、脂質分解酵素
によるエステル交換には水が必要であること、す
なわちエステル交換反応は分解反応と合成反応の
可逆反応の結果で分解反応を前提とすること、と
の考え方が当初からあり、従つてそこにおいても
酵素のとり扱いは従来通り脂質分解活性を重要な
尺度の一つとしていた。 しかし、本発明者は上述の研究を進める中で、
エステル交換を利用して得る目的物によつては、
反応系の水分をむしろ可及的低下させることの重
要性と、それによつて生じる反応速度の低下をカ
バーする別の方途の検討が必要であることに想到
した。そして、脂質分解活性のある酵素でも、特
に系の水分が低いときには、エステル交換を行う
能力がほとんどないものが少なくないこと、或い
はエステル交換の活性を示す同ロツトの酵素から
利用し易い製剤を数種調製した際に、製剤の脂質
分解活性が同等であるにもかかわらず、酵素エス
テル交換を行う活性は異なることがあること等脂
質分解活性とエステル交換活性の不相応の現象を
見出し、エステル交換活性についての明確な概念
規定の検討と、特に水分の低い系でも恒常的に高
いエステル交換活性を示す酵素剤を得る方法につ
いて研究を深め、遂には既存の酵素には認められ
ないエステル交換高活性の製剤を調製できること
を見出すにいたつた。 この発明は、既存の酵素では呈しなかつたエス
テル交換高活性の酵素剤に関するものであり、ま
た、脂質分解活性を水系下で担体に分散または吸
着させ、これを充分緩慢な初期速度で減圧乾燥す
ることを骨子とするエステル交換活性を賦活乃至
増大させた酵素剤の製造法に関するものである。 以下この発明を説明するが、エステル交換活性
の概念の説明及び定義から始める。 すなわち、一般に反応率がｘ（但し完全に反応
した状態が１、未反応の状態を０）、反応時間が
ｔで、反応速度dx／dtは（１−ｘ）に比例する
として、比例定数ｋ＝１／ｔln１／１−ｘである。エス テル交換を行なわせる反応系は低水分とし、エス
テル交換活性の測定は、適当な標識脂肪酸を定
め、その分布状況を測定することにより行なうこ
ととする。ここで「完全に反応した状態」とは、
充分な反応時間をとつて脂肪酸分布が実質的に一
定した状態のことをいうが、酵素の特異性の有無
及びその内容が明らかであるときは、理論的に
「完全に反応した状態」を設定する方が簡便であ
り、また支障がない。例えば、グリセリドの１，
３位に対して選択的に作用する（２位に対して作
用しない）ことが明らかな酵素を用いるとき、グ
リセリドの２位を除く脂肪酸分布が完全にランダ
ム化した状態をもつて「完全に反応した状態」と
みなすこととする。そしてエステル交換活性〔絶
対値〕Kaは比例定数ｋに基質量／酵素剤量を乗
じたものとする。エステル交換活性〔相対値〕
KrはKaを酵素剤1grの脂質分解活性でKaを除す
ものとする。 この発明では、測定方法を含めて活性の定義を
より詳細に次の通り定めるものとする。 ヤシ油（日本薬局方所載規格）とステアリン酸
メチルエステル（主としてC₁₇H₃₅COOCH₃及び
C₁₅H₃₁COOCH₃とからなりC₁₁H₂₃COOCH₃を含
まない）との等重量混合物（但し水分0.02重量％
以下であること）20gr及び、（湿つているものは
真空乾燥により可及的水分を下げた）酵素剤1gr
（系中水分の合計は0.08±0.02％の範囲内）を300
ml容の栓付マイヤーに仕込み、窒素ガスで空気を
置換後300〜500rpmで撹拌しながら40℃で24時間
（１日）反応させる。得た反応物を約20mg採取し、
薄層クロマトグラムに展開して脂肪酸メチルエス
テル区分を分取し、ガスクロマトグラムによりこ
の区分の脂肪酸組成を求める。標識脂肪酸はラウ
リン酸とし、メチルエステル区分における標識脂
肪酸の構成割合の値について、完全に反応した状
態の値をａ、ｔ＝（日）における値をｂ、ｔ＝０
における値をｃとして、ｘ＝ｂ／ａ，ｋ＝ln ａ／ａ−ｂ，Ka＝20lnａ／ａ−ｂである。ここで、酵 素の特異性が明らかであるときａは、前掲例の如
くグリセリドの１，３位に対して特異性を有する
酵素で例示すると、ヤシ油トリグリセリドの１，
３位の反応部位（脂肪酸基）とステアリン酸メチ
ルエステルの反応部位（同）の重量和に対する
１，３位に結合しているラウリン酸基の重量割合
として求めることができる。また例えばグリセリ
ドの位置に対する選択性が実質的に認められない
酵素の場合は、グリセリド及びメチルエステルの
全反応部位に対する全ラウリン酸基の割合として
求めることができる。脂質分解活性は使用酵素剤
1grが毎分生成する脂肪酸のμMで表示するもの
とし、福本らの、J.Gen.Appl.Microbiol.，９，
353（1963）に記載された方法に準じて測定する。
以上の定義の妥当性は実施例５と関連して後で検
証する。 次に酵素剤の製造法について説明する。 原料となる酵素乃至酵素含有物は、脂質分解活
性を呈するものを使用する。脂質分解活性を呈し
てエステル交換活性を呈しないものにはエステル
交換活性を賦活できるが、脂質分解活性のないも
のは、いかに加工してもエステル交換活性を賦活
できない。エステル交換反応は少くとも脂質分解
活性部位を必要とすると解される。本発明者が入
手した市販酵素を検討した限りにおいては、ある
種の菌体内酵素のように、弱いながら少しはエス
テル交換活性を示すものもあるが、他の脂質分解
酵素は単独ではほとんどエステル交換活性を示さ
ない傾向にある。使用する酵素又は酵素含有物の
起源、精製度、選択性について特に問うところで
なく、起源的には細菌や酵母等の脂質分解酵素か
ら高等動植物の脂質分解酵素まで広く使用できる
が、酵素によるエステル交換で選択性が皆無であ
るとアルカリ金属触媒等を用いるエステル交換反
応に対する格別な優位性を見出し難いので、実用
的には何らかの選択性、例えばグリセリドに結合
する位置の選択性とか、脂肪酸の種類に対する選
択性とかを有するものがよい。 脂質分解活性を有する酵素乃至酵素含有物は、
水系下で担体に分散乃至吸着させることが必要で
あり、酵素を単に乾燥した状態で担体と混合する
だけではエステル交換活性が賦活乃至増大されな
い。水系下とは酵素の蛋白質が水和される状態に
おくことをいうが、後の乾燥工程の時間を短かく
するためには酵素及び担体の保有能力を越える水
の量は可及的少なくするのが好ましい。使用する
担体はケイソウ土、カオリナイト、パーライト、
シリカゲル、セルロースパウダー、炭酸カルシウ
ム等、保水力が強く且つ吸着能は低い担体が適し
ている。活性炭、アルミナ等吸着能の強い担体
は、エステル交換反応の活性中心となるべき部分
を封鎭してしまうのか、エステル交換活性が賦活
乃至増大し難い。保水力の低い担体は、リパーゼ
水溶液を水和させるために多量を必要とし、それ
でも脂質分解活性の分散が充分でないので活性を
賦活乃至増大し難い。担体の形態は粉状、繊維状
等種々使用できるが、製品酵素剤を連続的反応に
供する場合は顆粒状のものを使用するとよい。分
散乃至吸着させる方法としては、酵素乃至酵素含
有物を水に溶解し、これに担体を添加混合する方
法、乾燥した酵素乃至酵素含有物と担体を混合し
これに水を噴霧する方法等が例示される。酵素乃
至酵素含有物と担体の比率は担体の保水力により
異なるが、概ね２対１〜１対20が適している。 水系下担体に分散乃至吸着させた酵素剤は次に
減圧乾燥するが、この工程は特別の配慮が必要で
あり、単に脂質分解活性を保持する範囲で可及的
速く乾燥する思想では、この発明の目的を到底達
することができない。すなわち、前述Kr値を賦
活乃至増大せしむるには乾燥初期、すなわち水和
状態からある程度水分が低下するまでの乾燥速度
を緩慢にすることが必要なのである。Kr値を満
足する緩慢な初期速度及び「初期」の期間は、使
用した酵素含有物中の酵素以外の成分や、使用さ
れる担体の種類、担体の状態、及び処理装置と処
理量の関係等により異なり一律には定められない
が、次の要領により実験的に定めることができ
る。すなわち、最初数種の乾燥速度で全工程を乾
燥して、適する緩慢な乾燥速度を求め、次に、途
中で乾燥速度を速くしてもよい時期を求めればよ
いのである。緩慢な乾燥速度は、しかしながら、
担体の状態に依存するところが最も大きく、保水
性の強い担体の場合で、粉状のものは１時間に
0.3以下の含水率の低下、粒径２mmの程度の顆粒
状のものは１時間に0.25以下の含水率の低下より
速くないことが概して必要であり、より一般的に
は１時間に0.2以下の含水率の低下より速くない
ことが好ましい。 本発明の減圧乾燥に凍結乾燥はあまり好ましく
ない。凍結乾燥であると脂質分解活性は保持され
るがエステル交換活性は少ししか賦活されない。
減圧乾燥中必要に応じて外部から熱を供給するこ
とができる。乾燥の程度は、酵素剤製品を利用す
る目的により異なるが、製品を水分の低い系中で
使用するには水分２％以下にするのが好ましい。 斯くして、乾燥した系においてエステル交換活
性を呈しない酵素を賦活でき、或いは弱い活性を
増大させ、従来の酵素剤には認められなかつた低
水分下でのエステル交換高活性の酵素剤が得られ
る。 この発明の説明を検証例、実施例、比較例を交
えながらさらに続けると次の通りである。 検証例 １ 入手している各種市販リパーゼについて測定し
た未処理のままのKr値を一覧に供すると次の通
りで0.01を越す活性を有するものは存在しなかつ
た。 【表】 この発明の一つはエステル交換活性〔Kr値〕
が0.01以上の酵素剤である。 また、これらを、水系下で担体に分散又は吸着
させ、リパーゼ活性を残存させたまま凍結乾燥や
急速な減圧乾燥してもKr値が0.005以上増大する
ものもなかつた（比較例２，３及び５参照）。実
施例１，２及び３並びに比較例１，２及び３リゾ
ープス・ニベウス（Rhizopus niveus）起源の
市販リパーゼ300ｇを水750ｇに５℃前後で溶解
し、これを撹拌しながらセライト750ｇ（Jo―hrs
―Marville社製No.545）を徐々に加えていくと、
ペースト状を経てさらに湿気をおびた粉末状の混
合物となつた。これを五分して、１つ（比較例
２）は直ちに凍結乾燥し（品温−23℃、真空度
0.6Torr）、他の四つは、真空ポンプに接続した
デシケーター中に入れ減圧乾燥に付した。減圧乾
燥の条件は、真空度及び乾燥時間が6Torr4時間
（比較例３）、8Torr20時間（実施例１）、
15Torr4日（実施例２）にて最終的に水分約1.4
％に乾燥させた。この間必要に応じて外部加熱及
び空気をリークさせた。残りの１つ（実施例３）
については、最初の１日を実施例２と同様に乾燥
して含水率0.4とし、さらに外部からの熱供給を
増して15Torr1日で最終的な水分を約1.4％にし
た。脂質分解活性及びエステル交換活性は次の通
りであつた。 【表】 のである。
表１に明らかな通り、単にリパーゼ活性を残存
させる乾燥ではKa値の実質的な賦活はほとんど
なかつた。 実施例４及び比較例４ リゾープス・ジヤポニカス（Rhizopus Japo
―nicus）起源の市販菌体内リパーゼ及び担体と
してパーライトを用い実施例２及び比較列２と同
様にして調製した。 【表】 市販製品単独でもエステル交換活性は呈するが
本発明方法によりKr値は著しく増大した。 該市販酵素そのまま5.62ｇ又は調製酵素剤20ｇ
を、パーム油中融点部（IV33.2）、及びステアリ
ン酸メチルエステル（構成脂肪酸はC₁₈が主成分
でC₁₆を一部含む）の等量混合物を真空加熱乾燥
して水分含量を0.015重量％とした基質200ｇとと
もに、500ml容かた付フラスコ中に入れ、40℃で
200r.p.mの撹拌を反応率0.9になるまで続けた
（但しここで反応率は、標識脂肪酸としてパルミ
チン酸を定め、２位を除く脂肪酸分布がランダム
化した状態を反応の終点とした）。該反応率に達
して後、酵素製剤を分離回収し、別の同じ基質を
用いてやはり反応率0.9になるまで反応させ、こ
の操作を反復した。 【表】 該結果より、本発明製品は、個々の日数におけ
るエステル交換活性が比較例より著しく高く、繰
返し使用によく耐えた。 実施例５及び検証例２ リゾープス・ニベウス（Rhizopus niveus）
起源の市販リパーゼ（Kr値0.0）300ｇｒを５℃
前後の水1200grに溶解し、顆粒状ケイソウ土（白
山工業(株)）750grにこの酵素液中を浸透させ、担
体が破壊されないようゆるやかに撹拌した。この
リパーゼ―顆粒状ケイソウ土混合物を減圧乾燥
し、15Torrで６日乾燥し、水分1.3％まで乾燥し
て製剤とした。このもののKr値は0.022であつ
た。 この酵素剤１ｇを用い、先に述べた活性の測定
法に従つて、ヤシ油・ステアリン酸メチルエステ
ルの等量混合物をエステル交換した。メチルエス
テル区分の経時的な脂肪酸変化は表４の通りであ
つた。 【表】 表４において標識脂肪酸（C₁₂）の値はｔ＝４
（日）以後において増大はなかつたのでａ＝
0.128.C＝０としてＸ及びln１／１−ｘを求め、表中 に記載した。ｔとln１／１−ｘはほとんど完全にリ ニアーであり、一次反応として活性を定めること
は妥当であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ エステル交換活性〔本文中に定義するKr値〕
   が0.01以上の担体付の乾燥されたリパーゼ酵素製
   剤。 ２ 脂質分解活性を水系下でケイソウ土、カオリ
   ナイト、パーライト、シリカゲル、セルロースパ
   ウダー、炭酸カルシウムまたはこれらと同等以上
   の保水力とこれらと同等以下の酵素吸着能を有す
   る担体に分散または吸着させ、これをエステル交
   換活性〔Kr値〕が0.005以上増大せしむるに充分
   緩慢な初期速度で減圧乾燥することを特徴とする
   酵素剤の製造法。