JPH0344757B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は、エステル交換活性の高い酵素剤、
特に乾燥した系中において該活性を呈する酵素剤
の製造法に関するものである。 脂質分解酵素は、消化薬、酵素フレーバー、皮
なめし、洗剤、化粧品、醸造、グリセリドの構造
分析等多くの用途が開発され利用されている。こ
れらの用途は酵素が脂質を分解する性質に係わる
ものであることからも明らかな通り、一般に酵素
の脂質を分解する力価（脂質分解活性）が、酵素
の価格を左右し或いは酵素調製における当然の尺
度となつている。 ところで、近年脂質分解酵素のエステル交換へ
の利用に着目した研究が散見されるようになり、
本発明者もそれに携わつて来たが、脂質分解酵素
によるエステル交換には水が必要であること、す
なわちエステル交換反応は分解反応と合成反応の
可逆反応の結果で分解反応を前提とすること、と
の考え方が当初からあり、従つてそこにおいても
酵素のとり扱いは従来通り脂質分解活性を重要な
尺度の一つとしていた。 しかし、本発明者は上述の研究を進める中で、
エステル交換を利用して得る目的物によつては、
反応系の水分をむしろ可及的低下させることの重
要性と、それによつて生じる反応速度の低下をカ
バーする別の方途の検討が必要であることに想到
した。そして、脂質分解活性のある酵素でも、特
に系の水分が低いときには、エステル交換を行う
能力がほとんどないものが少なくないこと、或い
はエステル交換の活性を示す同ロツトの酵素から
利用し易い製剤を数種調製した際に、製剤の脂質
分解活性が同等であるにもかかわらず、酵素のエ
ステル交換を行う活性は異なることがあること等
脂質分解活性とエステル交換活性の不相応の現象
を見出し、エステル交換活性についての明確な概
念規定の検討と、特に水分の低い系でも恒常的に
高いエステル交換活性を示す酵素剤を得る方法に
ついて研究を深め、遂には既存の酵素には認めら
れないエステル交換高活性の製剤を調製できるこ
とを見出すにいたり、酵素剤及びその製造法につ
いての提案を行つた（特願昭55−29707（特公昭63
−22795号））。 すなわち先の発明は、既存の酵素では呈しなか
つたエステル交換高活性の酵素剤に関するもので
あり、また、脂質分解酵素を担体とともに水和
し、これを充分緩慢な初期速度で減圧乾燥するこ
とを骨子とするエステル交換活性を賦活乃至増大
させた酵素剤の製造法に関するものである。 しかしながら、本発明者は、さらに検討を進め
る中で、上記乾燥は、充分緩慢な初期速度で乾燥
するという条件を満足する限り、減圧手段のみに
依存する必要はなく、より広範な手段を採用し得
ることを見出した。 すなわち、この発明は、脂質分解酵素を、ケイ
ソウ土、カオリナイト、パーライト、シリカゲ
ル、セルロースパウダー、炭酸カルシウムまたは
これらと同等以上の保水力とこれらと同等以下の
酵素吸着能を有する担体とともに水和し、これを
流体と接触させて乾燥し、少なくともその乾燥初
期において、品温を50℃以下に維持して、エステ
ル交換活性〔Kr値〕を0.005以上増大せしむるに
たる緩慢な乾燥速度とすることを骨子とする酵素
剤の製造法である。 以下この発明を説明するが、まずエステル交換
活性について説明する。 すなわち、一般に反応率がｘ（但し完全に反応
した状態が１、未反応の状態を０）、反応時間が
ｔで、反応速度dx／dtは（１−ｘ）に比例する
として、比例定数ｋ＝１／ｔln１／１−ｘである。エス テル交換を行なわせる反応系は低水分とし、エス
テル交換活性の測定は、適当な標識脂肪酸を定
め、その分布状況を測定することにより行なうこ
ととする。ここで「完全に反応した状態」とは、
充分な反応時間をとつて脂肪酸分布が実質的に一
定した状態のことをいうが、酵素の特異性の有無
及びその内容が明らかであるときは、理論的に
「完全に反応した状態」を設定する方が簡便であ
り、また支障がない。例えば、グリセリドの１、
３位に対して選択的に作用する（２位に対して作
用しない）ことが明らかな酵素を用いるとき、グ
リセリドの２位を除く脂肪酸分布が完全にランダ
ム化した状態をもつて「完全に反応した状態」と
みなすこととする。そしてエステル交換活性〔絶
対値〕Kaは比例定数ｋに基質量／酵素剤量を乗
じたものとする。エステル交換活性〔相対値〕
KrはKaを酵素剤1grの脂質分解活性でKaを除す
るものとする。 この発明で、エステル交換活性の標準的測定方
法についてより詳細な説明すると次の通りであ
る。 ヤシ油（日本薬局方所載規格）とステアリン酸
メチルエステル（主としてC₁₇H₃₅COOCH₃及び
C₁₅H₃₁COOCH₃とからなりC₁₁H₂₃COOCH₃を含
まない）との等重量混合物（但し水分0.02重量％
以下であること）20gr及び、（湿つているものは
真空乾燥により可及的水分を下げた）酵素剤1gr
（系中水分の合計は0.08±0.02％の範囲内）を300
ml容の栓付タイマーに仕込み、窒素ガスで空気を
置換後300〜500rpmで撹拌しながら40℃で24時間
（１日）反応させる。得た反応物を約20mg採取し、
薄層クロマトグラムに展開して脂肪酸メチルエス
テル区分を分取し、ガスクロマトグラムによりこ
の区分の脂肪酸組成を求める。標識脂肪酸はラウ
リン酸とし、メチルエステル区分における標識脂
肪酸の構成割合の値について、完全に反応した状
態の値をａ、ｔ＝１（日）における値をｂ、ｔ＝
０における値をｃとして、 ｘ＝ｂ／ａ、ｋ＝lnａ／ａ−ｂ、Ka＝20lnａ／ａ−ｂ
で ある。ここで、酵素の特異性が明らかであるとき
ａは、前掲例の如きグリセリドの１、３位に対し
て特異性を有する酵素で例示すると、ヤシ油トリ
グリセリドの１、３位の反応部位（脂肪酸基）と
ステアリン酸メチルエステルの反応部位（同）の
重量和に対する１、３位に結合しているラウリン
酸基の重量割合として求めることができる。また
例えばグリセリドの位置に対する選択性が実質的
に認められない酵素の場合は、グリセリド及びメ
チルエステルの全反応部位に対する全ラウリン酸
基の割合として求めることができる。脂質分解活
性は使用酵素剤1grが毎分生成する脂肪酸のμM
で表示するものとし、福本らの、J.Gen、Appl.
Microbiol.、９、353（1963）に記載された方法に
準じて測定する。 次に酵素剤の製造法について説明する。 原料となる酵素乃至酵素含有物は、脂質分解活
性を呈するものを使用する。脂質分解活性を呈し
てエステル交換活性を呈しないものにはエステル
交換活性を賦活できるが、脂質分解活性のないも
のは、いかに加工してもエステル交換活性を賦活
できない。エステル交換反応は少くとも脂質分解
活性部位を必要とすると解される。本発明者が入
手した市販酵素を検討した限りにおいては、ある
種の菌体内酵素のように、弱いながらも少しはエ
ステル交換活性を示すものもあるが、他の脂質分
解酵素は単独ではほとんどエステル交換活性を示
さない傾向にある。使用する酵素又は酵素含有物
の起源、精製度、選択性について特に問うところ
でなく、起源時には細菌や酵母等の脂質分解酵素
から高等動植物の脂質分解酵素まで広く使用でき
るが、酵素によるエステル交換で選択性が皆無で
あるとアルカリ金属接触等を用いるエステル交換
反応に対する格別な優位性を見出し難いので、実
用的には何らかの選択性、例えばグリセリドに結
合する位置の選択性とか、脂肪酸の種類に対する
選択性とかを有するものがよい。 脂質分解活性を有する酵素乃至酵素含有物は、
まず、担体とともに水和させることが必要であ
り、酵素を単に乾燥した状態で担体と混合するだ
けではエステル交換活性が賦活乃至増大されな
い。ここで水和は水性媒体例えば、水、緩衝溶
液、アセトン水溶液、アルコール水溶液等が、被
水和物の全体に行きわたる状態におくことをい
い、後の乾燥工程の時間を短かくするには、酵素
乃至酵素含有物と担体の保水能力を越える水性媒
体の量は可及的少なくするのが好ましい。このよ
うな水が多くなりすぎないための水和の方法とし
ては、酵素乃至酵素含有物を先に水性媒体に溶解
し次いで保水性の強い担体を添加混合する方法、
乾燥した酵素乃至酵素含有物と担体を混合しこれ
に水性媒体を噴霧する方法等が適当であるが、水
が多すぎることは、この発明の水質を阻害するも
のではなく、物理的方法による過剰の水の脱水も
可能である。 担体は公知のものの中から選択することができ
る。ケイソウ土．カオリナイト．パーライト．シ
リカゲル．セルロースパウダー．炭酸カルシウム
等のように保水力が強く且つ吸着能は低い担体は
本発明に用いて一般に優れており、無難に使用す
ることができる。吸着能の強い担体や、酵素と結
合する担体の中には、エステル交換反応の活性中
心となるべき部分を封鎖したり破壊したりするこ
とがあるためか、エステル交換活性の賦活乃至増
大の程度が少なかつたり殆んど困難なものがある
から、吟味して選択するのがよい。またガラスビ
ーズやアルミナのように保水力の低い担体は、酵
素溶液で担体を水和するのに多量を必要とする等
酵素の担体上への分布が良好でないためか、活性
の賦活乃至増大は概して弱い。保水力の大小は、
例えば、担体と水とを撹拌しながら水の量を増し
ていき、担体に保水されないで遊離したままの水
が肉眼的に確認される時点の水の量の大小で比較
することができ、上記担体の中ではガラスビーズ
が最も小さく次いでアルミナ≒シリカゲルがほぼ
同程度、次いで炭酸カルシウム、他のものと続
く。また酵素吸着能は、例えば、担体を酵素液と
混合したあと担体を除去し、あとの酵素液中の酵
素量を測定することにより大小比較することがで
き、上記担体の中では活性炭が吸着能が最も大き
く、次いで、アルミナ、シリカゲル、カオリナイ
ト≒炭酸カルシウムの順で、他はこれより小さ
い。担体の形態は粉状、繊維状等種々使用でき、
また最終的に酵素を包活（エントラツプ）する型
となるものであつてもよいが、製品酵素剤を連続
的反応に供する場合は、顆粒状のものを使用する
のが操作上簡便である。 酵素乃至酵素含有物と担体の比率は、担体の保
水力や用いる酵素力価により異なるが、概ね２対
１〜１対20が適している。 担体とともに水和させた酵素剤は次に乾燥する
が、この工程は特別の配慮が必要であり、単に脂
質分解活性を保持する範囲で可及的速く乾燥する
思想では、この発明の目的を到底達することがで
きない。すなわち、前述Kr値を賦活乃至増大せ
しむるには乾燥初期、すなわち水和状態からある
程度水分が低下するまでの乾燥速度を緩慢にする
ことが必要なのである。Kr値を満足する緩慢な
初期速度及び「初期」の期間は、使用した酵素含
有物中の酵素以外の成分や、使用される担体の種
類、担体の状態、及び処理装置と処理量の関係等
により異なり一律には定められないが、次の要領
により実験的に定めることができる。すなわち、
最初数種の乾燥速度で全工程を乾燥して、適する
緩慢な乾燥速度を求め、次に、途中で乾燥速度を
速くしてもよい時期を求めればよいのである。も
ちろん作業効率をさほど問題としないで、全工程
を緩慢な速度で乾燥することはこの発明の態様に
含まれる緩慢な乾燥速度は、１時間あたりの含水
率の低下でいつて、一般的には0.5より遅いこと
が必要であるが、担体の状態に依存するところも
あつて、保水性の強い担体の場合で、粉状のもの
は１時間に0.3以下の含水率の低下、粒径２mm程
度の顆粒状のものは１時間に0.25以下の含水率の
低下より速くないことが概して必要である。製品
酵素剤の品質上最も好ましい緩慢さは一般的にい
つて0.1の低下より遅い範囲にある。 この発明で、乾燥方法は、先の提案と重複する
手段（減圧手段）による場合を除き、上述のよう
な緩慢な乾燥速度に制御が可能である手段、すな
わち、水和した酵素と担体から水を緩慢な速度で
取り去ることのできる手段を包含するが、当業者
に容易に理解される通り、これらは乾燥のための
流体との接触を伴なうのが通常である。流体が気
体の場合、空気、窒素、或いはその他の不活性気
体が使用され、所謂、通風乾燥、送風乾燥、透気
乾燥、熱風乾燥等の技術が利用でき、流体が液体
の場合は、グリセリン、プロピレングリコール、
ソルビツト、等のように蛋白質を変性せず且つ水
と一定の相溶性ある流体等を用いることができ
る。乾燥速度を制御する手段としては、乾燥に用
いる流体との飽差を調節する（該流体中の湿分を
調節する）方法や、流体の被乾燥物表面での流動
状態を調整する（流速を調製する）、乾燥流体ま
たは被乾燥物に与える熱エネルギーを調整する方
法などがあげられる。しかし乾燥時の熱供給は、
被乾燥物の温度が上昇して酵素が失活するような
過剰を避けるべきであるのは当然で、乾燥初期に
おいて当該温度は通常50℃以下が好ましい。 乾燥の程度は、酵素剤製品を利用する目的によ
り異なるが、一般には水分10％程度以下がよく、
特に製品を水分の低い系中で使用するには例えば
水分２％以下にするなど、より低下させるのが好
ましい。 斯くして、乾燥した系においてエステル交換活
性を呈しない酵素に、該活性を賦活でき、或いは
弱い活性を増大させ、従来の酵素剤には認められ
なかつた低水分下乃至乾燥した系でのエステル交
換高活性の酵素剤が得られるのである。因みに、
本発明者らの確認している範囲内において、市販
リパーゼを担体と一体的に水和し、リパーゼ活性
を残存させることのできる急速な乾燥方法では
Kr値が0.005以上も増大することができなかつ
た。即ち先に提案した特願昭55−29707号の明細
書に記載のように、市販酵素を担体と水和後凍結
乾燥または種々の乾燥速度で減圧乾燥した場合の
脂質分解活性残存率、Ka値、Kr値（x10³）の関
係は次表のようであり、

【表】 また、乾燥を流体と接触させることにより行う
場合にあつても急速な乾燥ではKr値が0.005以上
増大しない（後記比較乾燥品参照）。このように
先に提案した方法及び本願発明における緩慢な初
期速度による乾燥の効果は意外である。 以下この発明を実施例で説明する。 実施例 １ 市販リパーゼ（リゾープス・ニベウス起源）１
部を冷水3.5部に分散し、この分散物にカオリナ
イト2.5部をさらに分散することにより、リパー
ゼ及びカオリナイトを水和した。これをカラムに
充填し、カラム中に20℃、湿度50％の空気を
SV1100（／hr）で通過させることにより、72時間
で水分3.0％の酵素剤を得た。 比較として湿度０％、温度20℃の乾燥空気を
SV12000／hrで同様カラム中を通過させる場合も
行つたが、これは水分３％の酵素剤とするのに約
４時間であつた。 結果は下表の通り

【表】 部分を除外して換算。
実施例 ２ 乾燥開始から24時間経過後通気量を上げて
SV4400／hrにする速い乾燥速度で24時間乾燥を
継続する他は実施例１と同様に乾燥酵素剤を得
た。Kr値は31.7×10^-3であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 脂質分解酵素を、ケイソウ土、カオリナイ
   ト、パーライト、シリカゲル、セルロースパウダ
   ー、炭酸カルシウムまたはこれらと同等以上の保
   水力とこれらと同等以下の酵素吸着能を有する担
   体とともに水和し、これを流体と接触させて乾燥
   し、少なくともその乾燥初期において、品温を50
   ℃以下に維持して、エステル交換活性〔本文中に
   定義するKr値〕を0.005以上増大せしむるにたる
   緩慢な乾燥速度とすることを特徴とする酵素剤の
   製造法。