JPS61149084A - 酵素の活性化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、油脂の分解や改質において有用な酵素製剤の
酵素を活性化させる方法に関するものである。

天然界に潤沢に存在する植物性あるいは動物性油脂につ
いて、これらを改質する事により、高付加価値の油脂製
品類を製出する試みが、当業界において精力的になされ
ている。

例えば、最近、脂質分解酵素（リパーゼ）の特異的な性
質を利用した油脂の高付加価値化のひとつとして、該酵
素による油脂のエステル交換反応によるチョコレート用
原料油脂であるカカオ代用脂の製造に関する提案が種々
なされている。

脂質分解酵素は、油脂の加水分解に対して有効な触媒作
用を有するばかシでなく、条件を選・ぶことＫよシ、加
水分解の逆反応であるエステル合成反応をも触媒する作
用を示す。該酵素のかかる特徴を利用することＫよシ、
エステル合成反応の一部で、重要な油脂改質技術のひと
つであるエステル交換反応を効率よく達成することがで
きる。

しかしながら、油脂のエステル交換反応を効率よく行う
ためＫは、該酵素の活性を如何に発現させるか、あるい
は、活性な酵素製剤を如何に製造するかが酵素利用技術
を開発する上で最も重要な課題である。

〔従来の技術〕

これらの課題を解決するため、従来よシ次のような方法
が提案されている。例えば、エステル交換活性を発現さ
せるため、酵素の活性化剤として微量の水分を用いる方
法（特開昭５２−１０４５０６号公報）、２価又は３価
の低級アルコール（例えばグリセリンのような多価アル
コール類）を用いる方法（％公昭５７−６４８０号公報
、特開昭５７−７８４９６号公報）などを挙げることが
できる。

他方、活性な酵素製剤を製造する方法としては、脂質分
解酵素水溶液中忙担体を分散させることＫよシ、酵素あ
るいは酵素含有物を担体に吸着させ１次いで、この担体
を乾燥処理することにより、−走水分量の酵素製剤を調
製す企方法が提案されている（例えば、特開昭５６−１
２７０８７号公報、同５８−４８００６号公報など）０ しかしながら、これら公知の方法は、いずれもが次に示
す如くいくつかの欠点を有するため。

工業的な応用を考えた場合、十分満足のできる方法とは
言い難い。これらの欠点を具体的に示すと次の通シであ
る。

先ず、酵素活性化剤として、微量の水分を用いた油脂の
エステル交換反応においては、目的とするエステル交換
反応以外に、油脂の加水分解が併発して、エステル交換
脂の収率が低下することが指摘されている〔例えば、　
ｙｏｕｒｎａｌｏｆＡｍｅｒｉｃａｎ　ｏｉ１０ｈｓｍ
ｉｓｔ’ｓｓ　Ｅｌｏｃｉｅｔｙ　、第６０巻。

２９１頁〜２９４頁（１９８３年）など〕０かかる欠点
を有する水に代えて、グリセリンのような低級多価アル
コールを用いた場合、本発明者らの検討結果によれば、
加水分解反応をある糧度抑制する効果は認められるが、
エステル交換速度が極めて遅く、目的とする反応率を得
る為に１週間近い日数を要するという欠点が見い出され
た。

油脂の加水分解反応で組成する副生成物は、エステル交
換反応で得られる油脂の性質を損い、高品質あるいは一
定品質の油脂製品を得るための大きな障害となる。更に
は、目的とする品質を保持するためＫは、これら副生成
物を除去する必要があシ、このためＫは、分電精製など
の処理１穆が必要となる。これは、明らかに工程の煩雑
化を招き工業的な実施の妨けとなるばかシか、処理１穆
で、油脂の組成変化をひきおこす恐れがある。

これらの事から、酵素活性化剤を用いる従来の方法は、
未だ十分な方法とは言えない。最近。

酵素活性化剤のもついくつかの欠点を克服し。

加水分解反応を抑制してエステル交換を効率よく行わせ
る酵素触媒系として、界面活性剤（乳化剤）の利用（特
−昭５７−１９８７９８号公　　報）あるいは、高吸水
性樹脂の利用（特開昭５８−１１６６８９号公報）等が
提案されている。

しかし、これらの方法による酵素触媒系を用いても、前
記発明の実施例に開示されている如く加水分解反応め抑
制は十分でなく、更には、エステル交換生成脂中に乳化
剤が残存したシ、高吸水性樹脂中の不純物（例えばモノ
マーなど）が溶出する恐れがある。従って、これらの方
法も又、十分なものでな−。

他方、第２の方法である活性な酵素製剤を調製する方法
においては、酵素活性を発現させる為に、長時間の乾燥
処理が必要であったり、至適酵素活性を得るために乾燥
速度を厳密に制御する必要がある。更には、長時間の乾
燥処理中に酵素活性が失われる恐れがある。このようＫ
。

本方法も操作が煩雑であったシ多大の労力を要するなど
、工業的な実施を考えた場合十分な方法とは言い難い。

かかる実情において１本発明者らは、目的とするエステ
ル交換反応のみを効率よく行わしめ、副反応を極力抑制
するという特徴をもった酵素触媒について研究した結果
、先に、新規で且つ簡便な酵素活性化方法による酵素製
剤（リパーゼ製剤）の製造方法を見い出し特許出願した
（特願昭５９−１１０３３５号）０ 〔発明が解決しよりとする問題点〕 しかしながら、これらエステル交換活性の高い酵素製剤
を用いた油脂のエステル交換反応では１次のような問題
点が残っている０即ち、従来の方法では、反応時間が長
くかかったシ、又、酵素が高価である等のため、工業的
規模で実施するためには、これらの課題を解決する必要
がある。これらの問題点を解決せんとして、例えば、反
応速度を高めて反応時間を短くするためＫ、水などの酵
素活性化剤を多量に添加することが考えられるが、これ
は、目的とする反応以外に、副反応（油脂の加水分解な
ど）を併発し、目的とする油脂の生産性や品質を大きく
損う０さらに１これら副反応を抑制するために、脱水処
理等の煩雑な操作が必要となシ、工程の煩雑化を招き工
業的規模での実施が困難となる。また、酵素が高価であ
る事から、酵素の使用量を削減する方法が考えられるが
、単に酵素使用量を減するだけでは、反応速度の低下や
目的油脂の品質の低下等を招くだけであり、工業的な実
施が困難である。

〔問題点を解決するための手段〕

かかる実情において、本発明者らは、副反応を極力抑制
して、目的とするエステル交換反応の反応速度を高めて
反発時間を短縮し、かつ、酵素使用量を削減する方法に
ついて鋭意検討した結果、該目的を達成する上で有効か
つ簡便な酵素活性化方法を見い出し本発明を完成した。

即ち、本発明は、簡便な方法でエステル交換活性を有す
る酵素製剤の酵素活性化方法を提供するものであシ１本
発明の方法で活性化せしめた酵素製剤による油脂のエス
テル交換反応では、副反応が抑制され、目的とするエス
テル交換反応が短時間で効率よく行われ、さらに、酵素
量の削減が可能となる。

かかる本発明の方法はリパーゼ展剤を、使用前にあらか
じめリパーゼ活性化剤を用いて湿潤処理するととくより
、リパーゼ製剤のリパーゼを活性化させる事を％像とす
るリパーゼの活性化方法である。

本発明に係るリパーゼ製剤としては、リパーゼ活性化剤
、リパーゼ及び担体から成る混合物に油脂を加えてこれ
らを反応させる事により油脂を分解させた後に、分解生
成物からｐ別等により油脂分を除去する事により得られ
るもの、或いは少なくとも一度以上エステル交換反応に
使用されたリパーゼ製剤等が例示される。

又、本発明に用いられるリパーゼ活性化剤としては、水
あるいは２価又は３価の低級アルコールのうちから選ば
れる１種又は２種以上の混合物が挙げられる。

本発明を更に詳細に説明すると次の通りである。先ず、
油脂、担体、リパーゼ活性化剤（例えば水、あるいは、
２価又は３価の低級アルコール）及びリパーゼから成る
混合物を反応させることによ＃）％油脂を分解せしめる
。次に分解生成物から、Ｐ別等により油脂分を除去して
、リパーゼと担体から成る混合物（リパーゼ製剤）を得
る。

得られたリパーゼ製剤は、そのままの形で、あるいは、
必要に応じて、リパーゼ活性を損わない溶剤類（例えば
炭化水素類）で洗浄した後、乾燥処理を施した後、湿潤
処理を施す。即ち。

リパーゼ製剤をエステル交換反応に使用する前に、リパ
ーゼ活性化剤による湿潤処理を加え、所定時間放置する
。このような湿潤処理を行う事によりエステル交換活性
が更に高められたリパーゼ製剤が得られる。かかる方法
で活性化せしめたリパーゼ製剤をエステル交換反応に用
いることができる。

本発明で使用するリパーゼ製剤の製造方法にりいて、詳
細な製造条件等は次の通シである。

先ず、使用するリパーゼについては、リパーゼによるエ
ステル交換反応で選択性が不良であると、アルカリ金属
触媒等を用いる従来のエステル交換反応に対する格別な
優位性が認められないので、実用的には何らかの選択性
、例えばグリセリドに結合する位置の選択性とか脂肪酸
の種類に対する選択性などを有するものがよい。

具体的には１位置選択性に優れたリパーゼとして１例え
ば、リゾプス系、アスペルギルス系。

中ヤンデイダ系、ムコール系のリパーゼ、すい臓すハー
ゼ等がある。これらリパーゼの多くは市販品として容易
に入手できる。グリセリドの１．３位の脂肪酸基を特異
的にエステル交換させる場合には、該目的に合致した特
性を有するリパーゼとして、例えば、リゾプスデレマー
（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｓｓｍａｒ　）　、　　リ
ゾプスヤボニ、／９（Ｒｈｉｚｏ−ｐｕｓ　ｊａｐｏｎ
ｉｃｕａ　）、ムコールヤポニカス（Ｍｕｃｏｒｊａｐ
ｏｎｉｃｕｓ　）等のリパーゼを用いればよい。

次に、リパーゼ活性化剤としては、水あるいは２価又は
３価の低級アルコールが好適であり、これらの中でも特
に水、あるいは、グリセリンが特に有効である。かかる
リパーゼ活性化剤は。

各々単独で用いても、２つ以上の混合物として用いても
いずれでも良い。

担体は、公知のものの中から選ぶ仁とができるが、セラ
イト、ケイン９土、カオリナイト、パーライト、シリカ
ゲル、ガラス繊維、活性炭、セルロースパウダー、炭酸
カルシラムなど、本発明のリパーゼ製剤製造系に不溶の
ものでリパーゼ活性に悪影響を与えないものであれば使
用できる。担体の形態は、粉状、顆粒状、繊維状など、
種々の形態で使用できる。

本発明で用いる油脂としては、一般的な植物性、動物性
の油脂もしくは加工油脂、あるいは。

これらの混合油脂が挙げられる。具体例としては、大豆
油、綿実油、ナタネ油、オリーブ油。

コーン油、ヤシ油、サフラワー油、牛脂、ラード、魚油
等が挙げられる。更に本発明で得られるリパーゼ製剤を
用いたエステル交換反応でカカオバター代用脂を目的物
とする場合には、グリセリドの２位にオレイン酸を多量
に含有する油脂１例えば、パーム油、オリーブ油、ツバ
キ油、サザンカ油、サル脂、イリツベ脂、コクム脂、シ
ア脂、コクア脂、フルクラ脂、ポルネオタロー脂又はこ
れらの分別油脂を用いることができる。

本発明で使用するリパーゼ製剤を製造するための具体的
な条件等は以下の通シである。油脂１００重量部に対し
て、市販のリパーゼ０．０１〜１０重量部、水分又は２
価あるいは３価の低級アルコール０．１〜２０重量部、
担体１〜５０重量部を各々加え、２０〜８０℃で１〜２
４時間かきまぜるととくよシ、油脂の分解を行なう。

この場合、添加順序については特に制限はない０油脂の
分解温度は、前記した温度の範囲で行われるが、リパー
ゼの作用に適した温度を選んで行うのが望ましい。

次に、油脂の分解生成物から、Ｐ別等により油脂外を除
去することにより、エステル交換活性の高いリパーゼ製
剤が得られる。ここで、必要に応じて、リパーゼの活性
を損わない不活性有機溶剤１例えば１石油ベンジン、ｎ
−ヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類でリパーゼ製
剤を洗浄後、更に乾燥処理を施してリパーゼ製剤を得る
こともできる。

紙上の如くし−Ｃ得られたリパーゼ製剤を油脂のエステ
ル交換反応に使用するに６たり、該リパーゼ製剤をリパ
ーゼ活性化剤を用いて湿潤処理する。湿潤処理の詳細な
条件等は次の通シである。

即ち１本発明の方法においては、前記製造方法で得られ
るリパーゼ製剤を、油脂のエステル交換反応に使用する
前に、エステル交換反応で使用するリパーゼ活性化剤と
あらかじめ接触させてリパーゼ製剤のリパーゼを活性化
させた後、反応系に加える。

本発明の湿潤処理時に用いるリパーゼ活性化剤としては
、油脂のエステル交換反応で使用するリパーゼ活性化剤
を用いる。具体例としては、水あるいは２価又は５価の
低級アルコールが好適であシ、中でも、水あるいはグリ
セリンが有効である。ここで、リパーゼ製剤製造時およ
び湿潤処理時に用いる水あるいは２価又は５価の低級ア
ルコール等のリパーゼ活性化剤は、互いに同じであって
も、互いに異なる組みあわせであってもいずれの組みあ
わせでも良い。

ＩＪ　ハーゼ活性化剤の使用量については、あらゆる担
体を含むリパーゼ重量の０．０１〜３０％の範囲が望ま
しい。これらリパーゼ活性化剤は。

各４単独で、あるいは２種以上のものを任意の割合で含
む混合物として用いることができる。

温度については、リパーゼの活性を阻害する温度範囲以
外であれば、適宜選んで湿潤処理を行プのが望ましいが
１通常、室温（２５℃）付近で湿潤処理を行えば十分な
活性化が達成できるＱ 湿潤処理に要する時間については、用いるリパーゼ活性
化剤やその使用量、処理温度によって異なるが、好まし
くは数時間以上の放置が望ましい。

本発明方法は、前記したリパーゼ製剤の高活性化に有効
であるだけでなく、一度以上エステル交換反応に使用さ
れ゛たリパーゼ製剤に適用した場合も、同様に高いリパ
ーゼ活性を発揮するという特徴を有する。

紙上の如く、湿潤処理により活性の高いリパーゼ製剤を
得ることができる。

〔発明の効果〕

本発明によるエステル交換活性を有するリパーゼ製剤を
活性化させる方法は、次に示す実施例、比較例等から明
らかなように、副反応である加水分解を抑制し、エステ
ル交換のみを効率よく、シかも、従来公知の方法に比べ
反応時間を大巾に短縮できる。さらＫ、本発明方法は、
リパーゼの使用量を大巾に削減できるという特徴を併せ
持つ。従って１本発明方法は、工業的規模での実施が容
易であり、かつ、大きな経済効果（反応時間の短縮、リ
パーゼ使用量の削減など）を有するものである。

〔実施例〕

以下に、参考例、実施例および比較例等をもって本発明
をさらに詳細に説明する。

参層例（リパーゼ製剤の製造例） パーム油軟質部１００ｔ、セライト１０Ｆ、イオン交換
水１．ＯＦ、および８．７Ｆの市販リパーゼ〔田辺製薬
（株）製、　　６０００１）パーゼ単位／ｌの活性を有
するリゾプス・デレマーのリパーゼ〕を、４０℃で１８
時間密閉容器中でかきまぜ酵素反応（加水分解）を行っ
た。

反応終了後、不溶性物質（セライト及びリパーゼの混合
物）をＰ別によｐ分取し、さらＫｎ−ヘキサン５ｍｌで
３回洗浄し、完全に油脂分を除いた。ついで、減圧下２
０〜３０′ｃｉＣて１時間転線する事により　＋７パー
ゼ裂剤を得た。

実施例１　リパーゼ製剤を用いたエステル交換反応（湿
潤処理を施した場合） 参考例で得たリパーゼ製剤（リパーゼｏ、８７’　、セ
フ　イト１．ｏ　ｏ　ｐからなる）Ｌ８７ＰＫイオン交
換水０．０１５　Ｆを加え密閉容器中で２４時間湿潤処
理を行った。このものとパーム油中融点部（沃素価３４
．ジグリセリド含量１％）１０ｖ１ステアリン酸１０Ｆ
及びｎ−ヘキサン４〇−を、４０℃で１日間密閉容器中
でかきまぜ酵素反応（エステル交換反応）を行った。反
応終了後、Ｆ別によシリバー上製剤等不溶性物質を除去
し、Ｆ液よシ減圧下ｎ−ヘキサンを留去した。得られた
交換脂について、カラムクロマトグラフィーにより、ジ
グリセリド画分及びトリグリセリド画分を各々得た。ト
リグリセリド画分については、ガスクロマトグラフィー
によりステアリン酸含量を測定した。ステアリン酸含量
及びジグリセリド含量については、第１表にその結果を
示した。

比較例１　リパーゼ製剤を用いたエステル交換反応（湿
潤処理をしない場合） 参考例で得たリパーゼ製剤１．８７Ｆ、パーム油中融点
部１０ｔ、ステアリン酸１０ｆ、イオン交換水０．０１
５　Ｆ及びｎ−ヘキサン４０ｄを％４゜℃で２日間密閉
容器中でかきまぜ酵素反応（エ　　　セラステル交換反
応）を行った。反応終了後、実施　　　テフ例１と同様
にして、生成トリグリセリド中のス　　　ｎ−テアリン
酸含量及びジグリセリド含量を求め、　　　器叫第１表
にその結果を各々示した。　　　　　　　　　をｆ比較
例２　リパーゼ製剤を用いないエステル交　　　生が換
反応（湿潤処理を施した場合）　　　　グリ０．８７Ｆ
の市販リパーゼ（参考例で用いたもの）、　　各刃セラ
イト１．Ｏｆを混合し水０．０１５　Ｆを加え２４時間
密閉容器中で湿潤処理を行った。このもの全量とパーム
油中融点部１０ｆ、ステアリン酸１０ｆ及びｎ−ヘキサ
ンａｏａＪを、４０℃で３日間密閉容器中でかきまぜ酵
素反応（エステル交換反応）を行った。反応終了後実施
例１と同様にして、生成トリグリセリド中のステアリン
酸含量、ジグリセリド含量を求め、第１表にその結果を
各々示した。

比較例３　リパーゼ製剤を用いないエステル交換反応（
湿潤処理をしない場合） ０．８７ｔの市販リパーゼ（参考例で用いたもの）。

・イト１．６ｔ、パーム油中融点部１０ｆ１ス′リン酸
１０ｆ、イオン交換水０．０１５　Ｆ及びヘキサ７４０
ＭＩを、４０℃で４日間密閉容Ｉでかきまぜ酵素反応（
エステル交換反応）ｉつた。反応終了後実施例１と同様
にして、ニトリグリセリド中のステアリン酸含量、ジセ
リド含量を求め、第１表にその結果を各；した。

実施例２　リパーゼ製剤を用いたエステル交換反応（湿
潤処理によるリパーゼ量削 減） 参考例で得たリパーゼ製剤を用い、リパーゼ単位１００
〜３’９０　ｕ／ｒ油脂の範囲で実施例１の条件下でエ
ステル交換を行った。比較のためＫ。

湿潤処理を施さない場合についても同様の条件下でエス
テル交換を行った。反応生成物の処理及び分析等につい
ては実施例１と同様に行った。

第２表にその結果を各々示した０ 第２表　　リパーゼ使用量の削減０） 注り湿潤処理；３０℃、２４時間 申り反応条件：水分０．１５％対油脂、４０℃７３日実
施例３　リパーゼ製剤のくシ返し使用によるエステル交
換反応（湿潤処理を施し た場合） 参考例で得たリパーゼ製剤１８．７Ｆに、イオン交換水
０．３ｆを加え密閉容器中で２４時間３０℃にて湿潤処
理を行った。湿潤処理で得たリパーゼ製剤全量、パーム
油中融点部２００　Ｆ　、ステアリン酸２ｏｏｒ及びｎ
−ヘキサン８００ｄから成る混合物を、密閉容器中で４
０℃にてかきまぜ酵素反応（エステル交換反応）を行っ
た。反応終了後、リパーゼ製剤等の不溶性物質をＰ別に
よシ除去し、Ｐ液を分取した。Ｐ液よシ、減圧下ｎ−へ
キサンを留去して交換脂を得九。実施例１と同様にして
、交換脂のステアリン酸含量を求めた。Ｐ別で得たリパ
ーゼ製剤は、減圧下１時間２０℃にて転線処理した後、
イオン交換水０．３Ｆを加え、前記と同様にして再び湿
潤処理した後、前記のエステル交換反応条件下で再びエ
ステル交換を行った。得られた交換脂について同様にス
テアリン酸含量を求めた。

リパーゼ製剤は前記と同様に回収、処理した後、湿潤処
理を施してくシかえしエステル交換反応に用いた。結果
を第３表に示した。

第３表　　リパーゼ製剤〈シかえし使用の結果出願人代
理人　　古　　谷　　　　　馨手続補正書印釦 昭和６０年１０月１６日 １、事件の表示 特願昭５９−２７０３１６号 ２、発明の名称 酵素の活性化方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 （０９１）花王石鹸株式会社 ４、代理人 東京都中央区日本橋横山町１の３中井ビル明細書の発明
の詳細な説明の欄 ６、補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　リパーゼ製剤を、使用前にあらかじめリパーゼ活性
   化剤を用いて湿潤処理する事により、リパーゼ製剤のリ
   パーゼを活性化させる事を特徴とするリパーゼの活性化
   方法。 ２　リパーゼ製剤が、リパーゼ活性化剤、リパーゼ及び
   担体から成る混合物に油脂を加えてこれらを反応させる
   事により油脂を分解させた後に、分解生成物から濾別等
   により油脂分を除去する事により得られるものである特
   許請求の範囲第１項記載のリパーゼの活性化方法。 ３　リパーゼ製剤が、少なくとも一度以上エステル交換
   反応に使用されたリパーゼ製剤である特許請求の範囲第
   １項記載のリパーゼの活性化方法。 ４　リパーゼ活性化剤が、水あるいは２価又は３価の低
   級アルコールのうちから選ばれる１種又は２種以上の混
   合物である特許請求の範囲第１項または第２項記載のリ
   パーゼの活性化方法。