JPH04501664A - 粒状固定化リパーゼ調製品、その製法およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 粒状固定化リパーゼ調製品、その製法およびその使用エステル変換に対する固定 化リパーゼの使用が増大していることを考慮し、固定化リパーゼ調製品を提供す るために広範囲の研究活動が進められてきている。エステル交換用の幾つかの最 初に工業的に適用可能な固定化リパーゼは、米国特許第４．２７５．０８１号明 細書第７欄、２８〜３５行に記載されており、この記載から火工の内容が明らか である。すなわち、固定化リパーゼ調製品は、セライト珪藻土に水性リパーゼ溶 液のアセトン沈殿を形成して調製される。

しかし、これらの固定化リパーゼ調製品の半減期は比較的短い。また、入手可能 な特定リパーゼ活性は、比較的低い。

更に、貯蔵およびカラム充填中の塵の問題が存在し、更にまた、溶剤はこれらの 従来技術の固定化リパーゼ調製品の使用中に必要である。

従って、疎水性結合部位を有する担体上にリパーゼを固定化させることに研究活 動が、多かれ少かれ向けられてきた。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ＸＸＩ Ｖ巻、１００７〜１０１３頁（１９８２）を参照のこと、この記載より以下の内 容が明らかである。すなわち、高半減期と工業的適用に対する高活性を有する固 定化リパーゼ調製品の製造において、多少疎水性結合部位を有する担体はコンデ チオ　シネ　クニア　ノンに−１ｔｉｏ　５ｉｎｅ　■ｎｏｎ）であると一般に 想定されている。また、公告されたデンマーク特許１５２７６３を参照されたい 。この特許は、特定のマクロポーラス弱アニオン交換樹脂、例えばデュオライト 系に属する樹脂から成る担体を有する固定化リパーゼ調製品を開示する。この種 の担体樹脂は、疎水性結合部位を有し、更に調製品は高半減期を示し、更に工業 的エステル交換に対し良好に適合している。

しかし、たとえそうであってもこれらのアニオン交換樹脂は欠点を有している。

第一に、それらは極めて高価であり、更にこのことは固定化リパーゼ調製品の価 値に対し大きな関係を持つ。第二に次の内容が見出された。すなわち、有機媒質 中の使用中、アニオン交換樹脂から抽出物を有機媒質に移し、更にたとえ抽出物 の量が少なくとも、これはしばしば重大な欠点を示し、特にもしも酵素プロセス の最終製品が人的消費に対して意図されている場合でもそうである。固定化する 前に有機溶剤で樹脂を洗うことは可能であるが、これはコスト高の工程である。

従って、高半減期と高い特異活性の可能性を有し更に担体から有機相への抽出物 の移動可能性がなく安価な固定化リパーゼ調製品に対する要求が存在する。

今や、本発明によれば、以下の内容が見出された。すなわち上記必要性はもしも 注意深く規制した種類の無機担体を用いる場合、（上述の珪操土に関する偏見に 反して）満たされ得る。

従って、担体材料としてマクロポーラスシリカもしくはケイ酸塩を有する本発明 の粒状固定化リパーゼは、９０％以上の粒子が１００ないし１０００卿の粒径を 有することを特徴とし、ここにおいて、粒子中の孔の８０％以上がリパーゼ小球 の直径の５ないし４５倍の直径を示し、更にここにおいて粒状固定化リパーゼの 含水率は１〜２０％、好ましくは２〜２０％、より好ましくは５〜２０％である 。

Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃｏ１１ｏｉｄ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　５ｃ ｉｅｎｃｅ、２５（１９８６）２３５〜２４８、ｒＭａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　５ ｉｌｉｃａ　ｉｎ　Ｃｈｒｏｎ＋ａｔｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄＩｎ＋ｍｏｂｉｌ ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ″の文献から、次の内容が明ら かである。すなわち、酵素の固定化に対する最大能力は、蛋白質小球の５〜１０ 倍の平均孔径を有するシリカについて見出された。驚くべきことに、本発明者等 は以下の内容を見出した。すなわち、リパーゼの固定化に対する最大能力は、リ パーゼ小球の径の５〜４５倍の孔径を有するシリカもしくはケイ酸塩について認 められる。この文献は、リパーゼには焦点が全く会っていないが、一般に酵素あ るいは一般に蛋白質に関する。本発明は、専ら特定の固定化リパーゼに関し、更 にリパーゼは酵素活性が二相間の界面で機能し次の内容を意味するという意味で 全く法外な酵素である。すなわち、リパーゼの固定化は極めてデリケートな問題 であり、この問題はリパーゼ固定化を含む分野において公知の固定化技術の利用 性を高度に制限する。Ｊ、Ｌａｖａｙｒｅ等、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ 　Ｐｒｏｐｅｒ−ｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｏｂｔｌｉｚｅｄ　Ｌｉｐａｓｅｓ、 　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉ−ｎｅｅｒｉｎｇ、Ｘ ＸＩＶ巻、１００７〜１０１３頁（１９８２年）、（ジョーン　ビレ−アンド　 サン社）参照。

語句ｒｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　Ｊは、孔の直径が少なくとも２５０人であるこ とを意味する。孔の直径はＢ、Ｅ、Ｔ、法によって測定される。

本発明による固定化リパーゼにおいて使用される担体物質は、少なくとも６５重 量％のシリカおよび／又はケイ酸塩、好ましくは少なくとも９０重量％のシリカ 又はケイ酸塩である。

また、この明細書およびクレームにおいて、「シリカ又はケイ酸塩」は、真正な シリカ又はケイ酸塩すなわち、誘導されていないシリカ又はケイ酸塩を意味する 。

リパーゼ小球の直径は、Ａｌｂｅｒｔ　Ｌ、　ＬｅｈｎｉｎｇｅｒのｒＢｉｏｃ ｈｅ−ｍｉｓｔｒｙＪ　１９７０年、Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎ ｃ、、　１４２〜１４３頁に示されるようなＸ線回折法によって測定できる。

リパーゼ小球の直径は、一般に５０人付近である。従って、ブレース情報小冊子 ＳＢ　ＢＣＩＥ／１９８７年６月（ブレース社発行、グレースプラザ、１１１４ 、アベニュー　オブ　ザ　アメリカンス、ニューヨーク、Ｎ、Ｙ、　１００３６ −７７９４）は、それらは全て孔径約２５０Å以上を有するので本発明の目的に 対し十分適合している。たとえ、シリカゲルが細胞および酵素の固定化に対して 使用され得ることが情報小冊子に示されていたとしても、シリカゲルがリパーゼ の固定化に対して使用できることは小冊子中には全く示されておらず、しかもリ パーゼは本明細書の初めに説明した如く、他の酵素と比較して固定化に関して独 得の特性を示す例外的酵素である。先の米国特許４，２７５，０８１（１２欄、 ４８行）において用いられる無機粉末は、本発明方法では使用できない（クレー ム１の粒状径の制限を参照）ことが見出された。更に、全ての欠点を伴うアセト ン沈殿法は米国特許４，２７５．０８１で用いられるセライト粉末にリパーゼを 固定させるための唯一の方法と思われることが見出された。

また、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　Ｘ ＸＩＶ巻、１００７〜１０１３頁（１９８２年）中の先の引用文献から、リパー ゼはスフェロジル（Ｓｐｈａｅｒｏｓｉｌ）支持体上で固定化されることができ 、この支持体はイソプロピル基の導入によって誘導され更に孔径１２５０〜３０ ００人を有する疎水性の多孔質支持体である。

しかし、スフェロジルは極めて高価である０本発明に係る粒状固定化リパーゼに 関する最も重要な面の一つは、担体の誘導が不必要である、安価な粒状固定化リ パーゼ調製品の製造に対する可能性である。

ヨーロッパ特許１４７．９１４において、粒径３０〜４５メツシユで平均孔径４ ００人を有するガラス担体にリパーゼを固定化する固定化リパーゼ調製品が記載 されている。しかし、またヨーロッパ特許１４７，９１４から以下の内容が明ら かである。すなわち、有機チタネートタイプのカップリング剤が固定化リパーゼ 調製品の製造用に用いられることが絶対必要である。

Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２８．５２７〜 ３０真において、粒径２０〜８０メツシユおよび孔径７００人を有するガラス担 体ＰＧ７００−８０に固定化されるリパーゼ調製品が開示されている。

しかし、５２８頁より以下の内容が明らかである。すなわち、水分は完全に除去 され、そしてこれは本発明の範囲外の公知のリパーゼ調製品となしている。何故 なら、本発明の固定化リパーゼは１〜２０％の水分を含有する。この相違は、公 知の製品の性能が本発明に係る固定化リパーゼの性能よりも劣っているという結 論を導く。

Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｏ１ｏｇｙ＋１９８４年、６巻 、１０月、４４３〜４４６真の文献から、次の内容が明らかである。すなわち、 種々の等級の珪藻土が脂肪の酵素的エステル交換反応に対する試剤として意図さ れている固定化リパーゼに対する支持体として使用できる。しかし、これらの支 持体は本発明の粉質固定化リパーゼの担体物質の孔径よりもより大きい孔径を有 する。このことは、各々の導入されたＬＵに対する活性が、公知の固定化リパー ゼの相当な小さな比表面積の故に、本発明に関して相当に小さいことを意味する 。従って、公知の固定化リパーゼ調製品に関し、多層のリパーゼが担体上に存在 し、−力木発明の固定化リパーゼに関しては単層のリパーゼが担体上に存在する 。

本発明に係る固定化リパーゼの好ましい態様において、９０％以上の粒子は２０ ０〜８００　ｕｍ、好ましくは２００〜４００声の大きさを有する。もしも、粒 径が２００ｐ以下の場合、カラム内の圧力損失は大きくなりすぎる傾向にあり、 もしも粒径が８００ｐｒｎ以上の場合、拡散抑制は高すぎる傾向となる。

本発明の固定化リパーゼの好ましい態様において、粒子中の８０％以上の孔はリ パーゼ小球の１０〜４５倍の直径を示し、好ましくはリパーゼ小球の直径の１２ 〜４０倍の直径を示す。この範囲の孔径において、表わされたリパーゼ活性（Ｂ ＩＤ／ｇで測定）は特異的に高い。

本発明に係る固定化リパーゼの好ましい態様において、リパーゼは熱安定性リパ ーゼである。このようにして、固定化リパーゼは高温度で操作するカラム中で使 用でき、これにより少なくとも２つの利点が得られる：第１の面において、反応 混合物の比較的低粘度のため、溶剤なしで例えばエステル交換に対し固定化リパ ーゼを使用することが可能となり、第２の面において反応速度は比較的高く、更 に第３の面において、基質および孔の内側の製品の拡散速度は増加するであろう 。

本発明に係る固定化リパーゼの好ましい態様において、すに発現する遺伝子を含 む微生物を培養することによって生産される。これらのリパーゼは、テストされ 更にこれらは全てカラム中高温度で良好な挙動を示す。

また、本発明は本発明に係る粉質固定化リパーゼの製造方法を含んでなり、ここ において微生物リパーゼの水性溶液を粒状担体物質と接触させるが、この物質は マクロポーラスシリカもしくはケイ酸塩であり、ここにおいて９０％以上の粒子 は１００〜１０００−の大きさであり、更にここにおいて粒子中８０％以上の孔 は担体物質に所望量のリパーゼを結合させるのに十分な期間中、リパーゼ小球の 直径の５〜４５倍の直径を示し、しかる後形成した粉質固定化リパーゼは水性相 から分離し更に分離した固定化リパーゼを含水率約２〜２０％まで乾燥する。

以下の内容が見出された。すなわち、水性相からの分離とその乾燥までの洗浄が 有利であることが見出された。

゛所望量のリパーゼが担体物質に結合するために十分な時間はリパーゼによって 異なり、そしてそれは２，３分から２゜３日にわたり得る。

本発明に係る方法の好ましい態様において、微生物リパーゼの水性溶液の量と担 体物質の重量の割合は、担体物質１ｇ（乾燥重量）に対しｉｏ、ｏｏｏ〜５００ ．０００に相当する。もしも吸着が担体物質１ｇ当たり１０．０ＯＯＬＵ以下で ある場合、カラムを通過する液体反応混合物の速度は小さすぎる傾向となり更に 担体物質１ｇ当たり５００．０ＯＯＬＵ以上の配合を得ることは極めて困難であ る。

本発明の好ましい態様において、担体物質と水性溶液との接触中のｐＨは表わさ れたリパーゼ活性に関して問題となっているリパーゼの最適配合ｐＨから１ｐＨ 単位以上は偏位していない。これにより、固定化リパーゼのＢＩＵ／　ｇで測定 された発現リパーゼ活性は、可能な限り大きい。第１図を参照のこと、この第１ 図は以下に詳細に説明されるであろう。

本発明方法の好ましい態様において、簡単な口過により分離が行われる。これは 操作の実施に関し最も簡単でかつ安価な方法である。

また、本発明は、本発明に係る固定化リパーゼの使用を含んでなる。この使用は 脂肪のエステル交換方法を含んでなり、ここにおいて遊離脂肪酸もしくは脂肪酸 エステルを含む液体脂肪もしくは脂肪混合物を、本発明に係る固定化リパーゼ調 製品と接触させる。更にまた、該使用は、グリセリド又は置換グリセロールの混 合物の合成方法を含んでなり、ここにおいてグリセロールもしくは置換グリセロ ール又は他のタイプのアルコールと遊離脂肪酸の混合物を本発明に係る固定化リ パーゼ調製品と接触させる。また、使用は例えばカラム中で連続的に、又は回分 式に行うことができる。

リパーゼ活性単位（ＬＵ）は、ノボノルディスク社（ノボアレー、ＤＫ−２８８ ０、バズグバエルト、デンマーク国）から入手可能な刊行物８３−０１−０３の ＡＰ９５．１／２．ＣＢに記載される如く決定される。

ＢＩＵ（バッチエステル交換単位）で表わされるリパーゼ活性は、ノボノルディ スク社（ノボアレー、ＤＫ−２８８０、バズグバエルト、デンマーク国）から入 手可能な刊行物ＡＦ２０６−２に記載される如く決定される。

第１図は、異なる孔径を有する担体物質上にリパーゼを充填する間のｐＨと発現 されたリパーゼ活性（ＢＩＬＩ／　ｇ　）　との依存性を示す。

第１図のデータは、次のように解される。Ｂｔｏｃａｔａｌｙｓｔ　５ｕ−ｐｐ ｏｒｔｓ　ＳＧ　ＢＣＩＥ（１９８７年、６月）に記載されたブレース社からの 担体製品である。シリカ担体を、次のリパーゼ吸着工程中使用されるｐＨで、す なわちｐｏ４，４．ｓ、ｓ、ｓおよび７で（第１図参照）３０分間緩衝液で洗う 。１８６，０ＯＯＬＵ　７ｇの吸着の発生に十分なリパーゼ活性の所望量のリパ ーゼを、５ｄの脱イオン水に溶解し次いで１ｇの担体に添加する。リパーゼをデ ンマーク特許出願第４４１７／８６の実施例１に記載される如く、すなわちス１ ユｊ−ｊノ」ン」二（２）朋お刀１工す１国竺蛙により生産する。ｐＨ値を調節 し、担体およびリパーゼ溶液を２時間回転によりゆっくりと撹拌し、次いで真空 口過する。

口液を加水分解活性（Ｌｌｌ／ｄ）に対し分析し吸着された（ロードされた）リ パーゼの量を測定する。固定化リパーゼを風乾し、湿分含量を１０重量％に調節 し、サンプルをバッチエステル交換活性（ＢＩＵ／　ｇ　）に対し分析する。図 面から明らかなように、孔径１５００人を有するシリカ担体（すなわち、リパー ゼ小球の直径の２５倍、すなわち孔径に対しクレーム内）は、最適ｐＨで秀れた リパーゼ活性を示す。

最高の発現リパーゼ活性を示し、ＢＩＵ／ｇの値で測定することによって評価し た第１図に示す４個のリパーゼ固定化リパーゼ調製品の内３個のものについて次 の方法でカラム中でテストした。

水で飽和されたイオン交換樹脂を有するプレカラムおよび酵素カラム（４，５ｇ の固定化リパーゼ調製品を含む）から成るシステムを組立てる。プレカラムの機 能は水を用いて基質を飽和することであった。２８．６％（ｗ／ｗ）のラウリン 酸および７１．４　（％）の大豆油から成るオイル混合物を、ポンプでカラム内 を通した。カラム内の温度を６０°Ｃに保持した。大豆油内に１４％導入された ラウリン酸の一定変換率を保持するために流速を調節した。サンプルを一週間に ３〜５回採取し次いで遊離脂肪酸および部分グリセリドをカラムクロマトグラフ ィーにより除去して分析し次いでトリグリセリドをメチル化し引き続きメチルエ ステルのキャピラリーガスクロマトグラフィー処理した。活性に比例する流速を 、転化率が導入ラウリン酸１４％±１％になった時、時間に対してプロットした 。

図面より、次の半減期および初期活性を推定する。

ＴＧはトリグリセリドの省略記号である。

また、この場合孔径１５００人を有するシリカ担体は、初期流速に関して極めて 良好に機能する。

固定化リパーゼ調製品中の水分含量を変えることの意義を実証するため、次の実 験を行った。固定化リパーゼ調製品を担体としてのブレース６を用いて調製した 。リパーゼはヱまコラ　−ヌギノザ　Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ａｎｕ　１ｎｏｓａ ）リパーゼであった。

乾燥を除き、固定化調製品をｐＨ４，５で第１に関して説明した如く調製した。

次の活性を見出した。

本発明の固定化酵素を次の実施例により更に説明する。例１．２および７は製造 例であり；例３．４．５、および６は応用例であり、更に例８は比較例である。

例１ ２ｇの担体（ブレース社、孔径７００人、粒径０．５〜１０）を、ｐＨ４，５の ０．２Ｍアセテート緩衝液で３０分間洗浄し次いで真空濾過した。

４００．０００Ｌ１１（ＥＰ２３８，０２３中に示した如く製造された０、１７ ｇのりシムコールマイヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ）および２． ４×１０６Ｌｌｌ／ｇ活性を有する）を、８ｇの脱イオン水に溶解し、次いで担 体に加えた。ｐＨ値を４．５に調節し次いで担体および酵素溶液のスラリーを室 温で２時間回転してゆっくり撹拌し、引続き真空濾過した。濾液は吸着率３２％ に相当する２、７×１０５ＬＵを含んでいた。固定化リパーゼを真空炉中２５° Ｃで一夜乾燥し、水分を１０％に調節した。サンプルを分析した結果２６ＢＩＵ ／　ｇであった。

例２ １ｇの担体（ブレース４、孔径５００人、粒径０．５〜１ｍ）をｐＨ４，５の０ ．２　Ｍアセテート緩衝液中で３０分間洗浄し次いで真空濾過した。ヨーロッパ 特許出願第８７９０７０９８．５で示される如（製造しり５０．０００ＬＵ　（ １，４ＸＩＯ’　ＬＵ／　ｇ　（７）活性ｔ−有ｔル０．３５ｇのリパーゼ）の カンデダ　アンタルクチ力（Ｃａｎｄｆｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼを 、５ｄの脱イオン水に溶解し次いで担体に添加する。ｐＨ値を４．５に調節し次 いで担体およびリパーゼ溶液のスラリーを室温で１２時間回転によりゆっくり撹 拌し、引続き真空濾過した。濾液は吸着率６２％に相当する１９．０ＯＯＬＵを 含有していた。固定化リパーゼを風乾し次いで湿分を１０％に調節した。サンプ ルを分析し、２４　ＢＩＤ／ｇであった（溶剤なしで６０°Ｃでの分析）。

例３ デンマーク特許出願第４１１７／８６の例１で示したように製造された２、５ｇ の固定化リパーゼ（すなわち、スまユｉ−ｉスギノザ　Ｈｕａ＋１ｃｏｌａ　１ ａｎｕ　１ｎｏｓａ））を、大豆油および水を含有するフラスコに添加し次いで ５０゛Ｃで振とうした。サンプルを取り出し、遊離脂肪酸含量（加水分解の程度 ）をＫＯＨで滴定して測定した。実験を、２５％、５０％および７５％の大豆油 含量で行った。オイルおよび水の合計量は常に５０ｇであった。

結果を第３図に示す。第３図から以下の内容が明らかである。すなわち、最高度 の加水分解が、最高含量の水について得られる。

例４ 固定化リパーゼを用いたエステル合成 ０．０５モル（Ｌｏｇ）のラウリン酸および０．０５モルのアルコールを、例３ で記載した如く製造した５％（Ｗ／Ｗ）の固定化リパーゼと混合した。反応は、 基質および酵素を含有するフラスコを回転させることより６０°Ｃで行った。４ 種の異なるアルコールを用いた。アウリルアルコール、ペンタノール、イソプロ パツールおよびプロパツール：結果を第４図に示す。

ラウリルアルコールによる実験を、減圧下（約５０ミリバール）で行った。第４ 図から以下の内容が明らかである。すなわち、最高の転化率がラウリルアルコー ルについて得られ更に酵素は第二アルコールをエステル化できない。

例５ 固定化リパーゼを用いた連続固定床操作例３で記載した如く製造した固定化リパ ーゼ６０ｇを各々有する２個のカラムを充填した。カラムを連続して組立て次い でカラムの温度は６０°Ｃであった。同様のカラム系を平行に組立てたが、この 系は代りに６０ｇのりポザイム（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ）　（ノボ−ノルディスクＡ 、／Ｓから商業的に入手可能な固定化リパーゼ）の２倍を有していた。２個の系 の床高は、零時で測定した。定められた流速を３日間用いた。しかる後、カラム の圧力降下とカラムの床高を測定した。次いで新たな流速を用いそして３日以後 の新たな値を測定した。結果を第５図に示す。この図の結果から明らかなように 、シリカ担体上のりパーゼは商業的に入手可能なりポザイムよりもより良い酵素 調製品である。何故なら、圧力降下は同流速に対してより低いからである。更に 以下の内容が観察された。すなわち、３００時間以上の操作後でさえ、シリカ担 体を含む床の圧縮はなかった。一方、リボザイムを含むカラムは合計１３鵬まで 圧縮された。

例６ ５ｇの担体（ブレース６、孔径１５００人、粒径０．５〜１−）を、ｗｏ　８８ １０２７７５．８頁に記載される如（、カンディダアンタルクチカ（Ｃａｎｄｉ ｄ虹μｍａｒｃｔｉｃａ）由来のＢ成分２５０．０００ＬＵを含有する溶液と混 合した。ｐＨ値を４．５に調節し次いで担体およびリパーゼ溶液のスラリーを室 温で４時間回転してよりゆっくり撹拌し、引き続き真空乾燥した。粒子の吸着は 、１ｇの乾燥担体光たり２８，１００であった。約２％の水分を有する１２５■ （乾燥重りの固定化リパーゼを、６０°Ｃでのプロパツールおよびミリスチン酸 ４０ミリモルのエステル化に対して用いた。２０分以内に、２９．２％のエステ ルが得られた。

例７ １ｇのケイ酸塩担体、マンビレ（Ｍａｎｖｉｌｌｅ）Ｒ−６４８（平均孔径１４ ００人）を、３０分間ｐＨ４，５の０．２Ｍアセテート緩衝液中で洗浄し次いで 真空乾燥した。デンマーク特許出願第４１１７／８６の例１で記載した如く製造 したリパーゼ（すなわち、ズマ且フーヌギノザ　Ｈｕｍｉｃｏｌａ　Ｉａｎｕ　 １ｎｏｓａ）１８６．０ＯＯＬＵ（活性３．１×１０６ＬＵ／ｇを有する０、０ ６ｇのリパーゼ）を、５ｄの脱イオン水に溶解し次いで担体に添加した。ｐＨを ４．５に調節し次いで゛担体およびリパーゼ溶液のスラリーを、２時間撹拌によ りゆっくり回転し、引続き真空濾過した。濾液は、吸着率８２％に相当する３４ ．０００ＬＵを有していた。固定化リパーゼを風乾し次いで湿分含量を１０％に 調節した。サンプルの分析して１４　ＢＩＵを得た。

例８ この例は比較例である。担体の孔径がリパーゼ小球の直径の５倍よりもより小さ いからである。

１ｇの担体、アミコン　マドレックス（Ａｍｉｃｏｎ　Ｍａｔｒｅｘ　（登録商 標）シリカＳｔクロマトグラフィー媒質（孔径１００人、粒径１９０〜３００ｔ ！ｍ）を、３０分間ｐＨ４，５の０．２Ｍアセテート緩衝液中で洗浄し次いで真 空濾過した。１８６．０００ＬＵ　（活性３．１×り特許出願第４１１７／８６ の例１で記載した如（製造）を、５Ｉｄの脱イオン水に溶解し次いで担体に添加 した。ｐＨを４．５に調節し、担体およびリパーゼ溶液のスラリーを、２時間回 転によりゆっくり撹拌し、引続き真空濾過した。濾液は、吸着率１００％に相当 する５０ＬＵを有していた。固定化リパーゼを風乾し次いで湿分含量を１０％に 調節した。低ＢＩＵ値は、固定化リパーゼが劣っていることを示す。

く　く ロ　＜　く ロ　− ０　ロ　００　α ｏ□　Ｌｌ’ｌ　＋／１ 〆　。　、０．。

区　区　区　区 ３　Δ　ム　３ も　Ｈ５ｂ 一 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年５月１５日

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．マクロポーラス担体物質を有する粒状固定化微生物リパーゼであって、少な くとも６５％のシリカもしくはケイ酸塩から成り、ここにおいて９０％以上の粒 子が１００ないし１０００μｍの粒径を有し、ここにおいて、粒子中の孔の８０ ％以上が粒子小球の直径の５ないし４５倍の直径を示し、更にここにおいて粒状 固定化リパーゼの含水率が１〜２０％、好ましくは２〜２０％、より好ましくは ５〜２０％である、前記粒状固定化微生物リパーゼ。
2. ２．９０％以上の粒子が２００〜８００μｍ、好ましくは２００〜４００μｍを 有する請求の範囲第１項記載の粒状固体化リパーゼ。
3. ３．粒子中の孔の８０％以上が、リパーゼ小球の直径の１０〜４５倍、好ましく はリパーゼ小球の直径の１２〜４０倍の直径を示す、請求の範囲第１項又は２項 記載の粒状固定化リパーゼ。
4. ４．リパーゼが熱安定性リパーゼである、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記 載の粒状固定化リパーゼ。
5. ５．リパーゼが、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）種、カンディダアンタルクチカ （Ｃａｎｄｉｄａ　ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）又はリゾコールアイヘイ（Ｒｈｉｚ ｏｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ）の菌株から由来するリパーゼをコードしかつ発現 するための遺伝子を有する微生物を培養することによって産生される、請求の範 囲第１〜４項のいずれかに記載の粒状固定化リパーゼ。
6. ６．請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の粒状固定化リパーゼの製造方法で あって、微生物リパーゼの水性溶液を、粒状担体物質（これは、マクロポーラス シリカもしくはケイ酸塩であり、ここにおいて９０％以上の粒子が１００ないし １０００μｍの粒径を有し、ここにおいて、粒子中の孔の８０％以上がリパーゼ 小球の直径の５ないし４５倍の直径を示す）と、所望量のリパーゼを担体物質に 結合させるのに十分な時間にわたって接触させ、しかる後形成した粒状固定化リ パーゼを含水率１〜２０９６、好ましくは２〜２０％、最も好ましくは５〜２０ ％まで乾燥することを含んでなる前記方法。
7. ７．微生物リパーゼの水性溶液の量と担体物質の重量の割合が担体物質１ｇ（乾 燥重量）当たり、１０，０００〜５００，０００ＬＵに相当する、請求の範囲第 ６項記載の方法。
8. ８．担体物質と水性溶液との接触中のｐＨが発現されたリパーゼ活性単位に関し 、問題のリパーゼの最適吸着ｐＨからｌｐＨ単位以上は偏位していない請求の範 囲第３項記載の方法。
9. ９．分離を簡単な濾過法で行う請求の範囲第６〜８項のいずれかに記載の方法。
10. １０．遊離脂肪酸もしくは脂肪酸エステルを含む液体脂肪もしくは脂肪混合物を 、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の固定化リパーゼ調製品と接触させる ことを含んでなる脂肪のエステル交換方法。
11. １１．トリグリセリドおよび水を請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の固定 化リパーゼ調製品と接触することを含んでなる脂肪の加水分解方法。
12. １２．グリセリド又は他の脂肪酸エステルの合成方法であって、グリセロールも しくは置換グリセリドまたは他のタイプのアルコールおよび遊離脂肪酸の混合物 を、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の固定化リパーゼ調製品と接触させ ることを含んでなる、前記合成方法。