DE3750982T2 - Positionsmässig nicht spezifische lipase von candida-arten; verfahren für ihre herstellung und ihre verwendung. - Google Patents

Positionsmässig nicht spezifische lipase von candida-arten; verfahren für ihre herstellung und ihre verwendung.

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Description

    Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue, hinsichtlich der Position unspezifische Lipase mit erhöhter Thermostabilität in löslicher und immobilisierter Form, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung bei der Esterhydrolyse, Estersynthese und Umesterung.
    • Definitionen
  • Die nachstehenden Definitionen der unterstrichenen Ausdrücke gelten in der vorliegenden Anmeldung einschließlich der Ansprüche.
  • Lipase soll ein Enzym bedeuten, das Reaktionen katalysiert, die Esterbindungen in wasserunlöslichen Carbonsäureestern betreffen (wie Hydrolyse, Synthese und Austausch von Esterbindungen).
  • Immobilisierte Lipase bezeichnet Lipase in Form eines immobilisierten Enzyms oder immobilisierter Zellen, wie es in "Guidelines for the characterization of immobilized biocatalysts", Enzyme Microb. Technol., Bd. 5 (1983), S. 304-307 definiert ist. Derivatisierte Lipase bezeichnet eine Lipase, die chemische modifiziert worden ist, ohne immobilisiert worden zu sein. Lösliche Lipase bezeichnet eine nicht-modifizierte Lipase, die weder immobilisiert noch derivatisiert ist.
  • Eine hinsichtlich der Position spezifische Lipase (oder kurz: spezifische Lipase) ist eine Lipase, die vorzugsweise mit Fettsäureacylgruppen in den Positionen 1 und 3 eines Triglyceridmoleküls reagiert, und eine hinsichtlich der Position unspezifische Lipase (oder kurz unspezifische Lipase) ist eine Lipase, die mit vergleichbaren Geschwindigkeiten mit allen drei Fettsäureacylgruppen eines Triglycerids reagiert.
    • Hintergrund
  • Es ist eine Vielzahl von Lipasen mikrobiellen Ursprungs (sowohl intrazellulär als auch extrazellulär) sowie pflanzlichen und tierischen Ursprungs bekannt. Für eine allgemeine Erörterung extrazellulärer mikrobieller Lipasen vgl. A. R. Macrae, S. 225ff in: Microbial Enzymes and Biotechnology (W. Fogarty, Herausgeber), ISBN 0-85334-185-0, Applied Science Publishers Ltd., 1983.
  • Unspezifische Lipasen aus den folgenden Mikroorganismen sind bekannt: Staphylococcus aureus (D.V. Vadehra, Lipids, Bd. 9 (1974), S. 158), Penicillium cyclopium (S. Okumura et al. Agricultural and Biological Chemistry, Bd. 40 (1976), S. 655; und E.C. Renshaw und C.L. San Clemente, Developments in Industrial Microbiology, Bd. 8 (1986), S. 214), Corynebacterium acnes (G.S. Hassing, Biochimica et Biophysica Acta, Bd. 242 (1971), S. 381; und G. Pablo, The Journal of Investigative Dermatology, Bd. 63 (1974), S. 231), Propionibacterium acnes (E. Ingham et al., Journal of General Microbiology, Bd. 124 (1981), S. 393), Candida cylindracea (auch bekannt als C. rugosa) (G. Benzonana und S. Esposito, Biochimica et Biophysica Acta, Bd. 231 (1971), S. 15; und Y. Kimura, Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., Bd. 17 (1983), S. 107), Candida curvata (D. Montet et al., Fette Seifen Anstrichmittel, Bd. 87 (1985), S. 181). Daten, die in der Literatur und in einem Beispiel der vorliegenden Anmeldung angegeben sind, zeigen jedoch, daß alle diese Lipasen eine unzureichende Thermostabilität bei Langzeitanwendung bei etwa 60ºC oder darüber aufweisen. Außerdem sind S. aureus, C. acnes und P. acnes angenommene oder erwiesene Pathogene.
  • Lipase aus Geotrichum candidum (R.G. Jensen, Lipids, Bd. 9 (1974), S. 149; R.G. Jensen et al., Lipids, Bd. 7 (1972), S. 738; und Y. Tsujisaka und M. Iwai, Kagaku to Kogyo, Bd. 58 (1984), S. 60) ist hinsichtlich der Position unspezifisch, sie ist jedoch hochgradig spezifisch für bestimmte ungesättigte Fettacylgruppen. Ferner ist sie nicht thermostabil.
  • Ferner sind Lipasen aus Humicola lanuginosa (W.H. Liu, T. Beppu und K. Arima, Agricultural and Biological Chemistry, Bd. 37 (1973), S. 1349) und Chromobacterium viscosum (M. Sugiura und M. Isobe, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Bd. 23 (1975), S. 1226) als unspezifisch beschrieben worden. Spätere Ergebnisse (Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, Bd. 3 (September 1985), S. 200) zeigen jedoch, daß diese beiden Lipasen in der Tat spezifisch sind. Daten in einem Beispiel der vorliegenden Anmeldung zeigen ebenfalls, daß die C. viscosum-Lipase spezifisch ist.
  • Eine immobilisierte unspezifische Lipase wird in Y. Kimura et al., Eur. J. Microbiol. Biotechnol., Bd. 17 (1983), S. 107-112 beschrieben. Die Lipase stammt aus Candida cylindracea, und die Daten in diesem Artikel zeigen, daß die immobilisierte Lipase eine optimale Temperatur von etwa 40ºC aufweist und daß eine erhebliche Desaktivierung bei 50ºC eintritt.
  • Eine immobilisierte unspezifische Lipase und ihre Verwendung zur statistischen Umesterung von Fetten werden in A.R. Macrae, Journal of the American Oil Chemists' Society (JAOCS), Bd. 60 (1983), S. 291 beschrieben. Die Temperatur des Verfahrens betrug jedoch nur 40ºC. Diese niedrige Temperatur wurde wahrscheinlich aufgrund der geringen Thermostabilität der Candida cylindracea-Lipase gewählt.
  • Es besteht ein Bedarf an einer thermostabilen unspezifischen Lipase zur Verarbeitung von hochschmelzenden Substraten bei etwa 60ºC oder darüber ohne ein Lösungsmittel, z.B. für die Randomisation von Fett in der Margarineindustrie. Es wird auf A.R. Macrae und R.C. Hammond: "Present and Future Applications of Lipases", Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, Bd. 3 (1985), S. 193-217 bezug genommen. Zubereitungen nach dem Stand der Technik sind nicht ausreichend wärmestabil, und eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine unspezifische Lipase bereitzustellen, die ausreichend thermostabil für eine Langzeitanwendung bei 60ºC oder darüber in löslicher oder immobilisierter Form ist. Die Lipase sollte mikrobiell sein, da derartige Lipasen wirtschaftlich hergestellt werden können.
    • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Wir haben festgestellt, daß eine Anzahl von Spezies, die zur Gattung Candida gehören, neue unspezifische Lipasen herstellen. Überraschenderweise sind diese neuen Lipasen wärmestabiler in löslicher und immobilisierter Form als irgendeine bisher bekannte unspezifische Lipase unter Einschluß der Lipasen aus C. curvata und C. rugosa (C. cylindracea).
  • Dementsprechend wird gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung eine hinsichtlich der Position unspezifische Lipase bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie
  • (1) mindestens 20 % Restaktivität nach Inkubation für 60 Minuten bei einem pH-Wert von 6,5 bei 65ºC aufweist;
  • (2) eine optimale Aktivität bei einem pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 8 zeigt; und
  • (3) eine immunochemische Identität zu einer extrazellulären Lipase mit den vorstehenden Merkmalen, die bei einem Stamm von Candida antarctica oder Candida tsukubaensis natürlich auftritt, gegenüber monospezifischem Kaninchenantiserum zeigt.
  • Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zur Herstellung der Lipase bereitgestellt, wobei das Verfahren (1) die aerobe Züchtung eines Lipase bildenden Candida-Stamms, der aus der aus C. antarctica und C. tsukubaensis bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und (2) die Isolierung der Lipase aus dem Kulturmedium umfaßt.
  • Schließlich wird erfindungsgemäß die Verwendung der Lipase in einem Lipase-katalysierten Verfahren zur Hydrolyse eines Esters, zur Synthese eines Esters oder zur Umesterung eines Esters bereitgestellt.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung Mikroorganismen
  • Erfindungsgemäße Lipasen können durch Züchten von Stämmen, die zur Gattung Candida, insbesondere zur Candida-Gruppe I, wie sie von N.J.W. Kreger van Rij: The Yeast, a Taxonomic Study, dritte überarbeitete und erweiterte Auflage, Elsevier, Amsterdam (1984) definiert ist, gehören, hergestellt werden. Gruppe I umfaßt die basidomycetisch Anamorphen von Candida. Bevorzugte Spezies sind C. antarctica (Goto et al.) Kurtzman et al. und C. tsukubaensis, wie sie in dem Buch definiert sind. Es ist darauf hinzuweisen, daß C. antarctica auch unter den Synonymen Sporobolomyces antarcticus Goto et al., Sterigmatomyces aphidis Henninger & Windisch und Trichosporon oryzae Ito et al. beschrieben worden ist.
  • Die bevorzugten Candida-Stämme sind diejenigen, die eine unspezifische Lipase bilden, die eine immunochemische Identität zu einer oder mehrerer der nachstehend als Beispiele angegebenen Lipasen zeigt.
  • Die bevorzugten Stämme umfassen die folgenden drei Stämme von C. antarctica, die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt wurden: Hinterlegungsnummer Hinterlegungsdatum 29. September 1986 Dezember 1986
  • Die bevorzugten Stämme umfassen auch die folgenden Stämme, die der Öffentlichkeit durch Centralbureau voor Schimmelculturen (CBS), American Type Culture Collection (ATCC), Agricultural Research Culture Collection (NRRL) und Institute of Fermentation, Osaka, (IFO) unter den angegebenen Hinterlegungsnummern frei zugänglich sind:
  • C. antarctica: CBS 5955, ATCC 34888, NRRL Y-8295 (Typenstamm)
  • C. antarctica: CBS 6678, ATCC 28323
  • C. antarctica: CBS 6821, NRRL Y-7954
  • C. tsukubaensis: CBS 6389, ATCC 24555, NRRL Y-7792 (Typenstamm)
  • Wie vorstehend angegeben wurde, wurde von Typenstämmen aller fünf bevorzugten Candida-Spezies festgestellt, daß sie die erfindungsgemäße Lipase bilden.
  • Die Verwendung von Mutanten und Varianten der vorstehend genannten Stämme soll ebenfalls zum Schutzumfang der Erfindung gehören.
  • Gentechnische Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können angewandt werden, um die Fähigkeit, eine erfindungsgemäße Lipase herzustellen, auf andere mikrobielle Stämme zu übertragen. Die Verwendung derartiger Stämme soll ebenfalls zum Schutzumfang der Erfindung gehören.
    • Thermostabilität
  • Die erfindungsgemäßen Lipasen weisen eine gute Thermostabilität in löslicher und immobilisierter Form auf. Lipasen von C. antarctica und C. tsukubaensis sind bevorzugt, und von C. antarctica stammende Lipasen sind besonders bevorzugt, und zwar aufgrund ihrer Thermostabilität.
  • Für einige erfindungsgemäße Lipasezubereitungen hat man beobachtet, daß sie während einer Wärmebehandlung anfangs recht rasch Aktivität verlieren, daß jedoch die nach einer bestimmten Zeit verbleibende Aktivität sehr stabil gegenüber einer weiteren Wärmebehandlung ist. Dieses Verhalten kann seine Ursache im Vorhandensein von zwei oder mehr Lipasen verschiedener Thermostabilität und/oder dem Vorhandensein einer wärmelabilen Protease und/oder dem Vorhandensein einer begrenzten Menge an die Lipase stabilisierenden Komponenten haben.
  • Die Wärmebehandlung von C. antarctica-Lipase, z.B. 1 bis 3 Stunden bei 60ºC, führt zu einer besonders thermostabilen Lipasezubereitung.
    • Lipaseherstellung durch Züchten von Candida
  • Die erfindungsgemäß verwendeten Candida-Stämme können unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium mit einem Gehalt an assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zusammen mit anderen essentiellen Nährstoffen gezüchtet werden, wobei das Medium gemäß dem Fachmann bekannten Prinzipien zusammengesetzt ist.
  • Geeignete Kohlenstoffquellen können Kohlenhydrate, Lipide und andere Ester sein. Geeignete Stickstoffquellen können anorganisch (z.B. Nitrat- oder Ammoniumsalze) oder organisch (z.B. Hefeextrakt, Maiseinweichflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl oder Maiskleber) sein.
  • Der pH-Wert des Mediums kann 3,5 bis 9,5 und vorzugsweise 5,5 bis 8,5 betragen. Die Fermentationstemperatur kann 15 bis 40ºC und vorzugsweise 20 bis 34ºC betragen.
  • Nach der Fermentation können flüssige Enzymkonzentrate unter Entfernung von grobem Material aus der Brühe und gegebenenfalls unter Einengen durch Verdampfen oder Umkehrosmose erhalten werden. Schließlich können Konservierungsmittel dem Konzentrat zugesetzt werden.
  • Feste Enzymzubereitungen können aus der gereinigten und/oder eingeengten Brühe durch Ausfällen mit Salzen, wie Na&sub2;SO&sub4;, oder mit wassermischbaren Lösungsmitteln, wie Ethanol oder Aceton, hergestellt werden; eine Entfernung des Wassers aus der Brühe durch geeignete Trockenverfahren, wie Sprühtrocknen, kann ebenfalls angewandt werden.
  • Derivatisierte (chemisch modifizierte) Lipase kann nach einem beliebigen bekannten Verfahren hergestellt werden. Ein Beispiel ist die Polyethylenglykol-Modifizierung (PEG-Modifizierung), die in A. Matsushima et al., Biotechnology Letters, Bd. 8 (1986), S. 72-78 beschrieben wird.
    • Bestandteile darstellende Lipasen A und B
  • Es ist festgestellt worden, daß C. antarctica-Lipase zwei Bestandteile darstellende Lipasen A und B enthält. Die Eigenschaften und Anwendungen jeder dieser Lipasen werden nachstehend in dieser Anmeldung erörtert.
  • Gereinigte Lipase A und B kann aus der Lipase nach der Fermentation z.B. durch Gelfiltration hergestellt werden.
  • Alternativ dazu kann die rekombinante DNA-Technologie angewandt werden, um selektiv das für Lipase A oder B codierende Gen zu übertragen. Ein bevorzugtes Verfahren dafür wird nachstehend beschrieben.
  • Lipase A ist thermostabiler, und Lipase B ist alkalibeständiger als A, so daß eine Behandlung bei hoher Temperatur oder hohem pH-Wert angewandt werden kann, um eine Zubereitung zu erhalten, die hauptsächlich Lipase A bzw. B enthält.
  • Lipase A weist ein Molekulargewicht von 43 kD und einen isoelektrischen Punkt von 8,0 ± 0,2 auf. Lipase B weist ein Molekulargewicht von 33 kD und einen pI-Wert von 6,0 ± 0,2 auf.
    • Immunochemische Charakterisierung von Lipasen
  • Die erfindungsgemäß bevorzugten Lipasen zeigen eine immunologische Identität zu einer Lipase aus einer der vorstehend genannten Candida- Spezies, insbesondere aus einem der vorstehend genannten Stämme, und ganz besonders zu Lipase A oder B aus DSM 3855.
  • Die am stärksten bevorzugten Lipasen weisen sowohl eine immunologische Identität zu einer dieser Lipasen als auch das gleiche Molekulargewicht wie eine dieser Lipasen auf.
  • Die Herstellung von Antiserum zur Verwendung in immunologischen Tests ist in Kapitel 41 von N.H. Axelsen: Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Techniques (Blackwell Scientific Publications, 1983) beschrieben.
  • Die immunologische Identität und das Molekulargewicht von Proteinen können durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) (z.B. gemäß der Novo-Analysemethode AF 217-GB), gefolgt von einem Immunoblot gemäß J. Hald et al., Journal of Reproductive Immunology, Bd. 10 (1987), S. 15-26 bestimmt werden.
  • Monospezifisches Kaninchenantiserum, das gegen gereinigte Lipase A aus DSM 3855 (aus Beispiel 7) erzeugt wurde, wurde für Immunoblots von SDS-PAGE nach dem vorstehend genannten Verfahren zur Untersuchung der folgenden Lipasen verwendet:
  • - C. antarctica: 0,2 OU-Lösung eines Pulvers, das wie in Beispiel 3 hergestellt wurde
  • - C. tsukubaensis: 0,2 OU-Lösung des Pulvers aus Beispiel 5.
  • Die C. antarctica-Lipase zeigte eine starke Bande, und die C. tsukubaensis-Lipase zeigte eine schwache Bande bei einer Position von 43 kD, d.h., es wird eine Lipase gebildet, die immunologisch identisch zu der Lipase A von C. antarctica ist und die das gleiche Molekulargewicht aufweist.
  • Die Identitätsuntersuchungen können auch nach dem bekannten Ouchterlony-Doppelimmundiffusionsverfahren oder durch gekreuzte Tandem- Immunelektrophorese gemäß Kapitel 5 und 14 des vorstehend genannten Buches von N. H. Axelsen durchgeführt werden.
    • Lipaseherstellung durch rekombinante DNA-Techniken
  • Rekombinante DNA-Techniken können angewandt werden, um eine höhere Ausbeute an Lipase zu erhalten, oder um eine einzelne der Bestandteile darstellenden Lipasen, wie Lipase A oder B aus C. antarctica, die vorstehend beschrieben wurden, in guter Ausbeute herzustellen.
  • Ein bevorzugtes Verfahren macht von einem Aspergillus-Stamm als Wirt Gebrauch und umfaßt folgende Stufen:
  • (a) Bereitstellung eines geeigneten rekombinanten DNA-Clonierungsvektors, der DNA-Sequenzen, die für Funktionen codieren, die eine Genexpression erleichtern, und eine DNA-Sequenz, die für die Candida-Lipase codiert, umfaßt;
  • (b) Transformation eines geeigneten Wirtsorganismus mit dem Clonierungsvektor aus Stufe (a); und
  • (c) Züchten des transformierten Wirts in einem geeigneten Kulturmedium und wahlweise Gewinnung der Lipase aus dem Kulturmedium.
  • Es ist besonders bevorzugt, A. oryzae als Wirt gemäß EP 0 238 023 zu verwenden, wobei diese Druckschrift durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird.
    • Immobilisierte Lipase
  • Für die Ausführung der vorliegenden Erfindung kann die Lipase nach einem beliebigen dem Fachmann bekannten Verfahren immobilisiert werden, z.B.: K. Mosbach (Herausgeber): Methods in Enzymology, Bd. 44, "Immobilized Enzymes", Academic Press, New York, 1976. Verfügbare Methoden für die Enzymimmobilisierung umfassen: Vernetzung von Zellhomogenisaten, kovalente Kopplung an unlösliche anorganische oder organische Träger, Einschließen in Gele und Adsorption an Ionenaustauschharze oder andere Adsorptionsmaterialien. Auch ein Auftragen auf einen teilchenförmigen Träger kann angewandt werden, wie es in A.R. Macrae und R.C. Hammond, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, Bd. 3 (1985), S. 193 beschrieben wird.
  • Ein bevorzugtes Immobilisierungsverfahren nutzt ein teilchenförmiges makroporöses Harz. Die Lipase kann einfach an das Harz adsorbiert werden, oder sie kann an das Harz durch Vernetzung mit Glutaraldehyd oder andere Vernetzungsmittel, die dem Fachmann bekannt sind, angeheftet werden.
  • Ein bevorzugter Harztyp ist ein schwach basisches Anionenaustauschharz, z.B. vom Acryl-, Polystyrol- oder Phenol-Formaldehyd-Typ. Beispiele für handelsübliche Produkte sind Lewatit E1999/85 (Produkt von Bayer, Deutschland) und Duolite ES-568 (Rohm & Haas). Die Immobilisierung auf dieser Art von Harz erfolgt vorzugsweise gemäß EP 0 140 542, wobei diese Druckschrift durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird.
  • Ein weiterer bevorzugter Harztyp ist ein Adsorbensharz vom Phenol- Formaldehyd-Typ. Die Immobilisierung auf diesem Harz erfolgt vorzugsweise gemäß DK 85/878, die durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird.
  • Ein weiterer bevorzugter Harztyp ist ein Adsorbensharz vom Acryltyp. Ein Beispiel für ein handelsübliches Produkt ist Lewatit E2001/85 (Produkt von Bayer).
  • Ein weiteres bevorzugtes Immobilisierungsverfahren nutzt ein anorganisches Trägermaterial, und die Lipase wird vorzugsweise durch Adsorption oder kovalente Kopplung an den Träger angeheftet. Derartige Trägermaterialien und Immobilisierungstechniken sind in K. Mosbach (Herausgeber): Methods in Enzymology, Bd. 44, "Immobilized Enzymes", Academic Press, 1976 beschrieben.
    • Lipase-katalysierte Prozesse
  • Die erfindungsgemäßen Lipasen können in einem beliebigen der nachstehenden Prozesse eingesetzt werden (die Reaktanten sind in Klammern angegeben):
  • - Esterhydrolyse (Ester + Wasser)
  • - Estersynthese (Säure + Alkohol)
  • - Umesterung unter Einschluß von
  • - Acidolyse (Ester + Säure)
  • - Alkoholyse (Ester + Alkohol)
  • - Esteraustausch oder "transesterification" (Ester + Ester)
  • Bei dem Alkohol kann es sich um einen ein- oder mehrwertigen primären und/oder sekundären Alkohol oder ein Gemisch davon handeln. Bei der Säure kann es sich um eine beliebige Carbonsäure oder ein Gemisch von Carbonsäuren handeln. Bei dem Ester kann es sich um einen beliebigen Ester handeln, der von dem vorstehend genannten Alkohol und der Säure oder einem Gemisch davon abgeleitet ist. Einige vorteilhafte Ausführungsformen der Prozesse werden nachstehend beschrieben.
    • Esterhydrolyseverfahren
  • Dieses Verfahren kann absatzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. In einem diskontinuierlichen Reaktor werden das Fett und Wasser mechanisch mit einer erforderlichen Menge an Lipase gemischt. Die Reaktions zeit hängt von der Enzymdosierung und der gewünschten Umwandlung ab, beträgt im allgemeinen jedoch von 4 bis 6 Stunden bis zu 3 bis 4 Tagen. Wenn eine immobilisierte Lipase verwendet wird, dann kann sie am Ende der Reaktion wiedergewonnen und erneut verwendet werden, wodurch die Wirtschaftlichkeit des Prozesses verbessert wird.
  • In einem kontinuierlichen Verfahren wird Fett oberhalb seines Schmelzpunktes durch einen Reaktor geleitet, indem die immobilisierte Lipase enthalten ist. Wasser kann dem System auf verschiedenen Wegen zugeführt werden, z.B. durch Dispergieren von Wasser im Fett oder durch intermittierendes Absorbieren von Wasser in die immobilisierte Lipase.
  • Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit bei der Gewinnung wird der Wassergehalt üblicherweise unter 40 % (Gew./Gew.) gehalten. Die Temperatur sollte oberhalb des Schmelzpunktes des Reaktionsgemisches liegen und kann einen hohen Wert von 80ºC annehmen. Bevorzugte Temperaturen sind 45 bis 70ºC.
  • Ein Beispiel für dieses Verfahren ist die Fettspaltung. Wenn ein hoher Hydrolysegrad erwünscht ist, dann ist es bevorzugt, C. antarctica- Lipase, die sowohl Lipase A als auch Lipase B enthält, zu verwenden.
  • Ein zweites Beispiel für dieses Verfahren ist die Hydrolyse von Cholesterinestern.
  • Als drittes Beispiel kann Fett mit hohen Mengen an Ölsäure oder Linolsäure mit C. antarctica-Lipase, vorzugsweise mit Lipase A, hydrolysiert werden. Die gesättigten Fettsäuren werden hydrolysiert, Ölsäure und Linolsäure bleiben jedoch zum größten Teil unberührt. Nach Entfernung der freien Fettsäure kann eine nahezu vollständige Hydrolyse chemisch oder enzymatisch, z.B. mit C. antarctica-Lipase B, durchgeführt werden. Nach Abtrennung erhält man Fettsäuren mit einem hohen Gehalt an Ölsäure oder Linolsäure. Durch dieses Verfahren kann Ölsäure aus Olivenöl erhalten werden, und Linolsäure kann aus Baumwollsamenöl, Sojabohnenöl oder Sonnenblumenöl erhalten werden.
    • Estersyntheseverfahren
  • Dieses erfindungsgemäße Verfahren ist von besonderem Vorteil für die Synthese von Estern sekundärer Alkohole, die auf andere Weise schwierig herzustellen sind, und zwar unter Einschluß solcher, bei denen die Säure oder der Alkohol hochschmelzend sind.
  • Das Verfahren kann absatzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Beim absatzweisen Verfahren kann die immobilisierte Lipase zurückgewonnen und erneut verwendet werden, um die Wirtschaftlichkeit zu verbessern. Vorzugsweise wird Wasser während der Reaktion entfernt, z.B. durch Vakuumdestillation oder durch Absorption in Molekularsieben. Die Temperatur sollte so gewählt sein, daß das Reaktionsgemisch flüssig ist, vorzugsweise 60 bis 90ºC und insbesondere 60 bis 80ºC.
  • Für die Estersynthese aus kurzkettigen Alkoholen (primär oder sekundär) ist es bevorzugt, C. antarctica-Lipase zu verwenden, die Lipase B enthält. Für die Estersynthese langkettiger nicht-flüchtiger Alkohole ist es bevorzugt, C. antarctica-Zubereitungen mit einem Gehalt an Lipase A zu verwenden und eine Vakuumdestillation zur Wasserentfernung anzuwenden.
    • Esteraustausch
  • Bei diesem Prozeß kann ein organisches Lösungsmittel, wie Hexan oder ein anderer Kohlenwasserstoff, in das Reaktionsgemisch eingeschlossen werden. Aufgrund der hervorragenden Thermostabilität der erfindungsgemäßen Lipasen ist es in den meisten Fällen jedoch möglich und bevorzugt, das Verfahren im geschmolzenen Substrat ohne ein Lösungsmittel durchzuführen.
  • Das Reaktantengemisch kann auch eine kleine Menge Wasser enthalten, um die Aktivität des Enzyms zu erhalten. Ein Wassergehalt bis zur Sättigung kann angewandt werden, ein höherer Wassergehalt führt jedoch zu einem unerwünscht hohen Grad an Nebenproduktbildung durch Hydrolyse.
  • Abhängig von der Reinheit der Reaktanten kann eine Reinigung vor der Durchführung der Reaktion erforderlich sein, um die höchste Produktivität der immobilisierten Lipase zu erzielen. Herkömmliche Reinigungsverfahren können angewandt werden, wie Bleichen, Alkaliraffination und Desodorisierung.
  • Aufgrund der hervorragenden Thermostabilität der Lipase kann die Reaktionstemperatur einen hohen Wert von 90ºC annehmen. Die untere Grenze für die Reaktionstemperatur wird durch den Schmelzpunkt und die Viskosität des Reaktantengemisches bestimmt. Bevorzugte Temperaturen betragen von 60 bis 90ºC und insbesondere von 60 bis 80ºC.
  • Immobilisierte Lipase wird für den Esteraustausch aus Gründen der Zweckmäßigkeit und der Wirtschaftlichkeit stark bevorzugt. C. antarctica-Lipase mit einem Gehalt an Komponente A ist bevorzugt. Die Reaktion kann absatzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden.
  • Beim absatzweisen Verfahren werden das Substrat und gegebenenfalls das Lösungsmittel in einem absatzweisen Reaktor, der auf die bevorzugte Temperatur erwärmt wird, zusammen mit der immobilisierten Lipase gemischt. Das Substrat kann teilweise oder vollständig mit Wasser gesättigt sein. Die Enzymdosierung kann bis zu 10 %, abhängig von der gewünschten Umwandlung und Reaktionszeit, betragen. Die Reaktionszeit kann von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen betragen. Nach der Reaktion kann das Enzym abfiltriert und erneut verwendet werden, gegebenenfalls nach Waschen mit einem Lösungsmittel.
  • Beim kontinuierlichen Verfahren wird das Substrat durch eine Säule geleitet, die die immobilisierte Lipase enthält. Das Substrat kann teilweise oder vollständig vor dem Eintritt in die Enzymsäule mit Wasser gesättigt werden. Dies kann z.B. durch eine Vorsäule, die wassergesättigtes Harz enthält, oder durch Sättigen des Substrats im Substratbehälter erfolgen. Die gewünschte Umwandlung kann durch Einstellen der Durchflußgeschwindigkeit durch die Säule, d.h. durch Veränderung der Verweilzeit, erzielt werden.
  • Die Betriebszeit in einem derartigen System kann bis zu mehrere tausend Stunden betragen. Der langsame Verlust an Aktivität, der auftritt, kann durch eine Verringerung der Durchflußgeschwindigkeit, d.h. durch eine Erhöhung der Verweilzeit des Reaktantengemisches, kompensiert werden. Die anfängliche Verweilzeit hängt von der gewünschten Umwandlung ab und beträgt typischerweise 5 Minuten bis 2 Stunden.
  • Beispiele für dieses Verfahren sind die Fettrandomisation und die Herstellung von Glyceriden mehrfach ungesättigter Fettsäuren.
    • Randomisation von Fett
  • Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens ist die statistische Umesterung von Fett, wobei das Reaktantengemisch Triglyceridfette umfaßt und die Reaktion durch Austausch von Acylgruppen zwischen Triglyceridmolekülen auftritt.
  • Das Reaktionsgemisch kann aus einer einzelnen Fettfraktion bestehen, wobei ein Austausch zwischen Acylgruppen in den drei verschiedenen Positionen auftritt.
  • Das Reaktionsgemisch kann auch aus zwei oder mehr Arten von Fett, insbesondere einem bei Umgebungstemperatur flüssigen Fett und einem hochschmelzenden Fett bestehen. Letztgenanntes Fett kann durch Fraktionierung aus natürlichen Quellen oder durch Hydrierung erhalten werden. Das durch eine Randomisation derartiger Gemische erhaltene Produkt eignet sich für die Margarineherstellung.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Esteraustauschprozesses umfassen die Reaktanten ein Triglyceridfett und einen Carbonsäureester, insbesondere einen Methyl- oder Ethylester.
  • Nach der Umesterung können die Produkte weiterverarbeitet werden. Nebenprodukte, wie freie Fettsäuren, können anschließend nach herkömmlichen Verfahren, wie alkalische Raffination, entfernt werden.
  • Das Produkt selbst kann fraktioniert, mit anderen Ölen gemischt werden oder dgl., abhängig von der speziellen Anwendung.
    • Glyceride mehrfach ungesättigter Fettsäuren
  • Die erfindungsgemäße Lipase kann in vorteilhafter Weise bei der Acidolyse oder beim Esteraustausch von Fett und Fettsäuren oder Estern (insbesondere Methyl- oder Ethylestern) mit einem hohen Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) zur Herstellung von Fett mit einem hohen PUFA-Gehalt für die Verwendung bei Diäten angewandt werden. C. antarctica-Lipase eignet sich dafür besonders, da sie eine hohe Aktivität für die Umesterung von PUFA aufweist.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • Figg. 1 und 2 zeigen pH-Wert-Aktivitätskurven für Lipasen aus C. antarctica bzw. C. tsukubaensis. Einzelheiten werden in Beispiel 11 angegeben.
  • Fig. 3 zeigt pH-Wert-Aktivitätskurven für die C. antarctica-Lipasen A und B. Einzelheiten werden in Beispiel 7 angegeben.
  • Figg. 4 und 5 zeigen die Ergebnisse der Acidolyse bzw. Umesterung (Esteraustausch) mit immobilisierter C. antarctica-Lipase bei verschiedenen Temperaturen. Einzelheiten werden in Beispiel 28 angegeben.
  • Figg. 6 und 7 zeigen die Ergebnisse der Myristinsäureestersynthese mit immobilisierter C. antarctica-Lipase unter Verwendung von n-Propanol bzw. Isopropanol. Einzelheiten werden in Beispiel 34 angegeben.
  • Figg. 8 und 9 zeigen die Ergebnisse der kontinuierlichen Acidolyse bzw. Umesterung (Esteraustausch) mit immobilisierter C. antarctica-Lipase. Einzelheiten werden in den Beispielen 33 und 36 angegeben.
    • Beispielhafte Ausführung der Erfindung Assays für die Aktivität von löslicher Lipase (LU und OU)
  • Zwei Verfahren werden angewandt. Das erste Verfahren basiert auf der Hydrolyse von Tributyrin in einem pH-Stat. 1 LU (Lipaseeinheit) ist die Menge an Enzym, die 1 uMol titrierbare Buttersäure pro Minute bei 30ºC, pH-Wert: 7,0 mit Gummi arabicum als Emulgator freisetzt. Weitere Einzelheiten sind in der Novo-Analysemethode AF 95/5 angegeben, die auf Anfrage erhältlich ist.
  • Die Messung der Aktivität in Lipaseeinheiten durch Hydrolyse von Olivenöl (OU) wird wie folgt durchgeführt: 1 ml Enzymlösung, 5 ml Emulsion (25 ml Olivenöl und 75 ml 2 % Polyvinylalkohol, ungefähres Molekulargewicht: 72 000, emulgiert in einem Waring-Mischer) und 5 ml Puffer (50 millimolar Tris-Maleat-Puffer, pH-Wert: 7,0) werden gemischt und 10 Minuten bei 40ºC in einem geschütteltem Wasserbad inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 20 ml Abbruchreagenz (500 ml Aceton, 500 ml Ethanol und 11 ml 1 n NaOH) beendet. Die Probe und eine Leerprobe (Zugabe von Abbruchreagenz vor der Emulsion) werden bis auf einen pH-Wert von 9,2 mit 0,05 n NaOH titriert. Die Aktivität (OU) wird aus der Differenz in titriertem NaOH zwischen der Probe und der Leerprobe berechnet und als 1 umolar freigesetzte freie Fettsäure pro Minute ausgedrückt.
    • Unspezifität von löslicher Lipase
  • Diese kann durch Kurzzeithydrolyse von Triglycerid und Analyse der erhaltenen Diglyceride (DG) bestimmt werden. Eine spezifische Lipase bildet fast ausschließlich 1,2-DG, während eine unspezifische Lipase zu einem nennenswerten Gehalt an 1,3-DG in der DG-Fraktion führt. Hydrolyse und Handhabungszeit müssen kurz gehalten werden, um eine Acylwanderung zu vermeiden.
  • Genauer gesagt wird die Messung wie folgt durchgeführt: 250 ul Enzymlösung (4-100 OU/ml), 250 ul Tris-Maleat-Puffer, pH-Wert: 7,0 und 500 ul Substrat (Triolein: 2 % Polyvinylalkohol, Molekulargewicht: 72 000; 1:3) werden in einem Eppendorf-Zentrifugenröhrchen gemischt und 30 bis 90 Minuten bei 42ºC geschüttelt. Die Reaktion wird durch Mischen mit 10 ml CHCl&sub3; (0,2 % Lithocholsäure können als interner Standard verwendet werden) beendet. Das CHCl&sub3; wird mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. 1 ul werden auf einen Dünnschichtchromatographiestab (Chromarod Typ S II, Newman-Howell Associates Ltd.) aufgetragen und 20 Minuten mit Hexan/Ether/Essigsäure (70:30:1) als Lösungsmittel entwickelt. Die partiellen Glyceride werden durch einen FID-Analysator (Iatroscan TH 10, Newman-Howell Associates Ltd.) quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse werden als 1,3-DG in % der gesamten DG angegeben. Eine spezifische Lipase ergibt also 0, und von einer vollständig unspezifischen Lipase erwartet man einen Wert von etwa 33 %.
    • Acidolyse-Aktivität von immobilisierter Lipase (BIU, BIU-2)
  • Die Aktivität wird durch Umsetzung von Palmitinsäure mit Triolein mit oder ohne Lösungsmittel bestimmt. Der gesamte Einbau von Palmitinsäure wird durch FAME-GLC des Triglycerids gemessen. Der Einbau in der Position 2 wird durch Behandlung der Triglyceride mit Pankreaslipase zur Hydrolyse in den Positionen 1 und 3 und anschließende Analyse des erhaltenen 2-Monoglycerids durch FAME-GLC bestimmt.
  • FAME-GLC (Fettsäuremethylester-Gas-Flüssigkeitschromatographie) kann gemäß den Verfahren Ce 2-66 und Ce 1-62 durchgeführt werden, die von der American Oil Chemists Society (AOCS) veröffentlicht wurden.
  • Im Fall der Reaktion mit Lösungsmittel besteht das Reaktionsgemisch aus 0,6 g Triolein, 0,174 g Palmitinsäure und 8,083 g Petrolether. Für die Reaktion ohne Lösungsmittel werden 3,0 g Triolein und 0,87 g Palmitinsäure verwendet.
  • In jedem Fall wird eine geeignete Menge Enzym hydratisiert, mit dem vorstehenden Reaktionsgemisch bei einer gegebenen Temperatur für 1 bis 4 Stunden inkubiert und anschließend abfiltriert, um die Reaktion zu beenden. Das Filtrat wird über eine Aluminiumoxidsäule gereinigt, und die Triglyceride werden durch FAME-GLC analysiert.
  • Getrennt davon werden Triglyceride aus 2 ml Filtrat in der gleichen Weise über 4 g aktiviertes Aluminiumoxid gereinigt. Die ungefähr 100 mg Triglyceride, 3 ml Pankreaslipase-Lösung (250 mg Schweinepankreaslipase "Grad II" von Sigma, Katalog Nr. L3126, gelöst in 10 ml 1 m Tris-Puffer, pH-Wert: 8), 300 ul 2 m CaCl&sub2; und 0,75 ml 0,2 % (Gew./Vol.) Taurocholat werden gemischt. Die Emulsion wird in einem Wasserbad 2 Minuten auf 40ºC erwärmt und mit einem Whirley-Mischer für 1 1/2 Minuten gemischt, bevor die Reaktion durch Zugabe von 4 ml 96 %-iges Ethanol beendet wird. Die Probe wird in einen Scheidetrichter übertragen und mit 4 x 20 ml Diethylether extrahiert. Die Etherphase wird 4 mal mit 20 ml entionisiertem Wasser gewaschen, bevor sie mit einem Na&sub2;SO&sub4;-Filter getrocknet und eingeengt wird. Die Probe wird erneut in 1 ml 1,1,1-Trichlorethan gelöst. Die Glyceride werden durch präparative TLC auf vorbeschichteten TLC-Platten ("Silikagel 60" von Merck, 30 Minuten bei 110ºC aktiviert) in einem gut gesättigten Entwicklungsbehälter mit Diethylether und n-Hexan (70:30) als Entwicklungslösungsmittel getrennt. Die TLC wird 40 Minuten bei 20ºC durchgeführt.
  • Die Monoglyceridbande wird durch Ioddampf identifiziert, abgeschabt und 3 mal mit 120 ml Diethylether extrahiert. Die Etherphase wird filtriert und eingeengt. Die Probe wird methyliert und durch GLC analysiert.
  • 1 BIU ("Batch Interesterification Unit", absatzweise Umesterungseinheit) ist die Menge an immobilisierter Lipase, die Palmitinsäure bei einer Anfangsgeschwindigkeit von 1 uMol/Minute bei einer gegebenen Temperatur mit oder ohne Lösungsmittel einbaut. 1 BIU-2 (BIU in Position 2) ist entsprechend für den Einbau in Position 2 definiert.
    • Esteraustauschaktivität von immobilisierter Lipase (BTU)
  • Die Aktivität wird durch Umsetzung eines äquimolaren Gemisches von Triolein und Tripalmitin bestimmt. Die Bildung gemischter Triglyceride (POO, PPO und dgl.) wird durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) gemessen.
  • Genauer gesagt werden 0,8855 g Triolein (OOO) und 0,8073 g Tripalmitin (PPP) (jeweils 1 mMol) geschmolzen, und 250 mg Trockenmasse Enzym, die auf 10 % (Gew./Gew.) Wasser befeuchtet sind, werden zugegeben. Die Proben werden 15 Minuten in einem Wasserbad bei einer gegebenen Temperatur geschüttelt und anschließend durch HPLC analysiert.
  • Die HPLC kann gemäß G.W. Jensen, J. Chromatogr., Bd. 204 (1981), S. 407 durchgeführt werden.
  • 1 BTU ("Batch Transesterification Unit", absatzweise Esteraustauscheinheit) ist als die Menge an immobilisierter Lipase definiert, die gemischte Triglyceride mit einer Anfangsgeschwindigkeit von 1 uMol/Minute bei einer gegebenen Temperatur bildet.
    • Unspezifitätsindex für immobilisierte Lipase (NSI&sub1;, NSI&sub2;)
  • Dieser Index wird am besten durch Umesterung (z.B. Acidolyse) bestimmt. Die Messung des Austausches in der Position 2 zeigt die Unspezifität an. Zwei derartige Verfahren werden hier angewandt: Das NSI&sub1;- Verfahren mit Triolein und Palmitinsäure und das NSI&sub2;-Verfahren mit XOX- Triglycerid (X = Palmitinsäure/Stearinsäure, O = Ölsäure) und Laurinsäure. Das beste Verfahren ist NSI&sub1;, die Analyse ist jedoch sehr mühsam. Das NSI&sub2;-Verfahren ist einfacher durchzuführen, das Ergebnis wird jedoch durch die Fettsäurespezifität der Lipase beeinflußt. Die beiden Acidolyseverfahren sind weniger anfällig für Fehler aufgrund einer Acylwanderung als das Hydrolyseverfahren, das für lösliche Lipase angewandt wird.
  • Beim NSI&sub1;-Verfahren werden BIU und BIU-2 gemessen, und ein Index wird als NSI&sub1; = 3 x BIU-2/BIU berechnet. Dieser Wert ist 0 für eine vollständig spezifische Lipase, und er ist 1 für eine unspezifische Lipase, die mit allen drei Positionen gleich reagiert.
  • Beim NSI&sub2;-Verfahren wird die immobilisierte Lipase hydratisiert, wie es für die Aktivierung erforderlich ist, üblicherweise auf etwa 10 % Wasser. Es wird das folgende Gemisch verwendet:
  • - 345 mg Kakaobutterstearin (bezogen von Aarhus Olie A/S, Dänemark, mit einem Gehalt an etwa 95 % XOX-Triglyceriden)
  • - 480 mg Laurinsäure (Merck), 99 % rein
  • - 8,1 g Petrolether (BDH), Siedepunkt: 80-100ºC
  • - 250 mg (als Trockenmasse) immobilisierte Lipase.
  • Ein Gemisch der vorstehenden Bestandteile wird unter Schütteln in einem Wasserbad für eine Zeit bei einer Temperatur (im Bereich von 40 bis 60ºC) inkubiert, wie es erforderlich ist, um eine geeignete Umwandlung zu erzielen. Reine Triglyceride werden anschließend durch Aluminiumoxid-Chromatographie isoliert, und die Fettsäurezusammensetzung wird durch FAME-GLC bestimmt.
  • Ein Index wird wie folgt definiert:
  • NSI&sub2; = 3 x (Ölsäureabnahme)/(Laurinsäureeinbau)
  • Um zwischen einer spezifischen und einer unspezifischen Lipase zu unterscheiden, wird ein Laurinsäureeinbau im Bereich von 30 bis 65 % als am besten geeignet betrachtet.
    • Kulturmedien
  • Medien mit den nachstehenden Zusammensetzungen wurden in den Beispielen verwendet. Jedes Medium wurde 20 bis 90 Minuten bei 121 bis 130ºC autoklaviert. Bestandteile (g/l) Agar-3 YeDP YPG-AGar Bou-3 Pepton Mit Trypsin verdautes Casein Hefe-Extrakt Fleisch-Extrakt Dextrose Agar (Difco) Polypepton Bestandteile (g/l) Cale Cale-2 Ca4a YS-4 YS-25 Pharmamedia Hefe-Extrakt Maiseinweichflüssigkeit Dextrose Saccharose Sojabohnenöl (ml/l) Pepton Pluronic L61 (ml/l) pH-Wert
  • Die Zusammensetzung von Pharmamedia ist in Traders' Guide to Fermentation Media Formulation, 1980, Traders' Oil Mill Co., S. 50-51 beschrieben. Bestandteile (g/l) CGlg CG4h Ca19g Pharmamedia Hefe-Extrakt Sojabohnenpulver Dextrose Dextrin Kokosnußöl Sojabohnenöl (ml/l) Oleylalkohol Thiamin HCl (mg/ml) Spurenelemente (Difco-Manual (ml/l) Pluronic 60L (10 %, ml/l) Vitamingemisch (ml/1) pH-Wert
    • Vitamingemisch
  • Biotin 2 mg/l
  • Calciumpantothenat 400 mg/l
  • Inosit 2000 mg/l
  • Nicotinsäure 400 mg/l
  • Thiamin HCl 400 mg/l
  • Pyridoxin HCl 400 mg/l
  • p-Aminobenzoesäure 200 mg/l
  • Riboflavin 200 mg/l
  • Folsäure 10 mg/l
    • Beispiel 1 Herstellung von Lipase aus C. antarctica
  • Eine Kultur des Candida antarctica-Stamms DSM 3855 auf Schrägagar (Agar-3) wurde in einen 2000 ml fassenden Schüttelkolben mit 800 ml Bou- 3-Medium überführt und 1 Tag bei 26ºC geschüttelt (200 U/min, Amplitude ungefähr 2 cm).
  • Die erhaltene Kulturbrühe wurde als Vorkultur für einen 10 l fassenden herkömmlichen Fermenter mit 7 l Cale-2-Medium verwendet.
  • Die Fermentationsbedingungen waren wie folgt:
  • Fermentertyp: Laborfermenter FL 110 von Biotec AB, Bromma, Schweden
  • Belüftung: 6 Nl/min
  • Rührung: 520 U/min mit einem Rührer mit zwei Flügelrädern mit jeweils 6 Blättern
  • Temperatur: 26ºC
  • pH-Wert: Es gab keine pH-Steuerung.
  • Zeit: 119 Stunden
  • Die Lipaseausbeute betrug 157 LU/ml.
  • Die Kulturbrühe aus dem Fermenter wurde 35 Minuten bei 4100 U/min mittels einer Sorvall RC-3B-Zentrifuge mit einem Rotor 6000 A zentrifugiert. Der Überstand (insgesamt 5 l) wurde durch Ultrafiltration auf 600 ml mit einer Pellicon-Ultrafiltrationsvorrichtung von Millipore mit einem Filter mit einer Molekulargewichtsgrenze von 10 000 eingeengt (und 5 mal mit jeweils einem Volumen Wasser gewaschen). 600 ml 99 %-iges kaltes Ethanol wurden zu 560 ml des UF-Konzentrats gegeben, und das Gemisch wurde 30 Minuten bei 4ºC gerührt. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation (wie vorstehend). 2,5 Volumina kaltes 99 %-iges Ethanol wurden dann zu dem Überstand aus der ersten Ethanolfällung gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt und zentrifugiert (wie vorstehend). Das Pellet aus dieser Zentrifugation wurde in ungefähr 230 ml Wasser gelöst und gefriergetrocknet, wobei man 22 g Pulver mit 16 200 LU/g erhielt.
  • Die Lipase wurde weiter durch Anwendung einer hydrophoben Wechselwirkungschromatographie mit Ethanolelution und anschließendes Trocknen im Vakuum gereinigt, wobei man ein Pulver mit ungefähr 92 000 LU/g erhielt.
    • Vergleichsbeispiel 1 Herstellung von C. curvata-Lipase
  • Es wurde der Candida curvata-Stamm CBS 570 (alias ATCC 10567) verwendet. CBS bezeichnet das Centralbureau voor Schimmelculturen, Baarn, Niederlande, und ATCC bezeichnet die American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA. Eine Kultur dieses Stamms auf Schrägagar (Agar-3) (vgl. Beispiel 1) wurde in vier 500 ml fassende Schüttelkolben mit jeweils 100 ml Bou-3-Medium (vgl. Beispiel 1) übertragen und 1 Tag bei 26ºC geschüttelt (200 U/min, Amplitude ungefähr 2 cm).
  • Die Kulturbrühe aus den Bou-3-Schüttelkolben wurde als Vorkultur zum Animpfen von zweihundert 500 ml fassenden Schüttelkolben mit jeweils 200 ml LR-15-Medium verwendet.
  • Die Zusammensetzung des LR-15-Mediums war wie folgt: Bestandteil Konzentration Pharmamedia Tween-80 pH-Wert auf 7,0 durch HCl eingestellt; 40 Minuten bei 121ºC autoklaviert.
  • Tween-80 ist Polyoxyethylensorbitanmonooleat (erhalten von Merck).
  • Jeder Schüttelkolben wurde mit 0,5 bis 2 ml Bou-3-Kulturbrühe angeimpft und bei 200 bis 300 U/min (Amplitude: ungefähr 2 cm) 4 Tage bei 26ºC geschüttelt.
  • Die Kulturbrühe aus den Schüttelkolben wurde bei der Gewinnung vereinigt, wobei man insgesamt 29,5 l mit einer Lipaseaktivität von 15 LU/ml enthielt. Die Brühe wurde zentrifugiert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, gefolgt von einem Einengen, wie es ebenfalls in Beispiel 1 beschrieben ist, wobei jedoch nur zweimal mit 1 Volumen Wasser gewaschen wurde. Man erhielt 3,9 l Konzentrat mit einer Lipaseaktivität von 168 LU/ml.
    • Beispiel 2 Herstellung von Lipase aus C. antarctica in einer Pilotanlage
  • Eine Kultur des Candida antarctica-Stamms DSM 3855 wurde in einem Fernbach-Kolben mit einem Gehalt an YPG-Agar angeimpft.
  • Der Fernbach-Kolben wurde 8 Tage bei 26ºC inkubiert, bevor er zur Animpfung eines herkömmlichen gerührten und belüfteten Vorfermenters mit einem Gehalt an 300 l Medium mit der folgenden Zusammensetzung verwendet wurde:
  • Hefe-Extrakt 3,0 kg
  • KH&sub2;PO&sub4; 0,2 kg
  • Na&sub2;HPO&sub4; 12H&sub2;O 0,2 kg
  • Glucose 0,3 kg
  • Pluronic 60 L 125 ml
  • pH-Wert 5,6
  • Nach 1 Tag Fermentation bei 26ºC wurde die Brühe verwendet, um einen herkömmlichen gerührten und belüfteten Fermenter mit 1500 l Medium mit der folgenden Zusammensetzung anzuimpfen:
  • Hefeextrakt 7,0 kg
  • Pharmamedia 56,0 kg
  • KH&sub2;PO&sub4; 4,0 kg
  • Na&sub2;HPO&sub4; 12H&sub2;O 3,0 kg
  • Saccharose 4,2 kg
  • MgSO&sub4; 7H&sub2;O 1,4 kg
  • Sojabohnenöl 42 l
  • Pluronic 60 L 600 ml
  • pH-Wert 6,2
  • Die Fermentation wurde 5 Tage bei 26ºC mit einer Belüftung von 1000 Nl/min und unter Rühren bei 200 U/min durchgeführt. Die Ausbeute betrug 82 LU/ml.
  • Die Lipase wurde nach dem folgenden Verfahren gewonnen: 1) Trommelfiltration der Kulturbrühe; 2) Klarfiltration; 2) Einengen durch Ultrafiltration; 4) Zugabe von Ethanol bis auf 50 % (Gew./Gew.); 5) Klarfiltration; 6) Einengen durch Ultrafiltration; 7) Zugabe von Ethanol bis auf 77 % (Gew./Gew.), 8) Zentrifugation; 9) Trocknen im Vakuum; 10) erneutes Auflösen in Wasser; 11) absatzweise Reinigung durch hydrophobe Wechselwirkung (die Lipase wurde auf einer hydrophoben Matrix absorbiert, mit Wasser gewaschen und mit 50 % (Gew./Gew.) Ethanol eluiert); und 12) Verdampfen des Ethanols und Gefriertrocknen. Das erhaltene Pulver wies eine Aktivität von 143 000 LU/g auf.
    • Beispiel 3 Herstellung von C. antarctica-Lipasepulver
  • Eine Kultur von Candida antarctica DSM 3855 wurde auf PDA-Schrägagar gehalten.
  • Zusammensetzung des PDA-Agar:
  • Bacto-Kartoffel-Dextrose-Agar (Difco) 39 g/l
  • Agar 10 g/l
  • 20 Minuten bei 121ºC autoklaviert.
  • 50 Schüttelkolben mit Cale-Medium wurden von dem Schrägagar angeimpft und 64 Stunden bei 25ºC kultiviert.
  • Die Brühe (46 OU/ml) wurde bei maximal 4400 g 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde auf 1 l eingeengt und mit 1 l Wasser in einer Amicon-Ultrafiltrationsvorrichtung mit einer HIP 10-20-Patrone (Molekulargewichtsgrenze von 10 000) entsalzt und gefriergetrocknet. Die Aktivität des Pulvers betrug 4000 OU/g.
    • Beispiel 4 Herstellung von C. antarctica-Lipase
  • Kulturen der Stämme DSM 3908 und DSM 3909, die auf PDA-Schrägagar gehalten wurden (vgl. Beispiel 3), wurden in Schüttelkolben mit einem Gehalt an YS-4-, YS-25- oder Ca4a-Medium überführt und 2 bis 3 Tage bei 25ºC kultiviert. Die Lipaseaktivität (OU) der Brühe wurde gemessen. Ergebnisse: Stamm Medium Fermentationszeit OU/ml YS-4 YS-25 Ca4a Tage
    • Beispiel 5 Herstellung von C. tsukubaensis-Lipase
  • Eine Kultur von Candida tsukubaensis CBS 6389 wurde auf PDA- Schrägagar gehalten (die Zusammensetzung des PDA-Agar ist in Beispiel 3 angegeben).
  • Zwei YeDP-Schüttelkolben wurden angeimpft und 24 Stunden bei 25ºC kultiviert.
  • Diese Kultur wurde verwendet, um 52 Schüttelkolben mit CG-1g-Medium anzuimpfen.
  • Die Schüttelkolben wurden 4 Tage bei 25ºC kultiviert. Die Brühe wurde 20 Minuten bei maximal 4400 g zentrifugiert. Der Überstand (3 l) wurde auf 450 ml eingeengt und mit 2 l Wasser in einer Amicon-Ultrakonzentrationsvorrichtung mit einer HlP 10-20-Patrone entsalzt und gefriergetrocknet, wobei man 24 g Pulver mit 223 OU/g und 135 LU/g erhielt.
    • Beispiel 6 Herstellung von Lipase aus 2 Candida-Spezies
  • Jeder der nachstehend angegebenen Stämme wurde auf PDA-Schrägagar (vgl. Beispiel 3) überimpft und 3 Tage bei 25ºC kultiviert. Die Zellen wurden anschließend in 9 ml sterilem entionisiertem Wasser suspendiert und in YePD-Medium (vgl. Beispiel 5) als Vorkultur überimpft und 17 bis 23 Stunden kultiviert. 2 bis 7 ml der Kulturbrühe wurden in Schüttelkolben mit Ca19g-Medium, YS-4-Medium oder YS-25-Medium (vgl. Beispiel 4) überimpft und 3 Tage unter Schütteln bei 25ºC kultiviert. pH-Wert und Lipaseaktivität (OU) der Brühe wurden anschließend gemessen. Ergebnisse: Spezies Stamm Nr. Medium pH-Wert OU/ml C. antarctica C. tsukubaensis Ca19g YS-4
  • Zum Vergleich wurde C. curvata CBS 570 in der gleichen Weise bei 4-tägiger Züchtung in YS-25-Medium gezüchtet. Die Aktivität betrug 34,8 OU/g.
    • Beispiel 7 Trennung und Charakterisierung der Bestandteile darstellenden Lipasen A und B aus C. antarctica
  • Teilweise gereinigte Lipasen aus C. antarctica, wie sie in Beispiel 2 erhalten wurden, wurden wie folgt weiter gereinigt. 1 g Enzympulver wurde in 50 millimolar Tris-Acetat, pH-Wert: 6, suspendiert. 1 g DEAE-Sephadex A50 wurde in 50 millimolar Tris-Acetat, pH-Wert: 6, quellen gelassen und damit gewaschen und anschließend zu der Enzymsuspension gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und über einen gesinterten Glastrichter filtriert. Das Filtrat wurde anschließend durch Ultrazentrifugation eingeengt und gegen 20 millimolar Citratpuffer, pH-Wert: 4,5, dialysiert und auf eine CM-Sepharose-Säule, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, aufgetragen. Das B-Enzym wurde als ausströmendes Medium eluiert, und das A-Enzym wurde mit einem Salzgradienten eluiert.
  • Das Molekulargewicht der Enzyme A und B wurde mit Hilfe des Pharmacia Phast -Systems unter Verwendung von 8 bis 25 % SDS-PAGE-Gradientengelen bestimmt. Das Molekulargewicht für die Enzyme A und B wurde zu 43 bzw. 33 kD bestimmt. Die isoelektrischen Punkte für die Enzyme A und B wurden unter Verwendung einer "LKB Ampholine Page"-Platte bei einem pH-Wert im Bereich von 3,5 bis 9,5 bestimmt. Der pI-Wert für das Enzym A betrug 8,0 ± 0,2 und für das Enzym B 6,0 ± 0,2.
  • Zur weiteren Reinigung des B-Enzyms wurde die vereinigte Menge, die als ausströmendes Medium aus der CM-Sepharose-Säule erhalten wurde, gegen 20 millimolar Borat, pH-Wert: 10, dialysiert und auf eine Mono-Q- -Säule (Pharmacia), die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, aufgetragen. Aktivität des B-Enzym wurde mit einem Salzgradienten unter Verwendung einer Pharmacia-FPLC-Ausrüstung eluiert.
    • pH-Stabilität des Enzyms
  • Die Enzyme A und B wurden in 20 millimolar Phosphatpuffer für pH- Werte von 6 oder 7 und 20 millimolar Boratpuffer für pH-Werte von 8, 9 oder 10 verdünnt. Die Endkonzentrationen an Enzym wurden auf OD&sub2;&sub8;&sub0;=1 eingestellt, und es wurde 1 1/2 Stunden bei Raumtemperatur und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die nachstehende Tabelle zeigt die prozentuale restliche Aktivität, die nach der LU-Methode gemessen wurde. Die Aktivität der Enzyme bei einem pH-Wert von 7 wurde auf 100 % eingestellt. Es ist ersichtlich, daß das A-Enzym bei einem pH-Wert von 10 nach einer Inkubation über Nacht bei 4ºC völlig inaktiv war, während das B-Enzym mehr als 78 % seiner Aktivität bei einem pH-Wert von 10 behielt, jedoch weniger stabil bei einem pH-Wert von 6 war. A-Enzym B-Enzym Inkubationszeit pH-Wert
    • Einfluß der Temperatur auf die Aktivität
  • Die Lipase-Aktivität wurde nach der LU-Methode gemessen, mit der Abwandlung, daß die Temperatur variiert wurde. Die Ergebnisse sind nachstehend gezeigt, wobei die Aktivität bei 30ºC als 100 % angenommen wurde. Anstieg der Aktivität (%) Temperatur A-Enzym B-Enzym
    • Einfluß des pH-Wertes auf die Aktivität
  • Die Lipase-Aktivität wurde nach der LU-Methode gemessen, mit der Abwandlung, daß der pH-Wert variiert wurde. Die bei den entsprechenden pH-Werten in Abwesenheit des Enzyms erhaltenen Ergebnisse wurden als Kontrollen für die spontane Hydrolyse herangezogen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Es ist ersichtlich, daß festgestellt wurde, daß der optimale pH-Wert für beide Enzyme A und B bei einem pH-Wert von etwa 7 liegt.
    • Beispiel 8 Thermostabilität der Lipasen
  • Proben von Kulturbrühe, wie sie in Beispiel 6 hergestellt wurde (mit Ca19g- oder YS-4-Medium) wurden 30 Minuten bei 60, 70 und 84ºC wärmebehandelt. Die Lipaseaktivität der wärmebehandelten Proben und einer Kontrollprobe ohne Wärmebehandlung wurde anschließend durch Auftragen der Probe auf eine Diffusionsplatte, die Olivenöl, Polyvinylalkohol (PVA) und Brillantgrün in Agar bei einem pH-Wert von 5,5 enthielt, und Messen der Zone in Farbänderung (Durchmesser in mm) nach 24-stündiger Diffusion bei 30ºC bestimmt. Wärmebehandlung Spezies Stamm Nr. keine C. antarctica C. curvata (Vergleich)
  • Es ist ersichtlich, daß die Lipase aus C. antarctica stabil bis 84ºC war, während die Lipase nach dem Stand der Technik aus C. curvata bei 60ºC instabil war.
    • Beispiel 9 Thermostabilität löslicher Lipasen
  • Die Thermostabilitäten der folgenden Lipasen wurden verglichen.
    • Erfindung:
  • C. antarctica: Eine 0,8 %-ige Lösung des Pulvers aus Beispiel 1.
  • Gereinigte Lipase A: Die Probe aus Beispiel 10 wurde über Nacht gegen 15 millimolar Tris-Maleat-Puffer, pH-Wert: 7, dialysiert.
    • Vergleich:
  • C. cylindracea: Eine 1 %-ige Lösung der Lipase OF, die von Meito Sangyo erhalten wurde.
  • C. curvata: Das UF-Konzentrat aus Vergleichsbeispiel 1.
  • Die folgenden Puffer wurden bei diesem Versuch verwendet:
  • Tris-Maleat-Puffer 0,1 m, pH-Wert: 6,0:
  • 50 ml 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan + 26 ml 0,1 m Maleinsäure
  • Citrat-Phosphat-Puffer 0,1 m, pH-Wert: 6,5:
  • 142 ml 0,05 m Citronensäure + 355 ml 0,1 m zweibasisches Natriumphosphat (Na&sub2;HPO&sub4;)
  • Phosphat-Puffer 0,1 m, pH-Wert: 7,5:
  • 16 ml 0,1 m NaH&sub2;PO&sub4; + 84 ml 0,1 m Na&sub2;HPO&sub4;
  • Die Thermostabilität wurde durch Mischen von 1 ml Lipaselösung mit 4 ml Puffer in einem Teströhrchen gemessen. Das Teströhrchen wurde 60 Minuten in einem Wasserbad bei 60, 65 oder 70ºC inkubiert. Die Thermostabilität wird als restliche Aktivität (LU/ml) in Prozent der Aktivität (LU/ml) des Enzym-Puffer-Gemisches vor der Inkubation ausgedrückt.
  • Die Ergebnisse (Restaktivitäten) waren wie folgt: Erfindung Vergleich Enzym inkubationstemp. C. antarctica Lipase A C. curvata C. cylindracea Puffer-pH-Wert
  • Die Inkubationen bei einem pH-Wert von 6 für C. curvata mit Tris- Maleat-Puffer wurden eingeschlossen, da dies den von D. Montet et al. in ihrer Beschreibung der Lipase (Fette Seifen Anstrichmittel, Bd. 87 (1985), S. 181-185) angewandten Bedingungen entspricht und daher als geeignet für diese Lipase angesehen wird.
  • Es kann geschlossen werden, daß die C. antarctica-Lipase und die Lipase A weitaus stabiler sind als die C. cylindracea- und C. curvata- Lipasen nach dem Stand der Technik.
    • Beispiel 10 Thermostabilität von Lipasen nach der Wärmebehandlung
  • In diesem Versuch wurden Lipaseproben zuerst 1 Stunde bei 60ºC, pH-Wert: 6,5, wie folgt vorbehandelt:
    • Erfindung:
  • C. tsukubaensis: Das Pulver aus Beispiel 5 (7 %) wurde in einem Puffer vom pH-Wert 6,5 (siehe vorstehend) gelöst und 1 Stunde bei 60ºC vorbehandelt.
  • Gereinigte Lipase A: Das Eluat aus der Säule (Beispiel 10) wurde über Nacht gegen 15 millimolar Tris-Maleat-Puffer, pH-Wert: 7, dialysiert, 5-fach mit einem Puffer vom pH-Wert 6,5 verdünnt und 1 Stunde bei 60ºC vorbehandelt.
    • Vergleich:
  • C. curvata: Das UF-Konzentrat aus Vergleichsbeispiel 1. Das Konzentrat wurde auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und 1 Stunde bei 60ºC, pH-Wert: 6,5, inkubiert. Diese vorbehandelte Probe wurde 5-fach im Puffer (pH-Wert: 6; 6,5; 7,5; siehe vorstehend) für die Versuche zur Thermostabilität verdünnt.
  • Die vorstehend vorbehandelten Proben wurden anschließend 1 Stunde bei 65ºC und einem pH-Wert von 6,0; 6,5 oder 7,5 inkubiert.
  • Die Ergebnisse waren wie folgt: Erfindung Vergleich Lipase C. tsukubaensis gereinigte Lipase A C. curvata Verbleibende Aktivität nach der Wärmebehandlung pH-Wert bei der Inkubation Verbleibende Aktivität nach 1 h bei:
  • Es ist ersichtlich, daß die beiden erfindungsgemäßen Lipasen etwas von ihrer Aktivität während der Vorbehandlung bei 60ºC verlieren, daß jedoch die vorbehandelten Proben sehr stabil bei 65ºC sind. Die Lipase aus C. curvata nach dem Stand der Technik wird bei 65ºC rasch inaktiviert.
    • Beispiel II Thermostabilität der C. antarctica-Lipase
  • Wie in Beispiel 3 erhaltenes Lipase-Pulver wurde in Wasser (1 %) gelöst und weiter 5-fach mit 50 millimolar Tris-Maleat-Puffer, pH-Wert: 7, verdünnt. Diese Lösung wurde 0, 60 und 180 Minuten bei 60ºC vorbehandelt und anschließend 30 Minuten bei verschiedenen Temperaturen wärmebehandelt. Die verbleibende Aktivität nach jeder Stufe wurde nach der OU- Methode gemessen. Vorbehandlung bei 60ºC min Verbleibende Aktivität nach der Vorbehandlung Wärmebehandlung, 30 min, bei:
  • Die Ergebnisse zeigen, daß etwas von der Lipase-Aktivität während der Vorbehandlung bei 60ºC verlorengeht, daß die verbleibende Lipase-Aktivität jedoch überaus wärmestabil selbst bei 80ºC ist.
  • Es ist nicht klar, warum einige Daten erheblich über 100 % liegen.
    • Beispiel 12 Aktivität gegen Temperatur für C. antarctica-Lipase
  • Die Enzymaktivität von C. antarctica-Lipase (0,1 % des Pulvers aus Beispiel 3) wurde bei 30, 40, 50, 60, 65 und 70ºC gemessen. Die Aktivitäten wurden nach der OU-Methode, die im Text beschrieben wurde, gemessen, jedoch bei Inkubation bei verschiedenen Temperaturen. Die Ergebnisse waren wie folgt: Inkubationstemperatur Aktivität, OU/ml
    • Beispiel 13 pH-Wert-Aktivität für Lipasen
  • Die pH-Abhängigkeit der Aktivitäten der Lipase aus C. antarctica (0,2 %-ige Lösung des Pulvers aus Beispiel 3) und C. tsukubaensis (3,0 %-ige Lösung des Pulvers aus Beispiel 5) wurde gemessen.
  • Der pH-Wert wurde von 4,0 auf 10,5 in Schritten von 0,5 Einheiten variiert. Bei den verwendeten Puffern handelte es sich um Natriumacetat/Essigsäure bei pH-Wert 4,0 bis 5,5 (200 millimolar für C. antarctica und 100 millimolar für die anderen Lipasen), 50 millimolar Tris-Maleat/NaOH bei pH-Wert 5,5 bis 8,5 und Glycin/NaOH bei pH-Wert 9,0 bis 10,5 (200 millimolar für C. antarctica und 100 millimolar für die anderen Lipasen.
  • Die Messungen wurden wie bei der OU-Methode durchgeführt, jedoch mit 5 ml Enzym, gelöst im Puffer, anstelle von 1 ml Enzymlösung und 5 ml Tris-Maleat-Puffer.
  • Die pH-Wert-Aktivitätskurven sind in den Figuren 1 und 2 für C. antarctica bzw. C. tsukubaensis gezeigt. Alle Lipasen zeigten also eine optimale Aktivität im Bereich vom pH-Wert 6,5 bis 8.
    • Beispiel 14 Unspezifität der löslichen Lipasen
  • Wie in Beispiel 6 hergestellte Kulturbrühe wurde gemäß der vorstehend erläuterten Unspezifitätsmethode untersucht. Die Ergebnisse sind als 1,3-Diglycerid in % des gesamten Diglycerids angegeben: Spezies Stamm Nr. 1,3-Diglycerid (%) C. antarctica C. tsukubaensis
  • Lipasen aus Candida antarctica (0,2 %-ige Lösung des wie in Beispiel 3 erhaltenen Pulvers) und C. tsukubaensis (3,0 %-ige Lösung des Pulvers aus Beispiel) 5 wurden nach der gleichen Methode vermessen.
  • C. antarctica : 41 %
  • C. tsukubaensis : 48 %
  • Es ist ersichtlich, daß beide Lipasen unspezifisch sind.
    • Beispiel 15 Substratspezifität für die Bestandteile darstellenden C. antarctica-Lipasen
  • Die Aktivitäten der gereinigten Lipasen A und B (aus Beispiel 7) für verschiedene Substrate wurden verglichen. Die Aktivitäten für Tributyrin und Olivenöl wurden nach der LU-Methode bzw. nach der OU-Methode gemessen. Die Aktivitäten für Methyloleat, Methyllaurat und racemisches Diolein wurden nach der LU-Methode mit den folgenden Modifizierungen gemessen: 1 % Substrat (Methyllaurat, 99 % rein, von Nu Check Prep; Methyloleat, 99 % rein, von Nu Check Prep; oder racemisches Diolein, 99 % rein, von Sigma) anstelle von Tributyrin und bei NaOH-Titration bei einem pH-Wert von 8,5 anstelle von einem pH-Wert von 7,0.
  • Die nachstehenden Ergebnisse sind als prozentuale Aktivität, relativ zu Tributyrin, angegeben: Substrat Lipase A Lipase B Tributyrin (LU) Olivenöl (OU) Racemisches Diolein Methyllaurat Methyloleat
  • Es ist ersichtlich, daß Lipase B eine hohe Aktivität für Diglyceride und Methylester aufweist, während Lipase A eine vergleichsweise geringe Aktivität dafür, in bezug zur Aktivität für Triglyceride, aufweist.
    • Beispiel 16 Immobilisierung von C. antarctica-Lipase auf einem Anionenaustauschharz
  • 0,6 g Candida antarctica-Lipase, wie sie in Beispiel 1 erhalten wurde, wurden mit Wasser auf 7,5 g verdünnt und mit 1,5 g Trockenmasse Lewatit E1999/85 (schwach basisches Anionenaustauschharz, Produkt von Bayer), eingestellt auf einen pH-Wert von 7, gemischt.
  • Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Nach Waschen mit Wasser wurde die Zubereitung im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, wobei man 1,83 g (Trockenmassegehalt: 98 %) erhielt. Die im Filtrat verbleibende Aktivität betrug 39 %, entsprechend einer Beladung von etwa 19 000 LU/g Trockenmasse immobilisierte Lipase.
    • Beispiel 17 Immobilisierung auf einem Anionenaustauschharz
  • 12,5 ml Lipaselösung (12 500 LU/ml) von C. antarctica-Lipase, wie sie in Beispiel 2 erhalten wurde und 4,25 g Trockenmasse Duolite ES-568 (schwach basisches Anionenaustauschharz, Produkt von Rohm & Haas), eingestellt auf einen pH-Wert von 7, wurden gemischt und 24 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Nach Waschen mit Wasser wurde die Zubereitung im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, wobei man 4,6 g Trockenmasse immobilisierte Lipase erhielt. Die im Filtrat verbleibende Aktivität betrug 33 %, entsprechend einer Beladung von etwa 22 700 LU/g Trockenmasse immobilisierte Lipase. Die Aktivität betrug 9,2 BIU/g, gemessen nach der bereits beschriebenen Methode.
    • Beispiel 18 Immobilisierung auf einem Anionenaustauschharz
  • 100 ml mit 15 000 LU/ml C. antarctica-Lipase, wie sie in Beispiel 2 erhalten wurde, wurden mit 46 g Trockengewicht von gewaschenem Lewatit E 1999/85 (schwach basisches Anionenaustauschharz, Produkt von Bayer), eingestellt auf einen pH-Wert von 7, gemischt. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Waschen mit Wasser wurde die Zubereitung im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, wobei man 51,5 g (Trockenmassegehalt: 99 %) erhielt. Die im Filtrat verbleibende Aktivität betrug 1 %, entsprechend einer Beladung von 29 200 LU/g. Die Aktivität betrug 37,6 BIU/g.
    • Beispiel 19 Immobilisierung auf einem Adsorbensharz
  • 60 ml mit 12 500 LU/ml C. antarctica-Lipase, wie sie in Beispiel 2 erhalten wurde, wurden mit 25 g Trockengewicht von gewaschenem Lewatit E 2001/85 (nicht-ionisches Harz, Produkt von Bayer), eingestellt auf einen pH-Wert von 7, gemischt. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Waschen mit Wasser wurde die Zubereitung im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, wobei man 25 g (Trockenmassegehalt: 98 %) erhielt. Die im Filtrat verbleibende Aktivität betrug 1,6 %, entsprechend einer Beladung von 30 200 LU/g.
    • Beispiel 20 Immobilisierung auf einem Adsorbensharz
  • Das vorstehende Beispiel wurde wiederholt, und zwar unter Verwendung von 100 ml mit 15 000 LU/ml C. antarctica-Lipase und 50 g Harz, wobei man 58 g (Trockenmassegehalt: 98 %) erhielt. Die Aktivität im verbleibenden Filtrat betrug 2 %, entsprechend einer Beladung von 25 800 LU/g. Die Aktivität betrug 52,2 BIU/g.
    • Beispiel 21 Immobilisierung gereinigter Lipase A
  • Herstellung des Trägers: 10 g Lewatit 2001/85 wurden auf einem G- 2-Glasfilter gewaschen, der pH-Wert wurde einen pH-Wert von 7 mit einem pH-Stat unter Verwendung von 0,05 n NaOH (2-stündiger Ansatz) eingestellt, es wurde erneut gewaschen und auf dem Glasfilter getrocknet. Die Trockenmasse wurde gemessen und betrug 61,55 %, und 2,5 g Trockengewicht wurden für die Immobilisierung verwendet.
  • Herstellung des Enzyms: Lipase A (Beispiel 7) wurde über Nacht gegen 15 millimolar Tris-Maleat-Puffer, pH-Wert: 8, dialysiert, was zu 15 ml an 8000 LU/ml führte.
  • Immobilisierung: Träger und Enzym wurden über Nacht gemischt, auf einem Glasfilter gewaschen und 2 Stunden im Vakuum getrocknet. Die Trockenmasse betrug 96 %. 2 % der Aktivität verblieben in der Lösung, was einer Beladung von 28 200 LU/g entspricht.
    • Beispiel 22 Immobilisierung gereinigter Lipase A
  • Der Träger wurde wie im vorstehenden Beispiel hergestellt. Die Trockenmasse wurde gemessen und betrug 76,32 %, und 4,4 g Trockengewicht wurden für die Immobilisierung verwendet.
  • Das Enzym wurde wie im vorstehenden Beispiel hergestellt, was zu 24,7 ml mit 5400 LU/ml führte.
  • Immobilisierung: Träger und Enzym wurden über Nacht gemischt, auf einem Glasfilter gewaschen und 5 Stunden im Vakuum getrocknet. Die Trockenmasse betrug 100 %. 28 % der Aktivität verb1ieben in der Lösung, was einer Beladung von 22 300 LU/g entspricht.
    • Beispiel 23 Immobilisierung gereinigter Lipase B
  • 2,6 g Trockengewicht des Trägers, der im vorstehenden Beispiel hergestellt worden war, wurden für die Immobilisierung verwendet.
  • Lipase B (Beispiel 7) wurde wie in Beispiel 21 hergestellt, was zu 24,9 ml mit 3200 LU/ml führte.
  • Immobilisierung: Träger und Enzym wurden über Nacht gemischt, auf einem Glasfilter gewaschen und 5 Stunden im Vakuum getrocknet. Die Trockenmasse betrug 100 %. 6,4 % der Aktivität verblieben in der Lösung, was einer Beladung von 29 200 LU/g entspricht.
  • Die Aktivität betrug 4,4 BIU/g. Ein NSI&sub2;-Assay wurde 2 Stunden mit 250 mg Trockenmasse Lipase und nur 4 ml Reaktionsgemischen durchgeführt. Der Laurinsäureeinbau betrug nur 14 Mol-%, und der NSI&sub2;-Wert betrug 0,65, was anzeigt, daß Lipase B unspezifisch ist.
    • Beispiel 24 Eigenschaften von immobilisierter C. antarctica-Lipase und immobilisierter Lipase A
  • Aktivität, Thermostabilität und Unspezifität von immobilisierter Candida antarctica-Lipase aus Beispiel 19 und immobilisierter gereinigter Lipase A aus Beispiel 21 wurden verglichen.
  • Die Aktivität wurde sowohl mit dem BIU-Assay (60ºC, ohne organisches Lösungsmittel) als auch mit dem BTU-Assay bei 70ºC bestimmt.
  • Die Unspezifität wurde sowohl nach dem NSI&sub1;- als auch nach dem NSI&sub2;-Assay gemessen.
  • Die Thermostabilität wurde nach fo1gendem Verfahren gemessen.
  • 1,2 g Triolein wurden zu 150 mg Trockengewicht 10 % hydratisiertes Enzym gegeben. Die Probe wurde anschließend 3 Tage bei 80ºC inkubiert. Die verbleibende Aktivität (BIU) wurde bei 40ºC nach Zugabe von 12 ml Petrolether mit 348 mg Palmitinsäure gemessen. Die Thermostabilität wird in % der Aktivität einer Vergleichsprobe, die für 3 Tage in einen Kühlschrank gegeben wurde, ausgedrückt.
  • Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt. Enzym: Immobilisierte C. antarctica-Lipase Immobilisierte Lipase A BIU/g (60ºC, kein Lösungsmittel) BTU/g (70ºC) NSI&sub2; (bei % erzieltem Laurinsäure-Einbau) Thermostabilität 3 Tage bei 80ºC
  • Die beiden immobilisierten Produkte zeigen sehr ähnliche Eigenschaften in allen diesen Tests. Beide sind unspezifisch, wirksam für die Katalyse von Acidolyse und Esteraustausch, und beide sind überaus thermostabil.
    • Beispiel 25 Aktivität und Spezifität immobilisierter Lipasen
  • Die folgenden immobilisierten Lipasen wurden zum Vergleich hergestellt:
  • A) 2,72 g Candida cylindracea-Lipase mit einer Aktivität von 120 000 LU/g (Produkt von Meito Sangyo Co.) wurden in 25 ml Wasser gelöst. 8,5 g Trockenmasse Lewatit E1999/85 (schwach basisches Anionenaustauschharz, Produkt von Bayer) wurden auf einen pH-Wert von 6 eingestellt und mit der Lipaselösung gemischt. Nach Rotation für 24 Stunden bei Raumtemperatur und Waschen mit Wasser wurde die Zubereitung im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, wobei man 9,27 g (Trockenmassegehalt: 97 %) erhielt. Die im Filtrat verbleibende Aktivität betrug 0,2 %, was einer Beladung von 28 000 LU/g Trockenmasse immobilisierte Lipase entspricht.
  • B) 2,0 g Chromobacterium viscosum-Lipase mit einer Aktivität von 67 700 LU/g (Produkt von Toyo Jozo, Japan) wurden in 25 ml Wasser gelöst. 4,25 g Trockenmasse Duolite ES-568N (schwach basisches Anionenaustauschharz, Produkt von Rohm & Haas, USA) wurden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und mit der Lipaselösung gemischt. Nach Rotation für 4 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Zubereitung filtriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 4,52 g (Trockenmasse: 94 %), und die restliche Aktivität im Filtrat betrug 6 %, was einer Beladung von 28 000 LU/g Trockenmasse immobilisierte Lipase entspricht.
  • Der Unspezifitätsindex (NSI&sub2;) wurde gemessen, wie zuvor in der Anmeldung beschrieben wurde, und zwar unter Verwendung von immobilisierter C. antarctica-Lipase (Zubereitung von Beispiel 16), den beiden vorstehenden Zubereitungen und immobilisierter Mucor miehei-Lipase (Lipozyme IM 20, Produkt von Novo Industri A/S).
  • In der nachstehenden Tabelle sind die Fettsäurezusammensetzungen in Mol-% nach Reaktionen für 2 Stunden bei 60ºC angegeben. Lipasezubereitung Fettsäurezusammensetzung Erfindung: Candida antarctica Vergleich: Candida cylindracea Chromobac. viscosum Mucor miehei Kakaobutterstearin
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß die beiden Candida-Lipasen hinsichtlich der Position unspezifisch sind und daß die Chromobacterium- und die Mucor-Lipase 1,3-spezifisch sind.
    • Beispiel 26 Thermostabilität immobilisierter Lipasen
  • Die Thermostabilität der immobilisierten Zubereitungen von Candida antarctica- und Candida cylindracea-Lipase (Beispiele 16 bzw. 25) wurde wie folgt untersucht:
  • 250 mg Trockenmasse Zubereitung wurden auf 10 % (Gew./Gew.) hydratisiert. 600 mg Triolein wurden zugegeben, und es wurde 0, 2, 4 und 24 Stunden bei 70ºC inkubiert. Nach Inkubation wurde die Probe gekühlt, 12 ml Petrolether mit einem Gehalt an 174 mg Palmitinsäure wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 40ºC inkubiert. Eingebaute Palmitinsäure (%, (Gew./Gew.)) wurde in jedem Fall gemessen, wie es in der AF 206-Methode, auf die vorstehend bezug genommen wurde, beschrieben ist, wobei man folgende Ergebnisse erhielt: Inkubation (h) C. antarctica C. cylindracea
  • Die Ergebnisse zeigen die hervorragende Thermostabilität von immobilisierter C. antarctica-Lipase, da sie nahezu die gesamte Aktivität nach 24 Stunden bei 70ºC behält, während die Lipase nach dem Stand der Technik den größten Teil ihrer Aktivität verliert.
  • Durch Berechnung als reversible Reaktion erster Ordnung läßt sich abschätzen, daß die C. antarctica-Lipase ungefähr 90 % ihrer Aktivität nach 24 Stunden bei 70ºC behält und daß die restliche Aktivität der C. cylindracea-Lipase unter 10 % beträgt.
    • Beispiel 27 Acidolyse und Esteraustausch mit immobilisierter C. antarctica-Lipase
  • Das immobilisierte Produkt von Beispiel 19 wurde für die Acidolyse (Triolein + Palmitinsäure) und Esteraustausch (Triolein + Tripalmitin) ohne Lösungsmittel bei verschiedenen Temperaturen gemäß der BIU- und der BTU-Methode verwendet.
  • Die Aktivitäten (BIU und BTU) sind in Fig. 4 bzw. 5 gezeigt. Diese Figuren zeigen klar die extreme Thermostabilität der immobilisierten Lipase, da die höchste Aktivität bei den höchsten untersuchten Temperaturen, d.h. 85 bis 90ºC, festgestellt wurde.
    • Beispiel 28 Estersynthese mit immobilisierten C. antarctica-Lipasen
  • Die Fähigkeit von immobilisierter C. antarctica-Lipase (Zubereitung aus Beispiel 19), immobilisierter gereinigter Lipase A (Zubereitung aus Beispiel 22) und immobilisierter gereinigter Lipase B (Zubereitung aus Beispiel 23), die Estersynthese zu katalysieren, wurde nach dem folgenden Verfahren verglichen: 150 mg Trockengewicht, vor der Verwendung 20 Stunden auf 10 % hydratisiert, 1,5 mMol Alkohol (1-Propanol, 2- Propanol oder Oleylalkohol (technische Qualität, BDH)) und 1,5 mMol freie Fettsäure (Myristinsäure (Qualität von 99 %, Sigma) oder Ölsäure (92 %, BDH)) wurden in einem 8 ml fassenden Fläschchen gemischt und in einem Wasserbad bei 60ºC geschüttelt. Ungefähr 1 g Probe wurden nach 20- minütiger und nach 90-minütiger Inkubation entnommen. 150 ml neutralisiertes Ethanol wurden zu der Probe gegeben, und die restlichen freien Fettsäuren wurden mit KOH titriert. Die erhaltene Estersynthese wird als 100 % minus titrierte verbleibende freie Fettsäuren berechnet.
  • Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt. Immobilisiertes Enzym Alkohol Freie Fettsäure erzielte Estersynthese (%) nach min Reine Lipase C. antarctica-Lipase 1-Propanol 2-Propanol Oleylalkohol Myristinsäure Ölsäure
  • Es ist ersichtlich, daß immobilisierte Lipase B wirksamer für die Estersynthese als Lipase A in allen Versuchen ist, und zwar sowohl mit langkettigen als auch mit kurzkettigen Alkoholen und sowohl mit primären als auch mit sekundären Alkoholen.
  • Immobilisierte Lipase A ergibt geringe Esterausbeuten im Fall kurzkettiger Alkohole, ist jedoch wirksamer im Fall langkettiger Alkohole.
  • Immobilisierte C. antarctica-Lipase (mit einem Gehalt sowohl an Lipase A als auch an Lipase B) ergibt ähnliche Ausbeuten wie Lipase B für kurzkettige Alkohole und bessere Ausbeuten als Lipase A oder B für langkettige Alkohole.
    • Beispiel 29 Einfluß der Fettsäure bei der Acidolyse mit immobilisierter Lipase
  • 250 mg Trockenmasse immobilisierte C. antarctica-Lipase (Zubereitung aus Beispiel 19) oder 150 mg Trockenmasse immobilisierte Lipase A (Zubereitung aus Beispiel 22) wurden in 20 Stunden auf 10 % hydratisiert und anschließend mit 3 mMol Tricaprylin (Sigma, Qualität II) und 3 mMol einer der folgenden Fett sauren in einem 8 ml fassendem Fläschchen gemischt: Laurinsäure (Merck, Artikel 805333), Myristinsäure (Sigma, Qualität 99 %), Palmitinsäure (BDH, besonders rein), Stearinsäure (Merck, Artikel 800673), Ölsäure (Nu Check Prep, 99 %) und Linolsäure (Nu Check Prep, 99 %). Die Gemische wurden unter Schütteln in einem Wasserbad bei 70ºC inkubiert, und Proben wurden nach geeigneten Zeiten entnommen, um die Aktivität zu berechnen. Die Triglyceride wurden gereinigt, methyliert, durch GLC analysiert, und die Aktivitäten wurden berechnet, wie es bei der vorstehend beschriebenen BIU-Methode angegeben wurde. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengefaßt. Immobilisierte C. antarctica-Lipase: Aktivität uMol eingebaute Fettsäure pro min (Anfangsaktivität) Acidolyse von Tricaprylin mit: Laurinsäure Myristinsäure Palmitinsäure Stearinsäure Ölsäure Linolsäure Immobilisierte gereinigte Lipase A: Aktivität uMol eingebaute Fettsäure pro min (Anfangsaktivität) Acidolyse von Tricaprylin mit: Laurinsäure Ölsäure
    • Beispiel 30 Einfluß der Fettsäure bei der Acidolyse mit immobilisierter Lipase
  • In einem weiteren Versuch wurden 150 mg Trockenmasse immobilisierte C. antarctica-Lipase (Zubereitung aus Beispiel 19) oder immobilisierte gereinigte Lipase A (Zubereitung aus Beispiel 22) in 20 Stunden auf 10 % hydratisiert und anschließend mit 3 mMol jedes der folgenden Reaktanten in einem 8 ml fassenden Fläschchen gemischt: Trilaurin (Sigma, Qualität 98 %), Palmitinsäure (BDH, besonders rein), Ölsäure (Nu Check Prep, 99 % rein) und Linolsäure (Nu Check Prep, 99 % rein). Die Reaktionsgemische wurden in einem Wasserbad bei 70ºC und Schütteln angeordnet. Proben wurden nach 1 1/2 und 3 1/2 Stunden für immobilisierte C. antarctica-Lipase und nach 1 1/2 und 5 1/2 Stunden für immobilisierte gereinigte Lipase A entnommen. Die Triglyceride wurden gereinigt, methyliert und durch GLC analysiert, wie es vorstehend beschrieben wurde. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengefaßt:
  • Enzym, immobilisiert Gereinigte Lipase A C. antarctica-Lipase Reaktionszeit Triglyceridzusammensetzung Mol-% Laurinsäure Mol-% Palmitinsäure Mol-% Ölsäure Mol-% Linolsäure
  • Es ist ersichtlich, daß Lipase A eine wesentlich geringere Aktivität gegenüber einfach und zweifach ungesättigten Säuren als gegenüber gesättigten Säuren aufweist. C. antarctica-Lipase (mit einem Gehalt sowohl an Lipase A als auch an Lipase B) weist nur eine geringfügig geringere Aktivität gegenüber einfach und zweifach ungesättigten Säuren auf.
    • Beispiel 31 Acidolyse mit immobilisierten Lipasen bei mehrfach ungesättigten Fettsäuren
  • Die Fähigkeit von immobilisierter C. antarctica-Lipase (Zubereitung aus Beispiel 19), immobilisierter gereinigter Lipase A (Zubereitung aus Beispiel 22) und immobilisierter spezifischer Lipase aus Mucor miehei (Lipozyme IM 20 vom NOVO INDUSTRI A/S), mehrfach ungesättigte Fettsäuren in Triglyceride einzubauen, wurde durch Mischen von 250 mg Trockenmasse immobilisierte Lipase (hydratisiert auf 10 % Wasser), 1276 mg Trilaurin (Sigma, Qualität 98 %) und 2500 mg Fettsäuregemisch in einem 8 ml fassenden Fläschchen verglichen. Das Fettsäuregemisch wurde durch Mischen von Palmitinsäure mit einer an mehrfach ungesättigten Fettsäuren reichen Fraktion (erhalten durch Vakuumdestillation) von hydrolysiertem Menhadenöl erhalten. Das Fettsäuregemisch enthielt 24,9 Mol-% Palmitinsäure (C16:0), 20,4 Mol-% Eicosanpentaenonsäure (C20:5), 7,2 Mol-% Docosapentaenonsäure (C22:5) und 26,2 Mol-% Docosahexaenonsäure (C22:6). Die Reaktion wurde unter Schütteln in einem Wasserbad bei 70ºC durchgeführt. Proben wurden nach 3 und nach 5 Stunden entnommen, und die Triglyceride wurden gereinigt, methyliert und durch GLC analysiert, wie es vorstehend beschrieben wurde.
  • Die Fettsäurezusammensetzung der Triglyceride (in Mol-%) und die Verhältnisse zwischen diesen Triglyceriden sind nachstehend gezeigt: Erfindung Vergleich Immobilisierte Lipase Reine Lipase A C. antarctica Mucor miehei Reaktionszeit in h Fettsäure: Laurin (C12:0) Palmitin (C16:0) Verhältnisse:
  • Es ist ersichtlich, daß C. antarctica-Lipase beim Einbau mehrfach ungesättigter Fettsäuren wirksam ist, der fast mit der gleichen Leichtigkeit wie der gesättigter Fettsäuren erfolgt. Die beiden Lipasen der Erfindung sind wirksam beim Einbau von C22:6-Säure.
    • Beispiel 32 Estersynthese mit immobilisierter Lipase
  • Erläuterung des Unterschieds der Aktivität von Lipase aus Candida antarctica und 1,3-positionsspezifischer Lipase aus Mucor miehei bei der Synthese von Estern aus primären und sekundären Alkoholen.
  • 11,42 g (0,05 Mol) Myristinsäure (Merck, Reinheit 98 %) und 3,01 g (0,05 Mol) n-Propanol oder Isopropanol (Merck, Reinheit 99 %) wurden zusammen bei 60ºC mit 1 g einer immobilisierten Lipase geschüttelt. Es wurde entweder eine immobilisierte Lipase aus Candida antarctica (Zubereitung aus Beispiel 19), eingestellt auf 10 % Wassergehalt, oder eine im Handel erhältliche 1,3-positionsspezifische Lipase aus Mucor miehei (Lipozyme IM 20) verwendet.
  • Die Veresterungsreaktion wurde verfolgt, indem Proben entnommen wurden und die nicht-umgesetzte Fettsäure titriert wurde (wie es in Beispiel 28 beschrieben ist).
  • Ergebnisse für n-Propanol und Isopropanol sind in Fig. 6 bzw. Fig. 7 gezeigt.
  • Die Ergebnisse zeigen, daß C. antarctica-Lipase wirksam bei der Estersynthese sowohl mit primären als auch mit sekundären Alkoholen ist, während die hinsichtlich der Position spezifische Mucor-Lipase nur für primäre Alkohole wirksam ist.
  • Die Fähigkeit von Candida antarctica-Lipase, langkettige Ester zu synthetisieren, wurde ebenfalls untersucht.
  • 11,42 g (0,05 Mol) Myristinsäure (Merck, Reinheit 98 %) und 10,72 g (0,05 Mol) Myristinalkohol (Merck, Reinheit 98 %) wurden miteinander mit der immobilisierten Lipase (Zubereitung aus Beispiel 19) unter Vakuum bei 60ºC umgesetzt. Der gemessene prozentuale Estergehalt ist nachstehend angegeben: Enzymdosierung Reaktionszeit
  • Die Ergebnisse zeigen, daß C. antarctica-Lipase wirksam für die Estersynthese sowohl mit kurzkettigen als auch mit langkettigen Alkoholen ist.
    • Beispiel 33 Kontinuierliche Acidolyse
  • 4,5 g der immobilisierten C. antarctica-Lipase (Beispiel 18) wurden in eine Säule mit einem Wassermantel mit einem Innendurchmesser von 1,5 cm gefüllt.
  • Die Säule war mit einem Wassermantel mit im Kreis geführtem heißem Wasser ausgestattet und wurde bei 60ºC oder 80ºC gehalten. Eine Vorsäule mit einem Gehalt an Wasser-gesättigtem Harz (Duolite ES561) wurde vor der Enzymsäule angeordnet und bei der gleichen Temperatur gehalten. Ein Substrat, das aus 71 % hochgradig gereinigtem Sojabohnenöl mit einem Peroxidwert von weniger als 3 und 29 % Laurinsäure mit analytischer Qualität bestand, wurde durch die Säulen gepumpt. Am Auslaß der Enzymsäule wurden Proben für die Analyse genommen, und der Einbau von Laurinsäure wurde durch GLC gemessen. Ein Einbau von 14 % (Gew./Gew.) Laurinsäure wurde angestrebt, und die Durchflußgeschwindigkeit wurde eingestellt, um die Umwandlung bei diesem Wert zu halten. Messungen der Durchflußgeschwindigkeit wurden durchgeführt, wenn die tatsächliche Umwandlung 14 ± 1 % betrug. Wenn die Vorsäule trocken war, wurde sie durch eine frische ersetzt.
  • Die Proben wurden durch Entfernen der freien Fettsäure und der Mono- und Diglyceride durch Al&sub2;O&sub3;-Säulenchromatographie, anschließende Methylierung der Triglyceride mit NaOCH&sub3; und schließlich Analyse des Methylesters durch GLC analysiert.
  • Die Ergebnisse sind in Fig. 8 als natürlicher Logarithmus der Durchflußgeschwindigkeit (g Triglycerid/Stunde/g immobilisiertes Enzym) gegen die Zeit (Stunden) gezeigt. Es ist ersichtlich, daß bei 60ºC die Lipaseaktivität in 2400 Stunden nahezu konstant ist, d.h. die Zubereitung ist überaus stabil.
    • Beispiel 34 Fetthydrolyse
  • Olivenöl wurde bei 60ºC mit C. antarctica-Lipase (hergestellt wie in Beispiel 2) in einem 8 l fassenden thermostatisierten Behälter unter Rühren hydrolysiert. Das Öl:Wasser-Verhältnis betrug 60:40 oder 70:30 (Gew./Gew.), und die Lipasedosierung betrug 75 LU/g Öl. Es wurden folgende Ergebnisse (Hydrolyse (%)) erhalten. Öl:Wasser-Verhältnis Zeit, h
  • Es ist ersichtlich, daß eine im wesentlichen vollständige Hydrolyse erzielt werden kann und daß die Lipase selbst nach 4 Tagen bei 60ºC noch aktiv ist.
    • Beispiel 35 Thermostabilität von Lipasen nach einer Wärmebehandlung
  • Lipasen aus C. antarctica (0,1%-ige Lösung des Pulvers aus Beispiel 1) und C. tsukubaensis (3 % aus Beispiel 5) wurden untersucht.
  • Jede Enzymlösung wurde zuerst 1 Stunde bei 60ºC vorbehandelt und anschließend 30 Minuten bei 0, 40, 50, 60, 70 oder 80ºC inkubiert. Die Aktivitäten wurden nach der OU-Methode gemessen. C. antarctica C. tsukubaensis Verbleibende Aktivität nach der Vorbehandlung 30 min bei
  • Es ist ersichtlich, daß wärmebehandelte C. antarctica-Lipase überaus thermostabil ist, und zwar selbst bei 80ºC. Wärmebehandelte C. tsukubaensis-Lipase ist stabil bis 70ºC.
    • Beispiel 36 Kontinuierlicher Esteraustausch
  • Immobilisierte Lipase aus Beispiel 20 wurde bei 60ºC mit einem Substratgemisch aus gleichen Volumina der mittleren Fraktion von Palmöl und Sojabohnenöl verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen denen von Beispiel 33.
  • Auslaßproben wurden durch HPLC analysiert, und die Durchflußgeschwindigkeit wurde eingestellt, um zu versuchen, den Gehalt an Trilinolein im Auslaß nahe 6 % zu halten. Dies stellt etwa 63 % der Gleichgewichtsumwandlung dar, da der Einlaßgehalt 11,0 % betrug. Messungen wurden durchgeführt, wenn der Auslaßgehalt 6 % ± 1 % betrug.
  • Die Ergebnisse sind in Fig. 9 in der gleichen Weise wie in Fig. 8 (Beispiel 33) gezeigt. Die Durchflußgeschwindigkeit zeigt eine Variation von ungefähr ± 20 %, es zeigt sich jedoch keine Desaktivierung in ungefähr 1000 Stunden Betrieb bei 60ºC.

Claims (21)

1. Hinsichtlich der Position unspezifische Lipase, dadurch gekennzeichnet, daß sie
(1) mindestens 20 % Restaktivität nach Inkubation für 60 Minuten bei einem pH-Wert von 6,5 und 65ºC aufweist;
(2) eine optimale Aktivität bei einem pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 8 zeigt; und
(3) eine immunochemische Identität zu einer extrazellulären Lipase mit den vorstehenden Merkmalen, die von einem Stamm von Candida antarctica oder Candida tsukubaensis herrührt, gegenüber monospezifischem Kaninchenantiserum, zeigt.
2. Lipase nach Anspruch 1, wobei der Stamm ein C. antarctica-Stamm ist.
3. Lipase nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Stamm um C. antarctica DSM 3855, DSM 3908, DSM 3909, CBS 5955, CBS 6678 oder CBS 6821 handelt.
4. Lipase nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem Stamm um C. antarctica DSM 3855 handelt.
5. Lipase nach Anspruch 4, die ein Molekulargewicht von etwa 43 kD und einen isoelektrischen Punkt von etwa 8,0 aufweist.
6. Lipase nach Anspruch 4, die ein Molekulargewicht von etwa 33 kD und einen isoelektrischen Punkt von etwa 6,0 aufweist.
7. Lipase nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Candida-Stamm um C. tsukubaensis CBS 6389 handelt.
8. Lipase nach einem der vorstehenden Ansprüche in immobilisierter Form.
9. Lipase nach Anspruch 8, wobei die immobilisierte Lipase eine Halbwertszeit der Lipaseaktivität bei 60ºC von mehr als 1000 Stunden bei der kontinuierlichen Umesterung aufweist.
10. Lipase nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Lipase durch Adsorption an einem schwach-basischen Anionenaustauschharz oder an einem Adsorbensharz immobilisiert ist.
11. Verfahren zur Herstellung einer Lipase nach Anspruch 1, wobei das Verfahren (1) das aerobe Kultivieren eines Lipase-bildenden Candida- Stamms, der aus der aus C. antarctica und C. tsukubaensis bestehenden Gruppe ausgewählt ist, in einem geeigneten Nährmedium und (2) die Isolierung der Lipase aus dem Kulturmedium umfaßt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem Stamm um C. antarctica DSM 3855, DSM 3908, DSM 3909, CBS 5955, CBS 6678 oder CBS 6821 handelt.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, das ferner das Erwärmen der isolierten Lipase für 1 bis 3 Stunden auf etwa 60ºC umfaßt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, das ferner das Immobilisieren der isolierten Lipase umfaßt.
15. Verwendung der Lipase nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in einem Lipase-katalysierten Verfahren zur Hydrolyse eines Esters, zur Synthese eines Esters oder zur Umesterung eines Esters.
16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Lipase in immobilisierter Form vorliegt.
17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei es sich bei dem Verfahren um ein kontinuierliches Verfahren handelt.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei es sich bei dem Ester um ein Triglycerid handelt.
19. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei es sich bei der Lipase um eine Lipase nach Anspruch 3 handelt.
20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei es sich bei dem Verfahren um eine Umesterung handelt und es sich bei der Lipase um eine Lipase nach Anspruch 5 handelt.
21. Verwendung nach Anspruch 19, wobei es sich bei dem Verfahren um eine Estersynthese handelt und es sich bei der Lipase um eine Lipase nach Anspruch 6 handelt.
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