JP4917349B2 - リパーゼ活性の回復方法 - Google Patents
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Description
具体的には、不活性有機溶媒の存在下または非存在下、エステル交換反応時に分散リパーゼ粉末粒子の90%以上を1〜100μmの範囲の粒子径に保つように、エステルを含有する原料にリパーゼ粉末を分散させてエステル交換反応を行う方法が提案されている(特許文献6)。又、リン脂質および脂溶性ビタミンを含む酵素溶液を乾燥して得た酵素粉末を用いることが提案されている(特許文献7)。
一方、酵素であるリパーゼは高価であるため、反応終了後回収して繰り返し使用し、リパーゼ活性がかなり低下した場合に初めて廃棄されている。しかしながら、低下したリパーゼ活性を回復させることができれば、リパーゼの使用効率が格段に向上するので、工業的見地から、リパーゼ活性を回復させる有効な方法の開発が望まれている。
本発明は、又、回復したリパーゼ活性を有する固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物を用いるエステル化方法及びエステル交換方法を提供することを目的とする。
すなわち、本発明は、担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径1μm以上で300μm未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後、トリアシルグリセロールで洗浄することを特徴とするリパーゼ活性の回復方法を提供する。
本発明は、又、担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径1μm以上で300μm未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後、反応系から分離し、トリアシルグリセロールで洗浄してリパーゼ活性を回復させた後、この固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物を用いてエステル化反応又はエステル交換反応を行うことを特徴とするエステル化反応又はエステル交換反応方法を提供する。
このような固定化リパーゼを粉砕品とするには、通常の粉砕機を用いて、1μm以上で300μm未満の平均粒子径、好ましくは平均粒子径1〜200μm、より好ましくは平均粒子径1〜100μm、特に好ましくは平均粒子径20〜100μmとなるように粉砕するのがよい。ここで、粉砕機としては、乳鉢、せん断摩擦式粉砕機、カッター式粉砕機、石臼(マイコロイダー、マスコロイダー)、コーヒーミル、パワーミル、ピンミル、衝撃式粉砕機(ハンマーミル、ボールミル)、ロール式粉砕機及び気流式粉砕機、ホモジナイザー、超音波破砕機などがあげられる。
上記リパーゼ粉砕品とろ過助剤との質量比は、1/10〜10/1であるのが好ましく、特に1/7〜2/1であるのが好ましい。
ここで用いる長鎖脂肪酸トリグリセリド及び中鎖脂肪酸トリグリセリドとしては、後述の固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物の洗浄の項に記載のものを用いるのが好ましい。
長鎖脂肪酸トリグリセリドと中鎖脂肪酸トリグリセリドとを、質量比にして、95:5〜50:50の割合で使用するのが好ましく、リパーゼの全質量に対して2倍〜100倍の質量のトリグリセリドを接触させるのが好ましい。
上記固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物を用いるエステル化反応としては、該固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物の存在下に、油脂のエステル化反応を行い、次いで固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物を回収しリサイクルするのが好ましい。
しかしながら、このようなリパーゼ粉末組成物や固定化リパーゼを、リサイクルして何回もエステル化反応やエステル交換反応に使用すると、使用回数に応じて、エステル化能やエステル交換能といったリパーゼ活性が低下する。
本発明は、このようなリパーゼ活性が低下した固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物を特定の条件で洗浄すると、リパーゼ活性が回復し、又、上記リパーゼ粉末組成物については、向上したリパーゼ活性と使用しやすさ(操作性)とを長い期間利用し続けることを可能とするものである。
本発明で対象とする固定化リパーゼやリパーゼ活性が低下したリパーゼ粉末組成物としては、初期の活性に対して少しでも低下したものを対象とすることができるが、工業的見地から、初期の活性(100%)が70〜50%に低下したものを対象とするのが好ましい。
ここで用いる長鎖脂肪酸トリグリセリドとしては、構成脂肪酸の炭素数が14〜24のトリグリセリドであるのが好ましく、特に菜種油、大豆油、ヒマワリ油、紅花油、コーン油からなる群から選ばれる植物油であるのが好ましい。
中鎖脂肪酸トリグリセリドとしては、構成脂肪酸の炭素数が6〜12のトリグリセリドであるのが好ましい。このような脂肪酸トリグリセリドは、公知の製法で製造することもできるし、市販品を使用することもできる。市販品としては、例えば日清オイリオグループ(株)から商品名ODOで販売されている。
長鎖脂肪酸トリグリセリドと中鎖脂肪酸トリグリセリドとを、質量比にして、95:5〜50:50の割合で使用するのが好ましく、リパーゼの全質量に対して好ましくは2倍〜100倍、より好ましくは5〜50倍の質量のトリグリセリドを接触させるのがよい。
特に、洗浄に用いるトリアシルグリセロールとしては、エステル交換をするための原料油であるのが好ましい。
接触、具体的には、攪拌は10〜45℃が好ましく、特に好ましくは室温で、好ましくは2時間以上、より好ましくは10時間以上、特に好ましくは12時間〜48時間行うのがよい。尚、所望により48時間以上行ってもよい。
攪拌を行うのに用いる攪拌機は特に限定されないが、羽根攪拌機、マグネチックスターラー、スリーワンモーターなどを用いるのが好ましい。
このようにして、固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物中のリパーゼをトリアシルグリセロールに十分接触させた後、常法によりろ過してトリアシルグリセロールから固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物を分離し、再度エステル化やエステル交換反応に使用する。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
(1)ノボザイムズA/S社製リポザイムTL-IM(平均粒子径800μm) 1Kgをホソカワミクロン(株)社製のピンミル(ファインインパクトミル100UPZ)を用い、17600rpmにて粉砕した。粉砕したリパーゼ粒子径を堀場製作所社製の粒度分布計LA-500を用いて測定したところ、平均粒子径は13.8μmであった。この粉末にろ過助剤としてセルロースパウダー(日本製紙ケミカル:平均粒子径30μm)を1kg加えてリパーゼ粉末組成物とした。
(2)このようにして得られたリパーゼ組成物5gに対して菜種脱色油90gおよびODO(日清オイリオグループ(株)社製:中鎖脂肪酸トリグリセリド)10gを添加して室温で、24時間攪拌した後、ろ過してリパーゼ組成物を回収した。このリパーゼ組成物のエステル交換活性を下記の方法で測定したところ、粉砕前のリポザイムTL-IMの活性を100とした場合の相対活性は714であった。
トリオレインとトリカプリリンを1:1(w)の割合で混合した油に、リパーゼ組成物を添加し60℃で反応させた。経時的に10μlをサンプリングし、ヘキサン1.5mlで希釈後、リパーゼ組成物をろ過した溶液をガスクロマトグラフフィー(GC)用サンプルとした。GC(カラム:DB-1ht)で分析し下式より反応率を求めた。GC条件は、カラム温度:初期150℃、昇温:15℃/分、最終370℃である。
反応率(%)={C34area/(C24area+C34area)}×100
式中、C24はトリカプリリン、C34はトリカプリリンの1つの脂肪酸がオレイン酸に置き換わったものを示し、areaはそれらのエリア面積である。各時間における反応率の基づき、解析ソフト(origin ver.6.1)により反応速度定数k値を求めた。
リパーゼ活性はリポザイムTL-IMのk値を100とした時の相対活性で表した。
(3)菜種脱色油(日清オイリオグループ(株)社製)85g、およびODO(日清オイリオグループ(株)社製)15gに上記(2)で得られたリパーゼ組成物1質量%を添加して60℃で、19時間攪拌しエステル交換反応を行った。エステル交換率を経時的に求め、反応の進行を確認した。尚、エステル交換反応は、ガスクロマトグラフィーを用いてグリセリド組成を分析し、測定試料中におけるエステル交換反応物の比率を算出して求めた。
反応後リパーゼ組成物をろ過して回収し、その回収したリパーゼ組成物を繰り返しエステル交換反応に用いた。繰り返し反応を数回行い、相対比で反応率の変化を確認したものを図1に示す。
図1に示されている結果から、合計反応時間が約82時間に達すると、リパーゼ組成物のリパーゼ活性が約60%に低下することがわかる。
図2に示されている結果から、活性が低下したリパーゼ組成物を攪拌洗浄することにより、リパーゼ活性が当初の100%に回復し、リパーゼ組成物をリサイクルして何回も使用できることがわかる。
(2-1)実施例1の(1)で得られたリパーゼ組成物5gに対して菜種脱色油90gおよびODO(日清オイリオグループ(株)社製)10gを添加して60℃、2時間攪拌した後、ろ過してリパーゼ組成物を回収した。このリパーゼ組成物のエステル交換活性を実施例1と同様の方法で測定したところ、相対活性は557であった。
(2-2)大豆油100g、および大豆極度硬化油(横関油脂工業(株)社製)25gに、上記(2-1)で得たリパーゼ組成物1.2質量%添加し、70℃にて120時間反応させた後、ろ過にてリパーゼ組成物を回収した。回収したリパーゼ組成物の一部を実施例1と同様にリパーゼ活性を測定した(2-2a)。先に回収したリパーゼ組成物をアセトンに分散させろ過後、そのろ過ケーキを再び回収し、菜種脱色油:ODO(日清オイリオグループ(株)社製)=9:1(w)の混合油50gに分散後、室温にてろ過することにより)洗浄・置換しリパーゼ組成物を回収した。このリパーゼ組成物のエステル交換活性を実施例1と同様の方法で測定し(2-2b)、得られた活性を相対値で表1に示す。
リパーゼ製剤質量当たりの
相対エステル交換活性
粉砕前 (TL-IM) 100
(2-1) 557
(2-2a) 11
(2-2b) 200
菜種脱色油(日清オイリオグループ(株)社製)85g、およびODO(日清オイリオグループ(株)社製)15gにリポザイムTL-IM(固定化リパーゼ:ノボザイムズA/S社製)5質量%添加して60℃で、19時間攪拌しエステル交換反応を行った。エステル交換率を経時的に求め、反応の進行を確認した。尚、エステル交換反応は、ガスクロマトグラフィーを用いてグリセリド組成を分析し、測定試料中におけるエステル交換反応物の比率を算出して求めた。
反応後上記固定化リパーゼをろ過して回収し、その回収した固定化リパーゼを繰り返しエステル交換反応に用いた。繰り返し反応を数回行い、相対比で反応率の変化を確認したものを図3(3-1)に示す。
相対活性が60%程度に低下した上記固定化リパーゼをろ過して回収し、その回収した固定化リパーゼに菜種脱色油(日清オイリオグループ(株)社製)18g、およびODO(日清オイリオグループ(株)社製)2gに添加して室温で24時間攪拌した。ろ過により固定化リパーゼを回収後、再び上記操作(3-1)を繰り返しエステル交換反応を行った。相対比で反応率の経時変化を確認したものを図3(3-2)に示す。
Claims (8)
- 担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径1μm以上で300μm未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後、エステル交換をするための原料油であるトリアシルグリセロールであって、液体状態のトリアシルグリセロールと10〜45℃で接触させて洗浄することを特徴とするリパーゼ活性の回復方法。
- トリアシルグリセロールが中鎖脂肪酸トリグリセリドを含む請求項1記載の方法。
- 洗浄を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後の固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物をトリアシルグリセロール中に攪拌して分散させ、次でトリアシルグリセロールから分離することにより行う請求項1又は2記載の方法。
- 担体がシリカである請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 粉砕品の平均粒子径が1〜200μmである請求項1〜4のいずれか1項の方法。
- ろ過助剤がセルロースである請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- ろ過助剤が平均粒子径10〜90μmの粉状である請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径1μm以上で300μm未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後、反応系から分離し、エステル交換をするための原料油であるトリアシルグリセロールであって、液体状態のトリアシルグリセロールと10〜45℃で接触させて洗浄してリパーゼ活性を回復させた後、この固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物を用いてエステル化反応又はエステル交換反応を行うことを特徴とするエステル化反応又はエステル交換反応方法。
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