TWI398521B - 脂肪酶活性的回復方法 - Google Patents

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Description

脂肪酶活性的回復方法
本發明係有關特定之固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物之酯化能或交酯化能等之脂肪酶活性的回復方法以及使用該回復之固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物進行酯化反應或油脂交酯化反應之方法者。
脂肪酶廣泛使用在脂肪酸等之各種羧酸與一元醇或多元醇等醇類之酯化反應、複數羧酸酯間之交酯化反應等。其中，交酯化反應係應用於動植物類油脂之重組，以及各種脂肪酸之酯、糖酯、或類固醇之製造方法的重要技術。此等反應的觸媒可使用油脂分解酵素之脂肪酶，於室溫至約70℃左右的溫和條件下進行交酯化反應，和以往的化學反應相比，不僅可抑制副反應及降低能源成本，而且由於作為觸媒之脂肪酶為天然物因此安全性也高。此外，依據該受質特異性或位置特異性而能以優良的效率生產目的物。但是，一般而言，將脂肪酶粉末直接使用於交酯化反應時常無法充分地表現活性，原本水溶性的脂肪酶要均勻地分散於油性原料中相當困難，其回收也相當困難。因此，以往通常係將脂肪酶固定於某些載體，例如陰離子交換樹脂(專利文獻1)、酚吸附樹脂(專利文獻2)、疏水性載體(專利文獻3)、陽離子交換樹脂(專利文獻4)、鉗合樹脂(專利文獻5)等，然後再使用於酯化反應或交酯化反應。
然而，將脂肪酶固定化於載體時，脂肪酶的活性會降 低，因此開發了使用脂肪酶粉末的各種技術。
具體而言，有人提案在非活性有機溶劑的存在下或不存在下，於進行交酯化反應時將分散脂肪酶粉末粒子的90%以上確保其粒徑在1至100μm之範圍，而將脂肪酶粉末分散在含酯原料中進行交酯化反應的方法(專利文獻6)。此外，亦有人提案使用將含有磷脂質及脂溶性維他命的酵素溶液乾燥所得之酵素粉末(專利文獻7)。
另一方面，由於酵素之脂肪酶係高價產品，因此反應結束後進行回收而重複使用，直到脂肪酶活性降至相當低時才廢棄。然而，如果能夠使活性降低的脂肪酶之活性回復，脂肪酶的使用效率將顯著地提升，從工業上的角度而言，相當期望開發出使脂肪酶活性回復之有效方法。
專利文獻1：日本國特開昭60-98984號公報
專利文獻2：日本國特開昭61-202688號公報
專利文獻3：日本國特開平2-138986號公報
專利文獻4：日本國特開平3-61485號公報
專利文獻5：日本國特開平1-262795號公報
專利文獻6：日本國特許2668187號公報
專利文獻7：日本國特開2000-106873號公報
本發明之目的在於提供一種能使活性降低之脂肪酶回復其活性的方法。
此外，本發明之目的在於提供一種使用具有回復脂肪酶活性的固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物之酯化方法或 交酯化方法。
本發明係根據以下知識而完成者，亦即，針對含有特定之固定化脂肪酶或該固定化脂肪酶之粉碎物、與助濾劑而成的脂肪酶粉末組成物，於其脂肪酶活性降低者以三酸甘油酯洗淨，便能回復至初期的脂肪酶活性。
亦即，本發明係提供一種脂肪酶活性的回復方法，其特徵為：含有被載體固定化之來自嗜熱真菌屬的脂肪酶或被載體固定化之來自嗜熱真菌屬的脂肪酶之平均粒徑為1μm以上而未滿300μm之粉碎物、及助濾劑的脂肪酶粉末組成物在使用於酯化反應或交酯化反應後，以三酸甘油酯(triacylglycerol)予以洗淨。
此外，本發明係提供一種酯化反應或交酯化反應，其特徵為：含有被載體固定化之來自嗜熱真菌屬的脂肪酶或被載體固定化之來自嗜熱真菌屬的脂肪酶之平均粒徑為1μm以上而未滿300μm之粉碎物、及助濾劑的脂肪酶粉末組成物在使用於酯化反應或交酯化反應後，從反應系統中予以分離，並以三酸甘油酯洗淨使脂肪酶的活性回復，然後再使用該固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物進行酯化反應或交酯化反應。
本發明使用之脂肪酶係為來自嗜熱真菌屬者，係固定化至載體之脂肪酶，該載體以二氧化矽為佳。在本發明可將此直接使用，或將該脂肪酶粉碎至1μm以上而未滿300μm後使用。在此，於二氧化矽載體固定化之該脂肪酶的 平均粒徑宜為300μm至1000μm左右。如此固定化之脂肪酶例如Lipozyme TL-IM可由Novozyme A/S公司取得。
製作此固定化脂肪酶之粉碎物可藉使用一般粉碎機實施，宜粉碎成1μm以上而未滿300μm之平均粒徑，較好為平均粒徑1至200μm，更宜為平均粒徑1至100μm，最好是平均粒徑20至100μm。在此，使用之粉碎機可例舉如乳缽、剪切摩擦式粉碎機、刀片式粉碎機、微粒化機(mycolloider、masscolloider)、咖啡磨粉機、破碎式磨粉機(power mill)、針盤式磨粉機(pin mill)、衝擊式磨碎機(錘磨機、球磨機)、輥式磨碎機以及氣流式磨碎機、均質機、超音波破碎機等。
當本發明使用之脂肪酶為上述粉碎物時，較好是和助濾劑組合使用為佳。作為助濾劑可例舉如矽鈣石(celite)等之無機助濾劑及纖維素等有機助濾劑，尤以有機高分子助濾劑為佳，其中以纖維素為佳，適合者可例舉如日本製紙CHEMICALS(株)之商品名為KC FLOCK之商品。助濾劑以粉狀為佳，平均粒徑為10至90μm為佳。
上述脂肪酶粉碎物與助濾劑的質量比以1/10至10/1為佳，尤以1/7至2/1為佳。
本發明使用之上述固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物雖可直接使用於交酯化反應或酯化反應，但藉由使其與長鏈脂肪酸三酸甘油酯(triglyceride)和中鏈脂肪酸三酸甘油酯接觸，接著進行採取，則可進行精製，同時能使脂肪酶活性提升。
作為在此使用之長鏈脂肪酸三酸甘油酯與中鏈脂肪酸三酸甘油酯較好係使用記載於後述之固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物之洗淨項目中者為佳。
將長鏈脂肪酸三酸甘油酯與中鏈脂肪酸三酸甘油酯以質量比95：5至50：50的比例使用為佳，使相對於脂肪酶之全質量2倍至100倍質量之三酸甘油酯接觸為佳。
使用上述固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物進行酯化反應時，較好是在該固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物的存在下進行油脂的酯化反應，接著再將固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物回收再利用為佳。
尤其是上述脂肪酶粉末組成物，由於其脂肪酶活性提升，且使酯化反應或交酯化反應之易使用性(操作性)提升，而且可循環使用於此等反應，因此可適用於工業規模之油脂的交酯化等之油脂的改質。
然而，若將如此之脂肪酶粉末組成物或固定化脂肪酶經數次回收再利用於酯化反應或交酯化反應時時，會隨著使用次數而降低所謂酯化能或交酯化能之脂肪酶活性。
本發明係將如此之脂肪酶粉末組成物或固定化脂肪酶以特定條件洗淨，使脂肪酶活性回復，而且，上述脂肪酶粉末組成物係可長時間持續提升其脂肪酶活性與易使用性(操作性)之產品。
作為本發明對象的固定化脂肪酶或脂肪酶活性降低之脂肪酶粉末組成物，雖可將相對於初期活性稍微降低者作為對象，但從工業上的角度來看，以初期活性(100%)降低 至70至50%者作為對象為佳。
在此，作為用以洗淨固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物而使用的三酸甘油酯以在室溫下為液狀者為佳。尤其是以使用精製上述脂肪酶組成物所使用之長鏈脂肪酸三酸甘油酯與中鏈脂肪酸三酸甘油酯的混合物為佳。
作為在此使用之長鏈脂肪酸三酸甘油酯，係以構成脂肪酸之碳數為14至24的三酸甘油酯為佳，尤以從菜籽油、大豆油、葵花油、紅花油、玉米油所構成之群集中選出之植物油為佳。
作為在此使用之中鏈脂肪酸三酸甘油酯，係以構成脂肪酸之碳數為6至12的三酸甘油酯為佳。如此之脂肪酸三酸甘油酯，可為公知方法可製造者，亦可使用市售商品。市售商品可例舉如日清Oillio group之商品名為ODO之商品。
將長鏈脂肪酸三酸甘油酯與中鏈脂肪酸三酸甘油酯之質量比以95：5至50：50的比例為佳。使脂肪酶與其相對全質量為2倍至100倍質量，較宜為5至50倍質量之三酸甘油酯接觸為佳。
尤其是作為用於洗淨之三酸甘油酯，以作為進行交酯化之原料油為佳。
洗淨處理係使固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物中的脂肪酶與上述三酸甘油酯充分接觸的方式進行為佳。具體而言，藉由在三酸甘油酯中將使用於酯化反應或交酯化反應後之固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物進行攪拌並使其 分散，接著從三酸甘油酯中分離的方式進行。
接觸，具體而言，係於10至45℃攪拌為佳，尤以室溫為佳，以2小時以上為佳，以10小時以上為更佳，尤以12小時至48小時的方式進行為佳。另外，依據期望亦可進行48小時以上。
用以進行攪拌的攪拌機雖無特別限定，但以使用葉片攪拌器、電磁攪拌器、攪拌震盪器為佳。
以此方式，使固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物中的脂肪酶充分接觸三酸甘油酯後，藉由一般方法過濾而從三酸甘油酯中分離出固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物，然後再度使用於酯化或交酯化反應。
(發明的效果)
根據本發明，關於將脂肪酶使用於各種反應而造成脂肪酶活性降低者，直到目前為止都是廢棄不用，但藉由本發明的方法，由於能使脂肪酶活性回復，而能延長脂肪酶的使用壽命，且能降低使用脂肪酶製造之製品的成本，因此本發明從工業上的角度來看有很大的優點。
以下，藉由實施例詳細地說明本發明。
實施例1
(1)使用HOSOKAWA MICRON(株)公司製造之針盤式磨粉機以17600rpm將Novozyme A/S公司生產之Lipozyme TL-IM(平均粒徑800μm)1Kg磨碎。使用堀場公司製造之粒度分布計LA-500測定磨碎後之脂肪酶粒徑，測得平均粒徑為13.8μm。於該粉末中加入1kg作為助濾劑之纖維 素粉(日本製紙CHEMICALS：平均粒徑30μm)，作為脂肪酶粉末組成物。
(2)於上述所得之脂肪酶組成物5g中添加脫色菜籽油90g及ODO[日清Oillio group(株)公司製造：中鏈脂肪酸三酸甘油酯]10g，在室溫下攪拌24小時後，過濾回收脂肪酶組成物。將此脂肪酶組成物的交酯化活性以下述方法測定之。結果發現，以磨碎前之Lipozyme TL-IM的活性定為100時，測得之相對活性為714。
(脂肪酶活性的測定方法)
在三油酸甘油酯和三辛酸甘油酯之1：1(w)比例的混合油中，添加脂肪酶組成物後於60℃進行反應。定時採樣10μl，以己烷1.5ml稀釋後，將濾除脂肪酶組成物之溶液作為氣相層析(GC)之分析樣品。以GC(管柱：DB-1ht)分析並依下式求得反應率。GC條件為管柱溫度：初期150℃、升溫：15℃/分鐘、最終370℃。
反應率(%)={C34area/(C24area+C34area)}×100
算式中，C24表示三辛酸甘油酯、C34表示三辛酸甘油酯的1個脂肪酸被油酸置換者，area為該等的區域面積。根據各時間之反應率，藉由解析軟體(origin ver.6.1)求得反應速率常數k。
脂肪酶活性係以將Lipozyme TL-IM之活性定為100時的相對活性來表示。
(3)於脫色菜籽油(日清Oillio group(股)公司製造)85g及ODO(日清Oillio group(股)公司製造)15g中添加上述(2)所 得之脂肪酶組成物1質量%，於60℃攪拌19小時進行交酯化反應。定時求得交酯化率並確認反應的進行。又，交酯化反應係使用氣相層析法分析甘油酯的組成，將測定樣品中之交酯化反應物中的比例算出。
將反應後的脂肪酶組成物過濾回收，使用該回收之脂肪酶組成物重複進行交酯化反應。進行數次的重複反應，以相對比確認反應率之變化，結果如第1圖所示。
由第1圖的結果發現，當合計反應時間到達82小時時，脂肪酶組成物之脂肪酶活性會降低至約60%。
(4)在上述(3)中，將相對活性降低至約60%的脂肪酶組成物過濾回收，於該回收之脂肪酶組成物中添加脫色菜籽油(日清Oillio group(股)公司製)18g及ODO(日清Oillio group(股)公司製)2g，於室溫使用電磁攪拌器攪拌24小時。過濾回收脂肪酶組成物，再和上述(3)一樣重複進行交酯化反應。以相對比但確認反應率變化之結果，如第2圖所示。
由第2圖的結果發現，藉由攪拌洗淨活性降低的脂肪酶組成物，可使脂肪酶活性回復至當初的100%，並可將脂肪酶回收重複使用許多次。
實施例2
(2-1)於實施例1之(1)所得之脂肪酶組成物5g中添加脫色菜籽油90g及ODO(日清Oillio group(股)公司製)10g，於60℃攪拌2小時後，過濾回收脂肪酶組成物。將該脂肪酶組成物之交酯化活性依實施例1相同之方法測定，結果測 得其相對活性為557。
(2-2)在大豆油100g及大豆極高度氫化油(橫關油脂工業(股)公司製)25g中添加上述(2-1)所得之脂肪酶組成物1.2質量%，於70℃反應120小時後，過濾回收脂肪酶組成物。將回收之脂肪酶的一部分依實施例1一樣地測定脂肪酶活性(2-2a)。將上述回收的脂肪酶組成物分散於丙酮中，然後過濾，將濾餅再次回收，並分散於脫色菜籽油：ODO(日清Oillio group(股)公司製)=9：1(w)的混合油50g中，藉由在室溫過濾的方式而進行洗淨/置換，而回收脂肪酶組成物。將該脂肪酶組成物之交酯化活性依實施例1相同的方法測定(2-2b)，所得之活性以相對值表示，結果如表1所示。
實施例3
在脫色菜籽油(日清Oillio group(股)公司製)85g及ODO(日清Oillio group(股)公司製)15g中添加Lipozyme TL-IM(固定化脂肪酶：Novozyme A/S公司製)5質量%，於60℃攪拌19小時進行交酯化反應。定時求得交酯化率並確認反應的進行。又，交酯化反應率係使用氣相層析法分析 甘油酯的組成，藉由測定試料中之交酯化反應物的組成比例算出。
將反應後之上述脂肪酶組成物過濾回收，使用該回收之脂肪酶組成物重複進行交酯化反應。進行數次的重複反應，並以相對比值確認反應率之變化，結果如第3圖(3-1)所示。
將相對活性降低至約60%的脂肪酶組成物過濾回收，於該回收之固定化脂肪酶組成物中添加脫色菜籽油(日清Oillio group(股)公司製)18g及ODO(日清Oillio group(股)公司製)2g，於室溫攪拌24小時。過濾回收固定化脂肪酶組成物，再重複上述操作(3-1)進行交酯化反應。以相對比值確認反應率之變化。結果如第3圖(3-2)所示。
第1圖示使用脂肪酶粉末組成物進行交酯化反應時間隨時間造成之交酯化活性的降低[實施例1(3)]。
第2圖示將交酯化活性降低的脂肪酶粉末組成物藉由本發明方法洗淨後達成之交酯化活性的回復。
第3圖示將交酯化活性降低之固定化脂肪酶藉由本發明方法洗淨後達成之交酯化活性的回復。

Claims (10)

  1. 一種脂肪酶活性的回復方法，其特徵為：含有被載體固定化之來自嗜熱真菌屬(Thermomyces)的脂肪酶或被載體固定化之來自嗜熱真菌屬的脂肪酶之平均粒徑為1μm以上而未滿300μm之粉碎物、及助濾劑的脂肪酶粉末組成物在使用於酯化反應或交酯化反應後，於10至45℃以三酸甘油酯(triacylglycerol)予以洗淨。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該三酸甘油酯係在室溫為液狀者。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該三酸甘油酯係含有中鏈脂肪酸三酸甘油酯者。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中，該三酸甘油酯係用作交酯化之原料油。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中，該洗淨處理係藉由將酯化反應或交酯化反應後之固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物在三酸甘油酯中進行攪拌並使其分散，然後再從三酸甘油酯中分離者。
  6. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中，該載體係二氧化矽。
  7. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中，該粉碎物的平均粒徑係1至200μm。
  8. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中，該助濾劑係纖維素。
  9. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中，該 助濾劑係平均粒徑為10至90μm之粉末。
  10. 一種酯化反應或交酯化反應之方法，其特徵為：含有被載體固定化之來自嗜熱真菌屬的脂肪酶或被載體固定化之來自嗜熱真菌屬的脂肪酶之平均粒徑為1μm以上而未滿300μm之粉碎物、及助濾劑的脂肪酶粉末組成物在使用於酯化反應或交酯化反應後，從反應系統中予以分離，並於10至45℃以三酸甘油酯洗淨使脂肪酶的活性回復後，再使用該固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物進行酯化反應或交酯化反應。
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