WO2007132775A1 - リパーゼ活性の回復方法 - Google Patents

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Junko Suzuki
Yoshie Yamauchi
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Definitions

  • the present invention relates to a method for recovering lipase activity such as various esterification ability and transesterification ability of a specific immobilized lipase or lipase powder composition, and an esterification using the recovered immobilized lipase or lipase powder composition. It is related to the soot reaction and the transesterification of fats and oils.
  • Lipases are widely used in esterification reactions of various carboxylic acids such as fatty acids with alcohols such as monoalcohols and polyhydric alcohols, and transesterification reactions between a plurality of carboxylic acid esters. Of these, transesterification is an important technology for the production of various fatty acid esters, sugar esters and steroids, including the modification of animal and vegetable fats and oils.
  • lipase an oil and fat hydrolase, as a catalyst for these reactions, it is possible to carry out transesterification under mild conditions at room temperature to about 70 ° C. Compared with conventional chemical reactions, side reactions
  • the lipase as a catalyst is a natural product.
  • the target product can be produced efficiently due to its substrate specificity and position specificity.
  • lipase has conventionally been treated with some kind of carrier such as anion-exchanged resin (Patent Document 1), phenol-adsorbed resin (Patent Document 2), hydrophobic carrier (Patent Document 3), cation-exchanged resin (Patent Document). 4) In general, it is immobilized on chelate rosin (Patent Document 5) or the like and used for esterification or transesterification.
  • carrier such as anion-exchanged resin (Patent Document 1), phenol-adsorbed resin (Patent Document 2), hydrophobic carrier (Patent Document 3), cation-exchanged resin (Patent Document).
  • ester in the presence or absence of an inert organic solvent, ester is contained so that 90% or more of the dispersed lipase powder particles are maintained at a particle size in the range of 1 to LOO ⁇ m during the transesterification reaction.
  • a method of transesterifying by dispersing lipase powder in the raw material It has been proposed (Patent Document 6). It has also been proposed to use enzyme powder obtained by drying an enzyme solution containing phospholipids and fat-soluble vitamins (Patent Document 7).
  • the enzyme lipase is expensive, it is recovered after the completion of the reaction and repeatedly used, and is discarded only when the lipase activity is reduced. However, if the lowered lipase activity can be recovered, the use efficiency of the lipase will be improved significantly. From an industrial point of view, development of an effective method for recovering the lipase activity is desired.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-98984
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 61-202688
  • Patent Document 3 JP-A-2-138986
  • Patent Document 4 JP-A-3-61485
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 1-262795
  • Patent Document 6 Japanese Patent No. 2668187
  • Patent Document 7 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-106873
  • An object of the present invention is to provide a method capable of recovering reduced lipase activity.
  • Another object of the present invention is to provide an esterification method and a transesterification method using an immobilized lipase or lipase powder composition having recovered lipase activity.
  • the present invention relates to a lipase powder composition
  • a lipase powder composition comprising a specific immobilized lipase or a pulverized product of the immobilized lipase in combination with a filter aid. This is based on the knowledge that lipase activity can be restored.
  • the present invention relates to a lipase derived from Thermomyces genus immobilized on a carrier or a lipase derived from Thermomyces genus immobilized on a carrier and having an average particle diameter of 1 ⁇ m or more and less than 300 m, and a filter aid.
  • a method for recovering lipase activity characterized in that a lipase powder composition containing an agent is used for esterification reaction or transesterification and then washed with triacylglycerol.
  • the present invention also provides a lipase derived from Thermomyces genus immobilized on a carrier or a lipase derived from Thermomyces genus immobilized on a carrier and having an average particle diameter of 1 ⁇ m or more and less than 300 ⁇ m and a filter aid.
  • the lipase powder composition containing the agent is used in the esterification reaction or transesterification reaction, it is separated from the reaction system, washed with triacylglycerol to recover the lipase activity, and then this immobilized lipase or lipase is recovered.
  • a method for esterification reaction or transesterification characterized by carrying out esterification reaction or transesterification reaction using a powder composition.
  • the lipase used in the present invention is a lipase derived from Thermomyces sp. And immobilized on a carrier, preferably a silica carrier.
  • a carrier preferably a silica carrier.
  • the lipase can be used as it is, or the lipase pulverized to an average particle size of 1 ⁇ m or more and less than 300 m can be used.
  • the average particle size of the lipase immobilized on a silica carrier is preferably about 300 to 1000 ⁇ m.
  • Such an immobilized lipase can be obtained as, for example, Lipozyme TL-IM from Novozymes A / S.
  • a pulverizer a mortar, a shear friction pulverizer, a cutter pulverizer, a stone mill (my colloider, masco mouth ider), a coffee mill, a power mill, a pin mill, an impact pulverizer (a non-mer mill, a ball mill), a roll Pulverizer, airflow pulverizer, homogenizer, and ultrasonic crusher.
  • the lipase targeted in the present invention is the above pulverized product, it is preferably used in combination with a filter aid.
  • filter aids include inorganic filter aids such as celite and organic filter aids such as fibers such as cellulose and pulverized products thereof. Among them, organic filter aids, especially organic polymer filter aids are preferred, but cellulose and the like are preferred. Nippon Paper Chemicals Co., Ltd. has been marketed under the trade name KC Flock, etc. It can be given as a thing.
  • the filter aid is also preferably in the form of a powder and preferably has an average particle size of 10 to 90 m.
  • the mass ratio of the lipase pulverized product to the filter aid is preferably 1/10 to: LO / 1, particularly preferably 1/7 to 2/1.
  • the above-mentioned immobilized lipase lipase powder composition used in the present invention is a force S that can be used as it is in an ester exchange reaction or esterification reaction of fats and oils. Then, by collecting it, it can be purified and at the same time the lipase activity can be improved.
  • long-chain fatty acid triglyceride and the medium-chain fatty acid triglyceride used here those described in the section of washing the immobilized lipase lipase powder composition described later are preferably used.
  • the mass ratio of long-chain fatty acid triglycerides and medium-chain fatty acid triglycerides is preferably 2 to 100 times the total mass of lipase, which is preferably used in a ratio of 95: 5 to 50:50. It is preferable to contact triglycerides.
  • an oil esterification reaction is performed in the presence of the immobilized lipase lipase powder composition, and then the immobilized lipase lipase powder composition is recovered. It is preferable to recycle.
  • the lipase powder composition described above has improved lipase activity and improved ease of use (operability) in esterification reactions and transesterification reactions, and can be recycled for use in these reactions. Therefore, it can be suitably used for the modification of fats and oils by transesterification of fats and oils on an industrial scale.
  • the lipase activity is recovered, and the lipase powder composition described above has improved lipase activity and use. Ease of use (operability) can be used for a long period of time.
  • the lipase powder composition in which the immobilized lipase lipase activity targeted in the present invention is reduced it is possible to target those that have decreased even a little with respect to the initial activity, From an industrial point of view, it is preferable to target those whose initial activity (100%) has dropped to 70-50%.
  • the triacylglycerol used for washing the immobilized lipase lipase powder composition is preferably liquid at room temperature.
  • the long-chain fatty acid triglyceride used here is preferably a triglyceride having 14 to 24 carbon atoms in the constituent fatty acid, and particularly a group power consisting of rapeseed oil, soybean oil, castor oil, safflower oil, and corn oil is also selected. Preference is given to vegetable oil.
  • the medium-chain fatty acid triglyceride is preferably a triglyceride having from 12 to 12 carbon atoms of the constituent fatty acid.
  • a fatty acid triglyceride can be produced by a known production method, or a commercially available product can be used.
  • the long chain fatty acid triglyceride and the medium chain fatty acid triglyceride are used in a mass ratio of 95: 5 to 50:50, preferably 2 to 100 times the total mass of lipase. More preferably, the triglyceride having a mass of 5 to 50 times is contacted.
  • triacylglycerol used for washing is preferably a raw material oil for transesterification.
  • the washing is performed so that the lipase in the immobilized lipase lipase powder composition is sufficiently in contact with the above triacyl darrol. Specifically, the washing is performed after the esterification reaction or the transesterification reaction.
  • the immobilized lipase lipase powder composition is dispersed by stirring in triacylglycerol and then separated by triacylglycerol force.
  • stirring is preferably performed at 10 to 45 ° C., particularly preferably at room temperature, preferably 2 hours or more, more preferably 10 hours or more, and particularly preferably 12 hours to 48 hours. If desired, it may be performed for 48 hours or longer.
  • the stirrer used for stirring is not particularly limited, but a blade stirrer, a magnetic stirrer, a three-one motor, or the like is preferably used.
  • the lipase in the immobilized lipase lipase powder composition is sufficiently brought into contact with triacyldaricerol, and then filtered by a conventional method to separate the fixed lipase lipase powder composition from triacylglycerol. Used for esterification and transesterification.
  • the lipase activity is reduced by using the lipase in various reactions.
  • the lipase activity can be recovered by the method of the present invention. Since the lifetime can be extended and the cost of a product manufactured using lipase can be reduced, the present invention has a great merit from an industrial point of view.
  • Lipozyme TL-IM average particle size 800 ⁇ m
  • IKg manufactured by Novozymes
  • a / S was pulverized at 17600 rpm using a pin mill (fine impact mill 100 UPZ) manufactured by Hosokawa Micron.
  • the pulverized lipase particle size was measured using a particle size distribution analyzer LA-500 manufactured by Horiba, the average particle size was 13.8 ⁇ m.
  • 1 kg of cellulose powder (Nippon Paper Chemicals: average particle size 30 ⁇ m) was added as a filter aid to make a lipase powder composition.
  • a lipase composition was added to an oil in which triolein and tricaprylin were mixed at a ratio of 1: 1 (w) and reacted at 60 ° C.
  • a sample of 101 was sampled over time, diluted with 1.5 ml of hexane, and the solution obtained by filtering the lipase composition was used as a sample for gas chromatography (GC).
  • GC gas chromatography
  • Analyzed by GC column temperature: initial 1 50 ° C, temperature rise: 15 ° C / min, final 370 ° C.
  • C24 indicates tricaprylin
  • C34 indicates that one fatty acid of tricaprylin is replaced by oleic acid
  • area is the area of those areas.
  • the lipase activity was expressed as relative activity when the k value of Lipozyme TL-IM was 100.
  • the lipase composition having a relative activity reduced to about 60% in (3) above is collected by filtration, and the collected lipase composition is rapeseed decolorized oil (Nisshin Oilio Group, Inc.) 18 g) and 2 g of ODO (Nisshin Oillio Group Co., Ltd.) were added and stirred at room temperature for 24 hours using a magnetic stirrer. After recovering the lipase yarn and the product by filtration, the transesterification was repeated again in the same manner as in (3) above.
  • Figure 2 shows the results of confirming the change in the reaction rate with the relative ratio.
  • the lipase composition with reduced activity can be recovered by stirring and washing so that the lipase activity is restored to the original 100%, and the lipase composition can be recycled and used several times.
  • Rapeseed bleaching oil (Nisshin Oillio Group Co., Ltd.) 85g, and ODO (Nisshin Oillio Doop Co., Ltd.) 15g Lipozyme TL-IM (immobilized lipase: Novozymes A / S) 5 quality
  • the transesterification was carried out by adding 19% and stirring at 60 ° C for 19 hours. The transesterification rate was obtained over time, and the progress of the reaction was confirmed.
  • the transesterification reaction was determined by analyzing the glyceride composition using gas chromatography and calculating the ratio of the transesterification product in the measurement sample.
  • FIG. 1 shows a decrease in ester exchange activity over time when a transesterification reaction is performed using a lipase powder composition (Example 1 (3)).

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Abstract

　担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径1μｍ以上で300μｍ未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後、トリアシルグリセロールで洗浄することを含むリパーゼ活性の回復方法。この方法によると、効率的に低下したリパーゼ活性を回復させることができる。

Description

明 細 書
リパーゼ活性の回復方法
技術分野
[0001] 本発明は、特定の固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物の各種エステルイ匕能や エステル交換能などのリパーゼ活性を回復させる方法及び回復させた固定化リパー ゼ又はリパーゼ粉末組成物を用いるエステルイ匕反応や油脂のエステル交換方法な どに関するものである。
[0002] (発明の背景）
リパーゼは、脂肪酸などの各種カルボン酸とモノアルコールや多価アルコールなど のアルコール類とのエステル化反応、複数のカルボン酸エステル間のエステル交換 反応などに幅広く使用されている。このうち、エステル交換反応は動植物油脂類の改 質をはじめ、各種脂肪酸のエステル、糖エステルやステロイドの製造法として重要な 技術である。これらの反応の触媒として、油脂加水分解酵素であるリパーゼを用いる と、室温ないし約 70°C程度の温和な条件下でエステル交換反応を行うことができ、従 来の化学反応に比べ、副反応の抑制やエネルギーコストが低減ィヒされるだけでなぐ 触媒としてのリパーゼが天然物であることから安全性も高い。また、その基質特異性 や位置特異性により目的物を効率良く生産することができる。ところが、一般的にリバ ーゼ粉末をそのままエステル交換反応に用いても活性が十分に発現しないば力りか 、元来が水溶性のリパーゼを油性原料中に均一に分散させることは困難であり、その 回収も困難である。このため、従来はリパーゼを何らかの担体、たとえば陰イオン交 換榭脂 (特許文献 1)、フエノール吸着榭脂 (特許文献 2)、疎水性担体 (特許文献 3) 、陽イオン交換榭脂 (特許文献 4)、キレート榭脂 (特許文献 5)等に固定化してエステ ルイ匕やエステル交換反応などに用いることが一般的である。
[0003] し力しながら、リパーゼを担体に固定ィ匕すると、リパーゼ活性が低下してしまうので、 リパーゼ粉末を用いた各種技術が開発されてきた。
具体的には、不活性有機溶媒の存在下または非存在下、エステル交換反応時に 分散リパーゼ粉末粒子の 90%以上を 1〜： LOO μ mの範囲の粒子径に保つように、ェ ステルを含有する原料にリパーゼ粉末を分散させてエステル交換反応を行う方法が 提案されている (特許文献 6)。又、リン脂質および脂溶性ビタミンを含む酵素溶液を 乾燥して得た酵素粉末を用いることが提案されて 、る (特許文献 7)。
一方、酵素であるリパーゼは高価であるため、反応終了後回収して繰り返し使用し 、リパーゼ活性が力なり低下した場合に初めて廃棄されている。し力しながら、低下し たリパーゼ活性を回復させることができれば、リパーゼの使用効率が格段に向上する ので、工業的見地から、リパーゼ活性を回復させる有効な方法の開発が望まれてい る。
[0004] 特許文献 1 :特開昭 60— 98984号公報
特許文献 2：特開昭 61 - 202688号公報
特許文献 3 :特開平 2— 138986号公報
特許文献 4：特開平 3 - 61485号公報
特許文献 5：特開平 1― 262795号公報
特許文献 6 :特許第 2668187号公報
特許文献 7：特開 2000— 106873号公報
発明の開示
[0005] 本発明は、低下したリパーゼ活性を回復させることができる方法を提供することを目 的とする。
本発明は、又、回復したリパーゼ活性を有する固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組 成物を用いるエステル化方法及びエステル交換方法を提供することを目的とする。
[0006] 本発明は、特定の固定化リパーゼ又は該固定化リパーゼの粉砕物をろ過助剤と併 用してなるリパーゼ粉末組成物について、リパーゼ活性が低下したものをトリアシルグ リセロールで洗浄すると、初期のリパーゼ活性を回復させることができるとの知見に基 づ 、てなされたものである。
すなわち、本発明は、担体に固定ィ匕されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は 担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径 1 μ m以上で 30 0 m未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反 応又はエステル交換反応に用いた後、トリァシルグリセロールで洗浄することを特徴 とするリパーゼ活性の回復方法を提供する。 本発明は、又、担体に固定ィ匕されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体 に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径 1 μ m以上で 300 μ m未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応 又はエステル交換反応に用いた後、反応系から分離し、トリァシルグリセロールで洗 浄してリパーゼ活性を回復させた後、この固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物 を用いてエステルイ匕反応又はエステル交換反応を行うことを特徴とするエステルイ匕反 応又はエステル交換反応方法を提供する。 発明を実施するための最良の形態
[0007] 本発明で用いるリパーゼは、サーモマイセス属 (Thermomyces sp.)由来のものであ つて、担体、好ましくはシリカ担体に固定ィ匕されたリパーゼである。本発明ではこれを そのまま使用するか、又は該リパーゼを 1 μ m以上で 300 m未満の平均粒子径に粉 砕したものを使用することができる。ここで、シリカ担体に固定ィ匕された該リパーゼの 平均粒子径は 300〜1000 μ m程度であるのが好ましい。このような固定化リパーゼは 、例えば、ノボザィムズ A/S社からリポザィム TL-IMとして入手することができる。 このような固定化リパーゼを粉砕品とするには、通常の粉砕機を用いて、 l /z m以上 で 300 μ m未満の平均粒子径、好ましくは平均粒子径 1〜200 μ m、より好ましくは平 均粒子径 1〜100 μ m、特に好ましくは平均粒子径 20〜100 μ mとなるように粉砕する のがよい。ここで、粉砕機としては、乳鉢、せん断摩擦式粉砕機、カッター式粉砕機、 石臼（マイコロイダー、マスコ口イダー）、コーヒーミル、パワーミル、ピンミル、衝撃式 粉砕機 (ノヽンマーミル、ボールミル）、ロール式粉砕機及び気流式粉砕機、ホモジナ ィザ一、超音波破砕機などがあげられる。
[0008] 本発明で対象とするリパーゼが上記粉砕品である場合、ろ過助剤と組み合わせて 用いるのが好ましい。ろ過助剤としてはセライトなどの無機ろ過助剤及びセルロース などの繊維やその粉砕物などの有機ろ過助剤があげられる。これのうち、有機ろ過助 剤、特に有機高分子ろ過助剤が好ましぐなかでもセルロースなどが好ましぐ 日本 製紙ケミカル (株)から商品名 KCフロックで発売されて 、るもの等が好ま 、ものとし てあげられる。ろ過助剤も粉状であるのが好ましぐ平均粒子径 10〜90 mであるの が好ましい。 上記リパーゼ粉砕品とろ過助剤との質量比は、 1/10〜： LO/1であるのが好ましぐ 特に 1/7〜2/1であるのが好ましい。
[0009] 本発明で用いる上記固定化リパーゼゃリパーゼ粉末組成物は、そのまま油脂のェ ステル交換反応やエステルイ匕反応に用いることができる力 S、長鎖脂肪酸トリグリセリド と中鎖脂肪酸トリグリセリドとを接触させ、次いで採取することにより、精製することがで き、同時にリパーゼ活性を向上させることができる。
ここで用いる長鎖脂肪酸トリグリセリド及び中鎖脂肪酸トリグリセリドとしては、後述の 固定化リパーゼゃリパーゼ粉末組成物の洗浄の項に記載のものを用いるのが好まし い。
長鎖脂肪酸トリグリセリドと中鎖脂肪酸トリグリセリドとを、質量比にして、 95 : 5〜50 : 5 0の割合で使用するのが好ましぐリパーゼの全質量に対して 2倍〜 100倍の質量のト リグリセリドを接触させるのが好まし 、。
上記固定化リパーゼゃリパーゼ粉末組成物を用いるエステルイ匕反応としては、該 固定化リパーゼゃリパーゼ粉末組成物の存在下に、油脂のエステル化反応を行い、 次いで固定化リパーゼゃリパーゼ粉末組成物を回収しリサイクルするのが好ましい。
[0010] 特に、上記リパーゼ粉末組成物は、リパーゼ活性が向上しており、かつエステルイ匕 反応やエステル交換反応における使用しやすさ（操作性）が向上し、リサイクルしてこ れらの反応に使用することができるので、工業的規模での油脂のエステル交換など による油脂の改質に好適に用いることができる。
し力しながら、このようなリパーゼ粉末組成物や固定化リパーゼを、リサイクルして何 回もエステルイ匕反応やエステル交換反応に使用すると、使用回数に応じて、エステ ルイ匕能やエステル交換能といったリパーゼ活性が低下する。
本発明は、このようなリパーゼ活性が低下した固定化リパーゼゃリパーゼ粉末組成 物を特定の条件で洗浄すると、リパーゼ活性が回復し、又、上記リパーゼ粉末組成 物については、向上したリパーゼ活性と使用しやすさ (操作性)とを長い期間利用し 続けることを可能とするものである。
本発明で対象とする固定化リパーゼゃリパーゼ活性が低下したリパーゼ粉末組成 物としては、初期の活性に対して少しでも低下したものを対象とすることができるが、 工業的見地から、初期の活性（100%)が 70〜50%に低下したものを対象とするの が好ましい。
[0011] ここで、固定化リパーゼゃリパーゼ粉末組成物を洗浄するために用いるトリァシルグ リセロールとしては、室温で液状であるのが好ましい。特に、上述したリパーゼ粉末組 成物を精製するのに用いる長鎖脂肪酸トリグリセリドと中鎖脂肪酸トリグリセリドの混合 物を用いるのが好ましい。
ここで用いる長鎖脂肪酸トリグリセリドとしては、構成脂肪酸の炭素数が 14〜24のトリ グリセリドであるのが好ましぐ特に菜種油、大豆油、ヒマヮリ油、紅花油、コーン油か らなる群力も選ばれる植物油であるのが好まし 、。
中鎖脂肪酸トリグリセリドとしては、構成脂肪酸の炭素数力 ¾〜12のトリグリセリドであ るのが好ましい。このような脂肪酸トリグリセリドは、公知の製法で製造することもできる し、市販品を使用することもできる。市販品としては、例えば日清オイリオグループ（ 株)から商品名 ODOで販売されている。
長鎖脂肪酸トリグリセリドと中鎖脂肪酸トリグリセリドとを、質量比にして、 95 : 5〜50 : 5 0の割合で使用するのが好ましぐリパーゼの全質量に対して好ましくは 2倍〜 100倍 、より好ましくは 5〜50倍の質量のトリグリセリドを接触させるのがよい。
特に、洗浄に用いるトリァシルグリセロールとしては、エステル交換をするための原 料油であるのが好ましい。
[0012] 洗浄は、固定化リパーゼゃリパーゼ粉末組成物中のリパーゼカ 上記トリァシルダリ セロールに十分接触するようにして行うのが好ましぐ具体的には、エステルイ匕反応 又はエステル交換反応に用いた後の固定化リパーゼゃリパーゼ粉末組成物をトリア シルグリセロール中に攪拌して分散させ、次でトリァシルグリセロール力 分離するこ とにより行うのが好ましい。
接触、具体的には、攪拌は 10〜45°Cが好ましぐ特に好ましくは室温で、好ましく は 2時間以上、より好ましくは 10時間以上、特に好ましくは 12時間〜 48時間行うのが よい。尚、所望により 48時間以上行ってもよい。
攪拌を行うのに用いる攪拌機は特に限定されないが、羽根攪拌機、マグネチックス ターラー、スリーワンモーターなどを用いるのが好ましい。 このようにして、固定化リパーゼゃリパーゼ粉末組成物中のリパーゼをトリァシルダリ セロールに十分接触させた後、常法によりろ過してトリァシルグリセロールから固定ィ匕 リパーゼゃリパーゼ粉末組成物を分離し、再度エステル化やエステル交換反応に使 用する。
[0013] (発明の効果）
本発明によれば、リパーゼを各種反応に用いることにより、リパーゼ活性が低下した ものについては、これまで廃棄されてきた力 本発明の方法により、リパーゼ活性を 回復させることができるので、リパーゼの使用寿命を延ばすことができ、リパーゼを用 いて製造される製品のコストを低下させることができるので、本発明は工業的見地か ら大きなメリットを有する。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
[0014] 実施例 1
(1)ノボザィムズ A/S社製リポザィム TL-IM (平均粒子径 800 μ m) IKgをホソカワミクロ ン（株）社製のピンミル（ファインインパクトミル 100UPZ)を用い、 17600rpmにて粉碎し た。粉砕したリパーゼ粒子径を堀場製作所社製の粒度分布計 LA-500を用いて測定 したところ、平均粒子径は 13.8 μ mであった。この粉末にろ過助剤としてセルロースパ ウダ一（日本製紙ケミカル：平均粒子径 30 μ m)を lkgカ卩えてリパーゼ粉末組成物とし た。
(2)このようにして得られたリパーゼ組成物 5gに対して菜種脱色油 90gおよび ODO (日 清オイリオグループ (株)社製:中鎖脂肪酸トリグリセリド） 10gを添加して室温で、 24時 間攪拌した後、ろ過してリパーゼ組成物を回収した。このリパーゼ組成物のエステル 交換活性を下記の方法で測定したところ、粉砕前のリポザィム TL-IMの活性を 100と した場合の相対活性は 714であった。
[0015] リパーゼ活件の測定方法
トリオレインとトリカプリリンを 1： 1 (w)の割合で混合した油に、リパーゼ組成物を添 加し 60°Cで反応させた。経時的に 10 1をサンプリングし、へキサン 1.5mlで希釈後、 リパーゼ組成物をろ過した溶液をガスクロマトグラフフィー（GC)用サンプルとした。 G C (カラム: DB-lht)で分析し下式より反応率を求めた。 GC条件は、カラム温度:初期 1 50°C、昇温： 15°C/分、最終 370°Cである。
反応率（％) ={C34area/(C24area+C34area)}X 100
式中、 C24はトリカプリリン、 C34はトリカプリリンの 1つの脂肪酸がォレイン酸に置き 換わったものを示し、 areaはそれらのエリア面積である。各時間における反応率の基 づき、解析ソフト（origin ver.6.1)により反応速度定数 k値を求めた。
リパーゼ活性はリポザィム TL-IMの k値を 100とした時の相対活性で表した。
(3)菜種脱色油（日清オイリオグループ (株)社製) 85g、および ODO (日清オイリオグ ループ (株)社製） 15gに上記 (2)で得られたリパーゼ組成物 1質量％を添加して 60°C で、 19時間攪拌しエステル交換反応を行った。エステル交換率を経時的に求め、反 応の進行を確認した。尚、エステル交換反応は、ガスクロマトグラフィーを用いてダリ セリド組成を分析し、測定試料中におけるエステル交換反応物の比率を算出して求 めた。
反応後リパーゼ組成物をろ過して回収し、その回収したリパーゼ組成物を繰り返し エステル交換反応に用いた。繰り返し反応を数回行い、相対比で反応率の変化を確 認したものを図 1に示す。
図 1に示されている結果から、合計反応時間が約 82時間に達すると、リパーゼ組成 物のリパーゼ活性が約 60%に低下することがわかる。
[0016] (4)上記 (3)において、相対活性が約 60%に低下したリパーゼ組成物をろ過して回収 し、その回収したリパーゼ組成物に菜種脱色油（日清オイリオグループ (株)社製） 18 g、および ODO (日清オイリオグループ (株)社製) 2gに添加して室温で、マグネチック スターラーを用いて 24時間攪拌した。ろ過によりリパーゼ糸且成物を回収後、再び上記 (3)と同様に繰り返しエステル交換反応を行った。相対比で反応率の変化を確認した 結果を図 2に示す。
図 2に示されている結果から、活性が低下したリパーゼ組成物を攪拌洗浄すること により、リパーゼ活性が当初の 100%に回復し、リパーゼ組成物をリサイクルして何回 ち使用でさることがゎカゝる。
[0017] 実施例 2
(2-1)実施例 1の (1)で得られたリパーゼ組成物 5gに対して菜種脱色油 90gおよび OD O (日清オイリオグループ (株)社製) 10gを添加して 60°C、 2時間攪拌した後、ろ過し てリパーゼ組成物を回収した。このリパーゼ組成物のエステル交換活性を実施例 1と 同様の方法で測定したところ、相対活性は 557であった。
(2-2)大豆油 100g、および大豆極度硬化油 (横関油脂工業 (株)社製) 25gに、上記 (2 -1)で得たリパーゼ組成物 1.2質量％添加し、 70°Cにて 120時間反応させた後、ろ過 にてリパーゼ組成物を回収した。回収したリパーゼ組成物の一部を実施例 1と同様に リパーゼ活性を測定した (2_2a)。先に回収したリパーゼ組成物をアセトンに分散させ ろ過後、そのろ過ケーキを再び回収し、菜種脱色油： ODO (日清オイリオグループ（ 株)社製） =9 : 1 (w)の混合油 50gに分散後、室温にてろ過することにより）洗浄 '置換 しリパーゼ組成物を回収した。このリパーゼ組成物のエステル交換活性を実施例 1と 同様の方法で測定し (2-2b)、得られた活性を相対値で表 1に示す。
表 1
リパーゼ製剤質量当たりの
相対エステル交換活性
粉砕前 （TL- IM) 100
(2- 1) 557
(2- 2a) 11
(2- 2b) 200 実施例 3
菜種脱色油（日清オイリオグループ (株)社製) 85g、および ODO (日清オイリオダル ープ (株)社製） 15gにリポザィム TL- IM (固定化リパーゼ：ノボザィムズ A/S社製) 5質 量％添加して 60°Cで、 19時間攪拌しエステル交換反応を行った。エステル交換率を 経時的に求め、反応の進行を確認した。尚、エステル交換反応は、ガスクロマトグラフ ィーを用いてグリセリド組成を分析し、測定試料中におけるエステル交換反応物の比 率を算出して求めた。
反応後上記固定化リパーゼをろ過して回収し、その回収した固定化リパーゼを繰り 返しエステル交換反応に用いた。繰り返し反応を数回行い、相対比で反応率の変化 を確認したものを図 3 (3-1)に示す。
相対活性が 60%程度に低下した上記固定化リパーゼをろ過して回収し、その回収 した固定化リパーゼに菜種脱色油（日清オイリオグループ (株)社製） 18g、および OD O (日清オイリオグループ (株)社製) 2gに添加して室温で 24時間攪拌した。ろ過によ り固定化リパーゼを回収後、再び上記操作 (3-1)を繰り返しエステル交換反応を行つ た。相対比で反応率の経時変化を確認したものを図 3 (3-2)に示す。
図面の簡単な説明
[図 1]リパーゼ粉末組成物を用いてエステル交換反応を行った場合の経時によるエス テル交換活性の低下を示す (実施例 1(3))。
圆 2]エステル交換活性が低下したリパーゼ粉末組成物を本発明により洗浄すること によりエステル交換活性が回復することを示す (実施例 1(4))。
圆 3]エステル交換活性が低下した固定化リパーゼを本発明により洗浄することにより エステル交換活性が回復することを示す (実施例 3(3- 2))。

Claims

請求の範囲
[1] 担体に固定ィ匕されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定ィ匕された サーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径 1 μ m以上で 300 μ m未満の粉砕品 及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換 反応に用いた後、トリァシルグリセロールで洗浄することを特徴とするリパーゼ活性の 回復方法。
[2] トリァシルグリセロールが室温で液状である請求項 1記載の方法。
[3] トリァシルグリセロールが中鎖脂肪酸トリグリセリドを含む請求項 1記載の方法。
[4] トリァシルグリセロール力 エステル交換をするための原料油である請求項 1〜3の いずれか 1項記載の方法。
[5] 洗浄を、エステルイ匕反応又はエステル交換反応に用いた後の固定化リパーゼ又は リパーゼ粉末組成物をトリアシルグリセロール中に攪拌して分散させ、次でトリァシル グリセロール力 分離することにより行う請求項 1〜4のいずれか 1項記載の方法。
[6] 担体がシリカである請求項 1〜5のいずれか 1項記載の方法。
[7] 粉砕品の平均粒子径カ 1〜200 μ mである請求項 1〜6のいずれ力 1項の方法。
[8] ろ過助剤がセルロースである請求項 1〜7の 、ずれか 1項記載の方法。
[9] ろ過助剤が平均粒子径 10〜90 /z mの粉状である請求項 1〜8のいずれか 1項記載 の方法。
[10] 担体に固定ィ匕されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定ィ匕された サーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径 1 μ m以上で 300 μ m未満の粉砕品 及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換 反応に用いた後、反応系から分離し、トリァシルグリセロールで洗浄してリパーゼ活性 を回復させた後、この固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物を用いてエステルイ匕 反応又はエステル交換反応を行うことを特徴とするエステルイ匕反応又はエステル交 換反応方法。
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