DE68907611T2

DE68907611T2 - Auf teilchen immobilisierte lipasezubereitung, verfahren zur herstellung und deren verwendung.

Info

Publication number: DE68907611T2
Application number: DE89912889T
Authority: DE
Inventors: Tomas Hansen; Sven Pedersen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1988-11-16
Filing date: 1989-11-15
Publication date: 1993-10-21
Anticipated expiration: 2009-11-16
Also published as: WO1990005778A1; EP0444092B1; DK638688D0; CA2003163A1; JPH04501664A; JP2873251B2; EP0444092A1; US5342768A; DE68907611D1

Description

Umfassende Forschungsaktivitäten sind darauf gerichtet worden, eine immobilisierte Lipasezubereitung zur Verfügung zu stellen, in Anbetracht der wachsenden Verwendung immobilisierter Lipasen für Umesterung. Einige der ersten industriell anwendbaren immobilisierten Lipasezubereitungen zur Umesterung sind in US-Patent Nr. 4,275,081, Spalte 7, Zeilen 28-35, beschrieben, woraus sich ergibt, daß die immobilisierten Lipasezubereitungen durch Acetonausfällung einer wäßrigen Lipaselösung auf Celite -Diatomeenerde hergestellt werden.
Die Halbwertszeit dieser immobilisierten Lipasezubereitungen ist jedoch relativ niedrig. Auch ist die erhältliche spezifische Lipaseaktivität relativ niedrig. Außerdem liegt ein Staubproblem während Lagerung und Beladung in die Säulen vor und auch sind Lösungsmittel während der Verwendung dieser immobilisierten Lipasezubereitungen nach dem Stand der Technik erforderlich.
Die Forschungsaktivitäten haben sich somit mehr oder weniger auf die Immobilisierung von Lipase auf Trägern mit hydrophoben Bindungsstellen konzentriert. Bezug kann genommen werden auf Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIV, S. 1007-1013 (1982), woraus sich ergibt, daß allgemein angenommen wird, daß bei der Herstellung von immobilisierten Lipasezubereitungen mit hoher Halbwertszeit und hoher Aktivität für industrielle Anwendungszwecke ein Träger mit hydrophoben Bindungsstellen mehr oder weniger eine conditio sine qua non sei. Bezug wird auch genommen auf das veröffentlichte dänische Patent Nr. 152763, das eine immobilisierte Lipasezubereitung mit einem Träger beschreibt, der aus einem teilchenförmigen makroporösen schwachen Anionenaustauschharz besteht, z.B. einem Harz, das zur Duolite -Reihe gehört. Trägerharze dieser Art haben hydrophobe Bindungsstellen und die Zubereitungen zeigen eine hohe Halbwertszeit und sind sehr gut geeignet für industrielle Umesterung.
Selbst diese Anionenaustauschharze haben jedoch Nachteile. Erstens sind sie sehr teuer und dies hat einen großen Einfluß auf den Preis der immobilisierten Lipasezubereitungen. Zweitens ist festgestellt worden, daß während der Verwendung in organischen Medien extrahierbare Substanzen aus den Anionenaustauschharzen in das organische Medium überführt werden, und selbst wenn die Menge der extrahierbaren Substanzen niedrig ist, stellt dies oft einen schwerwiegenden Nachteil dar, insbesondere wenn das Endprodukt des enzymatischen Verfahrens für den menschlichen Verzehr gedacht ist. Es ist möglich, die Harze vor der Immobilisierung mit organischen Lösungsmitteln zu waschen, aber dies ist ein kostspieliger Schritt.
Es besteht somit ein Bedürfnis nach einer preiswerten immobilisierten Lipasezubereitung mit hoher Halbwertszeit und der Möglichkeit hoher spezifischer Aktivität und ohne irgendeine Möglichkeit der Überführung von extrahierbaren Substanzen aus dem Träger in eine organische Phase.
Gemäß der Erfindung ist nunmehr festgestellt worden, daß das obige Bedürfnis erfüllt werden kann, wenn - gegen das Vorurteil im Hinblick auf den oben angegebenen Diatomeenerde-Träger - eine sorgfältig definierte Klasse von anorganischen Trägern verwendet wird.
Somit ist die auf Teilchen immobilisierte Lipase gemäß der Erfindung mit makroporösem Siliziumdioxid oder Silikaten als Trägermaterial durch die Tatsache gekennzeichnet, daß mehr als 90 % der Teilchen Teilchengrößen zwischen 100 und 1000 um haben, wobei mehr als 80 % der Poren in den Teilchen einen Durchmesser zwischen dem 10- und 45-fachen des Durchmessers der Lipasekügelchen aufweisen und wobei der Wassergehalt der auf Teilchen immobilisierten Lipase zwischen 1 und 20 % liegt, vorzugsweise zwischen 22 %, bevorzugter zwischen 5 und 20 %.
Aus einem Artikel in Advances in Colloid and Interface Science, 25 (1986) , 235-248, "Macroporous Silica in Chromatography and Immobilization of Biopolymers" ergibt sich, daß die maximale Kapazität für die Immobilisierung mit Enzymen bei Siliziumdioxid mit mittleren Porengrößen von dem 5- bis 10- fachen der Größe der Proteinkügelchen angetroffen wird. Überraschenderweise haben wir festgestellt, daß die maximale Kapazität für die Immobilisierung von Lipasen bei Siliziumdioxid oder Silikaten mit Porengrößen zwischen dem 10- und 45-fachen der Größe der Lipasekügelchen auftritt. Dieser Artikel konzentriert sich überhaupt nicht auf Lipase, sondern beschäftigt sich mit Enzamen im allgemeinen, sogar mit Proteinen im allgemeinen. Die Erfindung ist ausschließlich auf Teilchen immobilisierte Lipasen gerichtet, und Lipasen sind ziemlich außergewöhnliche Enzyme in dem Sinn, daß die enzymatische Aktivität auf einer Grenzschicht zwischen zwei Phasen funktioniert, was bedeutet, daß die Immobilisierung der Lipasen ein sehr heikles Problem ist, das die Brauchbarkeit bekannter Immobilisierungstechniken in dem Gebiet, das Lipaseimmobilisierung umfaßt, in hohem Maße beschränkt, s. J. lavayre et al., Preparation and Properties of Immobilized Lipases, Biotechnology and Bioengineering, vol. XXIV, S. 1007-1013 (1982), John Wiley & Sons.
Der Ausdruck "makroporös" bedeutet, daß die Poren wenigstens 250 Å im Durchmesser sind. Der Porendurchmesser wird mit Hilfe der B.E.T.-Methode gemessen.
Das in der immobilisierten Lipase gemäß der Erfindung verwendete Trägermaterial besteht aus wenigstens 65 Gew.-% Siliziumdioxid und/oder Silikaten, vorzugsweise wenigstens 90 Gew.-% Siliziumdioxid und/oder Silikaten. Auch bedeutet in dieser Beschreibung mit Ansprüchen "Siliziumdioxid oder Silikate" echtes Siliziumdioxid oder echte Silikate, d.h. Siliziumdioxid oder Silikate, die nicht derivatisiert sind.
Der Durchmesser der Lipasekügelchen kann mit Hilfe einer Röntgendiffraktionsanalyse und anderen Methoden gemessen werden, wie angegeben in "Biochemistry" von Albert L. Lehninger, 1970, Worth Publishers Inc., S. 142 -143.
Der Durchmesser der Lipasekügelchen ist im allgemeinen um die 50 Å. Somit sind die teilchenförmigen Silikagele, die in der Grace-Informationsbroschüre SG BC 1E/June 1987 (von Grace, Grace Plaza, 1114 Avenue of the Americas, New York, N.Y. 10036-7794) beschrieben sind, für den Zweck dieser Erfindung gut geeignet, da die meisten von ihnen Porendurchmesser von 500 Å oder darüber haben. Selbst wenn in der Informationsbroschüre angegeben ist, daß die Silikagele zur Immobilisierung von Zellen und Enzymen verwendet werden können, gibt es in der Broschüre keinen wie auch immer gearteten Hinweis darauf, daß die Silikagele für die Immobilisierung von Lipasen verwendet werden können, und Lipasen sind außergewöhnliche Enzyme, die im Vergleich mit anderen Enzymen einzigartige Eigenschaften im Hinblick auf Immobilisierung zeigen, wie zuvor in dieser Beschreibung erläutert.
Es ist festgestellt worden, daß das anorganische Pulver, daß in dem zuvor zitierten US-Patent Nr. 4,275,081 (Spalte 12, Zeile 48) verwendet wird, in dem Verfahren gemäß der Erfindung nicht verwendet werden kann (s. die Teilchengrößenbeschränkung in Anspruch 1) und daß Acetonausfällung mit all den begleitenden Nachteilen der einzige Weg zu sein scheint, die Lipase auf dem Celite -Pulver zu fixieren, das im US-Patent Nr. 4,275,081 verwendet wird.
Aus dem zuvor zitierten Artikel in Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIV, S. 1007-1013 (1982) ergibt sich auch, daß Lipasen auf einem Sphaerosil -Träger immobilisiert werden können, der durch Einführung von Iodopropyl-Gruppen derivatisiert ist und der ein hydrophober poröser Träger mit einem Porendurchmesser von 1250-3000 Å ist. Sphaerosil ist jedoch extrem teuer. Einer der wichtigsten Aspekte im Hinblick auf die auf Teilchen immobilisierte Lipase gemäß der Erfindung ist die Möglichkeit zur Herstellung einer preiswerten auf Teilchen immobilisierten Lipasezubereitung, wobei im Zusammenhang mit dieser eine Derivatisierung des Trägers nicht erforderlich ist.
In EP-Patent Nr. 147,914 ist eine immobilisierte Lipasezubereitung beschrieben, bei der Lipase auf einem Glasträger mit Teilchengröße 30-45 Mesh und einer mittleren Porengröße von 400 Å immobilisiert ist. Es ergibt sich jedoch auch aus EP-Patent Nr. 147,914, daß es unumgänglich ist, daß ein Kopplungsmittel vom Organotitanat-Typ für die Herstellung der immobilisierten Lipasezubereitung verwendet wird.
In Applied Microbiol. Biotechnol. 28, S. 527-30 ist eine Lipasezubereitung beschrieben, die auf einem Glasträger PG 700-80 mit einer Teilchengröße von 20-80 Mesh und einem Porendurchmesser von 700 Å immobilisiert ist. Aus Seite 528 ergibt sich jedoch, daß das Wasser vollständig entfernt wurde, und dieses stellt die bekannte immobilisierte Lipasezubereitung außerhalb des Schutzbereiches dieser Erfindung, weil die immobilisierte Lipase gemäß der Erfindung 1-20 % Wasser enthält. Dieser Unterschied hat die Folge, daß die Leistung des bekannten Produktes der Leistung der immobilisierten Lipase gemäß der Erfindung unterlegen ist.
Aus einem Aufsatz in Enzyme Microbial Technology, 1984, Vol. 6, Oktober, 443-446, ergibt sich, daß verschiedene Güteklassen von Diatomeenerde als Träger für eine immobilisierte Lipase verwendet werden können, die als ein Mittel zur enzymatischen Umesterung von Fetten gedacht ist. Diese Träger haben jedoch weit größere Porengrößen als die Porengrößen des Trägermaterials auf Teilchen immobilisierten Lipase gemäß der Erfindung. Dies bedeutet, daß die Aktivität für jede eingebrachte LU beträchtlich geringer ist als in Bezug auf die der Erfindung, wegen der beträchtlich kleineren spezifischen Oberfläche der bekannten immobilisierten Lipase. So ist in Bezug auf die bekannte immobilisierte Lipasezubereitung eine Mehrfachschicht aus Lipase auf dem Träger vorhanden, wohingegen in Bezug auf die immobilisierte Lipase gemäß der Erfindung eine Monoschicht aus Lipase auf dem Träger vorhanden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der immobilisierten Lipase gemäß der Erfindung haben mehr als 90 % der Teilchen Größen zwischen 200 und 800 um, vorzugsweise zwischen 200 und 400 um. Wenn die Teilchengröße unter 200 um liegt, wird der Druckverlust in einer Säule dazu neigen, zu groß zu sein, und wenn die Teilchengröße oberhalb 800 um ist, neigt die Diffusionshemmung dazu, zu hoch zu sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der immobilisierten Lipase gemäß der Erfindung zeigen mehr als 80 % der Poren in den Teilchen einen Durchmesser zwischen dem 12- und 40-fachen des Durchmessers der Lipasekügelchen. In diesem Porengrößenintervall ist die ausgedrückte Lipaseaktivität, gemessen in BIU/g, besonders hoch.
In einer bevorzugten Ausführungsform der immobilisierten Lipase gemäß der Erfindung ist die Lipase eine thermostabile Lipase. Auf diese Weise kann die immobilisierte Lipase in Säulen verwendet werden, die mit hoher Temperatur arbeiten, wodurch wenigstens 2 Vorteile erzielbar sind: erstens ist es möglich, die immobilisierte Lipase, z.B. zur Umesterung, ohne ein Lösungsmittel zu verwenden, wegen der relativ niedrigen Viskosität der Reaktionsmischung, zweitens wird die Reaktionsgeschwindigkeit relativ hoch sein und drittens wird die Diffusionsgeschwindigkeit von Substrat und Produkten im Inneren der Poren erhöht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der immobilisierten Lipase gemäß der Erfindung wird die Lipase durch Kultivierung eines Mikroorganismus hergestellt, der ein Gen enthält, das für eine Lipase kodiert und diese exprimiert, abgeleitet von einem Stamm von Humicola-Spezies, Candida antarctica oder Rhizomucor miehei. Diese Lipasen sind getestet worden und zeigen alle bei hoher Temperatur in einer Säule gute Leistung.
Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung einer auf Teilchen immobilisierten Lipase gemäß der Erfindung, wobei eine wäßrige Lösung einer mikrobiellen Lipase mit einem teilchenförmigen Trägermaterial, das makroporöses Siliziumdioxid oder makroporöse Silikate ist, in dem (denen) mehr als 90 % der Teilchen Größen zwischen 100 und 1000 um haben und in dem (denen) mehr als 80 % der Poren in den Teilchen einen Durchmesser zwischen dem 10- und 45-fachen des Durchmessers der Lipasekügelchen zeigen, während eines Zeitraums, der ausreicht, um die gewünschte Menge an Lipase an das Trägermaterial zu binden in Kontakt gebracht wird, woraufhin die so gebildete auf Teilchen immobilisierte Lipase von der wäßrigen Phase abgetrennt wird und die abgetrennte immobilisierte Lipase auf einen Wassergehalt von zwischen etwa 2 und 20 % getrocknet wird. Es ist festgestellt worden, daß eine Wäsche der auf Teilchen immobilisierten Lipase zwischen der Abtrennung derselben von der wäßrigen Phase und der Trocknung derselben vorteilhaft ist.
Der Zeitraum, der ausreichend ist, um die gewünschte Menge an Lipase an das Trägermaterial zu binden, variiert von Lipase zu Lipase und er kann im Bereich von zwischen ein paar Minuten und ein paar Tagen liegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung entspricht das Verhältnis zwischen der Menge der wäßrigen Lösung der mikrobiellen Lipase und dem Gewicht des Trägermaterials 10.000-500.000 LU/g Trägermaterial (Trockengewicht). Wenn die Beladung geringer als 10.000 LU/g Trägermaterial ist, neigt die Geschwindigkeit der flüssigen Reaktionsmischung durch die Kolonne dazu, zu klein zu sein, und es ist sehr schwierig, eine Beladung über 500.000 LU/g Trägermaterial zu erzielen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung weicht der pH während des Kontakts zwischen Trägermaterial und wäßriger Lösung nicht mehr als 1 pH-Einheit von dem optimalen Beladungs-pH der fraglichen Lipase im Hinblick auf exprimierte Lipaseaktivität ab. Dadurch ist die exprimierte Lipaseaktivität, gemessen in BIU/g immobilisierte Lipase, so groß wie möglich. Bezug kann genommen werden auf Fig. 1, die detaillierter im folgenden beschrieben werden wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird die Abtrennung durch einfache Filtration durchgeführt. Dies ist der einfachste und billigste Weg, die Abtrennung durchzuführen.
Die Erfindung umfaßt auch eine Verwendung der immobilisierten Lipase gemäß der Erfindung. Die Verwendung umfaßt ein Verfahren zur Umesterung von Fetten, bei dem flüssige Fette oder Fettgemische, einschließlich freier Fettsäuren oder Fettsäureestern, mit der immobilisierten Lipasezubereitung gemäß der Erfindung in Kontakt gebracht werden, ein Verfahren zur Hydrolyse von Fetten, bei dem Triglyceride und Wasser mit der immobilisierten Lipasezubereitung gemäß der Erfindung in Kontakt gebracht werden, und ein Verfahren zur Synthese von Glyceriden oder anderen Fettsäureestern, bei dem eine Mischung aus Glycerin oder substituierten Glycerinen oder anderen Arten von Alkoholen und freien Fettsäuren mit der immobilisierten Lipasezubereitung gemäß der Erfindung in Kontakt gebracht wird. In Bezug auf diese Verwendungen ist kein Lösungsmittel erforderlich, aber ein Lösungsmittel kann verwendet werden, falls erwünscht. Auch können die Verwendungen kontinuierlich, z.B. in Säulen, oder diskontinuierlich durchgeführt werden.
Die Lipaseaktivitätseinheit (LU) wird bestimmt, wie beschrieben in der Veröffentlichung AF 95.1/2.GB von 83-01-03, erhältlich von Novo Nordisk A/S, Novo Allé, DK-2880 Bagsvaerd, Dänemark.
Die Lipaseaktivität, ausgedrückt in BIU (Batch Interesterification Units), wird bestimmt, wie beschrieben in der Veröffentlichung AF 206-2, erhältlich von Novo Nordisk A/S, Novo Allé, DK-2880 Bagsvaerd, Dänemark.
Fig. 1 veranschaulicht die Abhängigkeit zwischen exprimierter Lipaseaktivität (BIU/g) und pH während Aufladung einer Lipase auf Trägermaterialien mit verschiedenen Porengrößen.
Fig. 2 zeigt den Logarithmus der Durchlaufgeschwindigkeit gegen Zeit für eine Lipase auf Trägermaterialien mit verschiedenen Porengrößen
Die Daten auf Fig. 1 hatten ihren Ursprung wie folgt. Der Siliziumdioxidträger, der ein Trägerprodukt von Grace ist, beschrieben in Biocatalyst Supports SG BC 1E/June 1987, wird mit Puffer bei dem während der folgenden Lipaseadsorptionsstufe zu verwendenden pH, d.h. bei pH 4, 4,5, 5, 6 und 7, s. Fig. 1, für eine halbe Stunde gewaschen und filtriert. Die gewünschte Menge an Lipase, welche die Lipaseaktivität ist, die zur Erzeugung einer Beladung von 186.000 LU/g ausreichend ist, wird in 5 ml entionisiertem Wasser gelöst und zu 1 g Träger zugegeben. Die Lipase wird hergestellt, wie angegeben in Beispiel 1 in der dänischen Patentanmeldung Nr. 4417/86, d.h. mit Hilfe von Humicola lanuginosa. Der pH-Wert wird eingestellt und der Träger und die Lipaselösung wird langsam durch Rotation für 2 Stunden bewegt, gefolgt von Vakuumfiltration. Das Filtrat wird auf hydrolytische Aktivität (LU/ml) analysiert, um die Menge an adsorbierter (aufgeladener) Lipase zu bestimmen. Die immobilisierte Lipase wird luftgetrocknet, der Feuchtegehalt wird auf 10 Gew.-% eingestellt und die Probe wird auf Chargenumesterungsaktivität (BIU/g) analysiert. Es ergibt sich aus dieser Darstellung deutlich, daß der Siliziumdioxidträger mit Porengröße 1500 Å (d.h. das 25-fache des Durchmessers der Lipasekügelchen, d.h. innerhalb des beanspruchten Intervalls für Porengrößen) eine hervorragende exprimierte Lipaseaktivität beim optimalen pH zeigt.
Auf Fig. 2 wurden die drei der vier immobilisierten Lipasezubereitungen aus Fig. 1, die innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen, in einer Säule in der folgenden Art und Weise getestet.
Ein System, das in Reihe aus einer Vorsäule, die Ionenaustauschharz enthält, das mit Wasser gesättigt ist, und einer Enzymsäule (die 4,5 g immobilisierte Lipasezubereitung enthält) besteht, wurde aufgebaut. Die Funktion der Vorsäule war Sättigung des Substrats mit Wasser. Ein Ölgemisch, das aus 28,6 Gew.-% Laurinsäure und 41,4 Gew.-% Sojabohnenöl bestand, wurde durch die Säulen gepumpt. Die Temperatur in den Säulen wurde bei 60ºC gehalten. Die Durchlaufgeschwindigkeit wurde eingestellt, um eine konstante Umwandlung von 14 % eingebauter Laurinsäure im Sojabohnenöl zu halten. Proben wurden 3-5mal pro Woche genommen und durch Entfernen der freien Fettsäuren und partiellen Glyceride durch Säulenchromatographie und Methylieren der Triglyceride, gefolgt von Kapillargaschromatographie der Methylester, analysiert. Die Durchlaufgeschwindigkeit, die proportional zur Aktivität ist, wurde dann gegen die Zeit aufgetragen, als die Umwandlung bei 14 % ± 1 % eingebaute Laurinsäure lag.
Aus der Darstellung können die folgende Halbwertszeit und die folgenden Anfangsaktivitäten geschätzt werden: Trägertyp Anfangsdurchlaufgeschwindigkeit (Aktivität) (g TG/h/g Lipasezubereitung) Halbwertszeit Stunden GRACE
TG ist eine Abkürzung für Triglycerid.
Auch in diesem Fall zeigte der Siliziumdioxidträger mit Porengröße 1500 Å eine gute Leistung in Bezug auf die Anfangsdurchlaufgeschwindigkeit.
Um die Signifikanz der Variation von Wassergehalten in der immobilisierten Lipasezubereitung zu belegen, wurden die folgenden Experimente durchgeführt. Immobilisierte Lipasezubereitungen wurden mit Grace 6 als dem Träger hergestellt. Die Lipase war die Lipase aus Humicola lanuginosa. Mit Ausnahme der Trocknung wurden die immobilisierten Zubereitungen hergestellt, wie in Bezug auf Fig. 1 angegeben, bei pH 4,5.
Die folgenden Aktivitäten wurden gefunden: Aktivität % Wasser BIU/g % vom Maximum
Die folgenden Beispiele veranschaulichen weiter die immobilisierte Lipase gemäß der Erfindung. Beispiel 1, 2 und 7 sind Herstellungsbeispiele; Beispiel 3, 4, 5 und 6 sind Anwendungsbeispiele und Beispiel 8 ist ein Vergleichsbeispiel.

BEISPIEL 1

2 g Träger (Grace, Porendurchmesser 700 Å, Teilchengröße 0,5-1 mm) wurden in 0,2 M Acetatpuffer mit pH 4,5 für eine halbe Stunde gewaschen und vakuumfiltriert. 400.000 LU (0,17 g Lipase aus Rhizomucor miehei, hergestellt, wie angegeben in EP 238.023, und mit einer Aktivität von 2,4 x 10&sup6; LU/g) wurden in 8 g entionisiertem Wasser gelöst und zum Träger zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 4,5 eingestellt und die Aufschlämmung aus Träger und Enzymlösung wurde langsam durch Rotation für 2 Stunden bei Raumtemperatur bewegt, gefolgt von Vakuumfiltration. Das Filtrat enthielt 2,7 x 10&sup5; LU, was einer Adsorption von 32 % entsprach. Die immobilisierte Lipase wurde in einem Vakuumofen bei 25ºC über Nacht getrocknet und der Feuchtigkeitsgehalt wurde auf 10 % eingestellt. Die Probe wurde zu 26 BIU/g analysiert.

BEISPIEL 2

1 g Träger (Grace 4, Porendurchmesser 500 Å, Teilchengröße 0,5-1 mm) wurde in 0,2 M Acetatpuffer mit pH 4,5 für eine halbe Stunde gewaschen und vakuumfiltriert. 50.000 LU (0,35 g Lipase mit einer Aktivität von 1,4 x 10&sup5; LU/g) Lipase aus Candida antarctica, hergestellt, wie in der EP- Anmeldung Nr. 87 907 098.5 angegeben, wurden in 5 ml entionisiertem Wasser gelöst und zum Träger zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 4,5 eingestellt und die Aufschlämmung aus Träger und Lipaselösung wurde langsam durch Rotation für 12 Stunden bei Raumtemperatur bewegt, gefolgt von Vakuumfiltration. Das Filtrat enthielt 19.000 LU, was einer Adsorption von 62 % entsprach. Die immobilisierte Lipase wurde luftgetrocknet und der Feuchtigkeitsgehalt auf 10 % eingestellt. Die Probe wurde zu 26 BIU/g analysiert (60ºC-Analyse ohne Lösungsmittel).

BEISPIEL 3

Hydrolyse mit immobilisierter Lipase

2,5 g immobilisierte Lipase, hergestellt, wie in Beispiel 1 in der dänischen Patentanmeldung Nr. 4117/86 angegeben, (d.h. mit Hilfe von Humicola lanuginosa), mit pH 4,5 wurden zu einem Kolben zugegeben, der Sojabohnenöl und Wasser enthielt, und bei 50ºC gerüttelt. Proben wurden genommen und der Gehalt an freier Fettsäure (Hydrolysegrad) wurde durch Titration mit KOH gemessen. Das Experiment wurde bei 25 %, 50 % und 75 % Sojabohnenölgehalt durchgeführt. Die Gesamtmenge an Öl und Wasser betrug immer 50 g. Die Ergebnisse zeigen sich aus Fig. 3. Es zeigt sich, daß der höchste Hydrolysegrad mit dem höchsten Wassergehalt erzielt wird.

BEISPIEL 4

Estersynthese mit immobilisierter Lipase

0,05 Mol (10 g) Laurinsäure und 0,05 Mol Alkohol wurden mit 5 Gew.-% immobilisierter Lipase, hergestellt, wie in Beispiel 3 beschrieben, vermischt. Die Reaktion wurde bei 60ºC durchgeführt, indem der Kolben, der das Substrat und Enzym enthielt, in Rotation versetzt wurde. Vier verschiedene Alkohole wurden verwendet: Laurylalkohol, Pentanol, Isopropanol und Propanol. Die Ergebnisse ergeben sich aus Fig. 4. Das Experiment mit Laurylalkohol wurde unter einem verringerten Druck (etwa 50 mbar) durchgeführt. Es zeigt sich aus der Darstellung, daß die höchste Umwandlung mit Laurylalkohol erreicht wird und daß das Enzym sekundäre Alkohole nicht verestern kann.

BEISPIEL 5

Kontinuierlicher Festbettbetrieb mit immobilisierter Lipase

Zwei Säulen, die jeweils 60 g immobilisierte Lipase, hergestellt, wie in Beispiel 3 beschrieben, enthielten, wurden gepackt. Die Säulen wurden in Reihe aufgebaut und die Temperatur der Säulen betrug 60ºC. Ein ähnliches Säulensystem wurde parallel aufgebaut, enthaltend stattdessen zweimal 60 g Lipozyme (eine kommerziell erhältliche immobilisierte Lipase von Novo- Nordisk A/S). Reines Sojabohnenöl wurde durch die Systeme gepumpt und rückgeführt. Die Betthöhe der zwei Systeme wurde zum Zeitpunkt 0 gemessen. Eine feststehende Durchlaufgeschwindigkeit wurde für 3 Tage verwendet, wonach der Druckabfall über die Säulen und die Betthöhe der Säulen gemessen wurden. Eine neue Durchlaufgeschwindigkeit wurde dann verwendet und die neuen Werte wurden nach drei Tagen gemessen u.s.w.. Die Ergebnisse ergeben sich aus Fig. 5. Es zeigt sich aus den Ergebnissen, daß die Lipase auf einem Siliziumdioxidträger eine bessere Enzymzubereitung als das kommerziell erhältliche Lipozyme ist, da der Druckabfall bei derselben Durchlaufgeschwindigkeit niedriger ist. Außerdem wurde beobachtet, daß keine Kompression des Betts auftrat, das den Siliziumdioxidträger enthielt, sogar nach mehr als 300 Stunden Betrieb, wohingegen die Säulen, die Lipozyme enthielten, um bis zu insgesamt 13 mm komprimiert wurden.

BEISPIEL 6

5 g Träger (Grace 6, Porendurchmesser 1500 Å, Teilchengröße 0,5-1 mm) wurden mit einer Lösung vermischt, die 250.000 LU der B-Komponente aus Candida antarctica enthielt, wie beschrieben in WO88/02775, Seite 9. Der pH-Wert wurde auf 4,5 eingestellt und die Aufschlämmung aus Träger und Lipaselösung wurde durch Rotation für 4 Stunden bei Raumtemperatur langsam bewegt, gefolgt von Vakuumtrocknung. Die Beladung der Teilchen betrug 28.100 LU/g trockener Träger. 125 mg (Trockengewicht) der immobilisierten Lipase, die etwa 2 % Wasser enthielt, wurde zur Umesterung von 40 mmol Propanol und Myristinsäure bei 60ºC verwendet. Innerhalb von 20 Minuten wurden 29,2 % Ester gebildet.

BEISPIEL 7

1 g des Silikatträgers Manville R-648 (mit mittlerem Porendurchmesser 1400 Å) wurde in 0,2 M Acetatpuffer mit pH 4,5 für eine halbe Stunde gewaschen und vakuumfiltriert. 186.000 LU (0,06 g Lipase mit einer Aktivität von 3,1 x 10&sup6; LU/g) Lipase, hergestellt, wie in Beispiel 1 der dänischen Patentanmeldung Nr. 4117/86 angegeben, d.h. mit Hilfe von Humicola lanuginosa, wurden in 5 ml entionisiertem Wasser gelöst und zum Träger zugegeben. Der pH wurde auf 4,5 eingestellt und die Aufschlämmung aus Träger und Lipaselösung wurde durch Rotation für 2 Stunden langsam bewegt, gefolgt von Vakuumfiltration. Das Filtrat enthielt 34.000 LU, was einer Adsorption von 82 % entsprach. Die immobilisierte Lipase wurde luftgetrocknet und der Feuchtigkeitsgehalt auf 10 % eingestellt. Die Probe wurde zu 14 BIU analysiert.

BEISPIEL 8

Dieses Beispiel ist ein Vergleichsbeispiel, wegen der Tatsache, daß der Porendurchmesser des Trägers geringer ist als das 5-fache des Durchmessers der Lipasekügelchen.
1 g des Trägers Amicon Matrex Siliziumdioxid-Si-Chromatographiemedium (Porendurchmesser 100 Å, Teilchengröße 190-300 um) wurde in 0,2 M Acetatpuffer mit pH 4,5 für eine halbe Stunde gewaschen und vakuumfiltriert. 186.000 LU (0,06 g Lipase mit einer Aktivität von 3,1 x 10&sup6; LU/g) Lipase (hergestellt, wie in Beispiel 1 der dänischen Patentanmeldung Nr. 4117/86 angegeben) wurden in 5 ml entionisiertem Wasser gelöst und zum Träger zugegeben. Der pH wurde auf 4,5 eingestellt und die Aufschlämmung aus Träger und Lipaselösung wurde durch Rotation für 2 Stunden langsam bewegt, gefolgt von Vakuumfiltration. Das Filtrat enthielt 50 LU, was einer Adsorption von 100 % entsprach. Die immobilisierte Lipase wurde luftgetrocknet und der Feuchtigkeitsgehalt auf 10 % eingestellt. Die Probe wurde zu 6 BIU analysiert. Der niedrige BIU-Wert zeigt, daß die immobilisierte Lipase unterlegen ist.

Claims

1. Auf Teilchen immobilisierte mikrobielle Lipase mit einem makroporösen Trägermaterial, das aus wenigstens 65 % Siliziumdioxid oder Silikaten besteht, wobei mehr als 90 % der Teilchen Teilchengrößen zwischen 100 und 1000 um haben, wobei mehr als 80 % der Poren in den Teilchen einen Durchmesser zwischen dem 10- und 45-fachen des Durchmessers der Lipasekügelchen zeigen und wobei der Wassergehalt der auf Teilchen immobilisierten Lipase zwischen 1 und 20 %, vorzugsweise zwischen 2 und 20 %, bevorzugter zwischen 5 und 20 % liegt.

2. Auf Teilchen immobilisierte Lipase nach Anspruch 1, wobei mehr als 90 % der Teilchen Größen zwischen 200 und 800 um, vorzugsweise zwischen 200 und 400 um haben.

3. Auf Teilchen immobilisierte Lipase nach Anspruch 1 oder 2, wobei mehr als 80 % der Poren in den Teilchen einen Durchmesser zwischen dem 12- und 40-fachen des Durchmessers der Lipasekügelchen zeigen.

4. Auf Teilchen immobilisierte Lipase nach den Ansprüchen 1-3, wobei die Lipase eine thermostabile Lipase ist.

5. Auf Teilchen immobilisierte Lipase nach den Ansprüchen 1-4, wobei die Lipase hergestellt ist durch Kultivierung eines Mikroorganismus, der ein Gen enthält, das für eine Lipase kodiert und diese exprimiert, abgeleitet von einem Stamm von Humicola-Spezies, Candida antarctica oder Rhizomucor miehei.

6. Verfahren zur Herstellung einer auf Teilchen immobilisierten Lipase nach den Ansprüchen 1-5, wobei eine wäßrige Lösung einer mikrobiellen Lipase mit einem teilchenförmigen Trägermaterial, das ein makroporöses Siliziumdioxid oder makroporöse Silikate ist, in dem (denen) mehr als 90 % der Teilchen Größen zwischen 100 und 1000 um haben und in dem (denen) mehr als 80 % der Poren in den Teilchen einen Durchmesser zwischen dem 10- und 45-fachen des Durchmessers der Lipasekügelchen zeigen, während eines Zeitraumes, der ausreicht, um die gewünschte Menge an Lipase an das Trägermaterial zu binden, in Kontakt gebracht wird, woraufhin die so gebildete, auf Teilchen immobilisierte Lipase von der wäßrigen Phase abgetrennt wird und die abgetrennte immobilisierte Lipase auf einen Wassergehalt zwischen 1 und 20 %, vorzugsweise zwischen 2 und 20 %, bevorzugter zwischen 5 und 20 % getrocknet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Verhältnis zwischen der Menge der wäßrigen Lösung der mikrobiellen Lipase und dem Gewicht an Trägermaterial 10.000-500.000 LU/g Trägermaterial (Trockengewicht) entspricht.

8. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der pH während des Kontaktes zwischen Trägermaterial und wäßriger Lösung nicht mehr als 1 pH-Einheit von dem optimalen Beladungs-pH der fraglichen Lipase im Hinblick auf exprimierte Lipaseaktivität abweicht.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 6-8, wobei die Abtrennung durch einfache Filtration durchgeführt wird.

10. Verfahren zur Umesterung von Fetten, wobei flüssige Fette oder Fettgemische, einschließlich freier Fettsäuren oder Fettsäureestern, mit der immobilisierten Lipasezubereitung nach den Ansprüchen 1-5 in Kontakt gebracht werden.

11. Verfahren zur Hydrolyse von Fetten, wobei Triglyceride und Wasser mit der immobilisierten Lipasezubereitung nach den Ansprüchen 1-5 in Kontakt gebracht werden.

12. Verfahren zur Synthese von Glyceriden oder anderen Fettsäureestern, wobei ein Gemisch aus Glycerin oder substituierten Glycerinen oder anderen Arten von Alkoholen und freien Fettsäuren mit der immobilisierten Lipasezubereitung nach den Ansprüchen 1-5 in Kontakt gebracht wird.