DE2714103C2

DE2714103C2 - Gelierung von mikroskopisch kleinen Zellen

Info

Publication number: DE2714103C2
Application number: DE19772714103
Authority: DE
Inventors: Taisuke Hino Tokyo Iwasaki; Toshihiko Tokyo Kikuchi
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1976-03-31
Filing date: 1977-03-30
Publication date: 1983-03-10
Also published as: DE2714103A1; JPS582674B2; JPS52120183A

Description

verschiedenen Arten enzymat'MScher Wirksamkeiten erforderlich sind, können verschiedene Arten von mikroskopisch kleinen Zellen, die jeweils die einzelnen entsprechenden Arten derartiger enzymatischer Wirkungen in den Zellen besitzen, in Kombinatton verwendet und durch die Verfahren gemäß dieser Erfindung festgelegt werden.

Der Grad der Gelierung in Abhängigkeit von den Arten der Mikroorganismen ist als Referenz in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Art des Mikroorganismus

Grad der Gelierung

Actinomycetes ++

Fungi ++

Bakterien , -

Lactobacillus +

- Gelbildung ist extrem niedrig.

+ -<■++ Es wird Gel gebildet (schwach - stark).

10

15

20

25

Der Grad der Gelierung in der Tabelle oben wurde an jeder einzelnen Type der mikroskopisch kleinen Zellen untersucht, die einzeln verwendet wurden und nach dem Verfahren gemäß dieser Erfindung gelierten.

Es kann allgemein beobachtet werden, wie aus der obigen Tabelle ersichtlich ist, daß die Gelierfähigkeit in den Mikroorganismen mit Mycelium wie Actinomycetes und Schimmelpilz hoch ist und in Hefe und Bakterien extrem niedrig isL Dementsprechend werden beim Festlegen der Enzyme, die in Hefe jder Bakterien enthalten sind, die Zellen in Mischung mit der Suspension von stark gelierenden mikroskopisch kleinen Zellen wie Actinomycetes verwendet Dann wird eine Netzstruktur unter den Zellen gebildet, um die Größe der Zellteilchen zu erhöhen und schnelles Setzen zu erzielen, wodurch es möglich wird, sie in einem Säulenpackungszustand zu bearbeiten und zu verwenden.

Es ist natürlich möglich. Mikroorganismen zu verwenden, die in ihren Zellen verschiedene enzymatisehe Wirkstoffe wie z. B. Glucose-Isomerase, 0-Galac· tosidase, Invertase, Protease und Lipase besitzen.

Beim Herstellen einer Suspension aus mikroskopisch kleinen Zellen, die enzymatische Wirkung besitzen, werden die mikroskopisch kleinen Zellen mittels einer so Zentrifugaltrennung und dergleichen von einer Kulturbouillon der Mikroorganismen abgetrennt und aufgesammelt, mit Phosphatpuffer oder dergleichen gewaschen, um die Nährbodenkomponenten zu entfernen, und dann in einem Phosphatpuffer suspendiert. Wenn zwei oder mehrere Arten von mikroskopisch kleinen Zellen verwendet werden, werden Suspensionen für jede Art der Mikroorganismen hergestellt und dann zusammengemischt oder alternativ dazu kann eine Mischung von jeder der mikroskopisch kleinen Zellen in eine Suspension umgeformt werden.

Ein Reagenz mit Vernetzungsfähigkeit wird zu der wie oben angegeben hergestellten Suspension von den mikroskopisch kleinen Zellen hinzugegeben. Hierbei kann eine große Vielfalt von Reagenzien verwendet werden, die aus denjenigen ausgewählt wird, die herkömmlicherweise für das Festlegen oder Fixieren von Enzymen durch Vernetzung verwendet wird und wobei üblicherweise Rqagenzmittel verwendet werden, die bifunktionelle Gruppen besitzen. Solche Reagenzien, die für die Erfindung verwendet werden können, umfassen z, B, Glutaraldehyd, Bis-diwobenzidin-^'-disulfonsäure, i^-pifIuor-2,4-dinitrobenzo|, Epichlorhydrin. Phenol · disulfonylchlorid.Xylol-diisoeyanat, ToIuol-diisocyanat, 2-Amino-4,6-dichIor-S-triazin, 2,4,6-Trichlor-S-trigzin und dergleichen. Die Mengen des zu der Suspension von mikroskopisch kleinen Z. Ilen hinzugegebenen Reagenzmittels werden in Abhängigkeit von der Art der mikroskopisch kleinen Zellen, der Art des intrazellulären Enzyms und insbesondere der Gelbildungsfähigkeit der mikroskopisch kleinen Zellen gesteuert.

Es wurde ein Test für die Beziehung zwischen der Konzentration des verwendeten Glutaraldehyds und dem Grad der Gelierung der mikroskopisch kleinen Zellen durchgeführt, wobei das Glutaraldehyd als ein Reagenzmittel zu der Suspension von Streptomyces sp. hinzugegeben wurde, und die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 angegeben.

Der obige Test wurde in der folgenden Weise durchgeführt

Streptomyces sp. mit Glucose · Isomerase-Aktivität wurde bebrütet unter Schütteln während zwei Tagen bei 30⁰C auf einem Nährboden, der Xylose als eine Kohlenstoffquelle enthielt. Dann wurde die erhaltene Kulturbouillon einer Zentrifugaltrennung unterworfen, um die mikroskopisch kleinen Zellen abzutrennen und aufzusammeln, die dann mit M/100 Phosphatpuffer (pH 7,0) wiederholt gewaschen wurden, bis die Nährbodenkomponenten im wesentlichen entfernt waren. 5 g Naßgewicht der so erhaltenen mikroskopisch kleinen Zellen wurden in 60 m! M/100 Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert Zu der Suspension wurde eine 25%ige Glutaraldehyd-Lösung in solch einer Menge zugegeben, daß sich verschiedene Konzentrationen, die in Tabelle 2 angegeben sind, ergaben. Dann nach dem Frieren derselben über eine Nacht in einer Codiervorrichtung wurden die gefrorenen mikroskopisch kleinen Zellen in Aceton aufgetaut und luftgetrocknel, um gelartige Zellenkoagulanzien zu bilden, die in Wasser getaucht wurden, um schwammartige gelierte Zellen zu bilden. Die Grade der Gelierung wurden dann abgeschätzt.

Tabelle 2

Glutaraldehydkonzentration (%) Grad der Gelierung

Kontrolle -

0,0025 +

0,0125 +

0,025 ++

0,05 ++

0,075 ++

0,1 ++

0,125 ++

Es wurde kein Gel gebildet.
+ - ++ Es wurde Gel gebildet (schwach -

stark).

Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich ist, können gute Gelierungsgrade mit 0,025 bis 0,1 Vol.-% Konzentration an zugegebenem Glutaraldehyd erhalten werden. Bei der Zugabe von Glutaraldehyd wurden in dem obigen Falle keine Wirkungen auf die Aktivität von intrazellulärer Glucose-Isomerase beobachtet.

Dann wurden, nachdem die Zellensuspension, «4 dem das obige Reagenzmittel wie vorstehend beschrieben hinzugegeben worden war, in einer Gefriervorrichtung oder dergleichen über Nacht oder so ähnlich gefroren worden war, die gefrorenen Zellen in einem organischen Lösungsmittel aufgetaut und luftgetrocknet, um gelartige Zellenkoagulanzien zu bilden. Das Eintauchen derselben in Wasser führte zu schwammartigem Gel mit der entsprechenden Gestalt im gefrorenen Zustand, Dementsprechend wurden durch Frieren der obigen Zellensuspension in die Form wie z.B. Zylinder, Scheiben, Platten und Würfel, gelierte Zellen erhältlich, die in der obigen entsprechenden Form fixiert waren.

Es können irgendwelche beliebigen organischen Lösungsmittel wahlweise so lange verwendet werden, als sie keine nachteiligen Wirkungen auf die enzymatische Aktivität ausüben, am besten Aceton, Methanol und Äthanol.

Es ist auch möglich, bei dieser Erfindung gelierte mikroskopisch kleine Zellen dadurch zu erhalten, daß das Reagenzmittel zu der Suspension von den mikroskopisch kleinen Zellen hinzugegeben wird, um die Zellen zuerst zu fixieren bzw. festzulegen, wobei das oben angegebene Reagenz zugegeben wird und dann die Suspension gefroren und in Wasser aufgetaut wird, anstatt das organische Lösungsmittel beim Tauen der Zellen zu verwenden. Bei diesem alternativen Verfahren werden mikroskopisch kleine Zellen, die durch die Zugabe des organischen Lösungsmittels zu der Suspension von den Zellen, die in der oben angegebenen Weise hergestellt wurde (oder durch die Zugabe der Suspension zu dem organischen Lösungsmittel), Zenirifugaltrennung oder dergleichen unterworfen, um überschüssiges organisches Lösungsmittel zu entfernen. Dann wird das obige Reagenzmittel zu den so erhaltenen nassen Zellen hinzugegeben und mit ihnen gemischt und danach gefroren und dann in Wasser aufgetaut Obgleich die so hergestellten gelierten Zellen so wie sie sind als ein fixiertes intrazelluläres Enzym verwenJet werden können, können sie nach einem weiteren Trocknen unter einer tiefen Temperatur, z. B. durch Gefriertrocknung, verwendet werden.

Wie oben bereits angegeben wurde, werden durch das Verarbeiten der enzymatisch wirksamen mikroskopisch kleinen Zellen in den kombinierten Behandlungen mit dem Vernetzungsmittel bzw. Rtagenz, der organischen Lösung und dem Frieren gemäß dieser Erfindung nicht nur die intrazellulären Enzyme fixiert, sondern die Zellen werden auch in der Netzstruktur verbunden, um eine schwammartige Konfiguration zu bilden, wodurch die intrazellulären Enzyme, die von den Zellen per se getragen werden, festgelegt werden. Darüber hinaus kai;n fixiertes intrazelluläres Enzym, das für das Säulenpackungsverfahren für die kontinuierliche Reaktion geeignet ist, für vorteilhafte industrielle Anwendungen geschaffen werden, da die gelierten Zellen wahlweise in einer Gestalt gehalten werden können, die der im gefrorenen Zustand entspricht.

Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Streptomyces sp., die von dem Boden isoliert worden waren und eine Glucose-Isomerase-Aktivität besaßen, wurden auf einen flüssigen Nährboden (pH 7,0), cjer 3% Weizenkleie, 2% Maisquellwasser und 0,024% CoCb ' 6 H?O enthielt, eingeimpft und gezüchtet, während sie 24 Stunden lang bei 30⁰C geschüttelt wurden. Danach wurden die mikroskopisch kleinen Zellen abgetrennt und aufgesammelt und dann wiederholtem Zentrifugalwaschen mit M/100 Phosphatpuffsr bei pH 7,0 unterworfen, um die Nährbodenkomponenten zu entfernen. 5 g Naßgewicht der gewaschenen mikroskopisch kleinen Zellen wurden in 60 ml Phosphatpuffer bei pH 7,0 suspendiert, wozu 0,2 ml Glutaraldehyd (als 25%ige wäßrige Lösung) hinzugeben und durchgerührt wurde, um zu mischen. Dann wurden sie in einer Gefriervorrichtung über eine Nacht lang gefroren, die koagulierten Zellen wurden in einer Acetonlösung aufgetaut und die so gebildeten gelierten Zellen wurden auf einem Filterpapier luftgetrocknet. Die gelierten Zellen zeigten eine Giucose-Isomerase-Aktivität von 0,34 Einheiten/mg.

Eine Einheit bedeutet hier die Menge des Enzyms, die in der Lage sind, nach Reaktion \üt eine Stunde lang bei 70⁰C in einer 0,1-M-Glucose-Löaung (die 0,05 M Phosphatpuffer bei pH 7,2 und 0,01 M MgSO₄ · 7 H₂O enthält) 1 mg Fructose zu erzeugen.

Beispiel 2

Die gefrorenen mikroskopisch kleinen Zellen von Streptomyces albus wurden aufgetaut und dann Zentrifugalwaschen mit M/100 Phosphatpuffer bei pH 7,0 unterworfen, bis die Nährbodenkomponenten völlig entfernt waren. Dann wurden 5 g Naßgewicht der so erhaltenen Zellen in den gleichen Verfahren geliert, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind. Dann wurden die so erhaltenen Produkte in eine Kolonne gepackt (1,5 χ 54 cm),durchdie l-M-GIucose-Lösung.dieO.OOSM MgSO₄ enthielt (gelöst in M/50 Phosphatpuffer pH 7,0), bei 70° C mit iner Volumengeschwindigkeit von 1,2 hindurchgeleitet wurde. Die Umwandlungsrate der hindurchgeleiteten Lösung in Fructose betrug 35%.

Beispiel 3

Lactobazillus bulgarcus mit einT /?-Ga!actosidase-Aktivität in den Zellen wurde auf einem Molkennährboden (pH 7,0) einen Tag lang bei 37°C gezüchtet und dann Zentrifugalwaschen mit einer Phosphatpufferlösung bei pH 7,0 unterworfen, um die Nährbodenkomponenten im wesentlichen zu entfernen. Zu 1,4 g Naßgewicht der so erhaltenen Lactobazilluszellen wurden 1/4, bezogen auf das Gewicht, gewaschene Zellen von Streptomyces sp. und 15 ml M/100 i'hosphatpuffer bei pH 7,0 hinzugegeben. Sie wurden völlig gerührt, um sie zu mischen, und weiterhin wurden 0,08 ml Glutaraldehyd (in 25%iger wäßriger Lösung) inkorporiert, sie wurden eine Nacht lang gefroren und in Aceton aufgetaut. Die so hergestellten gelierten Zellen wurden in eine Kolonne (4,Cx 1,8 cm) gepackt, durch die 10% Lactose-Lösung (pH 7,0) bei Raumtemperatur mit einer Völumengesehwindigkeit von 3,0 geleitet wurde. Die Zersetzungsrate der Lactose betrug 3OVo.

Die obige Messung für die Lactose-Zersetzung beruhte auf dem Glucostat-Verfahren.

Claims

Patentansprüche:

1, Verfahren zur Gelierung von mikroskopisch kleinen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß

a) eine Suspension aus mikroskopisch kleinen Zellen die eine enzymatische Aktivität und Gelierfähigkeit besitzen, hergestellt, ein Rea- jo genzmittel mit einer Vernetzungsfähigkeit zu der so hergestellten Suspension hinzugegeben, die entstehende Mischung gefroren wird und dann die gefrorenen Zellen in einem organischen Lösungsmittel oder in Wasser aufgetaut werden, oder

b) eine Suspension von mikroskopisch kleinen Zellen, die eine enzymatische Aktivität und Gelierfähigkeit besitzen, hergestellt, ein organisches Lösungsmittel zu dieser Suspension hinzugegeben, ein Reagenzmittel mit einer Vernetzungsfähigkeit zu den so erzeugten Zellen hinzugegeben wird, die Zellen gefroren und dann die gefrorenen Zellen aufgetaut werden.
2. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß als Suspension der mikroskopisch kleinen Zellen mit enzymatischer Aktivität und Gelierfähigkeit eine gemischte Suspension eingcsetzt wird, die mikroskopisch kleine Zellen mit einer hohen Gelierfähigkeit und mikroskopisch kleine Zellen mit einer niedrigen Gelierfähigkeit enthält

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gelierung von mikroskopisch kleinen Zellen.

Im Zusammenhang mit der Enzyme verwendenden Industrie sind in den letzten Jahren verschiedene Verfahren zum Fixieren von Enzymen auf wasserunlöslichen Trägern vorgeschlagen worden, um ihre Ersetzbarkeit zu verbessern. Dadurch sollen Enzyme festgelegt werden, die bisher als wasserlösliche Katalysatoren verwendet wurden, damit die Enzyme nicht frei in das Reaktionssubstrat diffundieren und abfließen können. Hierdurch wird nicht nur ihre Rückgewinnung und Wiederverwendung ermöglicht, es läßt sich auch eine kontinuierliche Reaktion durchführen, da sie leicht in so eine Reaktionskolonne einbringbar sind. Die bisher vorgeschlagenen Verfahren zum Festlegen der Enzyme umfassen das Fixieren eines Enzyms durch Einfangen oder Einschließen in einer gelierten wasserunlöslichen hochmolekularen Substanz (z. B. Polyaci ylamid), Koppein des Enzyms an einen wasserunlöslichen Träger (z. B. poröses Glas) oder dergleichen. Es ist jedoch z. Z. schwierig, die obengenannten Verfahren für den praktischen Gebrauch einzusetzen, da mit ihrer Anwendung auf das Fixieren von intrazellulären Enzymen die Verfahrensschritte der Ultraschallbehandlung von mikroskopisch kleinen Zellen, die derartige Enzyme enthalten. Gefrier—Auftau —Mahlen, Behandlung mil organischem Lösungsmittel, Autolyse und dergleichen erforderlich werden, um die Enzyme von den Zellen zu isolieren, wobei sowohl Probleme in dem Verfahren selbst als auch bezüglich der Wirksamkeit für die Enzymextraktion aufgeworfen werden. Die verschiedenen vorgeschlagenen Verfahren zum Fixieren von intrazellulären Enzymen, einschließlich der Kopplung von enzymatisch wirksamen mikroskopisch kleinen Zellen an andere proteinartige Substanzen, Einschluß von solchen Zellen in einem Gitter aus hochmolekularer Substanz and ähnlichem, waren jedoch bisher noch nicht zufriedenstellend.

Die Erfinder haben nun Untersuchungen unter dem Gesichtspunkt durchgeführt, daß es am wirksamsten ist, mikroskopisch kleine Zellen selbst als den Träger für intrazelluläre Enzyme zu verwenden. Sie fanden, daß die mikroskopisch kleinen Zellen schwamm- oder gelartig in eine Netzstruktur umgewandelt werden können, wenn die Suspension der mikroskopisch kleinen Zellen, in die ein Reagenzmittel mit Vernetzungsfähigkeit, insbesondere ein Reagenzmittel mit bifunktionellen Gruppen, inkorporiert worden ist, gefroren und dann in einem organischen Lösungsmittel aufgetaut wird oder wenn alternativ dazu die genannte Suspension, in die das obige Reagenzmittel inkorporiert ist, nach der Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel gefroren und aufgetaut wird, und, wenn es erforderlich ist, ein weiteres Trocknen angewendet wird.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein vorteilhaftes Verfahren zur Gelierung mikroskopisch kleiner Zellen, die — selbstverständlich intrazelluläre — Enzyme enthalten, zu schaffen.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, wie es im Anspruch 1 angegeben ist

Vorzugsweise wird als Suspension der mikroskopisch kleinen Zellen mit enzymatischer Aktivität und Gelierfähigkeit eine gemischte Suspension eingesetzt, die mikroskopisch kleine Zellen mit einer hohen Geiierfähigkeit und mikroskopisch kleine Zellen mit einer niedrigen Gelierfähigkeit enthält

Nähere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.

Zusammengefaßt liegt das Merkmal dieser Erfindung im Einfrieren der Suspension von mikroskopisch kleinen Zellen mit einer enzymatischen Aktivität und Gelierfähigkeit, die mit einem Reagenzmittel mit einer Vernetzungsfähigkeit gemischt ist und dem darauffolgenden Auftauen derselben in einem organischen Lösungsmittel oder in Wasser oder aber alternativ im Einfrieren dieser mit dem angegebenen Reagenzmittel gemischten Suspension nach einer Behandlung mit organischem Lösungsmittel, Wiederauftauen und. wenn es erforderlich ist. Anwenden eines weiteren Trocknungsschrittes.

Es ist eine große Vielzahl mikroskopisch kleiner Zellen bei der Erfindung so lange und insoweit einsetzbar, als die Zellen intrazelluläre enzymatische Aktivitäten besitzen und per se eine Gelierfähigkeit aufweisen. Da die Gelierfähigkeiten der Zellen in Abhängigkeit von der Art des Mikroorganismus und speziell von ihrem Stamm, auch in der gleichen Art, verschieden sind, ist es vorzuziehen, mikroskopisch kleine Zellen mit niedriger Gelierfähigkeit mit anderen zu mischen oder zu überziehen, die eine hohe Gelierfähigkeit besitzen, um einen Träger zu bilden, wenn man nicht Mikroorganismen eines Stammes mit einer hohen Gelierfähigkeit für sich allein einsetzt. Wenn verwendete stark gelierende mikroskopisch kleine Zellen unerwünschte intrazelluläre Enzyme besitzen, werden sie zweckmäßig nach vorhergehender Desaktivierung derartiger unerwünschter Enzyme durch eine thermische oder chemische Behandlung verwendet. Wenn andererseits fixierte Enzyme mit