DE2305232C3 - Verfahren zur Herstellung eines zell- und cholesterinfreien Enzympräparates mit Cholesterindehydrogenase-Aktivität und seine Verwendung zur Bestimmung von Cholesterin im Serum - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen definierten Gegenstände.

Der Mikroorganismus Nocardia erythropolis, der Cholesterin umsetzt, ist von der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Großbritannien, unter der Nr. 9158 erhältlich. Er wurde bei der DSM ( = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) nachhinterlegt und erhielt von der DSM die Hinterlegungsnummer 743. Wird dieser Mikroorganismus in einem Medium, das Cholesterin als einzige Kohlenstoffquelle enthält, gezüchtet, so bildet dieser Mikroorganismus ein intrazelluläres Enzym, die Cholesterindehydrogenase, die Cholesterin in Cholestenon umwandelt.

Das Enzympräparat kann daher zur Bestimmung des Cholesteringehaltes im Serum verwendet werden, wobei das Enzympräparat mit einem Serumextrakt vermischt und die Menge des durch Oxidation von Cholesterin gebildeten Cholestenons bestimmt wird.

Obwohl das Enzympräparat in flüssiger Form hergestellt wird und auch weiterverwendet wird, kann man es gegebenenfalls für die Lagerung und/oder den Transport in eine feste Form überführen, z. B. durch liinfrieren oder durch Gefriertrocknung. Dieser Feststoff wird dann vor der Verwendung wieder in die flüssige Form gebracht. Man kann aber das Enzympräparat auch in Form einer Suspension in Ammoniumsulfatlösiiiig einsetzen.

Zur Herstellung des Enzympräparates kann der Mikroorganismus in ein Salz und Cholesterin enthaltendes Medium bei pH 7 bis 8 geimpft und darin 3 bis 3V₂ Tage gezüchtet werden. Da das Cholesterin in diesem Medium praktisch unlöslich ist, muß es vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus dispergiert werden, z. B. durch Beschallung.

ίο Die derart gezüchteten Zellen werden gesammelt, z. B. durch Zentrifugieren; der günstigste Zeitpunkt wird durch Messen des Cholestenongehaltes im Medium bestimmt. Die gesammelten Zellen enthalten das restliche Cholesterin aus dem Medium.

is Gegebenenfalls kann man die Zellen bei etwa — 20° C lagern. Die Zellen werden dann, gegebenenfalls nach dem Auftauen, aufgebrochen, indem sie als Paste in einem Phosphatpuffer suspendiert werden und entweder beschallt oder tiefgefroren und durch

ao eine öffnung ausgepreßt werden. Die Zelltrümmer und die Hauptmenge des unlöslichen Chofesterins werden entfernt, z. B. durch Zentrifugieren. Man erhält einen Überstand, der Cholesterindehydrogenase-Aktivität besitzt. Dieser Überstand enthält gele-

»5 gentlich noch restliches kolloidales Cholesterin oder Cholestenon, das entfernt werden muß, z. B. durch Serien- oder Gelfiltration durch eine Kolonne aus vernetztem Dextran.

Um weitere verunreinigende Enzyme, die das Cholestenon weiter oxidieren, zu entfernen, wird das Enzympräparat mittels einer Kolonne aus vernetztem Dextran mit einer Dextran-Ionenaustauscher-Kolonne chromatographiert oder durch Ammoniumsulfat-Fällung gereinigt. Bei der Ammoniumsulfat-Fällung wird das Enzym ausgefällt und anschließend wieder in die flüssige Form gebracht. Man kann aber dem Enzympräparat auch einen Inhibitor, der die Enzyme, die das Cholestenon weiter oxidieren, jedoch nicht die Cholesterindehydrogenase hemmt, zusetzen.

Durch die Absorption des Cholestenons bei 240 μ kann die Menge des vorhandenen Cholestenons direkt bestimmt wirden, da ein gereinigtes Enzympräparat bei 240 μ eine genügend niedrige Grundabsorption hat. Man kann das Cholestenon aber auch kolorimetrisch bestimmen, z. B. als 2,4-Dinitrophenylhydrazon oder mit jeder anderen Farbreaktion des Cholestenons.

Da Cholesterin in Wasser unlöslich ist, wird ein Lösungsmittelsystem verwendet, in dem Cholesterin löslich ist, das jedoch die Aktivität der Cholesterindehydrogenase nicht hemmt. Man kann Äthanol/Dioxan verwenden.

Die Bestimmung des Cholesteringehaltes im Serum kann dadurch erfolgen, daß man

a) das Serum mit Äthanol/Dioxan inkubiert,

b) den Überstand verseift,

c) eine Probe des verseiften Überstandes mit dem Enzympräparat in einem gepufferten, Protein enthaltenden Medium inkubiert,

d) das Enzympräparat ohne Serum in dem gepufferten, Protein enthaltenden Medium inkubiert und nach der Reaktion mit einer Probe des verseiften Serumüberstandes versetzt,

e) beide Gemische je eine weitere Stunde inkubiert, den gebildeten Niederschlag abtrennt und im Überstand den Gehalt des gebildeten Cholestenons bestimmt, beispielsweise durch Messung

der Absorption bei 240 μ.

Als Protein kann man Rinderserumalbumin verwenden.

Das erfindungsgemäß erhaltene Enzympräparat kann in einer Testausrüstung enthalten sein, die außerdem noch Äthanol/Dioxan, Kaliumhydroxid für die Verseifung des Überstandes, Rinderserumalbumin und ein gepuffertes Medium enthält, wobei alle Reagentien in einer für einen einzelnen Versuch abgestimmten Menge vorhanden sind.

Das gepufferte Medium enthält das Protein. Wird das Cholestenon kolorimetrisch bestimmt, so enthält die Testausrüstung auch das 2,4-Dinitrophenylhydrazin.

Die Reagentien der Testausrüstung können entweder in kleinen Mengen für Einzelversuche oder in größeren Mengen für die automatische Analyse vorliegen.

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

Ausführungsbeispiel

13,6 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 2 g (NHJ₂SO₄ und 1 ml einer 0,5 g/l FeSO₄-Lösung werden in einem Liter destilliertem Wasser gelöst und bis auf einen pH-Wert von 7,2 mit festem Kaliumhydroxid versetzt. Je Liter Salzlösung werden 5 g Cholesterin durch Beschallung dispergiert. Dieses Medium wird mit dem Mikroorganismus Nocardia erythropolis DSM 743 (=NCIB 9158) beimpft.

Das den Mikroorganismus enthaltende Medium wird in 100-mI-Proben geteilt. Jede Probe wird geschüttelt. Der Mikroorganismus wird bei einer Temperatur von 25° C 3 bis 3V₂ Tage gezüchtet.

Das Medium wird dann bei 2° C 20 Minuten bei 12000 g zentrifugiert. Durch Messen des Cholestenongehalts in den Proben wird der dafür günstigste Zeitpunkt bestimmt. Im atigemeinen erhält man 4 bis 5 ml gepackte Zellen aus 1 Liter Medium.

Gegebenenfalls können die gesammelten Zellen bei etwa —20° C gelagert werden.

Die Zellen werden dann mit einer solchen Menge an Phosphatpuffer versetzt, daß eine Paste entsteht. Stammen die Zellen z. B. aus 600 ml Medium, so benötigt man etwa 10 ml Phosphatpuffer. Die Zellen werden entweder durch Beschallung oder durch Gefriertrocknung der Paste und Auspressen durch eine kleine öffnung, z. B. durch Vor- und Zurückpressen durch die öffnung, aufgebrochen. Die aufgebrochenen Zellen werden bei 2° C 2 Stunden bei 80000 g zentrifugiert, um die Zelltrümmer und das restliche in der Paste enthaltene und aus dem Medium stammende Cholesterin abzutrennen. Man erhält einen zellfreien Überstand.

Der Überstand enthält gegebenenfalls noch restliches kolloidales Cholesterin oder Cholestenon, das im Überstand sichtbar ist und durch Serienfiltration entfernt werden kann, z. B. durch Filtrieren des Überstandes durch eine Serie von Filtern mit abnehmender Porengröße bis zu 0,1 Mikron. Man kann den Überstand aber auch durch eine vernetzte Dextran-Kolonne filtrieren.

Auf diese Weise erhält man ein rohes Enzympräparat, das Cholcstcrindehydrogenase-Aktivität besitzt, jedoch mit weiteren Enzymen, die das Choiestenon cxidieren, verunreinigt ist.

Das rohe Präparat wird durch Ammoniumsulfat-Fällung gereinigt, indem man das Rohpräparat mit Ammoniumsulfat so lange langsam versetzt, bis sich ein Niederschlag des Enzyms bildet. Dazu muß die Lösung bis etwa 30% mit festem gemahlenen Ammoniumsulfat gesättigt sein. Ein weiteres Enzym, das auf Cholestenon wirkt, bleibt in Lösung, da zu seiner Fällung eine Sättigung von etwa 35% notwendig ist. Der gesättigte Überstand wird eine halbe Stunde bei einer

ίο Temperatur von 0 Bis 2°C stehen gelassen, dann bei 2° C bei 7840 g 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Niederschlag wird in dem Phosphatpuffer aufgenommen, wobei für den Niederschlag aus den gesammelten Zellen eines 600-ml-Kulturmediums 0,5 ml Phosphatpuffer notwendig sind.

Auf diese Weise erhält man ein zell- und cholesterinfreies, wäßriges, gereinigtes Enzympräparat mit Cholesterindehydrogenase-Aktivität, das zur Bestimmung des Cholesteringehalts im Serum geeignet

ao ist.

Zur Bestimmung des Cholesteringehalts im Serum werden zuerst 0,2 ml Serum mit 1,2 ml eines 0,9 Volumenprozent Äthanol/1,1 Volumenprozent Dioxangemisches versetzt und bei Raumtemperatur etwa eine

»5 Stunde inkubiert. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 10 Minuten bei 1100 g zentrifugiert, um das ausgefallene Protein abzutrennen. Das im Serum enthaltene Cholesterin bleibt löslich. 0,5 ml dieses Serumextrakts werden mit 0,02 ml Kaliumlauge, die 56 g Kaliumhydroxid in 100 ml destilliertem Wasser enthält, bei 37° C 55 Minuten lang verseift.

0,05 ml des verseiften Serumextrakts werden mit 0,2 ml einer Rinderserumalbuminlösung, die 7 g Rinderserumalbumin in 100 ml 0,1 m Phosphatpuffer, pH 5,8, enthält, 0,1 ml 0,1 m Phosphatpuffer, pH 5,8, und 0,05 ml Enzympräparat versetzt. Da der verseifte Serumextrakt alkalisch ist, beträgt der End-pH-Wert etwa 7 bis 7,2 und ist daher für die Inkubation des Enzympräparats geeignet.

Das Kontrollgemisch wird durch Mischen von 0,05 ml Enzympräparat, 0,2 ml einer Rinderserumalbuminlösung, die 7 g Rinderserumalbumin in 100 ml 0,1m Phosphatpuffer, pH 7,2, enthält und 0,1 ml 0,1 m Phosphatpuffer, pH 7,2, hergestellt. Die Menge an Rinderserumalbumin genügt, um das Cholesterin in Lösung und in einer für den Angriff des Enzyms geeigneten Form zu halten.

Beide Gemische werden bei 37° C je 2'/₂ Stunden lang inkubiert. Man kann das Enzym auch bei einer höheren Temperatur inkubieren, z. B. bei 50° C, um die Inkubationszeit zu verkürzen, z. B. in einem automatischen Analysengerät. Durch Zugabe von je 3 ml Isopropanol, das das Protein ausfällt und das Cholestenon extrahiert, zu den Gemischen wird die Reaktion beendet.

0,05 ml des verseiften Serumextraktes werden zu dem Kontrollgemisch zugegeben. Beide Gemische werden eine weitere Stunde bei 37° C inkubiert, dann bei Raumtemperatur 10 Minuten bei 1100 g zentrifugiert.

Die Absorption beider Gemische bei 240 μ wird gemessen, um die Menge an gebildetem Cholestenon zu bestimmen.

Das gebildete Cholestenon kann auch als 2,4-Dinitrophenylhydrazon bestimmt werden.

Claims (4)

Pate ntansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines zell- und cholesterinfreien Enzympräparates mit Cholesterindehydrogenase-Aktivitäi, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Nocardia erythropolis DSM 743 in einem Cholesterin als einzige Kohlenstoffquelle enthaltenden Medium züchtet, die Zellen aufbricht, die Zelltrümmer und das unlösliche Cholesterin abtrennt, daß man nach dem Abtrennen der Zelltrümmer und des unlöslichen Cholesterins restliches kolloidales Cholesterin oder Cholestenon, vorzugsweise durch Serien- oder Gelfiltration, entfernt, daß man sodann verunreinigende Enzyme, die das Cholestenon weiter oxydiert, mittels einer Kolonne aus veraetztem Dextran durch Ionennaustauschchromatographie oder mittels Ammoniumsulfat-Fällung entfernt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Cholesterin, vorzugsweise durch Beschallung, in einem salzhaltigen Medium dispergiert und dieses Medium mit dem Mikroorganismus beimpft.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen aus dem Medium abtrennt, als Zellenpaste in einen Phosphatpuffer suspendiert, durch Beschallung oder Gefriertrocknung oder durch Auspressen durch eine Öffnung aufbricht.

4. Verwendung des Enzympräparats nach Anspruch 1, 2 oder 3 zur Bestimmung des Cholesteringehalts im Serum, wobei das Enzympräparat mit einem Serumextrakt vermischt und die Menge des durch Oxydation von Cholesterin gebildeten Cholestenons bestimmt wird.