DE2745205A1

DE2745205A1 - Neuartiges maltaseenzym, hergestellt durch einen neuen hefepilzstamm

Info

Publication number: DE2745205A1
Application number: DE19772745205
Authority: DE
Inventors: Leo M Prof Hall
Original assignee: University of Alabama UA
Current assignee: University of Alabama UA
Priority date: 1976-11-16
Filing date: 1977-10-07
Publication date: 1978-05-24
Also published as: JPS53104791A; US4071407A; DE2745205C2; GB1559951A; JPS57105186A; AU516594B2; JPS6126359B2; FR2370791A1; FR2370791B1; AU2945277A; JPS5735634B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Maltaseenzym, auf dessen Herstellung und dessen Verwendung bei Verfahren zur Bestimmung von Amylase.

Bisher wurde angenommen, daß ein einzelner Stamm des Hefepilzes Saccharomyces nur ein einzelnes Maltaseenzym bildet. Halvorson u.a., Biochimica et Biophysica Acta, Band 67, Seiten 542 bis 553, stellten aus fünf verschiedenen Stämmen des Hefepilzes Saccharomyces Maltaseenzyme her. Durch jeden dieser Stämme wurde ein Produkt hergestellt, bei dem sich zeigte, daß es sich um die gleiche Maltaseart (oU -Glucosidaseart) handelte, denn es lassen sich bei der nach diesem Verfahren hergestellten Maltase keine Unterschiede bezüglich der Desaktivierungswärme, der elektrophoretischen Beweglichkeit, des Verhaltens bei der Chromatographie, sowohl bei Säulen mit Carboxymethylcellulose als auch mit DEAE-Cellulose, der Neutralisation mit einem spezifischen Antiserum und, was am wichtigsten ist, der

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B 8494 Substratspezifität feststellen.

Eine Anwendung, die Maltase gefunden hat, ist die Prüfung von Enzymen auf den Amylasegehalt. Mit der Amylasebestimmung ist die Messung der Geschwindigkeit verbunden, mit der durch die Amylase die Hydrolyse eines Substrats unter Bildung von Glucose katalysiert wird. Die Messung wird typischerweise unter Verwendung des Enzyms Maltase durchgeführt, um Maltose in Glucose umzuwandeln. Die Glucose wird dann durch Umsetzung mit ATP in Glucose-6-phosphat umgewandelt, und zwar in der Gegenwart des En-Äyms Hexokinase. Das Glucose-6-phosphat wird in der Gegenwart des Enzyms Glucose-6-phosphat-dehydrogenase(Leuconostoc) bei Gegenwart von NAD (Nicotinamidadenindinucleotid) unter Bildung von 6-Phosphogluconat oxidiert, wobei das NAD unter Bildung von NADH reduziert wird. Durch die Umwandlung von NAD in NADH wird die Absorption der Lösung bei 34Onm verändert. Es ist möglich, durch Messung der Veränderung in der Absorption die Reaktionsgeschwindigkeit zu messen. Der Vorgang enthält, wenn man ein Oligosaccharid als Substrat einsetzt, folgende Stufen:

(1) Oligosaccharid ^ Maltose + Maltotriose

+ kleinere Oligosaccharide

(2) Maltose + Maltotriose Glucose

(3) Glucose + ATP — _Glucose_6-_phosphat +

ADP

(4) Glucose-6-phos- Dehydrogenase\^ 6-Phosphogluconat + phat + NAD S NADH

Bei der Anwendung dieses Amylasebestimmungsverfahrens stößt man auf die Schwierigkeit, daß die bisher bekannten Maltaseenzyme auch die Hydrolyse von Oligosacchariden unter Bildung von Maltose katalysieren. Diese Reaktion führt zu einem "positiven" Resultat, das heißt, daß selbst wenn keine Amylase vorhanden ist, NAD trotzdem in NADH umgewandelt wird , wodurch die

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Absorption der Lösung verändert wird. Die Geschwindigkeit dieser Reaktion wird als Blindgeschwindigkeit bezeichnet. Die Blindgeschwindigkeit muß festgestellt werden, bevor man mit dem Amylasebestimmungstest beginnt, und sie muß berücksichtigt werden, bevor man aus der Reaktionskinetik berechnen kann, wieviel Amylase vorhanden ist. Da durch die Blindgeschwindigkeit eine mögliche Fehlerquelle eingeführt wird, werden die Lösungen zur Amylasebestimmung in einer Weise hergestellt, daß die Blindgeschwindigkeit möglichst kleingehalten wird. Durch diese Minimierung der Blindgeschwindigkeit wird die Gesamtempfindlichkeit des Amylasebestimmungsverfahrens herabgesetzt.

Demnach wird eine Methode benötigt, durch die man bei Amylasebestimmungsverfahren die Empfindlichkeit erhöhen und gleichzeitig die Blindgeschwindigkeit herabsetzen kann.

Eine Aufgabe der Erfindung ist demnach ein Amylasebestimmungsverfahren mit erhöhter Empfindlichkeit und einer niedrigen Blindgeschwindigkeit.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung eines neuartigen Maltaseenzyms aus einem neuen Stamm des Hefepilzes Saccharomyces.
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Diese Aufgabe und andere Aufgaben der Erfindung werden dadurch gelöst, daß man einen Saccharomyces-Stamm (ATCC 20 488) auf einem Nährmedium züchtet, das Maltose, Maltotriose oder Malzextrakt, aus pflanzlichen Quellen gewonnen,enthält. Das auf diese Weise hergestellte Maltaseenzym wird gewonnen und gereinig-t. Das ^so gewonnene Maltaseenzym ist von besonderem

Nutzen für die Verwendung bei Amylasebestimmungverfahren, bei denen Oligosaccharide als Substratmaterial eingesetzt werden.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Nach Züchtung einer ausgedehnten Reihe von Subkulturen auf Maltose enthaltenden Nährmedien wurde ein neuartiger Hefe-

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pilzstairan, als Saccharomyces ATCC 20 488 bezeichnet, aus einem Elternhefepilzstanun isoliert. VIenn man diesen neuen Stamm, entweder anaerob oder aerob, in einem Nährmedium, das Maltose, Maltotriose oder Malzextrakt, aus pflanzlichen Quellen wie Gerstenmalz, Maismalz, Bierwürze und ähnlichem gewonnen, enthält, züchtet, zeigt er die Fähigkeit, große Mengen des Enzyms Maltase (06-Glucosidase) zu produzieren. Selbst wenn etwa 10% des gesamten, ursprünglich in dem Nährmedium vorhandenen Kohlenhydrats in Form von Glucose vorliegt, kommt es zur Bildung des Enzyms,sofern auch Maltose, Maltotriose oder Malzextrakt im Nährmedium eingemischt sind. Dieses Ergebnis ist ganz überraschend, da bei Verwendung anderer Stämme die Gegenwart von Glucose zu einer starken Herabsetzung der Maltasebildung führt (Hestrin u.a._; Arch. Biochem.Biophys.

29,315 (1950); Nature 168,913 (1951); Spiegelman u.a., J.Gen. Physiol. 68,265 (1954) und Robertson u.a., J.Gen.Physiol. 73,186 (1957)).

Weiterhin zeigt dieser neue Hefepilzstamm eine außerordentliche Aktivität bei der Erzeugung von Maltase. Der erfindungsgemäße Hefepilzstamm hat eine große Maltaseaktivität/ die dreimal bis zehnmal sogroß istwie die anderen Hefepilzstämme, von denen bisher berichtet wurde.

Der erfindungsgemäße Hefepilzstamm wird in einem Nährmedium gezüchtet, das wenigstens einen Vertreter von Maltose, Maltotriose oder Malzextrakt enthält. Man kann handelsüblichen Malzextrakt aus verschiedenen Quellen einsetzen, vorausgesetzt, daß der Glucosegehalt 10% bis 12% des gesamten Kohlenhydratgehalts nicht übersteigt, und daß der gesamte Gehalt an Maltose und Maltotriose zusammengenommen 40% bis 90% des gesamten Kohlenhydratgehalts ausmacht. Maltose, Maltotriose oder Malzextrakt können in dem Nährmedium in Mengen zwischen 25 g/l und 75 g/l, vorzugsweise zwischen 50 g/l und 60 g/l vorhanden sein. Das Nährmedium enthält Hefenextrakt, verschiedene Metallsalze und Trypton, Pepton, NZ-Amin vom Typ A oder ähnliche enzymatische Aufschlußprodukte aus Casein oder Fleischeiweiß. Trypton ist z.B. ein pankreatisches Auf-

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Schlußprodukt aus Gasein. Auch ein Zusatz von Entschäumern, z.B. eines Entschäumers auf der Grundlage von Siliconöl wie "Antifoam Λ" oder eines Entschäumungsmittels auf der Grundlage von Lardöl kann erwünscht sein, um die Schaumbildung zu verhindern.

Geeignet ist ein Nährmedium, das Hefenextrakt, Trypton oder Pepton, Ammoniumsulfat, Kaliumphosphat,Calciumchlorid, Magnesiumsulfat, und "Antifoam A" in Wasser aufgelöst enthält.

Die Hefenextrakte sind gut bekannt und haben bei der Untersuchung von Bakterien eine weite Verwendung gefunden, da sie eine Quelle von natürlich vorkommenden Vitaminen des B-Komplexes sind. Ein solcher Hdfenextrakt ist Bacto-Hefenextrakt (durch die Firma Difco in den Handel gebracht), der den wasserlöslichen Anteil eines Hefeautolysats enthält. Dieser Extrakt ist dadurch gekennzeichnet, daß er bei einer Reaktion vom pH 6,6 sprudelnde, saubere Lösungen mit einer Konzentration zwischen 0,3% und 0,5% bildet. Dieser lief enextrakt liegt im allgemeinen in Mengen zwischen etwa 1,O g/l und etwa 5 g/l, vorzugweise zwischen etwa

2Q 2,0 g/l und etwa 3,0 g/l vor. Trypton kann in Mengen zwischen etwa 2,0 g/l und etwa 10,0 g/l, doch vorzugsweise zwischen etwa 4,0 g/l und etwa 6,0 g/l vorhanden sein. Ammoniumsulfat ((NH₄) „SO.) liegt im allgemeinen in Mengen zwischen etwa 1,0 g/l und etwa 4,0 g/l, doch vorzugsweise zwischen 1,5 g/l und etwa ²»⁵ 9/¹ vor. Das Salz Kaliumphosphat (KH₃PO₄) ist im allgemeinen in Mengen zwischen etwa 1,0 g/l und etwa 10,0 g/l, doch vorzugsweise zwischen etwa 2,0 g/l und etwa 5,0 g/l vorhanden. Die Salze Calciumchlorid und Magnesiumsulfat liegen typischerweise in Mengen zwischen etwa 0,10 g/l und etwa 0,40g/l, doch vorzugs-

3Q weise, zwischen 0,20 g/l und etwa 0,30 g/l vor. Der pH des Nährmediums liegt zwischen 5,3 und 6,8.vorzugsweise zwischen 6,0 und 6,3. Während des Wachstums der Hefezellen wird durch Zugabe von Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid je nach Bedarf, vorzugsweise ein pH zwischen 6,0 und 6,3 aufrechterhalten.

Die Hefezellen werden in dem Nährmedium gezüchtet, bis

man an Proben, die dem Nährmedium periodisch entnommen werden, die maximale Enzymaktivität beobachtet. Man kann dafür die

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bekannten Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität anwenden.

Die Temperatur des Nährmediums ist nicht entscheidend. Sie liegt typischerweise zwischen etwa 2O°C und etwa 35°C, doch vorzugsweise zwischen etwa 24°C und etwa 26 C. Auch das Lösungsmittel für das Nährmedium ist nicht entscheidend, und man kann Leitungswasser, entionisiertes Wasser oder destilliertes Wasser einsetzen, da das Nährmedium vor der Verwendung im Autoklav behandelt wird. Die Zellen werden dann unter Anwendung bekannter Verfahren wie z.B. des Schnellzentrifugierens gewonnen. Das Enzym wird dann nach einem bekannten Verfahren von den Zellen abgetrennt. Ein geeignetes Verfahren wird von Halvorson u.a. in Biochem. Biophys. Acta.,Band 30, Seite 28 (1958) beschrieben. Bei diesem Verfahren wird der Hefebrei mit Essigsäureäthylester vermischt und anschließend nach Zugabe von Wasser und Einstellung des pH auf 7,8 mit Ammoniumhydroxid autolysiert. Bei einem bevorzugten Verfahren wird der Hefebrei einen Tag bis einige Monate lang eingefroren, dann wird das Enzym ohne die Verwendung von Essigsäureäthylester von den Zellen abgetrennt, wie nachfolgend beschrieben: Der gefrorene Hefebrei wird in entionisiertem Wasser suspendiert, wobei das Wasser in einer Menge eingesetzt wird, die dem Doppelten des Gewichts des Hefebreis entspricht. Nach dem Auftauen des Breis wird der pH mit Ammoniumhydroxid auf 7,6 bis 7,9 eingestellt (das Anunoniumhydroxid ist 0,50- bis 2,0-molar, vorzugsweise 1,4-molar}, und unmittelbar darauf wird Mercaptoäthanol in einer Menge von 7,0 ml bis 7,2 ml pro kg Hefe hinzugefügt. Nach 3- bis 4-stündigem Rühren wird das Enzym Maltase abgetrennt.

Auch andere Verfahren zur Abtrennung des Enzyms von

den Zellen, wie z.E. die Schallbehandlung, die Anwendung eines osmotischen Schocks unter Verwendung von Ammoniumphosphat, die Zerkleinerung durch Schütteln oder Homogenisieren mit Glasperlen, die Autolyse mit Toluol und das Zerreißen der Zellen, indem man die Zellen unter Anwendung eines hohen Druckes durch eine Öffnung treten läßt, können angewandt werden. Jedoch ist

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keines dieser Verfahren so geeignet oder so wirtschaftlich wie das bevorzugte Verfahren. Außerdem ist zu erwarten, daß bei vielen dieser Verfahren die Enzymausbeute vermindert werden würde.

Das abgetrennte Protein (in Form des Enzyms) wird dann gereinigt. Man kann bekannte Verfahren zur Reinigung von Protein anwenden, z.B. die Fraktionierung mittels Ammoniumsulfat, mittels Äthanol oder Aceton, die Behandlung mit Protaminsulfat, die Ionenaustausch-Chromatogra^hie, die Gelfiltration, die Elektrophorese oder die Adsorptionschromatographie. Ein solches Verfahren wird von Halvorson u.a. in Biochem. Biophys.Acta, 30, 28 (1958) beschrieben. Mit diesen Verfahren ist im allgemeinen die Fraktionierung des Proteins unter Verwendung von mehreren verschiedenen Chromatographiersäulen verbunden. Das bevorzugte Verfahren ist mit der Fraktionierung des Proteins durch aufeinanderfolgende Schritte verbunden: So wird Nucleinsäure abgetrennt, indem man eine wässrige Lösung von Protaminsulfat mit einer Konzentration zwischen 0,025 g/ml und 0,07 g/ml und einem PH zwischen 6,0 und 7,5 in einer Menge zugibt, die dazu ausreicht, die Nucleinsäuren auszufällen, dabei fügt man vorzugsweise 4,0 g bis 6,0 g des in Lösung befindlichen Protamine pro Liter der Proteinlösung zu. Die resultierende Proteinlösung wird dann mit 313 g bis 494 g Ammoniumsulfat pro Liter fraktioniert.

Nach der Fraktionierung wird die Fraktion, die Maltaseaktivität zeigt,gegen eine Piperazin-HCl-Pufferlösung dialysiert. Die Anteile, die Maltaseaktivität zeigen, werden dann gesammelt und an einer DEAE-Cellulosesäule einer Ionenaustauschchromatographie unterworfen. Die Maltase wird durch Anwendung einer Chloridionenquelle in einer Pufferlösung wie z.B. einem 0,02-m-Piperazin-HCl-Puffer , der einen pH zwischen 6,0 und 7,0 hat, aus der Säule eluiert. Die Fraktion, die eine Maltaseaktivität größer als 300 000 Einheiten/500 ml zeigt, wird gesammelt.Diese gesammelten Fraktionen werden dann einer Absorptionschromatographie an Hydroxylapatit unterworfen. Dann werden die aktiven Maltasefraktionen gesammelt. Die gereinigte Maltase kann bei 4°C in

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Form einer Suspension in 75%-igem gesättigtem Ammoniumsulfat, als ein trockenes Pulver nach LyophiliSieren der Maltase die in Wasser aufgelöst wird, oder in einem verdünnten, 0,01-bis 0,05-molaren Puffer bei annähernd neutralem pH, pH 6,5 bis 7,5, aufbewahrt werden. Ein Phosphatpuffer wird bevorzugt, doch können, falls gewünscht, auch andere Puffer verwendet werden.

In einem alternativen, weniger bevorzugten Verfahren werden,falls die Zellen mittels Essigsäureäthylester aufgerissen wurden, die Zellbruchstücke durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt, werden die Nucleinsäuren durch Behandlung mit Protamin entfernt und wird der Proteinextrakt durch eine Säule laufen gelassen, die mit Sephadex G-25 gefüllt ist, das mit Piperazin-HCl-Puffer ins Gleichgewicht gebracht wurde. Das Austreten des Proteins wird unter Anwendung einer Wellenlänge von 280 nm überwacht,und das austretende Protein wird direkt auf eine mit DEAE-Cellulose gefüllte Säule aufgegeben, die in Serie mit einer Säule verbunden ist, die mit Hydroxylapatit gefüllt wurde. Die Maltase wird dann unter Verwendung eines Phosphatpuffers aus der Hydroxylapatitsäule eluiert. Das eluierte Material wird dann an einer DEAE-Cellulosesäule fraktioniert. Bei dieser Endfraktionierung wird das Material zuerst durch eine Sephadex G-25-Säule laufen gelassen. Dann läßt man das Eluat durch die DEAE-Cellulosesäule laufen. Die Fraktionen, die aktive Peaks zeigen, werden dann gesammelt. Die Fließgeschwindigkeiten und andere Parameter sind nicht entscheidend. Diese Parameter hängen von der Menge des Materials, das fraktioniert wird, und von der Säulengröße ab, und sie können leicht bestimmt werden.

Bei diesen Reinigungsverfahren werden Fremdstoffe wie Äthanol, Essigsäureäthylester, Salze, Peptide, Nucleinsäuren, Materialien, die im Nährkulturmedium vorhanden waren, Alkoholdehydrogenase, Aldehyddehydrogenase, Hexokinase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Proteasen, NADH-Oxidase und andere Proteine abgetrennt. Da der neue Hefepilzstamm frei von

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c6- und ^-Amylasen ist, war es nicht notwendig, ein Verfahren für ihre Entfernung zu entwickeln.

Die durch den neuen Saccharomyces-Stamm gebildete Maltase zeigt eine Anzahl von Eigenschaften, die die Maltese nicht hat, die unter Verwendung von anderen Hefepilzstäminen hergestellt wird. Insbesondere entspricht die gezeigte Maltaseaktivität nicht der Aktivität einer einzelnen Enzymart. Die Chromatographie an Diethylaminoethylcellulose (DEAE) ergibt

IQ z.B. mindestens zwei Enzymformen, und unter geeigneten Bedingungen sind mindestens drei Enzymformen wahrnehmbar. Bei der Adsorptionschromatographie an Hydroxylapatit stellt sich heraus, daß durch den neuen Hefepilzstamm zwei neue Hauptformen von Maltase gebildet werden. Die Elektrophorese der Enzymextrakte an Celluloseacetat zeigt mehrere Formen des aktiven Enzyms, wobei man mindestens sechs unterscheidbare Formen des Enzyms wahrnehmen kann. Die Chromatographie der aus dem neuen Hefepilzstamm isolierten Maltase an Carboxymethylcellulose unter ähnlichen Bedingungen, wie von Halvorson u.a. angewandt (beschrieben in Biochim. et Biophys. Acta, Band 67,

Seiten 42 bis 53 (1963)), zeigte, daß das Enzym nicht durch den Ionenaustauscher absorbiert wird. Auf der Grundlage von Halvorsons Arbeit war erwartet worden, daß die Maltase durch die Carboxymethylcellulose absorbiert wird. Der Umstand, daß sie nicht absorbiert wurde, zeigt, daß die Maltas aus dem neuen Hefepilzstamm sich von der Maltase unterscheiden muß, von der im Zusammenhang mit anderen Stämmen von Saccharomyces früher berichtet wurde. Durch dieses Verhalten ergibt sich eine weitere Unterstützung der Annahme, daß der erfindungsgemäße Hefepilzstamm und die durch diesen gebildete Maltase ungewöhnlich und neu sind.

Das neuartige Maltaseenzym, das durch den neuartigen Saccharomyces-Stamm gebildet wird, hydrolysiert Phenyl-Q6 -D-glucosid, p-Nitrophenyl-06-D-glucosid, p-Nitrophenyl-O^-D-maltosid und Sucrose. Von besonderer Bedeutung ist die Spezifität dieser Maltase bezüglich der Hydrolyse von Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose und der höheren Oligosaccharide.

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Durch das erfindungsgemäße Maltaseenzym wird jedes dieser Kohlenhydrate mit einer verschiedenen Geschwindigkeit hydrolysiert. Z.B. beträgt die Hydrolysegeschwindigkeit von Maltotetraose nur ein Hundertstel der Hydrolysegeschwindigkeit von Maltose. Im Vergleich mit der Hydrolysegeschwindigkeit von Maltose beträgt die Hydrolysegeschwindigkeit von Maltopentaose nur 1/500 und die Hydrolysegeschwindigkeit der höheren Oligosaccharide nur weniger als 1/1000.

Diese Eigenschaft erlaubt es, das Enzym bei einem Amylasebestimmungstest einzusetzen, bei dem die größeren Oligosaccharide wie z.E. Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose, Maltooctaose, Haltononaose und ähnliche Oligosaccharide verwendet werden. Die neuartige Maltase kann auch für Amylasebestimmungstests eingesetzt werden, bei denen chromogene und Fluoreszenz verursachende Derivate der Oligosaccharide, z.B. 00 -D-Glykoside von Nitrophenol, Umbelliferon, Fluorescein und ähnlicher Verbindungen mit Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose, Maltooctaose und ähnlichen Oligosacchariden verwendet werden. Diese Derivate werden durch die Amylase unter Bildung von Maltose- oder Maltotriose-Glykosiden gespalten, die wiederum unter Bildung des freien Aglykone und der Glucose hydrolysiert werden, wodurch man die chromogenen und die Fluoreszenz erzeugenden Verbindungen erhält.

Die Maltase wird verwendet, um die kleineren Oligosaccharide (d.h. Maltose und Maltotriose), die durch die Einwirkung der Amylase auf das Substrat gebildet werden, unter Eildung von Glucose zu hydrolysieren. Der Glucosegehalt kann dann nach einer Vielzahl von Verfahren, z.B. durch Verwendung von Glucüseoxidase, von Peroxidase und von einem geeigneten Chromogen wie o-Dianisidin, durch die Messung des Glucosegehalts unter Verwendung von Glucoseoxidase und einer Sauer-5 stof f elektrode, durch die Verv/endung von Hexokinase und von Glucose-6-phosphatdehydrogenase in der Gegenwart von ATP NAD (oder NADP) und Mg⁺⁺ gemessen werden.Das Ausmaß der Reaktion kann auch gemessen werden, indem man Reagentien einsetzt,

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durch die ein Anwachsen der reduzierenden Eigenschaften der Lösung festgestellt werden kann. Solche Reagentien sind z.B. Dinitrosalicylsäure in alkalischer Lösung, eine Neocuproin-Kupfer-Lösung bei Kupferreduktionsmethoden und ähnliche Reagentien.

Durch die nachstehend beschriebene Reaktionsfolge wird ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Amylasebestimmung beschrieben :
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1. Oligosaccharid Maltose + Maltotriose

+ kleinere Oligosaccharide

_ ., ι . ,.ill· Maltase. _,,

2. Maltose + Maltotriose ^ Glucose

3. Glucose + ΛΤΡ Hexokinase^ _Glucose_6__phosphat +

- „, , , , . Glucose-6-phos-

4. Glucose-6-phosphat _phatdehydrg- 6-Phospho-

genäse ν gluconolacton

^ + NADH

Die Änderung in der Extinktion bei 340 nm wird als Maß der Amylaseaktivität genommen. Die bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren eingesetzte Amylasebestimmungslösung hat typischerweise die folgende Zusammensetzung:

Hexokinase: 0,5 bis 10 I. E./ml , vorzugsweise 2,5 bis 3,0 I. 25

E./ml;

Glucose-ö-phosphatdehydrogenase : 0,5 bis 10 I.E./ml, vorzugsweise 2,5 bis 3,0 I.F./ml; Magnesiumacetat oder Magnesiumchlorid: 0,001-m bis 0,02-m, vorzugsweise 0,002-m bis 0,003-πγ NAD: 0,5 bis 5,0 mg/ml, vorzugsweise 2,0 bis 3,0 mg/ml;

Na-ATP- 2H-O: 0,20 bis 2,0 mg/ml, vorzugsweise 0,4 bis 0,6 mg/ml als ATP-Quelle; Maltase: 100 bis 400 Einheiten /ml, vorzugsweise 200 bis 250 Einheiten/ml.

ATP ist die Abkürzung für Adenosintriphosphat. Zur Anwendung im beschreibungsgemäßen Sinn werden die Maltaseeinheiten so definiert: bei Verwendung von p-Nitrophenylglucosid als Substrat entspricht eine Maltaseeinheit (1,0) in Bezug auf die

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Wellenlänge 400 nm einer ^Extinktionsänderung von Ι,ΟΟ/min, wobei bei 38 C in einer 1-cm-Zelle gemessen wird, die l,OOml der nachstehend beschriebenen Lösung enthält: 0,10-m-Kaliumphosphatpuffer( pH 6,8), 500 mg/1 p-Nitrophenyl-06-D-glucosid, 0,10 ml/1 Mercaptoäthanol. Es wird ein Phosphatpuffer wie Natriumphosphat oder Kaliumphosphat verwendet, weil der pK eines solchen Puffers dem optimalen pH fHr die Amylase- und Maltaseaktivität sehr nahe kommt. Die Konzentration des Puffers liegt zwischen einer Molaritat von 0,02 und 0,20, vorzugsweise

IQ bei einer Molarität zwischen 0,08 und 0,12. Der pH liegt zwischen 6,5 und 7,1, vorzugsweise zwischen 6,8 und 7,0.

Chloridionen aktivieren bekanntlich die Amyläse, und sie können,falls gewünscht, zu der Lösung hinzugegeben werden. Falls Chlorid verwendet wird, liegt seine Konzentration bei einer Molarität zwischen 0,030 und 0,20, doch vorzugsweise bei einer Molarität zwischen etwa 0,04 und 0,06. Als Chloridionenquelle .können gebräuchliche Salze wie KCl, NH.Cl oder NaCl verwendet werden, doch wird die Zugabe von NaCl bevorzugt.

Der Oligosaccharidgehalt der Lösung liegt zwischen

0,5 mg/ml und 10 mg/ml, jedoch vorzugsweise zwischen etwa 3 mg/ml und etwa 4 mg/ml. Folgende Oligosaccharide können eingesetzt werden: Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose, Maltooctaose, Maltononaose, Maltodecaose und größere Oligosaccharide, doch wird die Verwendung von Maltopentaose bis Maltodecaose bevorzugt.

Bei Anwendung anderer Verfahren zur Messung der Glucose ™^erden die Bedingungen eingehalten, die man typischerweise bei den nach dem Stand der Technik bisher bekannten Verfahren anwendet. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Maltaseenzyms anstelle der bisher eingesetzten Maltaseenzyme jnacht keine Änderung in den zur Messung der Glucose angewandten Verfahren notwendig.

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Beispiel 1

Um die neuartige Maltase herzustellen, wurde der neue Saccharomyces-Stamm gezüchtet. Das Nährmedium hatte folgende ZusammensetzungC die nachstehend beschriebenen Stoffe wurden in 1000 ml Leitungswasser aufgelöst und im Autoklav behandelt}:

Hefenextrakt	2,5 g
Trypton oder Pepton	5,0 g
(NH₄J₂SO₄	2,0 g
KH₂PO₄	2,0 g
CaCl₂ ·H₂O	0,25 g
MgSO₄ '7H₂O	0,25 g

"Antifoam A" wird routinemäßig hinzugegeben.

Kurz vor dem Beimpfen mit einer Mutterkultur werden zu 20

vorstehend beschriebenen Nährmediums 1,13 kg Malzextrakt hinzugegeben. Zum Beimpfen des Nährmediums wird 1 1 einer Mutterkultur verwendet, die auf dem vorstehend beschriebenen Nährmedium gezüchtet wurde, doch wurden zu diesem Nährmedium noch 40g Maltosehydrat pro Liter hinzugegeben. Man läßt die Mutterkultur 24 h lang wachsen.

Die Hefepilze werden bei 25°C bis 27°C gezüchtet, wobei sanft gerührt oder Luft eingeleitet wird, um das Absetzen der Hefe zu verhindern. Das Fortschreiten der Kultur wird verfolgt, indem man die Trübung der Hefesuspension mißt, und auch indem man die Maltaseaktivität in den Zellen mißt. Wenn durch das Wachstum die maximale Enzymaktivität der Zellen erreicht ist, werden die Zellen durch Schnellzentrifugieren gewonnen. Die zusammenhängende Zellmasse kann dann nach dem Verfahren von Beispiel 2 oder Beispiel 3 verarbeitet werden.

Beispiel 2

Die zusammenhängende_/nasse Zellmasse (Naßgewicht 100 g

bis 200 g) wird 45 min lang bei Raumtemperatur mit 40 ml Essigsäureäthylester verrührt. 400 ml entionisiertes Wasser werden

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hinzugegeben, und der pH wird mit 1-m-NH.OH auf 7,6 bis 7,7 eingestellt. Direkt nach der Einstellung des pH wird 1,0 ml Mercaptoäthanol hinzugegeben. Nach 4-stündigem Stehen bei Raumtemperatur ist die Abtrennung des Enzyms von den Zellen beendet. Das Enzym ist in dieser und in den darauffolgenden Stufen sehr stabil. Man beobachtet z.B. nach 24 h bei Raumtemperatur oder nach 96 h bei 4 C einen vernachlässigbaren Aktivitätsverlust. Die überstehende Lösung, die man nach dem Zentrifugieren bei 8000 x g über einen Zeitraum von 15 min erhält,wird für die darauffolgenden Reinigungsschritte verwendet. Falls notwendig, wird der pH mit NH₄OH auf 6,2 bis 6,4 eingestellt.

Reinigungsverfahren:
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Schritt 1: Zu dem auf diese Weise erhaltenen Hefenextrakt wurde bei 4°C 1,0 g in 50 ml warmem, entionisiertem Wasser aufgelöstes Protaminsulfat hinzugegeben, und der pH wurde mit l-m-NH₄0H auf 6,2 eingestellt. Nach 1- bis 2-stündigem Stehenlassen wurde zentrifugiert, und die überstehende Lösung wurde für Schritt 2 abgetrennt.

Schritt 2: Die überstehende Flüssigkeit wurde bei Raumtemperatur durch eine mit Sephadex G-25 gefüllte Säule laufen gelassen, die mit einem Puffer der folgenden Zusammensetzung ins Gleichgewicht gebracht wurde: 0,01-m-NaCl, 0,01-m-HCl.

Der pH der vorstehend beschriebenen Lösung wurde mit 1,O-m-Piperazinhexahydrat auf 6,2 eingestellt, das Volumen wurde eingestellt und 0,10 ml Mercaptoäthanol wurden pro Liter des Puffers hinzugegeben. Das Austreten des Proteins wurde bei der Wellenlänge 280 nm überwacht, und das Protein wurde gesammelt.

Schritt 3: Das im Schritt 2 erhaltene, proteinhaltige Eluat wurde direkt auf eine Säule aufgegeben, die mit DEAE-Cellulose (Whatman DE 32, Bettvolumen 50 ml, 2,2 χ 13 cm) gefüllt

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war und mit dem beim Schritt 2 beschriebenen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war. Diese Säule wurde in Serie mit dem Einlaß einer Hydroxylapatitsäule (BioRad Bio-Gel, HT, Bettvolumen 200 ml, 4,5 χ 12, 6 cm) verbunden, die mit 0,02-m-Kaliumphosphatpuffer mit pH 6,7, der 0,1 ml Mercaptoäthanol pro Liter enthielt, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Sobald das ganze Protein in die DEAE-Säule eingetreten war (die Fließgeschwindigkeit ist nicht entscheidend, 2 ml bis 3 ml pro min), wurde die Säule, um den Anteil der Maltase zu eluieren, der an die r>EAE absorbiert worden war, mit 200 ml eines Puffers gewaschen, der die folgende Zusammensetzung hatte: 0,066-m-NaCl, 0,033-m-ITCl. Der pH wurde mit Piperazinhexahydrat auf 6,2 eingestellt, und der Puffer enthielt pro Liter 0,1 ml Mercaptoäthanol.

Schritt 4: Die DEAE-Eäule wurde abgetrennt,und die

Hydroxylapatitsäule wurde mit Phosphatpuffer eluiert, der die folgende Zusammensetzung hatte:

A. 0,08-m-Kaliumphosphat mit pH 6,7, mit einem Gehalt von 0,1 ml Mercaptoäthanol pro Liter. Durch 400 ml des Puffers wurde inertes Protein eluiert, das verworfen wurde.

B. 0,16-m-Kaliumphosphat mit pH 6,7, mit einem Gehalt von 0,1 ml Mercaptoäthanol pro Liter. Beim Auftreten eines größeren Proteinpeaks wurde eine Fraktion eluiert, die im wesentlichen die ganze Maltaseaktivität enthielt. Das Volumen der aktiven Fraktion betrug 150 ml.

Bei dieser Elution, die bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, war die Fließgeschwindigkeit nicht entscheidend, im allgemeinen wurden 2 ml bis 3 ml pro Minute durchfließen gelassen. Die Fraktionierung bei Raumtemperatur ist .besonders wichtig, v/eil die Fraktionierung bei 4 C zu einer beträchtlichen Bandverbreiterung und zu einer schlechten Gewinnung der aktiven Maltasefraktion führt.

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Schritt 5: Die aktive Fraktion von Schritt 4 wurde, wie vorstehend bei Schritt 2 beschrieben, durch eine Sephadex G-25-Säule laufen gelassen.Das proteinhaltige Eluat wurde durch eine DEAE-Cellulosesäule (Whatman DE 32, Bettvolumen 100 ml, 3,0 χ 14,2 cm) laufen gelassen ,.die mit dem in Schritt 2 beschriebenen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war.

Die nachstehend beschriebenen Puffer wurden in Mischungsbehältern hergestellt, wobei von jeder Lösung 250 ml hergestellt wurden.

Puffer wie bei Schritt 2 beschrieben

II

0,10-m-NaCl 0,05-m-HCl (mit Piperazin auf pH 6,2 eingestellt), 0,10 ml Mercaptoäthanol pro Liter

Die Säule wurde vor dem Eluieren mit 200 ml des Puffers I gewaschen. Das aktive Enzym wurde eluiert, indem die Cl-Konzentration des Puffers verändert wurde, und das aktive Enzym trat bei einer annähernd 0,06-nolaren Cl-Konzentration aus der Säule aus, was aus der der Säule zugeführten Menge berechnet wurde. Das Protein wurde nur bei zwei größeren Peaks eluiert, die sich überlappten. Bei beiden Peaks war Maltaseaktivität vorhanden. Die bei dem kleineren Peak austretende Fraktion stellte 20% der gesamten aktiven Enzymmenge dar, die eluiert wurde. Bei beiden Peaks waren die austretenden Fraktionen für den Amylasetest zu gebrauchen. Kurz bevor bei dem kleineren Peak aktive Maltase eluiert wurde, trat eine NADH "Oxidase" aus, die ausgeschlossen werden mußte. Das Gesamtvolumen des maltaseenthaltenden Eluats bei den beiden aktiven Peaks betrug 170 ml. Die Rückgewinnung und die Ausbeute der Maltase wird in der

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folgenden Tabelle gezeigt:

Schritt Maltaseaktivität Rückge

winnung in %

anfänglicher Extrakt 480,000 100

Schritt 1

Schritt 2 470,000 98

Schritt 3 4 65,000 97

, Schritt 4-5 4O8,OOO 85

Schritt 6 390,000 81

Die Endausbeute an Protein betrug 250 mg bis 300 mg, mittels Extinktion bei 280 nm bestimmt.

Beispiel 3

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben wurde der neuartige Saccharomyces-Stamm auf dem Nährmedium gezüchtet. Die Hefe wurde durch Schnellzentrifugieren gewonnen, als eine Prüfung der Kultur auf Maltase anzeigte, daß die Maltaseaktivität den maximalen Wert hatte. Der Hefebrei wurde bis zur Verwendung im gefrorenen Zustand gelagert. Die Maltase in dem Hefebrei wurde wie nachfolgend beschrieben extrahiert und gereinigt:

Schritt I: 6,3 kg gefrorener Hefebrei wurde zu 12,7 kg Wasser hinzugegeben und es wurde gerührt, bis die Hefe aufgetaut war. Der pH des dünnen Breis wurde durch langsame Zugabe von 1,4-m-Ammoniumhydroxid auf 7,7 eingestellt, und 45 ml Mercaptoäthanol wurden hinzugegeben. Die Suspension wurde weitere 4h gerührt, um die Maltase quantitativ abzutrennen.

Schritt II: 52 g Protaminsulfat, in 900 ml Wasser aufgelöst und auf pH 6,2 bis 6,7 eingestellt, wurden unter Rühren zu der Suspension hinzugegeben, um die Nucleinsäuren auszufällen. Nach 18-stündigem Stehen bei 4°C wurde das unlösliche Material durch Filtration entfernt, nachdem Celite

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als Filterhilfe zugegeben worden war. Die Untersuchung des Filtrats zeigte, daß 21 000 000 Einheiten Maltaseenzym vorhanden waren.

Schritt III: Der pH des Filtrats wurde mit 1,4-m-Ammoniumhydroxid auf 6,7 bis 6,8 eingestellt, und festes Ammoniumsulfat wurde hinzugegeben, bis eine 50%-ige Sättigung erreicht war .Nach 2-bis 3-stündigaTi Rühren wurden 250 g CeIi te hinzugegeben, und der Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt und verworfen. Zu dem Filtrat wurde zusätzliches, festes Ammoniumsulfat hinzugegeben, bis eine 72,5%-ige Sättigung erreicht war, um die Maltase auszufällen. Nach weiterem 3-stündigem Rühren wurde die Maltase durch Zentrifugieren gesammelt. Die gesamte, wiedergewonnene Aktivität betrug 19 800 000 Einheiten.

Schritt IV: Die durch Ammoniumsulfat ausgefällte Maltase wurde in 600 ml eines O,25-m-Piperazin-HCl-Puffers mit pH 6,2 aufgelöst und gegen 3 Anteile von je 20 1 eines 0,02-m-Piperazin-HCl-Puffers, der 0,1 ml Mercaptoäthanol pro Liter enthielt und pH 6,2 hatte, bei 4 C während eines Zeitraums von 4 Tagen dialysiert. Am Ende der Dialyse wurde ein voluminöser Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt und verworfen. 16 800 000 Einheiten Maltase wurden zurückgewonnen.

Schritt V.: Die dialysierte Maltaselösung wurde in der Kälte (4°C) mit 230 g feuchter DEAE-Cellulose behandelt, um'Verunreinigungen in Form von Chromogenen und unerwünschtem Protein zu entfernen. Nach Entfernung der DEAE durch Filtration wurde die Lösung in eine Chromatographiersäule gebracht, die 6 £ DEAE-Cellulose enthielt, die mit 0,02-m-Piperazin-HCl-Puffer, der 0,10 ml Mercaptoäthanol pro Liter enthielt und pH 6,2 hatte, bei 4 C ins Gleichgewicht gebracht worden war.

5 Nachdem die Enzymlösung auf die Säule aufgegeben worden war, wurde die Säule mit 6 f 0,02-m-Piperazin-HCl-Puffer (pH 6,2) gewaschen. Unter Anwendung eines linearen Chloridionengradienten im Piperazin-HCl-Puffer wurde Maltase aus der Säule eluiert.

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Der Gradient stieg bei einem Gesamtvolumen von 16 1 von der Molarität 0,02 auf die Molarität 0,30 bezüglich Chlorid an. Fraktionen von je 500 ml wurden gesammelt, und die Fraktionen, die mehr als 300 000 Maltaseeinheiten enthielten, wurden vereinigt. 15 800 000 Maltaseeinheiten wurden zurückgewonnen.

Schritt VI : Die Maltase enthaltende Lösung wurde bei Raumtemperatur unter Anwendung eines mäßigen Vakuums entgast und bei Raumtemperatur auf ein 6-1-Bett von Hydroxylapatit in einer Chromatographiersäule aufgegeben, das vorher mit 0,02-m-Kaliumphosphatpuffer mit einem pH 6,8, der 0,10 ml Mercaptoäthanol pro Liter enthielt, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Säule wurde schrittweise mit Phosphatpuffern ansteigender Molarität gewaschen, wobei jeder Puffer 0,02 % Natriumazid und 0,10 ml Mercaptoäthanol pro Liter enthielt, Die Phosphatpuffer wurden in folgenden Mengen eingesetzt: 6 1 O,O2-m,6 1 0,08-m und 8 1 0,25-m. Bei zwei getrennten Peaks wurden Fraktionen mit Maltaseaktivität eluiert, und zwar mit 0,08-m- bzw. 0,25-m-Phosphatpuffer.

Diese beiden, verschiedenen Enzymformen wurden Peak I-Maltase bzw. Peak II-Maltase genannt.Die Rückgewinnung betrug bezüglich der Maltaseaktivität 4 200 000 und 8 140 000 Einheiten für Peak I bzw. Peak II.

Schritt VII : Durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 75% wurde die Maltase aus den Fraktionen ausgefällt die durch Eluieren der Hydroxylapatitsäule erhalten worden waren. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und war beim Lagern in der Kälte (4 C) v/enigstens einige Monate lang stabil.

Beide Maltaseformen können jeweils für die in

Beispiel 4 beschriebene Amylasebestimmung eingesetzt werden. Jedoch wird die Peak II-Maltase vorgezogen, da dann die Empfindlichkeit des Amylasetests im Vergleich zu dem Fall der Verwendung von Peak I-Maltase um etwa das Vierfache erhöht wird.

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Das nach einem der beiden Verfahren gewonnene, gereinigte Enzym ist in Lösung (Piperazin-HCl- bzw. Phosphat-Puffer bei pH 6,2 bis 6,7) bei 4°C mindestens zwei Wochen lang stabil, wobei die Aktivität um weniger als 5% abnimmt. Durch Zugabe von 0,1% Natriumazid kann die Verunreinigung mit Bakterien unter Kontrolle gehalten werden. Das gereinigte Enzym wird in Form eines lyophilisierten, trockenen Pulvers gelagert, nachdem der Puffer des Eluats aus dem letzten Schritt des Reinigungsverfahrens unter Verwendung einer mit 0,01-m-Kaliumphosphat bei pH 6,7 ins Gleichgewicht gebrachten Fephadex G-25-Säule ausgetauscht wurde. Das trockene Pulver ist bei -20 C mindestens 6 Monate lange stabil.

Der Hydroxylapatit kann wiederholt verwendet werden, nachdem man ihn mit 0,5-m-Kaliumphosphatpuffer bei pH 6,7 regeneriert und anschließend mit dem angegebenen, verdünnten Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gebracht hat.

Die DEAE-CeIlulose kann wiederholt verwendet werden, nachdem man sie in 0,5-m-NaOH suspendiert, mit Wasser gewaschen, in 0,5-m-HCl suspendiert, mit Wasser gewaschen und mit dem am Anfang verwendeten Piperazin-HCl-Puffer ins Gleichgewicht gebracht hat.

Beispiel 4

Beim Vergleich der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Maltase mit der Wirksamkeit von zwei im Handel erhältlichen Hefemaltasepräparaten in einem Bestimmungssystem zeigte sich deutlich, daß die erfinduntrsgemHße Maltase den anderen Maltasen überlegen ist, was in der nachfolgenden Tabelle angegeben wird.

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Tabelle 1

2 7 4 b 2 Ü

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Messung der Blindgeschwindigkeit und der Empfindlichkeit bei der Amylasebestimmung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Maltase und im Handel erhältlicher Maltesen.

Maltasetyp

Blindgeschwindigkeit D Geschwindig- 2)

Erfindungsgemäße Maltase

(Peak II)

Im Handel erhältliche Maltase (Quelle A)

Im Handel erhältliche Maltase (Quelle B)

Milliextinktionyf_min)

1,5

23,5

30,7

keit nach Zugabe von Serumamylase

Milliextinktion / min)

21,5

39,4

51,0

Die Bestimmungen wurden mit einem Reagens durchgeführt, das die nachstehend beschriebene Zusammensetzung hatte: 0,10-m-Kaliumphosphatpuffer mit pH 6,9, 0,05-m-NaCl,O,OO25-m-MagnesiumaCetat, 2,0 mg/ml NAD, 0,50 mg/ml ATP, 3,5 mg/ml Oligosaccharid (sh. gleichzeitig anhängige Patentanmeldung 730 820,eingereicht am 10,7.1976), 2,50 ΙΕ/ml Hexokinase und 2,5 ΙΕ/ml Glucose-6-phosphatdehydrogenase aus Leuconostoc. Die Maltaseaktivität war bei jedem Versuch identisch und betrug 250 Einheiten/ml.

1) Die Geschwindigkeit der Extinktionsänderung wurde bei 37°C und einer Wellenlänge von 34Onm ohne Zusatz von Serumamylase bestimmt.

2) Die Geschwindigkeit der Extinktionsänderung wurde nach Zugabe von 10 ^iI eines Normalserums zu 1,00 ml des Amylasereagens bestimmt.

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Die in Tabelle 1 angegebenen Daten zeigen, daß die Verwendung der erfindungsgemäßen Maltase bei Amylasebestimmungen das Verhältnis des Signals zum "Untergrundrauschen" in hohem Maße verbessert. Auf diese Weise betrug das Signal-Rausch-Verhältnis unter Verwendung der erfindungsgemäßen Maltase 14,3, während es unter Verwendung der im Handel erhältlichen Maltasen 1,68 oder 1,66 betrug, wenn die Bestimmung an 10 Ul Normalserum durchgeführt wurde. Diese Eigenschaft der erfindungsgemäßen Maltase erlaubt es, an kleinen Mengen biologischer; fließender Medien mit erhöhter Genauigkeit den Amylasegehalt zu bestimmen, und es ist nicht mehr notwendig, bei der Bestimmung der Amylaseaktivität der Proben Korrektionen aufgrund der Blindgeschwindigkeit durchzuführen. Die angegebenen Daten unterstützen auch den Schluß, daß die erfindungsgemäße Maltase Eigenschaften hat, die sich auf einzigartige Weise von den Eigenschaften der Maltasen unterscheiden, die nach dem Stand der Technik bisher bekannt waren.

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Claims

Patentansprüche

1. Maltaseenzym, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Züchten eines Stammes von Saccharomyees (ATCC 20488) in einem Nährmedium, das wenigstens einen Vertreter von Maltose, Maltotriose, oder Malzextrakt, aus pflanzlicher Quelle erhalten, enthielt, Abtrennen des Enzyms von den Hefezellen und Wiedergewinnen des Enzyms hergestellt wurde. 20

2. Maltaseenzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es frei von Nucleinsäuren t£.-und ß- Amylase ,Äthanol ,Essigsäureäthylester, Salzen, Peptiden,Alkoholdehyarogenase, Aldehyddehydrogenase, Hexokinase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Protease, NADH-Oxidase und anderen Proteinen ist.

3. Maltaseenzym nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es Maltotetraose nur mit etwa l/loo und Maltopentaose nur mit 1/500 der Geschwindigkeit hydrolysiert, mit der es Maltose hydrolysiert.

4. Verfahren zur Herstellung eines Maltaseenzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen neuartigen Saccharomyces-Stamm (ATCC 20488) in einem Nährmedium züchtet, das wenigstens einen Vertreter von Maltose, Maltotriose oder Malzextrakt, aus pflanzlicher Quelle gewonnen, enthält.

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XI/8

ORIGINAL INSPECTED

'

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium einsetzt, das einen aus pflanzlicher Quelle gewonnenen Malzextrakt enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium einsetzt, das einen Hefeextrakt, Trypton und Ammoniumphosphat enthält.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzym durch Zentrifugieren eines Nährmediums gewinnt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium einsetzt, das 2,5 g/l bis 75 g/l wenigstens eines Vertreters von Maltose, Maltotriose oder Malzextrakt, aus pflanzlicher Quelle gewonnen,enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium einsetzt, das zusätzlich etwa 2 g/l bis etwa 10 g/l Trypton, etwa 1,0 g'l bis etwa 4,0 g/l (NH.)SO etwa 1 g/l bis etwa 10 g/l KH₂PO., etwa 0,10 g/l bis etwa 0,4o g/l CaCl₂ und etwa 0,10 g/l bis 0,40 g/l MgSO₄ enthält.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch

gekennzeichnet, daß man fcu dem Nährmedium ein Entschäumungs-

mittel hinzugibt.

11. Verfahrennach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,

daß man ein Nährmedium einsetzt, das wenigstens einen Vertreter von Maltose, Maltotriose oder Malzextrakt, aus pflanzlicher Quelle gewonnen, in einer Menge von 50 g/l bis 60 g/l enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium einsetzt, das ein Malzextrakt aus pflanzlicher Quelle enthält.

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13. Verwendung eines Maltaseenzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 3, hergestellt nach einem der Ansprüche 4 bis 12, zur Bestimmung des"Amylasegehalts einer Probe durch

a) Einführen der Probe in eine Testlösung, die ein Oligosaccharid und Maltase enthält und

b) Messung der Bildungsgeschwindigkeit von Glucose in der Testlösung.

14. Verwendung eines Maltaseenzyms nach Anspruch 13 unter Anwendung einer Testlösung, die außerdem Hexokinase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Adenosintriphosphat und Nicotinamidadenindinucleotid enthält.

15. Verwendung eines Maltaseenzyms nach Anspruch 14, wobei die Extinktionsänderung der Probe, die die Testlösung enthält, bei 340 nm als Maß für die Amylaseaktivität genommen wird.

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