DE2745205C2

DE2745205C2 - Maltase und ihre Verwendung bei Verfahren zur Bestimmung von Amylase

Info

Publication number: DE2745205C2
Application number: DE2745205A
Authority: DE
Inventors: Leo M. Prof. Homewood Ala. Hall
Original assignee: University of Alabama UA; University of Alabama at Birmingham UAB
Current assignee: University of Alabama UA; University of Alabama at Birmingham UAB
Priority date: 1976-11-16
Filing date: 1977-10-07
Publication date: 1985-05-23
Also published as: JPS6126359B2; FR2370791B1; AU516594B2; FR2370791A1; JPS5735634B2; US4071407A; JPS53104791A; GB1559951A; DE2745205A1; AU2945277A; JPS57105186A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Maltaseenzym und dessen Verwendung bei Verfahren zur Bestimmung von Amyiase (vgl. hierzu die beiden Patentansprüche).

Bisher wurde angenommen, daß ein einzelner Stamm des Hefepilzes Saccharomyces nur ein einzelnes Malta· seenzym bildet Halvorson u. a., Biochimica et Biophysica Acta, Band 67, Seiten S42 bis SS3, stellen aus fünf verschiedenen Stämmen des Hefepilzes Saccharomyces Maltaseenzyme her. Durch jeden dieser Stämme wurde ein Produkt hergestellt, bei dem sich zeigte, daß es sich um die gleiche Maltaseart (o-GIucosidaseart) handelte, denn es lassen sich bei der nach diesem Verfahren hergestellten Maltase keine Unterschiede bezüglich der Desaktivierungswärme, der elektrophoretischen Beweglichkeit, des Verhaltens bei der Chromatographie, sowohl bei Säulen mit Carboxymethylcellulose als auch mit DEAE-Cellulose, der Neutralisation mit einem spezifischen Antiserum und, was am wichtigsten ist, der Substratspezifität feststellen

Eine Anwendung, die Maltase gefunden hat, ist die Bestimmung des Amylasegehalts von Enzymen. Mit der Amylasebestimmung ist die Messung der Geschwindigkeit verbunden, mit der durch die Amylase die Hydrolyse eines Substrats unter Bildung von Glucose katalysiert wird. Die Messung wird typischerweise unter Verwendung des Enzyms Maltase durchgeführt, um Maltose in Glucose umzuwandeln. Die Glucose wird dann durch Umsetzung mit ATP in Glucose-6-phosphat umgewandelt, und zwar in der Gegenwart des Enzyms Hexokinase. Das Glucose-6-phosphat wird in der Gegenwart des Enzyms Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (Leuconostoc) bei Gegenwart von NAD (Nicotinamidadenindinucleotid) unter Bildung von 6-Phosphogluconat oxidiert, wobei das NAD unter Bildung von NADH reduziert wird. Durch die Umwandlung von NAD in NADH wird die Absorption der Lösung bei 340 nm verändert. Es ist möglich, durch Messung der Veränderung in der Absorption die Reaktionsgeschwindigkeit zu messen. Der Vorgang enthält, wenn man ein Oligosaccharid als Substrat einsetzt, folgende Stufen:

(1) Oligosaccharid ► Maltose + Maltotriose + kleinere Oligosaccharide

(2) Maltose + Maltotriose ► Glucose

(3) Glucose + ATP ^-* Glucose-6-phosphat + ADP

(4) Glucose-6-phosphat + NAD 6-Phosphogluconat + NADH

so Bei der Anwendung dieses Amylasebestimmungsverfahrens stößt man auf die Schwierigkeit, daß die bisher bekannten Maltaseenzyme auch die Hydrolyse von Oligosacchariden unter Bildung von Maltose katalysieren. Diese Reaktion fuhrt zu einem »positiven« Resultat, das heißt, daß, selbst wenn keine Amylase vorhanden ist, NAD trotzdem in NADH umgewandelt wird, wodurch die Absorption der Lösung verändert wird. Die Geschwindigkeit dieser Reaktion wird als Blindgeschwindigkeit bezeichnet. Die Blindgeschwindigkeit muß festgestellt werden, bevor man mit der Amylasebestimmung beginnt, und sie muß berücksichtigt werden, bevor man aus der Reaktionskinetik berechnen kann, wieviel Amylase vorhanden ist. Da durch die Blindgeschwindigkeit eine mögliche Fehlerquelle eingeführt wird, werden die Lösungen zur Amylasebestimmung in einer Weise hergestellt, daß die Blindgeschwindigkeit möglichst kiein gehalten wird. Durch diese Minimierung der Blindgeschwindigkeit wird die Gesamtempfindlichkeit des Amylasebestimmungsverfahrens herabgesetzt. ;

Es ist Aufgabe der Erfindung, eine Maltase zur Verfügung zu stellen, die bei ihrer Verwendung bei Amylase- k

bestimmungsverfahren zu einer erhöhten Empfindlichkeit und einer niedrigen Blindgeschwindigkeit fuhrt. ί

L icse Aufgabe wird durch eine Maltase mit den im Patentanspruch 1 angegebenen Eigenschaften gelöst. ί

Nach Züchtung einer ausgedehnten Reihe von Subkulturen auf Maltose enthaltenden Nährmedien wurde ein neuartiger Hefepilzstamm, als Saccharomyces ATCC 20 488 bezeichnet, aus einem Elternhefepilzstamm iso- ,

liert. Wenn man Saccharomyces ATCC 20 488 entweder anaerob oder aerob in einem Nährmedium, das wenig- ^f

stens Maltose, Maltotriose oder Malzextrakt aus pflanzlichen Quellen wie Gerstenmalz, Maismalz oder Bier- i'

würze enthält, züchtet, zeigt er die Fähigkeit, große Mengen des Enzyms Maltase (σ-Glucosidase) zu produzie- fc,¹

ren. Selbst wenn etwa 10% des gesamten ursprünglich in dem Nährmedium vorhandenen Kohlenhydrats in ,:,'

Form von Glucose vorliegen, kommt es zur Bildung des Enzyms, sofern auch Maltose, Maltotriose oder Malzextrakt im Nährmedium eingemischt sind. Dieses Ergebnis ist ganz überraschend, da bei Verwendung anderer Stämme die Gegenwart von Glucose zu einer starken Herabsetzung der Maltasebildung fuhrt (Hestrin u. a., Arch. Biochem. Biophys. 29.31S (1950); Nature 168.913 (1951); Soiegelman u. a., J. Gea Ph>siol. 68.265 (1954) und Robertson u. a., J. Gen. Physiol. 73.186 (1957)). S

Weiterhin zeigt Saccharomyces ATCC 20 488 eine außerordentliche Aktivität bei der Erzeugung von Maltase, die dreimal bis zehnmal so gtoß ist wie die Maltaseaktivität der Hefepilzstämme, von denen bisher berichtet wurde.

Saccharomyces ATCC 20 488 wird in einem Nährmedium gezüchtet, das wenigstens einen Vertreter von Maltose, Maltotriose oder Malzextrakt aus pflanzlicher Quelle enthält. Man kann handelsüblichen Malzextrakt aus entsprechenden Quellen einsetzen, vorausgesetzt, daß der Glucosegehalt 10% bis 12% des gesamten Kohlenhydratgehalts nicht übersteigt und daß der gesamte Gehalt an Maltose und Maltotriose zusammengenommen 40% bis 90% des gesamten Kohlenhydratgehalts ausmacht. Maltose, Maltotriose oder Malzextrakt können in dem Nährmedium in Mengen zwischen 25 g/l und 75 g/l, vorzugsweise zwischen 50 g/l und 60 g/l, vorhanden sein. Das Nährmedium enthält Hefeextrakt, verschiedene Metallsalze und Trypton, Pepton, NZ-Amin vom Typ A oder ähnliche snzymatische Aufschlußprodukte aus Casein oder Fleischeiweiß. Trypton ist z. B. ein pankreatisches Aufschlußprodukt aus Casein. Auch ein Zusatz von Entschäumern, z. B. eines Entschäumers auf der Grundlage von Siliconöl wie »Antifoam Α« oder eines Entschäumungsmittels auf der Grundlage von Lardöl, kann erwünscht sein, um die Schaumbildung zu verhindern.

Geeignet ist z. B. ein Nährmedium, das Hefeextrakt, Trypton oder Pepton, Ammoniumsulfat, Kaliumdihydrcgenphosphat, Calciumchlorid, Magnesiumsulfat und »Antifoam Α« in Wasser aufgelöst enthält. Die Hefeextrakte sind gut bekannt und haben bei der Untersuchung von Bakterien eine weite Verwendung gefunden, da sie eine Quelle von natürlich vorkommenden Vitaminen des B-Komplexes sind. Ein solcher Hefeextrakt ist Bacto-Hefeextrakt, der den wasserlöslichen Anteil eines Hefeautolysats enthält. Dieser Extrakt ist dadurch gekennzeichnet, daß er bei einer Reaktion vom pH 6,6 sprudelnde, saubere Lösungen mit einer Konzentration zwischen 0,3% und 0,5% bildet. Dieser Hefeextrakt liegt im allgemeinen in Mengen zwischen etwa 1,0 g/l und etwa 5 g/l, vorzugsweise zwischen etwa 2,0 g/l und etwa 3,0 g/l, vor. Trypton kann in Mengen zwischen etwa 2,0 g/l und etwa 10,0 g/l, doch vorzugsweise zwischen etwa 4,0 g/l und etwa f ,0 g/l, vorhanden sein. Ammoniumsulfat ((NHj)₂SO₄) liegt im allgemeinen in Mengen zwischen etwa 1,0 g/I und etwa 4,0 g/l, doch vorzugsweise zwischen 1,5 g/l und etwa 2,5 g/l, vor. Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄) ist im allgemeinen in Mengen zwischen etwa 1,0 g/l und etwa 10,0 g/l, doch vorzugsweise zwischen etwa 2,0 g/l und etwa 5,0 g/l, vorhanden. Calciumchlorid und Magnesiumsulfat liegen typtecherweise in Mengen zwischen etwa 0,10 g/l und etwa 0,40 g/l, doch vorzugsweise zwischen 0,20 g/l und etwa 0,30 g/l, vor. Der pH des Nährmediums liegt zwischen 5,3 und 6,8, vorzugsweise zwischen 6,0 und 64- Während des Wachstums der Hefezellen wird durch Zugabe von Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid je nach Bedarf vorzugsweise ein pH zwischen 6,0 und 6,3 aufrechterhalten.

Die Hefezellen werden in dem Nährmedium gezüchtet, bis man an Proben, die dem Nährmedium periodisch entnommen werden, die maximale Enzymaktivität beobachtet. Man kann dafür die bekannten Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität anwenden.

Die Temperatur des Nährmediums ist nicht entscheidend. Sie liegt typischerweise zwischen etwa 20⁰C und etwa 35°C, doch vorzugsweise zwischen etwa 24°C und etwa 26°C. Auch das Lösungsmittel für das Nährmedium ist nicht entscheidend, und man kann Leitungswasser, entionisirrtes Wasser oder destilliertes Wasser einsetzen, da das Nährmedium vor der Verwendung im Autoklav behandelt wird. Die Zellen werden dann unter Anwendung bekannter Verfahren wie z. B. des Schnellzentrifugierens gewonnen. Das Enzym wird dann nach einem bekannten Verfahren von den Zellen abgetrennt. Ein geeignetes Verfahren wird von Halvorson u. a. in Biochem. Biophys. Acta., Band 30, Seite 28 (1958) beschrieben. Bei diesem Verfahren wird der Hefebrei mit Essigsäureethylester vermischt und anschließend nach Zugabe von Wasser und Einstellung des pH auf 7,8 mit Ammoniumhydroxid autolysiert. Bei einem bevorzugten Verfahren wird der Hefebrei einen Taj bis einige Monate lang eingefroren, dann wird das Enzym ohne die Verwendung von Essigsäureethylester von den Zellen abgetrennt, wie nachstehend beschrieben: Der gefrorene Hefebrei wird in entionisiertem Wasser suspendiert, wobei das Wasser in einer Menge eingesetzt wird, die dem Doppelten des Gewichts des Hefebreis entspricht, so Nach dem Auftauen des Breis wird der pH mit Ammoniumhydroxid auf 7,6 bis 7,9 eingestellt (das Ammoniumhydroxid 0,50- bis 2,0molar, vorzugsweise l,4molar), und unmittelbar darauf wird Mercaptoethanol in einer Menge von 7,0 m! bis 7,2 ml pro kg Hefe hinzugefugt. Nach 3- bis 4stündigem Rühren wird das Enzym Maltase abgetrennt.

Auch andere Verfahren zur Abtrennung des Enzyms von den Zellen, wie z. B. die Schallbehandlung, die Anwendung eines osmotischen Schocks unter Verwendung von Ammoniumphosphat, die Zerkleinerung durch Schütteln oder Homogenisieren mit Glasperlen, die Autolyse mit Toluol und das Zerreißen der Zellen, indem man die Zellen unter Anwendung eines hohen Druckes durch eine Öffnung treten läßt, können angewandt werden, jedoch ist keines dieser Verfahren so geeignet oder so wirtschaftlich wie das bevorzugte Verfahren. Außerdem ist zu erwarten, daß bei vielen dieser Verfahren die Enzymausbeute vermindert werden würde.

Das abgetrennte Protein (in Form des Enzyms) wird dann gereinigt. Man kann bekannte Verfahren zur Reinigung von Protein anwenden, z. B. die Fraktionierung mittels Ammoniumsulfat, mittels Ethanol oder Aceton, die Behandlung mit Protaminsulfat, die Ionenaustausch-Chromatographie, die Gelfiltration, die Elektrophorese oder die Adsorptionschromatographie. Ein solches Verfahren wird von Halvorson u. a. in Biochem. Biophys.

Acta, 30,28 (1958) beschrieben. Mit diesen Verfahren ist im allgemeinen die Fraktionierung des Proteins unter Verwendung von mehreren verschiedenen Chromatographiesäulen verbunden. Das bevorzugte Verfahren ist mit der Fraktionierung des Proteins durch aufeinanderfolgenden Schritte verbunden: So wird Nucleinsäure abaetrennt. indem man eine wäßrige Lösung von Protaminsulfat mit einer Konzentration zwischen 0,025 g/ml

H und 0,07 g/ml und einem pH zwischen 6,0 und 7,5 in einer Menge zugibt, die dazu ausreicht, die Nucleinsäuren

iß auszufüllen, dabei fügt man vorzugsweise 4,0 g bis 6,0 g des in Lösung befindlichen Protamine pro Liter der Pro-

JiI teinlösung zu. Die erhaltene ProHnlösung wird dann mit 313 g bis 494 g Ammoniumsulfat pro Liter fraktio-

M niert. Nach der Fraktionierung wird die Fraktion, die Maltaseaktivität zeigt, gegen eine Piperazin-HCl-Pufferlö-

! 5 sung dialysiert. Die Anteile, die Maltaseaktivität zeigen, werden dann gesammelt und an einer DEAE-Cellulo-

y sesäule einer Ionenaustauschehromatographie unterzogen. Die Maltase wird durch Anwendung einer Chlori-

% dionenquelle in einer Pufferlösung wie z. B. einem 0,02 m Piperazin-HCl-Puffer, der einen pH zwischen 6,0 und

t 7,0 hat, aus der Säule eluiert Die Fraktion, die eine Maltaseaktivität größer als 300 000 Einheiten/500 ml zeigt,

_v wird gesammelt. Diese gesammelten Fraktionen werden dann einer Absorptionschromatogrephie an Hydroxy-

' ' ίο lapatit unterzogen. Dann werden die aktiven Maltasefraktionen gesammelt Die gereinigte Maltase kann bei 4°C

in Form einer Suspension in 75%igem gesättigtere Ammoniumsulfat, als ein trockenes Pulver nach Lyophilisie-

ren der Maltase, die in Wasser aufgelöst wird, oder in einem verdünnten, 0,01- bis 0,05molaren Puffer bei annä-

: hemd neutralem pH, pH 6,5 bis 7,5, aufbewahrt werden. Ein Phosphatpuffer wird bevorzugt, doch können, falls

gewünscht, auch andere Puffer verwendet werden.

Vj is In einem alternativen, weniger bevorzugten Verfahre« werden, falls die Zellen mittels Essigsäureethylester

aufgerissen wurden, die Zellbruchstücke durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt, werden die Nucleinsäu-■ ren durch Behandlung mit Protamin entfernt und wird der Proteinextrakt durch eine Säule laufen gelassen, die

; mit Sephadex G-25 gefüllt ist, das mit Piperazin-HCl-Puffer ins Gleichgewicht gebracht wurde. Das Austreten

i. des Proteins wird unter Anwendung einer Wellenlänge von 280 tun überwacht, und das austretende Protein wird

direkt auf eine mit DEAE-Celluiose gefüllte Säule aufgegeben, die in Reihe mit einer Säule verbunden ist, die mit Hydroxylapatit gefüllt wurde. Die Maltase wird dann unter Verwendung eines Phosphatpuffers aus der Hydroxylapatitsäule eluiert. Das eluierte Material wird dann an einer DEAE-Celluiosesäule fraktioniert. Bei dieser Endfraktionierung wird das Material zuerst durch eine Sephadex G-25-Säule laufen gelassen. Dann läßt man das Eluat durch die DEAE-Cellulosesäule laufen. Die Fraktionen, die aktive Peaks zeigen, werden dann gesammelt. Die Fließgeschwindigkeiten und andere Parameter sind nicht entscheidend. Diese Parameter hängen von der Menge des Materials, das fraktioniert wird, und von der Säulengröße ab, und sie können leicht bestimmt werden.

Bei diesen Reinigungsverfahren werden Fremdstoffe wie Ethanol, Essigsäureethylester, Salze, Peptide, Nucleinsäuren, Materialien, die im Nährmedium vorhanden waren, Alkoholdehydrogenase, Aldehyddehydrogenäse, Hexokinase, Glucose-ö-phosphatdtsiydrogenase, Proteasen, N ADH-Oxidase und andere Proteine abgetrennt. Da Saccharomyces ATCC 20 488 frei von a- undjS-Amylase ist, war es nicht notwendig, ein Verfahren für ihre Entfernung zu entwickeln.

Die durch Saccharomyces ATCC 20 488 gebildete Maltase zeigt eine Anzahl von Eigenschaften, die die Maltase nicht hat, die unter Verwendung von anderen Hefepilzstämmen hergestellt wird. Insbesondere entspricht die gezeigte Maltaseaktivität nicht der Aktivität einer einzelnen Enzymart. Die Chromatographie an Diethylaminoethylcellulose (DEAE) ergibt z. B. mindestens zwei Enzymformen, und unter geeigneten Bedingungen sind mindestens drei Enzymformen wahrnehmbar. Bei der Adsorptionschromatographie an Hydroxylapatit stellt sich heraus, daß durch Saccharomyces ATCC 20 488 zwei neue Hauptformen von Maltase gebildet werden. Die Elektrophorese der Enzymextrakte an Celluloseacetat zeigt mehrere Formen des aktiven Enzyms, wobei man mindestens sechs unterscheidbare Formen des Enzyms wahrnehmen kann. Die Chromatographie der aus Saccharomyces ATCC 20 48S isolierten Maltase an Carboxymethylcellulose unter ähnlichen Bedingungen wie von Halvorson u. a. angewandt (beschrieben in Biochim. et Biophys. Acta, Band 67, Seiten 42 bis 53 (1963)), zeigte, daß das Enzym nicht durch den Ionenaustauscher absorbiert wird. Auf der Grundlage von HaI-vorsons Arbeit war erwartet worden, daß die Maltase durch die Carboxymethylcellulose absorbiert wird. Der Umstand, daß sie nicht absorbiert wurde, zeigt, daß die Maltase aus Saccharomyces ATCC 20 488 sich von der Maltase unterscheiden muß, von der im Zusammenhang mit anderen Stämmen von Saccharomyces früher berichtet wurde. Durch dieses Verhalten ergibt sich eine weitere Unterstützung der Annahme, daß Saccharomyces ATCC 20 488 und die dadurch gebildete Maltase ungewöhnlich und neu sind.

Die Maltase, die durch Saccharomyces ATCC 20 488 gebildet wird, hydrolysiert Phenyl-e-D-glucosid, so p-Ni!ropheny!-ir-D-g!ucos!d, p-Nitrophenyl-ir-D-maltosid und Saccharose. Von besonderer Bedeutung ist die Spezifität dieser Maltase bezüglich der Hydrolyse von Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose und der höheren Oligosaccharide.

Durch die erfindungsgemäße Maltase wird jedes dieser Kohlenhydrate mit einer verschiedenen Geschwindigkeit hydrolysiert. Z. B. beträgt die Hydrolysegeschwindigkeit von Maltotetraose nur ein Hundertstel der Hydrolysegeschwindigkeit von Maitose. Im Vergleich mit der Hydrolysegeschwindigkeit von Maltose beträgt die Hydrolysegeschwindigkeit von Maltopentaose nur 1 /500 und die Hydrolysegeschwindigkeit der höheren Oligosaccharide nur weniger als 1/1000.

Diese Eigenschaft erlaubt es, die Maltase bei Verfahren zur Bestimmung von Amylase zu verwenden, bei denen die größeren Oligosaccharide wie z. B. Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose, Maltooctaose, Maltononaose und ähnliche Oligosaccharide verwendet werden. Die erfindungsgemäße Maltase kann auch bei Verfahren zur Bestimmung von Amylase verwendet werden, bei denen chromogene und Fluoreszenz verursachende Derivate der Oligosaccharide, z. B. ar-D-Glykoside von Nitrophenol, Umbelliferon, Fluorescein und ähnliche Verbindungen mit Maltotetraose, Maltopentrnse, Maltohexaose, Maltoheptaose, Maltooctaose und ähnlichen Oligosaccharide^ verwendet werden. Diese Derivate werden durch die Amylase unter Bildung von Maltose- oder Maltotriose-Glykosiden gespalten, die wiederum unter Bildung des freien Aglykons und der Glucose hydrolysiert werden, wodurch man die chromogenen und die Fluoreszenz erzeugenden Verbindungen erhält.
Die Maltase wird verwendet, um die kleineren Oligosaccharide (d. h. Maltose und Maltotriose), die durch die

Einwirkung der Amylase auf das Substrat gebildet werden, unter Bildung von Glucose zu hydrolysieren. Der Glucosegehalt kann dann nach einer Vielzahl von Verfahren, z. B. durch Verwendung von Glucoseoxidase, von Peroxidase und von einem geeigneten Chromogen wie o-Dianisidin, durch die Messung des Glucosegehalts unter Verwendung von Glucoseoxidase und einer SauerstofTelektrode oder durch die Verwendung von Hexokinase und von Glucose-6-phosphatdehydrogenase in der Gegenwart von ATP, NAD (oder NADP) und Mg⁺⁺, gemessen werden. Das Ausmaß der Reaktion kann auch gemessen werden, indem man Reagenzien einsetzt, durch die ein Anwachsen der reduzierenden Eigenschaften der Lösung festgestellt werden kann. Solche Reagenzien sind z. B. Dinitrosalicylsäure in alkalischer Lösung, eine Neocuproin-Kupfer-Lösung bei Kupferreduktionsmethoden und ähnliche Reagenzien.

Durch die nachstehend beschriebene Reaktionsfolge wird ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Amylasebestimmung beschrieben:

A rn yljiop

1. Oligosaccharid > Maltose + Maltotriose + kleinere Oligosaccharide

Maltese

2. Maltose + Maltotriose ► Glucose

3. Glucose + ATP ! ► Glucose-6-phosphat + ADP

„, „ , Glucose-o-phosphatdehydrogenase ,

4. Glucose-6-phosphat + N AD -— > o-Phosphogluconolacton + NADH

Die Änderung in der Extinktion bei 340 nm wird als Maß der Amylaseaktivität genommen. Die bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren eingesetzte Amylasebestimmungslösung hat typischerweise die folgende Zusammensetzung:

Hexokinase: 0,5 bis 10 I. E./ml, vorzugsweise 2,5 bis 3,0 I. E./ml; Glucose-ö-phosphatdehydrogenase: 0,5 bis 10 I. E./ml, vorzugsweise 2,5 bis 3,0 I. E./ml; Magnesiumacetat oder Magnesiumchlorid: 0,001 m bis 0,02 m, vorzugsweise 0,002 m bis 0,003 m; NAD: 0,5 bis 5,0 mg/ml, vorzugsweise 2,0 bis 3,0 mg/ml; Na₂ATP · 2H₂O: 0,20 bis 2,0 mg/ml, vorzugsweise 0,4 bis 0,6 mg/ml als ATP-Quelle; Maltase: 100 bis 400 Einheiten/ml, vorzugsweise 200 bis 250 Einheiten/ml.

ATP ist die Abkürzung für Adenosintriphosphat. Zur Anwendung im beschreibungsgemäßen Sinn werden die Maltaseeinheiten so definiert: Bei Verwendung von p-Nitrophenylglucosid als Substrat entspricht eine Maltaseeinheit (1,0) in bezug auf die Wellenlänge 400 nm einer Extinktionsänderung von 1,00/min, wobei bei 38°C in einer 1-cm-Zelle gemessen wird, die 1,00 ml der nachstehend beschriebenen Lösung enthält: 0,10 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,8), 500 mg/1 p-Nitrophenyl-a-D-Glucosid, 0,10 ml/1 Mercaptoethanol. Es wird ein Phosphatpuffer wie Natriumphosphat oder Kaliumphosphat verwendet, weil der pK eines solchen Puffers dem optimalen pH für die Amylase- und Maltaseaktivität sehr nahe kommt. Die Konzentration des Puffers liegt zwischen einer Molarität von 0,02 und 0,20, vorzugsweise bei einer Molarität zwischen 0,08 und 0,12. Der pH liegt zwischen 6,5 und 7,1, vorzugsweise zwischen 6,8 und 7,0.

Chloridionen aktivieren bekanntlich die Amylase, und sie können, falls gewünscht, zu der Lösung hinzugegeben werden. Falls Chlorid verwendet wird, liegt seine Konzentration bei einer Molarität zwischen 0,030 und 0,20, doch vorzugsweise bei einer Molarität zwischen etwa 0,04 und 0,06. Als Chloridionenquelle können gebräuchliche Salze wie KCl, NH₄Cl oder NaCl verwendet werden, doch wird die Zugabe von NaCl bevorzugt.

Der Oligosaccharidgehalt der Lösung liegt zwischen 0,5 mg/ml und 10 mg/ml, jedoch vorzugsweise zwischen etwa 3 mg/ml und etwa 4 mg/ml. Folgende Oligosaccharide können eingesetzt werden: Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose, Maltooctaose, Maltononaose, Maltodecaose und größere Oligosaccharide, doch wird die Verwendung von Maltopentaose bis Maltodecaose bevorzugt. so

Bei Anwendung anderer Verfahren zur Messung der Glucose werden die Bedingungen eingehalten, d:e man typischerweise bei den nach dem Stand der Technik bisher bekannten Verfahren anwendet. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Maltase anstelle der bisher eingesetzten Maltaseenzyme macht keine Änderung in den zur Messung der Glucose angewandten Verfahren notwendig.

55 Beispiel 1

Um die erfindungsgemäße Maltase herzustellen, wurde Saccharomyces ATCC 20 488 gezüchtet. Das Nährmedium hatte folgende Zusammensetzung (die nachstehend beschriebenen Stoffe wurden in 1000 ml Leitungswasser aufgelöst und im Autoklav behandelt):

Hefeextrakt 2,5 g Trypton oder Pepion 5,0 g

(NH₄J₂SO₄ 2,0 g

KH₂PO₄ 2,0 g

CaCl₂ · H₂O 0,25 g »Antifoam Α« wird routinemäßig hinzugegeben

MgSO₄-7H₂O 0,25 g

Kurz vor dem Beimpfen mit einer Mutterkultur werden zu 201 des vorstehend beschriebenen Nährmediums 1,13 kg Malzextrakt gegeben. Zum Beimpfen des Nährmediums wird 11 einer Mutterkultur verwendet, die auf dem vorstehend beschriebenen Nährmedium gezüchtet wurde, doch wurden zu diesem Nährmedium noch 40 g Maltosehydrat pro Liter gegeben. Man läßt die Mutterkultur 24 h lang wachsen.

Die Hefepilze werden bei 25^eC bis 27⁰C gezüchtet, wobei sanft gerührt oder Luft eingeleitet wird, um das Absetzen der Hefe zu verhindern. Das Fortschreiten der Kultur wird verfolgt, indem man die Trübung der Hefesuspension mißt, und auch indem man die Maltaseaktivität in den Zellen mißt. Wenn durch das Wachstum die maximale Enzymaktivität der Zellen erreicht ist, werden die Zellen durch Schnellzentrifugieren gewonnen. Die zusammenhängende Zellmasse kann dann nach dem Verfahren von Beispiel 2 oder Beispiel 3 verarbeitet werden.

Beispiel 2

Die zusammenhängende, nasse Zellmasse (Naßgewicht 100 g bis 200 g) wird 45 min lang bei Raumtemperatur is mit 40 ml Essigsäureethylester verrührt. 400 mi entionisienes Wasser werden zugegeben, und der pH wird mit 1 m NH₄OH auf 7,6 bis 7,7 eingestellt. Direkt nach der Einstellung des pH wird 1,0 ml Mercaptoethanol zugegeben. Nach 4stündigem Stehen bei Raumtemperatur ist die Abtrennung des Enzyms von den Zellen beendet. | Das Enzym ist in dieser und in den darauffolgenden Stufen sehr stabil. Man beobachtet z. B. nach 24 h bei Raum- gj temperatur oder nach 96 h bei 4°C einen vernachlässigbaren Aktivitätsverlust. Die überstehende Lösung, die | man nach dem Zentrifugieren bei 8000 x g über einen Zeitraum von IS min erhält, wird für die darauffolgenden * Reinigungsschritte verwendet. Falls notwendig, wird der pH mit NH₄OH auf 6,2 bis 6,4 eingestellt. '

U Reinigungsverfahren g·

Schritt 1

Zu dem auf diese Weise erhaltenen Hefeextrakt wurde bei 4°C 1,0 g in 50 ml warmen, entionisiertem Wasser aufgelösten Protaminsulfat gegeben, und der pH wurde mit 1 m NH₄OH auf 6,2 eingestellt. Nach 1- bis 2stündigem Stehenlassen wurde zentrifugiert, und die überstehende Lösung wurde fur Schritt 2 abgetrennt.

Schritt 2

Die überstehende Flüssigkeit wurde bei Raumtemperatur durch eine mit Sephadex G-25 gefüllte Säule laufen gelassen, die mit einem Puffer der folgenden Zusammensetzung ins Gleichgewicht gebracht wurde: 0,01 m NaCl, 0,01 m HCl.

Der pH der vorstehend beschriebenen Lösung wurde mit 1,0 m Piperazinhexahydrat auf 6,2 eingestellt, das Volumen wurde eingestellt, und 0,10 ml Mercaptoethanol wurden pro Liter des Puffers hinzugegeben. Das Austreten des Proteins wurde bei der Wellenlänge 280 nm überwacht, und das Protein wurde gesammelt.

Schritt 3

Das im Schritt 2 erhaltene, proteinhaltige Eluat wurde direkt auf eine Säule aufgegeben, die mit DEAE-Cellulose (Whatman DE 32, Bettvolumen 50 ml, 2,2 x 13 cm) gefüllt und mit dem beim Schritt 2 beschriebenen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war. Diese Säule wurde in Reihe mit dem Einlaß einer Hydroxylapatitsäule (BioRad Bio-Gel, HT, Bettvolumen 200 ml, 4,5 x 12,6 cm) verbunden, die mit 0,02 m Kaliumphosphatpuffer mit

IpH 6,7, der 0,1 rn! Niercaptoethano! prc Liter enthielt, ins Gleichgewicht gebrächt worden war. Sobald das ganze Protein in die DEAE-Säule eingetreten war (die Fließgeschwindigkeit ist nicht entscheidend, 2 ml bis 3 ml pro min), wurde die Säule, um den Anteil der Maltase zu eluieren, der an die DEAE absorbiert worden war, mit so 200 ml eines Puffers gewaschen, der die folgende Zusammensetzung hatte: 0,066 m NaCl, 0,033 m HCl. Der pH ■ wurde mit Piperazinhexahydrat auf 6,2 eingesieiii, und der Puffer enihicii pfö Liier 0,1 rn! Mercaptoethanol.

Schritt 4

Die DEAE-Säule wurde abgetrennt, und die Hydroxylapatitsäule wurde mit Phosphatpuffer eluiert, der die folgende Zusammensetzung hatte:

A. 0,08 m Kaliumphosphat mit pH 6,7, mit einem Gehalt von 0,1 ml Mercaptoethanol pro Liter. Durch 400 ml

des Puffers wurde inertes Protein eluiert, das verworfen wurde.

όθ B. 0,16 m Kaliumphosphat mit pH 6,7, mit einem Gehalt von 0,1 ml Mercaptoethanol pro Liter. Beim Auftreten eines größeren Proteinpeaks wurde eine Fraktion eluiert, die im wesentlichen die ganze Maltaseaktivität enthielt. Das Volumen der aktiven Fraktion betrug 150 ml.

Bei dieser Elution, die bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, war die Fließgeschwindigkeit nicht entscheidend, im allgemeinen wurden 2 ml bis 3 ml pro Minute durchfließen gelassen. Die Fraktionierung bei Raumtemperatur ist besonders wichtig, weil die Fraktionierung bei 4°C zu einer beträchtlichen Bandverbreiterung und zu einer schlechten Gewinnung der aktiven Maltasefraktion führt.

Schritt 5

Die aktive Fraktion von Schritt 4 wurde, wie vorstehend bei Schritt 2 beschrieben, durch eine Sephadex G-25-Säule laufen gelassen. Das proteinhaltige Eluat wurde durch eine DEAE-Cellulosesäule (Whatman DE 32, Bettvolumen 100 ml, 3,0 x 14,2 cm) laufengelassen, die mit dem in Schritt 2 beschriebenen Puffer inT Gleichgewicht gebracht worden war.

Die nachstehend beschriebenen Puffer wurden in Mischungsbehältern hergestellt, wobei von jeder Lösung 250 ml hergestellt wurden.

Puffer wie bei Schritt 2 0,10 ml NaCl,
beschrieben 0,05 m HCl

imjt pinp.rsi7in auf tiH ή_τ2 I^

eingestellt),

0,10 ml Mercaptoethanol pro Liter

Die Säule wurde vor dem Eluieren mit 200 ml des Puffers I gewaschen. Das aktive Enzym wurde eluiert, indem die Cl-Konzentration des Puffers verändert wurde, und das aktive Enzym trat bei einer annähernd 0,06molaren Cl-Konzentration aus der Säule aus, was aus der der Säule zugeführten Menge berechnet wurde. Das Protein wurde nur bei zwei größeren Peaks eluiert, die sich überlappten. Bei beiden Peaks war Mallaseaktivität vorhanden. Die bei dem kleineren Peak austretende Fraktion stellte 20% der gesamten aktiven Enzymmenge dar. die eluiert wurde. Bei beiden Peaks waren die austretenden Fraktionen für die Amylasebestimmung zu gebrauchen. Kurz bevor bei dem kleineren Peak aktive Maltese eluiert wurde, trat eine NADH »Oxidase« aus, die ausgeschlossen werden mußte. Das Gesamtvolumen des Maltase enthaltenden Eluats bei den beiden aktiven Peaks betrug 170 ml. Die Rückgewinnung und die Ausbeute der Maltase wird in der folgenden Tabelle gezeigt:

Schritt Maltaseaktivität Rückgewinnung

in%

Anfänglicher Extrakt

Schritt 1 480,000 100

Schritt 2 470,000 98

Schritt 3 465,000 97

Schritt 4-5 408,000 85

Schritt 6 390,000 81

Die Endausbeute an Protein betrug 250 mg bis 300 mg, mittels Extinktion bei 280 nm bestimmt. Beispiel 3

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben wurde Saccharomyces ATCC 20 488 auf dem Nährmedium gezüchtet. Die Hefe wurde durch Schnellzentrifugieren gewonnen, als eine Prüfung der Kultur auf Maltase anzeigte, daß die Maltaseaktivität den maximalen Wert hatte. Der Hefebrei wurde bis zur Verwendung im gefrorenen Zustand gelagert. Die Msitsss in dem Hefebrei wurde wie nachfolgend beschrieben extrahiert und gereinigt:

Schritt I

6,3 kg gefrorener Hefebrei wurde zu 12,7 kg Wasser hinzugegeben, und es wurde gerührt, bis die Hefe aufgetaut war. Der pH des dünnen Breis wurde durch langsame Zugabe von 1,4 m Ammoniumhydroxid auf 7,7 eingestellt, und 45 ml Mercaptoethanol wurden zugegeben. Die Suspension wurde weitere 4 h gerührt, um die Maltase quantitativ abzutrennen.

Schritt II

52 g Protaminsulfat, in 900 ml Wasser aufgelöst und auf pH 6,2 bis 6,7 eingestellt, wurden unter Rühren zu der Suspension gegeben, um die Nucleinsäuren auszufallen. Nach 18stündigem Stehen bei 4⁰C wurde das unlösliehe Material durch Filtration entfernt, nachdem Celite als Filterhilfe zugegeben worden war. Die Untersuchung des Filtrats zeigte, daß 21000000 Einheiten Maltaseenzym vorhanden waren.

Schritt IH

Der pH des Filtrats wurde mit 1,4 m Ammoniumhydroxid auf 6,7 bis 6,8 eingestellt, und festes Ammoniumsulfat wurde zugegeben, bis eine 50%ige Sättigung erreicht war. Nach 2- bis 3stündigem Rühren wurden 250 g Celite zugegeben, und der Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt und verworfen. Zu dem Filtrat wurde

zusätzliches festes Ammoniumsulfat gegeben, bis eine 72,5%ige Sättigung erreicht war, um die Maltese auszufällen. Nach weiterem 3stündigem Rühren wurde die Maltese durch Zentrifugieren gesammelt. Die gesamte wiedergewonnene Aktivität betrug 19800000 Einheiten.

Schritt IV

Die durch Ammoniumsulfat ausgefällte Maltese wurde in 600 ml eines 0,25-m-Piperazin-HCl-Puffers mit

pH 6,2 aufgelöst und gegen 3 Anteile von je 201 eines 0,02-m-Piperazin-HCI-Puflers, der 0,1 ml Mercaptoetha-

nol pro Liter enthielt und pH 6 J. hatte, bei 4 ⁰C im Verlauf von 4 Tagen dialysiert. Am Ende der Dialyse wurde

ίο ein voluminöser Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt und verworfen. 16800000 Einheiten Maltese wurden zurückgewonnen.

Schritt V

Die diaiysierte Maltsseicsung wurde in der Kälte (4⁰C) mit 230 g feuchter DEAE-Ceüulose behandelt, um Verunreinigungen in Form von Chromogenen und unerwünschtem Protein zu entfernen. Mach Entfernung der DEAE durch Filtration wurde die Lösung in eine Chromatographiersäule gebracht, die 61 E'EAE-Cellulose enthielt, die mit 0,02-m-Piperazin-HCl-Puffer, der 0,10 ml Mercaptoethanol pro Liter enthielt und pH 6,2 hatte, bei 4⁴C ins Gleichgewicht gebracht worden war. Nachdem die Enzymlösung auf die Säule aufgegeben worden war, wurde die Säule mit 6 1 0,02-m-Piperazin-HCl-Puffer (pH 6,2) gewaschen. Unter Anwendung eines linearen Chloridionengradienten im Piperazin-HCI-Puffer wurde Maltese aus der Säule eluiert.

Der Gradient stieg bei einem Gesamtvolumen von 161 von der MolaritätO,02 auf die MolaritätO,30 bezüglich Chlorid an. Fraktionen von je SOO ml wurden gesammelt, und die Fraktionen, die mehr als 300000 Malteseeinheiten enthielten, wurden vereinigt. 15 800000 Malteseeinheiten wurden zurückgewonnen.

Schritt VI

Die Maltese enthaltende Lösung wurde bei Raumtemperatur unter Anwendung eines mäßigen Vakuums entgast und bei Raumtemperatur auf ein 6-1-Bett von Hydroxylapatit in einer Chromatographiesäule aufgegeben, das vorher mit 0,02 m Kaliumphosphatpuffer mit einem pH 6,8, der 0,10 ml Mercaptoethanol pro Liter enthielt, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Säule wurde schrittweise mit Phosphatpuffem ansteigender MoIarität gewaschen, wobei jeder Puffer 0,02% Natriumazid und 0,10 ml Mercaptoethanol pro Liter enthielt. Die Phosphatpuffer wurden in folgenden Mengen eingesetzt: 610,02 m, 610,08 m und 810,25 m. Bei zwei getrennten Peaks wurden Fraktionen mit Malteseaktivität eluiert, und zwar mit 0,08 m bzw. 0,25 m Phosphatpuffer.

Diese beiden verschiedenen Enzymformen wurden Peak I-Maltase bzw. Peak II-Maltese genannt. Die Rückgewinnung betrug bezüglich der Malteseaktivität 4200000 und 8140000 Einheiten für Peak I bzw. Peak II.

Schritt VII

Durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 75% wurde die Maltese aus den Fraktionen ausgefällt, die durch Eiuieren der Hydroxyiapatitsäuie erhalten worden waren. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und war bei Lagern in der Kälte (4°C) wenigstens einige Monate lang stabil. Beide Maltesefonnen können jeweils für die in Beispiel 4 beschriebene Amylasebestimrnung eingesetzt werden, jedoch wird die Peak II-Maltese vorgezogen, da dann die Empfindlichkeit der Amylasebestimrnung im Vergleich zu dem Fall der Verwendung von Peak I-Maltase um etwa das Vierfache erhöht ist.

Die nach einem der beiden Verfahren gewonnene gereinigte Maltese ist in Lösung (Piperazin-HCl- bzw. Phosphat-Puffer bei pH 6,2 bis 6,7) bei 4°C mindestens zwei Wochen lang stabil, wobei die Aktivität um weniger als 5% abnimmt Durch Zugabe von 0,1% Natriumazid kann die Verunreinigung mit Bakterien unter Kontrolle gehalten werden. Das gereinigte Enzym wird in Form eines lyophilisierten, trockenen Pulvers gelagert, nachdem der Puffer des Eluats aus dem letzten Schritt des Reinigungsverfahrens unter Verwendung einer mit 0,01 m Kaliumphosphat bei pH 6,7 ins Gleichgewicht gebrachten Sephadex G-25-Säu!e ausgetauscht wurde. Das trockene Pulver ist bei -20⁰C mindestens 6 Monate lange stabil.

Der Hydroxylapatit kann wiederholt verwendet werden, nachdem man ihn mit 0,5 m Kaliumphosphatpuffer bei pH 6,7 regeneriert und anschließend mit dem angegebenen, verdünnten Phosphatpufler ins Gleichgewicht gebracht hat

Die DEAE-Cellulose kann wiederholt verwendet werden, nachdem man sie in 0,5 m NaOH suspendiert, mit Wasser gewaschen, in 0,5 m HCl suspendiert, mit Wasser gewaschen und mit dem am Anfang verwendeten Piperazin-HCI-Puffer ins Gleichgewicht gebracht hat

Beispiel 4

Beim Vergleich der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Maltese mit der Wirksamkeit von zwei im Handel erhältlichen Hefemaltesepräparaten in einem Bestimmungssystem zeigte sich deutlich, daß die erfindungsgemäße Maltese den anderen Maltesen überlegen ist, was in der nachfolgenden Tabelle angegeben wird.

Tabelle 1

Messung oer Blindgeschwindigkeit und der Empfindlichkeit bei der Amylasebestimmung unter Vei-wendung der erfindungsgemäßen Maltase und im Handel erhältlicher Maltasen ₅

Maltasetyp Blindgeschwindigkeit¹) Geschwindigkeit²)

(Milliextinktion/min) nach Zugabe von

Serumamylase (Milliextinktion/min) 10

Erfindungsgemäße Maltase 1,5 21,5

(Peak II)

Im Handel erhältliche Maltase 23,5 39,4 ₁₅

(Quelle A)

Im Handel erhältliche Maltase 30,7 51,0

(Quelle B)

Die Bestimmungen wurden mit einem Reagens durchgeführt, das die nachstehend 20

beschriebene Zusammensetzung hatte:

0,10 m Kaliumphosphatpufler mit pH 6,9,0,05 m NaCl, 0,0025 m Magnesiumacetat, 2,0 mg NAD/ml, 0,50 mg ATP/ml, 3,5 mg Oligosaccharid/ml (siehe US-Patentanmeldung 7 30 820, eingereicht am 10.7.1976), 2,50 IE Hexokinase/. .ii und 2,5 IE Glucose-6-phosphatdehydrogenase aus Leuconostoc/ml. 25

Die Maltaseaktivität war bei jedem Versuch identisch und betrug 250 Einheiten/ml.

') Die Geschwindigkeit der Extinktionsänderung wurde bei 37°C und einer Wellenlänge von

340 nm ohne Zusatz von Seiumamylase bestimmt.
²) Die Geschwindigkeit der Extinktionsänderung wurde nach Zugabe von 10 μΐ eines Normalse- 30

lums zu 1,00 ml des Amylasereagens bestimmt.

Die in Tabelle 1 angegebenen Daten zeigen, daß die Verwendung der erfindungsgemäßen Maltase bei Amylasebestimmungen das Verhältnis des Signals zum »Untergrundrauschen« in hohem Maße verbessert. So betrug das Signal-Rausch-Verhältnis unter Verwendung der erfindungsgemäßen Maltase 14,3, während es unter 35 Verwendung der im Handel erhältlichen Maltasen 1,68 oder 1,66 betrug, wenn die Bestimmung an 10 μΐ Normalserum durchgeführt wurde. Diese Eigenschaft der erfindungsgemäßen Maltase erlaubt es, an kleinen Mengen biologischer, fließender Medien mit erhöhter Genauigkeit den Amylasegehalt zu bestimmen, und es ist nicht mehr notwendig, bei der Bestimmung der Amylaseaktivität der Proben Korrektionen aufgrund der Blindgeschwindigkeit durchzufuhren. Die angegebenen Daten unterstützen auch den Schluß, daß die erfindungsge- 40 mäße Maltase Eigenschaften hat, die sich auf einzigartige Weise von den Eigenschaften der Maltasen unterscheiden, die nach dem Stand der Technik bisher bekannt waren.

50

60 65

Claims

Patentansprüche:

1. Maltase, die frei ist von Nucleinsäuren, a- und./?· Amylase, Ethanol, Essigsäureethylester, Salzen, Peptiden, Aikoholdehydrogenase, Aldehyddehydrogenase, Hexokinase, Glucose-6-phosphaldehydiOgenase,

s Protease, N ADH-Oxidase und anderen Proteinen; bsi deren Verwendung die Hydrolysegeschwindigkeit von Maltotetraose nur ein Hundertstel der Hydrolysegeschwindigkeit von Maltose beträgt, die Hydrolysegeschwindigkeit von Maltopentaose nur ein Fünfhundertstel der Hydrolysegeschwindigkeit von Maltose beträgt und die Hydrolysegeschwindigkeit der höheren Oligosaccharide weniger als ein Tausendstel der Hydrolysegeschwindigkeit von Maltose beträgt und die durch Züchten von Saccharomyces ATCC 20 488 in einem Nährmedium, das wenigstens Maltose, Maltotriose oder Malzextrakt aus pflanzlicher Quelle enthält, Abtrennen des Enzyms von den Zellen nach bekannten Verfahren und Reinigen des abgetrennten Eazyms nach bekannten Verfahren zum Reinigen von Protein erhältlich ist.

2. Verwendung der Maltase nach Anspruch 1 bei Verfahren zur Bestimmung von Amylase.