DE69219855T2

DE69219855T2 - Verfahren zur Bestimmung der alpha-Amylase-Aktivität

Info

Publication number: DE69219855T2
Application number: DE69219855T
Authority: DE
Inventors: Shigenori Emi; Shizuo Hattori; Yukihiro Sogabe; Yoshihiro Yamamoto
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1991-11-06
Filing date: 1992-11-05
Publication date: 1997-09-11
Anticipated expiration: 2012-11-06
Also published as: US5607838A; EP0541083B1; JPH05123193A; DE69219855D1; JP3075377B2; EP0541083A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivitat in Körperflüssigkeiten, die einen klinischen Parameter für die Diagnose von Pankreasleiden und die Speicheldrüsen betreffenden Erkrankungen darstellt, und Reagenzien zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität.
Unter den Verfahren zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität hat sich mit der Verbreitung automatischer Analysatoren allgemein ein Verfahren durchgesetzt, in dem ein Maltooligosaccharid verwendet wird. Bisher wurde die Aktivität von α- Amylase bestimmt, indem ein Maltooligosaccharid, das eine unmodifizierte nichtreduzierende terminale Glucose aufweist, und eine α-Glucosidase sowie gegebenenfalls eine ß-Glucosidase als Hilfsenzym(e) für die α-Amylase verwendet und die freie Glucose bestimmt wurde oder indem eine von der reduzierenden terminalen Glucose freigesetzte Markierung optisch bestimmt wurde. Bei diesen Bestimmungsmethoden wird häufig eine α-Glucosidase benutzt, die aus Hefe (der Gattung Saccharomyces) stammt
Da diese α-Glucosidase auch auf Maltooligosaccharide wirkt, deren reduzierende terminale Glucose mit einer Markierung gekoppelt ist, da sie jedoch kaum auf Maltooligosaccharide wirkt, die eine Glucosekette mit einer Länge von Maltodextrose (G4) oder länger aufweisen, wirkt sie vor der Wirkung von α-Amylase nur sehr langsam auf Maltooligosaccharide mit einer Kettenlänge von nicht weniger als G4 und unmodifizierter nichtreduzierender terminaler Glucose, was zur Folge hat, daß die Blindreaktion des Reagens ausreichend gering ist. Die α- Glucosidase muß als Hilfsenzym das durch die α-Amylase erzeugte Maltooligosaccharid sofort spalten.
Diese aus Hefe stammende α-Glucosidase zeigt jedoch eine immer niedrigere Aktivität, je länger die Glucosekette wird. Konkret ausgedrückt heißt das, daß die Wirkung auf Maltotriose (G3) nur schwach ist. Demgemäß muß man, wenn man dieses Enzym als Hilfsenzym einsetzt, einen Überschuß des Enzyms zugeben. Außerdem bringt das Reagens hinsichtlich der Stabilität Probleme. Wenn das Enzym lange mit einem Substrat in Kontakt ist, wirkt das Enzym nach und nach auf das Substrat, aus diesem Grund müssen das Reagens, welches das Enzym und ein Substrat enthält, sofort nach dessen Zubereitung zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität verwendet werden.
In den letzten Jahren hat ein Verfahren zunehmend Beachtung gefunden, wobei das als Substrat verwendete Maltooligosaccharid ein Maltooligosaccharid ist, das eine modifizierte nichtreduzierende terminale Glucose aufweist. Dieses Verfahren ist dadurch vorteilhaft, daß das Substrat vor der Wirkung der α-Amylase nicht durch ein Hilfsenzym angegriffen wird, da die nichtreduzierende terminale Glucose des Substrats modifiziert wurde. Demgemäß können Reagenzien, die das Enzym und das Substrat enthalten, auch noch benützt werden, wenn sie nach ihrer Herstellung langfristig gelagert wurden, wodurch die Möglichkeit gegeben ist, das Reagens, welches das (die) Enzym(e) und das (die) Substrat(e) zur Bestimmung der α-Amylase- Aktivität enthält, in einem einzigen Gläschen bereitzustellen.
Trotzdem bringt auch dieses Verfahren Probleme bezüglich der Spezifität der α-Glucosidase für das Substrat mit sich, außerdem muß man, um eine empfindliche Bestimmung mittels einer effizienten Hilfsreaktion durchführen zu können, einen großen Überschuß der α-Glucosidase zugeben. Die Verwendung einer großen Enzymmenge kann wirtschaftliche Nachteile und andere Probleme mit sich bringen, wie z.B. eine Trübung des Reagenzes und eine mögliche Zunahme der Blindreaktion des Reagenzes, die auf das in einem Enzym-Standardprodukt vorliegende Enzym zurückzuführen ist. Außerdem können bei Verwendung eines Maltooligosaccharids mit 7 oder mehr Glucoseeinheiten als Substrat möglicherweise Maltooligosaccharide erzeugt werden, die eine Glucosekettenlänge wie Maltotetraose (G4) oder länger aufweisen. Es ist extrem schwierig, solche Maltooligosaccharide durch die vorstehend erwähnte α-Glucosidase zu spalten. Die Folge davon ist, daß bei der α-Amylase-Reaktion die Markierungen nicht freigesetzt werden können, außerdem kam es einmal vor, daß die Werte der α-Amylase-Aktivität berechnet werden mußten, indem die Meßwerte mit stöchiometrischen Koeffizienten multipliziert wurden.
Zur Lösung der vorstehend erwähnten Probleme wird in USP- 4 794 078 die gleichzeitige Verwendung von α-Glucosidase und Glucoamylase beschrieben. Das heißt, man läßt die Glucoamylase hauptsächlich Maltooligosaccharide spalten, die eine Glucosekettenlänge wie Maltotriose (G3) oder länger aufweisen. Gemäß diesem Verfahren macht die Verwendung eines Maltooligosaccharids mit einer Glucosekettenlänge wie Maltoheptose (G7) oder länger als Substrat die vorstehend erwähnte Berechnung durch Multiplikation mit stöchiometrischen Koeffizienten nicht erforderlich, da das Maltooligosaccharid einfach in Glucoseeinheiten gespalten werden kann, was seinerseits die Empfindlichkeit des Bestimmungssystems erhöht. Die gleichzeitige Reduzierung der Gesamtmenge des Enzyms kann insofern vorteilhaft sein, als das Verfahren wirtschaftlich ist, das Reagens nicht trüb wird und die Blindreaktion des Reagens unterdrückt werden kann.
Während Glucoamylase auf Maltooligosaccharide mit einer Glucosekettenlänge wie Maltotriose (G3) oder länger unabhängig von der Kettenlänge der Glucoseeinheiten gut wirkt, wirkt sie nur schwach auf Maltose (G2). Da die Glucoamylase außerdem nicht auf reduzierende terminale Glucose mit einer daran gekoppelten Markierung wirkt, kann sie nicht alleine als Hilfsenzym zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität verwendet werden.
EP-A-319 993 beschreibt Maltooligosaccharid-Derivate und ihre Verwendung in Reagenzien zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität, wobei die Reagenzien ferner α-Glucosidase und/oder Glucoamylase und gegebenenfalls ß-Glucosidase enthalten.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität, das die vorstehend erwähnten Probleme löst.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Reagenzien zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität.
Die Erfinder kamen nun aufgrund intensiver Untersuchungen zu dem Ergebnis, daß bei Verwendung von α-Glucosidase, die im wesentlichen auf Glucose, bei der eine Markierung α-glucosidisch in Position 1 gebunden ist, und auf alle Maltooligosaccharide mit 2 bis 7 Glucoseeinheiten wirken kann, für die Bestimmung der α-Amylase-Aktivität, wobei Maltooligosaccharide mit modifizierter nichtreduzierender terminaler Glucose verwendet werden, eine wirksame Hilfsreaktion durch die α-Glucosidase alleine ohne gleichzeitigen Einsatz von Glucoamylase erhalten werden kann, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wurde.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität bereitgestellt, umfassend: Inkontaktbringen einer Probe mit einer α-Glucosidase und gegebenenfalls einer ß-Glucosidase in Gegenwart eines α-Amylase- Substrats und optische Bestimmung einer freigesetzten Markierung; wobei das Substrat ein aus mindestens drei Glucoseeinheiten zusammengesetztes Maltooligosaccharid ist, dessen reduzierende terminale Glucose mit einer optisch meßbaren Markierung in Position 1 durch eine α-glucosidische Bindung oder eine ß-glucosidische Bindung gekoppelt ist und dessen nichtreduzierende terminale Glucose durch einen Substituenten, der nicht Glucose ist, modifiziert ist, und wobei die α-Glucosidase im wesentlichen befähigt ist, auf die Glucose mit der Markierung, die in Position 1 durch α-glucosidische Bindung gekoppelt ist, und auf alle Maltooligosaccharide zu wirken, die aus 2 bis 7 Glucoseeinheiten zusammengesetzt sind.
Außerdem wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Reagens zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität bereitgestellt, umfassend:
(a) ein α-Amylase-Substrat, das ein aus mindestens drei Glucoseeinheiten zusammengesetztes Maltooligosaccharid ist, dessen reduzierende terminale Glucose mit einer optisch meßbaren Markierung in Position 1 durch eine α-glucosidische Bindung oder eine ß-glucosidische Bindung gekoppelt ist und dessen nichtreduzierende terminale Glucose durch einen Substituenten, der nicht Glucose ist, modifiziert ist,
(b) eine α-Glucosidase, die im wesentlichen befähigt ist, auf Glucose, an die die optisch meßbare Markierung in Position 1 durch eine α-glucosidische Bindung gekoppelt ist, und auf alle Maltooligosaccharide zu wirken, die aus 2 bis 7 Glucoseeinheiten zusammengesetzt sind, und, gegebenenfalls
(c) eine ß-Glucosidase.

Kurze Erklärung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Beziehung zwischen der Menge an α-Glucosidase, die dem erfindungsgemäßen Reagens zugegeben wurde, und den Änderungen der Absorption, die unter Verwendung von 3-Ketobutyliden-ß-2-chlor-4-nitrophenylmaltopentosid erhalten wurde;
Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen der Menge der aus Hefe stammenden α-Glucosidase und den Änderungen der Absorption, die unter Verwendung von 3-Ketobutyliden-ß-2-chlor-4-nitrophenylmaltopentosid erhalten wurde;
Fig. 3 zeigt die lineare Beziehung zwischen der Konzentration von α-Amylase und den Änderungen der Absorption, wenn das gleiche Substrat verwendet wurde; und
Fig. 4 zeigt die Beziehung zwischen der Menge der in der vorliegenden Erfindung verwendeten α-Glucosidase und den Änderungen der Absorption, die unter Verwendung von Ethyliden-α-4- nitrophenylmaltoheptosid erhalten wurde.
Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendende α-Glucosidase, nämlich die α-Glucosidase, die im wesentlichen befähigt ist, auf Glucose, an die eine Markierung in Position 1 durch α-glucosidische Bindung gekoppelt ist, und auf alle Maltooligosaccharide, die aus 2 bis 7 Glucoseeinheiten zusammengesetzt sind, zu wirken, kann einen beliebigen Ursprung haben, einschließlich Tiere, Pflanzen, Mikroorganismen usw.. Auch kann die α-Glucosidase durch gentechnische Verfahren hergestellt werden. Im allgemeinen werden die α-Glucosidase und die Glucoamylase anhand des bei der Spaltung erzeugten Glucose- Anomers klassifiziert. Das heißt, α-Glucose wird durch α- Glucosidase und ß-Glucose durch Glucoamylase erzeugt. Die beschriebenen α-Glucosidasen sind bei den Mikroorganismen hauptsächlich aus der Gattung Bacillus und bei den Pflanzen hauptsächlich aus Getreide verfügbar. Die aus Bacillus stearothermophilus stammende α-Glucosidase ist am stärksten bevorzugt. Dieses Enzym ist für die Aufgaben der vorliegenden Erfindung deshalb gut geeignet, da es auf alle aus 2 bis 7 Glucoseeinheiten zusammengesetzten Maltooligosaccharide und außerdem auf Glucose, an die eine Markierung in Position 1 durch α-glucosidische Bindung gekoppelt ist, und auf markierte Maltooligosaccharide, deren Markierungen freigesetzt werden können, gut wirkt und da dieses Enzym extrem stabil ist.
In der vorliegenden Erfindung wird ß-Glucosidase zusammen mit α-Glucosidase eingesetzt, wenn eine Markierung an die reduzierende terminale Glucose des Maltooligosaccharids durch ß- Verknüpfung gekoppelt ist. Diese ß-Glucosidase kann einen beliebigen Ursprung haben, z.B. Mandeln usw.
Beispiele des aus mindestens 3 Glucoseeinheiten zusammengesetzten Maltooligosaccharids, das in der vorliegenden Erfindung als Substrat verwendet werden kann, sind Maltotriose, Maltotetrose, Maltopentose, Maltohexose, Maltoheptose oder Maltooctose. Beliebige Substrate können verwendet werden, sofern das durch die α-Amylase-Spaltung entstehende Hauptspaltprodukt ein Maltooligosaccharid mit einer Kettenlänge wie Maltoheptose (G7) oder kürzer ist.
Die zu verwendende markierte Verbindung, die an die reduzierende terminale Glucose des Maltooligosaccharids durch eine glucosidische Bindung gekoppelt werden soll, kann eine beliebige Verbindung sein, sofern sie an die reduzierende terminale Glucose durch eine α-Bindung oder eine ß-Bindung gekoppelt werden kann, sofern sie durch die Wirkung von α-Glucosidase oder ß-Glucosidase einfach gespalten werden kann und sofern sie optisch bestimmt werden kann. Bevorzugt sind Verbindungen, die substituierte oder unsubstituierte Phenolreste aufweisen, und am stärksten bevorzugt sind 4-Nitrophenol, 2-Chlornitrophenol und dergleichen. Substrate, bei denen eine Markierung durch eine ß-Bindung an die reduzierende terminale Glucose gekoppelt ist, zeigen eine gute Löslichkeit, und solche Substrate sind bevorzugt.
Der zu verwendende Substituent zur Modifikation der nichtreduzierenden terminalen Glucose kann eine beliebige Gruppe sein, die die Bindung zwischen dem Substituenten und der nichtreduzierenden terminalen Glucose sowie die Bindung zwischen der nichtreduzierenden terminalen Glucose und der angrenzenden Glucose vor der Spaltung durch Hilfsenzyme schützen kann. Beispiele des Substituenten sind die Ethoxygruppe, Phenoxygruppe, Pyridyloxygruppe, Ethylcarboxylgruppe, Ketopropylidengruppe, Ketobutylidengruppe, Ethylidengruppe, Benzylidengruppe oder ß-D-Galactopyranosylgruppe. Von diesen Gruppen werden vorzugsweise die Ketobutylidengruppe, Ethylidengruppe, Benzylidengruppe und ß-D-Galactopyranosylgruppe eingesetzt.
Die α-Amylase-Aktivität wird z.B. folgendermaßen bestimmt:
Nach Mischung einer Maltooligosaccharid-Substratlösung mit einer Hufsenzymlösung wird eine Probe zugegeben und die Umsetzung bei etwa 37ºC durchgeführt, anschließend wird die Änderung der Absorption pro Minute bestimmt.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele genauer beschrieben, die den Umfang der Patentansprüche in keiner Weise einschränken sollen.

Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1

Die folgenden Bestandteile wurden in 6 l Leitungswasser gelöst und die wäßrige Lösung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, anschließend folgte die Behandlung in einem Autoklaven.
Lösliche Stärke 120 g
Pepton 120 g
Fleischextrakt 3g
Hefeextrakt 12 g
K&sub2;HPO&sub4; 18 g
KH&sub2;PO&sub4; 6g
Das vorstehend erwähnte Medium in einem 10-l-Glasfermenter wurde mit Bacillus stearothermophilus (ATCC 12016) beimpft und 10 Stunden bei Belüftung unter Rühren bei 60ºC gezüchtet, sodann folgte eine Zentrifugation, wodurch 80 g Zellen erhalten wurden. Die Zellen wurden unter Verwendung einer Dyno-Mühle pulverisiert und durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Ionenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie gereinigt, wodurch 350 Einheiten des α-Glucosidase- Standardproduktes erhalten wurden.
Unter Verwendung des erhaltenen Produktes wurde die Reaktivität auf Glucose (PNPG), Maltose (PNPG2), Maltotriose (PNPG3), Maltotetrose (PNPG4), Maltopentose (PNPG5), Maltohexose (PNPG6) und Maltoheptose (PNPG7) untersucht, an die jeweils als Markierung eine 4-Nitrophenylgruppe in Position 1 durch eine α-glucosidische Bindung gekoppelt worden war. Unabhängig davon wurde die Reaktivität der aus Hefe stammenden handelsüblichen α-Glucosidase (hergestellt von Toyo Boseki Kabushiki Kaisha) genauso wie vorstehend untersucht. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde bestimmt, indem die Menge der freigesetzten Glucose gemessen und die Aktivität auf PNPG als 100 genommen wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
Die Aktivität der α-Glucosidase wurde folgendermaßen berechnet: 0,5 ml einer Substratlösung, die 20 mM 4-Nitrophenyl- α-D-glucopyranosid enthielt, wurde mit 1,0 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gemischt und das Gemisch fünf Minuten bei 37ºC vorgewärmt. Danach wurden 0,5 ml einer Enzymlösung zugegeben und die Umsetzung fünf Minuten bei 37ºC durchgeführt, anschließend folgte die Bestimmung der Absorptionsänderungen pro Minute bei 400 nm. Die Enzymaktivität, die unter den vorstehend angegebenen Bedingungen 1 µMol 4-Nitrophenol pro Minute erzeugte, wurde als eine Einheit definiert. Tabelle 1
Die aus Bacillus stearothermophilus stammende α-Glucosidase zeigte in allen Fällen eine hohe Reaktionsgeschwindigkeit. Insbesondere konnte bei Verwendung von PNPG3 die höchste Reaktionsgeschwindigkeit erhalten werden, ferner konnten bei Verwendung der anderen Substrate, die von PNPG3 verschieden waren, ausreichend hohe Reaktionsgeschwindigkeiten erhalten werden. Dagegen wirkte die aus Hefe stammende α-Glucosidase nur schwach auf das Maltooligosaccharid, das eine Glucosekettenlänge von G3 aufwies, und sie wirkte kaum auf die Maltooligosaccharide, die eine Glucosekettenlänge wie G4 oder länger aufwiesen.

Beispiel 2

(1) Die folgenden Lösungen wurden als Reagens zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität hergestellt:
(A) 4 mM 3-Ketobutyliden-ß-2-chlor-4-nitrophenylmaltopentosid, gelöst in 0,05 M PIPES-Puffer (pH 7,0), enthaltend 1 mM Calciumchlorid,
(B) α-Glucosidase aus Bacillus stearothermophilus, gelöst in 0,05 M PIPES-Puffer (pH 7,0), in verschiedenen Konzentrationen von α-Glucosidase im Bereich von 0 bis 2 Einheiten pro ml, und ß-Glucosidase, 20 Einheiten pro ml.
(2) Die α-Amylase-Aktivität wurde durch das folgende Verfahren bestimmt.
Nach Mischung von 1,4 ml Lösung (A) mit 1,4 ml Lösung (B) wurden 0,2 ml einer α-Amylase-Standardlösung (130 Somogyi-Einheiten pro Liter, hergestellt von The Green Cross Corporation) zugegeben und die Umsetzung drei Minuten bei 37ºC durchgeführt, anschließend folgte die Bestimmung der Absorptionszunahme pro Minute bei 400 nm. Die Beziehung zwischen der α- Glucosidase-Konzentration und den Absorptionsänderungen pro Minute ist in Figur 1 dargestellt. Wie aus Fig. 1 ersichtlich ist, bestand kein Unterschied in der Absorptionsänderung, wenn α-Glucosidase in verschiedenen Mengen von 0,8 Einheiten pro ml oder mehr zugegeben wurde. Das heißt, die α-Glucosidase zeigte eine vollständige Hilfsenzymreaktion, wenn sie dem Reagens zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität der vorliegenden Erfindung in einer Menge von 0,8 Einheiten pro ml oder mehr zugegeben wurde.

Vergleichsbeispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die α-Glucosidase im Reagens zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität gegen eine handelsübliche, aus Hefe stammende α-Glucosidase (0 bis 180 Einheiten pro ml, hergestellt von Toyo Boseki, Kabushiki Kaisha) ersetzt wurde, und die erforderlichen Mengen der α-Glucosidase bestimmt (Fig. 2). Auch wenn die aus Hefe stammende α-Glucosidase in einer Menge von 180 Einheiten pro ml zugesetzt wurde, erreichte die Absorptionsänderung nicht den in Beispiel 2 erhaltenen Wert.

Beispiel 3

(1) Die folgenden Lösungen wurden als Reagens zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität hergestellt:
(A) 4 mM 3-Ketobutyliden-ß-2-chlor-4-nitrophenylmaltopentosid, gelost in 0,05 M PIPES-Puffer (pH 7,0), enthaltend 1 mM Calciumchlorid,
(B) α-Glucosidase, die aus Bacillus stearothermophilus stammte, gelöst in 0,05 M PIPES-Puffer (pH 7,0), 4 Einheiten pro ml, und ß-Glucosidase, 2 Einheiten pro ml.
(2) Die α-Amylase-Aktivität wurde durch das folgende Verfahren bestimmt.
Nach Mischung von 1,4 ml Lösung (A) mit 1,4 ml Lösung (B) wurden 0,2 ml der α-Amylase-Lösung, verdünnt auf verschiedene Konzentrationen im Bereich von 0 bis 1200 Somogyi-Einheiten pro Liter, zugegeben und die Umsetzung drei Minuten bei 37ºC durchgeführt, anschließend folgte die Bestimmung der Absorptionszunahme pro Minute bei 400 nm. Die Beziehung zwischen der α-Glucosidase-Konzentration und der Absorptionsänderung pro Minute ist in Figur 3 dargestellt. Wie aus Fig. 3 ersichtlich ist, konnte zwischen der α-Amylase-Konzentration und der Absorptionsänderung eine lineare Beziehung festgestellt werden.

Beispiel 4

(1) Die folgenden Lösungen wurden als Reagens zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität hergestellt:
(A) 6 mM Ethyliden-α-4-nitrophenylmaltoheptosid, gelöst in 0,1 M PIPES-Puffer (pH 7,0), enthaltend 1 mM Calciumchlorid,
(B) α-Glucosidase aus Bacillus stearothermophilus, gelöst in 0,1 M PIPES-Puffer (pH 7,0), in verschiedenen Konzentrationen von α-Glucosidase im Bereich von 0 bis 8 Einheiten pro ml.
(2) Die α-Amylase-Aktivität wurde durch das folgende Verfahren bestimmt.
Nach Mischung von 1,4 ml Lösung (A) mit 1,4 ml Lösung (B) wurden 0,2 ml einer α-Amylase-Standardlösung (130 Somogyi-Einheiten pro Liter, hergestellt von The Green Cross Corporation) zugegeben und die Umsetzung drei Minuten bei 37ºC durchgeführt, anschließend folgte die Bestimmung der Absorptionszunahme pro Minute bei 405 nm. Die Beziehung zwischen der α- Glucosidase-Konzentration und der Absorptionsänderung pro Minute ist in Figur 4 dargestellt. Wie aus Fig. 4 ersichtlich ist, bestand kein Unterschied in der Absorptionsänderung, wenn α-Glucosidase in verschiedenen Mengen von 2 Einheiten pro ml oder mehr zugegeben wurde. Das heißt, die α-Glucosidase zeigte eine vollständige Hilfsenzymreaktion, wenn sie dem Reagens zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität der vorliegenden Erfindung in einer Menge von 2 Einheiten pro ml zugegeben wurde.
Demgemäß ermöglicht die vorliegende Erfindung bei der Bestimmung der α-Amylase-Aktivität eine effiziente Hilfsenzymreaktion, eine Bestimmung mit guter Empfindlichkeit und eine schwache Blindreaktion des Reagens, wobei die α-Glucosidase verwendet wird, die befähigt ist, effektiv auf die Glucose, an die eine Markierung in Position 1 durch eine α-glucosidische Bindung gekoppelt ist, und auf alle Maltooligosaccharide, die aus 2 bis 7 Glucoseeinheiten zusammengesetzt sind, zu wirken.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität, umfassend:

Inkontaktbringen einer Probe mit einer α-Glucosidase in Gegenwart eines α-Amylase-Substrats und

optische Bestimmung einer freigesetzten Markierung;

wobei das Substrat ein aus mindestens drei Glucoseeinheiten zusammengesetztes Maltooligosaccharid ist, dessen reduzierende terminale Glucose mit einer optisch meßbaren Markierung in Position 1 durch eine α-glucosidische Bindung oder eine ß-glucosidische Bindung gekoppelt ist und dessen nichtreduzierende terminale Glucose durch einen Substituenten, der nicht Glucose ist, modifiziert ist, und

wobei die α-Glucosidase auf Glucose, an die diese Markierung in Position 1 durch α-glucosidische Bindung gekoppelt ist, und auf alle Maltooligosaccharide einwirkt, die aus 2 bis 7 Glucoseeinheiten zusammengesetzt sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine ß-Glucosidase zusammen mit der α-Glucosidase verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die α-Glucosidase aus einem Stamm der Gattung Bacillus stammt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die α-Glucosidase aus einem Stamm, der zu Bacillus stearothermophilus gehört, stammt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Markierung ein substituierter oder unsubstituierter Phenolrest ist.

6. Reagens zur Bestimmung der α-Amylase-Aktivität, umfassend:

(a) ein α-Amylase-Substrat, das ein aus mindestens drei Glucoseeinheiten zusammengesetztes Maltooligosaccharid ist, dessen reduzierende terminale Glucose mit einer optisch meßbaren Markierung in Position 1 durch eine α- glucosidische Bindung oder eine ß-glucosidische Bindung gekoppelt ist und dessen nichtreduzierende terminale Glucose durch einen Substituenten, der nicht Glucose ist, modifiziert ist, und

(b) α-Glucosidase, die im wesentlichen befähigt ist, auf Glucose, an die die optisch meßbare Markierung in Position 1 durch eine α-glucosidische Bindung gekoppelt ist, und auf alle Maltooligosaccharide einzuwirken, die aus 2 bis 7 Glucoseeinheiten zusammengesetzt sind.

7. Reagens nach Anspruch 6, das ferner eine ß-Glucosidase umfaßt.

8. Reagens nach Anspruch 6, wobei die α-Glucosidase aus einem Stamm der Gattung Bacillus stammt.

9. Reagens nach Anspruch 6, wobei die α-Glucosidase aus einem Stamm, der zu Bacillus stearothermophilus gehört, stammt.

10. Reagens nach Anspruch 6, wobei die Markierung ein substituierter oder unsubstituierter Phenolrest ist.