DE2649749C2 - - Google Patents
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
Description
Aus der deutschen Patentschrift 25 06 712
ist ein Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin
oder gebundenem Cholesterin durch Freisetzung des gebundenen
Cholesterins mit Cholesterinesterase und Bestimmung des freien
Cholesterins mit einem Cholesterin umsetzenden Enzym bekannt. Als
Cholesterin umsetzendes Enzym wird dort Cholesterinoxydase genannt,
welche in Anwesenheit von Luftsauerstoff Cholesterin unter
Bildung von H₂O₂ in Cholestenon überführt.
Der besondere Vorteil des oben beschriebenen Verfahrens ist darin
zu sehen, daß es eine vollenzymatische Bestimmung des Cholesterins
in biologischem Material ermöglicht, wo Cholesterin gewöhnlich sowohl
in freier als auch in gebundener Form als Ester vorliegt.
Durch diese vollenzymatische Bestimmung wird die früher übliche,
mindestens zweistufige Bestimmung, bei der die Verseifung des Esters
in einer gesonderten Stufe durchgeführt werden mußte, wesentlich
vereinfacht.
Aus Biochimica et Biophysica Acta, 348 (1974), 279-284, war
bereits bekannt, daß Eubacterium Sp. ATCC 21 408 ein Enzym
enthält, das die CC-Doppelbindung des Cholesterins unter
Bildung von Coprostanol hydriert. Es war daher nicht vorsehbar,
daß der gleiche Organismus ein Enzym enthalten könnte,
das die 3-β-OH-Gruppe des Cholesterins quantitativ zum Enon
dehydriert.
Bei analytischen und klinischen Bestimmungen wird sehr
häufig von Methoden Gebrauch gemacht, die in gekoppelten
Reaktionen schließlich zur Reduktion von NAD oder NADP unter
Bildung von NADH bzw. NADPH führen, da sich letztere Umsetzung
besonders einfach in üblichen und weit verbreiteten
Photometern verfolgen läßt. Die oben beschriebene, vollenzymatische
Cholesterinesterbestimmung läßt sich jedoch nur auf
recht komplizierte und umständliche Weise so mit nachgeschalteten
enzymatischen Reaktionen koppeln, daß schließlich NADH
bzw. NADPH gemessen werden kann. Nunmehr wurde gefunden, daß
es möglich ist, diese Schwierigkeit zu beseitigen und eine
vollenzymatische Bestimmung für Cholesterinester oder Gemische
von Cholesterinester und freiem Cholesterin zu schaffen,
welches sowohl die direkte Messung der NADH- bzw.
NADPH-Konzentration ohne zwischengeschaltete Reaktionen und
damit zusätzlichen Aufwand und zusätzliche Fehlermöglichkeiten,
als auch die beim bisher bekannten vollenzymatischen
Verfahren gegebene Möglichkeit der Bestimmung von gebildeten
Cholestenon ermöglicht.
Erreicht wird dies erfindungsgemäß durch das Verfahren gemäß
Hauptanspruch.
Bevorzugt wird dieses Verfahren gemäß Patent 25 06 712
unter Verwendung
einer Cholesterinesterase aus Mikroorganismen durchgeführt.
Das Verfahren kann jedoch auch mittels Cholesterinesterase
aus Pankreas oder Leber durchgeführt werden. Die Verwendung
des letzteren Enzyms zu diesem Zweck ist bereits bekannt aus
der DE-AS 22 24 132.
Die Erfindung beruht in der Verwendung einer NAD- bzw.
NADP-abhängigen Cholesterindehydrogenase aus dem anaeroben
Eubacterium Sp. ATCC 21 408.
Anstelle des beschriebenen mikrobiellen Enzyms ist es
auch möglich, eine aus Warmblüterleber gewonnene Cholesterindehydrogenase
zu verwenden.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise
Cholesterinesterase und NAD- bzw. NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase
der zur bestimmenden Probe gleichzeitig,
zweckmäßig als Mischung der Enzyme, zugesetzt.
Es ist aber natürlich auch möglich, die Enzyme nacheinander
zuzusetzen und beispielsweise erst die Verseifung
des Cholesterinesters durch die Cholesterinesterase aus
Mikroorganismen vollständig ablaufen zu lassen, ehe die
erfindungsgemäß verwendete Cholesterindehydrogenase
zugegeben wird. Bei einer derartigen Arbeitsweise ist
eine Cholesterinesterase aus Mikroorganismen zu verwenden,
um eine vollständige Esterspaltung auch in Abwesenheit
des Cholesterins weiter umsetzenden Enzyms zu
gewährleisten.
Die erfindungsgemäß verwendete NAD- oder NADP-abhängige
Cholesterindehydrogenase dehydriert Cholesterin unter
Bildung von Cholestenon und überträgt den abgespalteten
Wasserstoff dabei auf NAD bzw. NADP unter Bildung von
NADH bzw. NADPH, die, wie oben erwähnt, im Photometer
direkt gemessen werden können. Auf diese Weise ergibt
sich eine besonders einfache Bestimmungsmethode, die
keiner nachgeschalteten Meßreaktion bedarf. Die photometrische
Bestimmung von NADH bzw. NADPH ist dem Fachmann
geläufig und braucht hier nicht weiter beschrieben
zu werden.
Wahlweise ist es beim erfindungsgemäßen Verfahren aber auch
möglich, gebildetes Cholestenon zu bestimmen. Die Cholestenonbestimmung
erfolgt dabei zweckmäßig durch Zugabe eines
Hydrazinderivates, welches mit der Ketogruppe des Cholestenons
unter Hydrazonbildung zu reagieren vermag. Bevorzugt
wird hierzu 2,4-Dinitrophenylhydrazin verwendet, da dieses
mit dem Cholestenon ein Hydrazon bildet, welches im Photometer
bei 405 nm leicht gemessen werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei pH-Werten zwischen
4,5 und 8,5 durchgeführt werden. Der bevorzugte pH-Bereich
liegt zwischen 5 und 8. Die Pufferlösungskonzentration ist
nicht kritisch, gute Ergebnisse werden zwischen 0,05 und
0,8 M erzielt. Bevorzugt wird der Bereich zwischen 0,1 und
0,6 M.
Wahlweise kann beim erfindungsgemäßen Verfahren außer dem
Puffer auch ein Stabilisierungsmittel und/oder zur Verhinderung
des Auftretens von Trübungen bzw. Aktivierungen ein
oberflächenaktives Mittel zugesetzt werden. Als Stabilisierungsmittel
kommen die üblichen für Enzyme bzw. NAD oder
NADP verwendeten Stabilisierungsmittel in Betracht. Notwendig
sind sie nicht. Desgleichen kann auch ohne Zusatz eines
oberflächenaktiven Mittels gearbeitet werden, insbesondere
wenn feststeht, daß die Cholesterinkonzentration in der zu
untersuchenden Probe nicht so hoch ist, daß ein Auftreten
von Trübungen, die den optischen Test stören könnten, zu
befürchten ist.
Für die Gewinnung des erfindungsgemäß zu verwendenden NAD-
bzw. NADP-abhängigen Enzyms ist es erforderlich, Eubacterium
Sp. ATCC 21 408 unter streng anaeroben Bedingungen zu
züchten. Der Luftausschluß wird dabei zweckmäßig durch
Zugabe eines Sauerstoff entfernenden Mittels wie
Methylenblau und Aufrechterhaltung einer Inertgasatmosphäre
erzielt. Als Inertgas können beispielsweise Stickstoff,
Wasserstoff, Edelgas oder
Mischungen davon verwendet werden. Insbesondere hat sich ein
Gemisch von Stickstoff und Wasserstoff als günstig erwiesen.
Ein geeignetes Nährmedium für die Züchtung von Eubacterium
Sp. ATCC 21 408 weist beispielsweise folgende Zusammensetzung,
bezogen auf 1 l Medium auf:
20 bis 80 ghomogenisiertes, frisches Hirn
5 bis 25 gHefeextrakt
5 bis 25 gCasaminosäuren
1 bis 5 gNaCl
1 bis 3 gAlkalithioglycolat
0,5 bis 5 gCholesterin oder ein anderes 3-β-OH-Steroid
0,5 bis 1,5 gNaHCO₃
0,2 bis 1 gL-Cystin
5 bis 10 ml0,05%ige Methylenblaulösung.
Der pH-Wert des Mediums sollte annähernd neutral sein. Vor
der Beimpfung mit den Mikroorganismen muß das Medium durch
Erhitzen sauerstofffrei gemacht werden. Alle Manipulationen
einschließlich der Aufreinigung müssen in Inertatmosphäre
durchgeführt werden.
Als Züchtungsdauer erwies sich eine 30- bis 40stündige
Bebrütung bei 37 bis 40°C als gut geeignet. Am Ende dieser
Züchtungsperiode nimmt das Medium eine gallertartige Beschaffenheit
an. Durch Zentrifugieren und Resuspension in Puffer,
zweckmäßig Phosphatpuffer pH 6 bis 8, wird die Biomasse auf
etwa 20% konzentriert.
Der anschließende Aufschluß erfolgt vorzugsweise mechanisch
und nicht durch chemische Mittel. Gut geeignet erwies sich
der Ultraschallaufschluß oder das Zerreiben mit feinen
Glasperlen oder dergleichen. Diese und andere geeignete
mechanischen Aufschlußmethoden sind dem Fachmann bekannt und
brauchen hier nicht näher beschrieben zu werden. Vorzugsweise
wird bei diesem Aufschluß in Abwesenheit eines oberflächenaktiven
Mittels gearbeitet.
Unlösliche Bestandteile werden aus dem gewonnenen Aufschlußmaterial
abzentrifugiert. Der so erhaltene Rohextrakt kann
zwar bereits direkt für das erfindungsgemäße Verfahren
eingesetzt werden, vorzugsweise wird das Enzym jedoch konzentriert
durch Ausfällung mit einem der üblichen Fällungsmittel
wie Ammonsulfat. Bei Verwendung von Ammonsulfat wird
letzteres vorzugsweise bis zu einer Konzentration von 3,1 M
zugesetzt. Der gewonnene Niederschlag kann dann direkt für
die Bestimmung eingesetzt oder weiter gereinigt werden. Eine
Weiterreinigung ist beispielsweise durch Säulenchromatographie,
Molekularsiebchromatographie oder andere bekannte
biochemische Reinigungsmethoden, die hier nicht im einzelnen
beschrieben werden sollen, möglich.
Wird statt des mikrobiellen Enzyms ein solches aus Warmblüterleber
verwendet, so läßt sich ein analoges Reinigungsverfahren
anwenden. Hierbei wird zweckmäßig die zwischen 30 und 50%
Ammonsulfatsättigung ausfallende Fraktion für die Bestimmung
verwendet.
Bei der Züchtung des Eubacteriums Sp. wird dem Nährmedium
als eine 3-β-OH-Gruppe enthaltendes Steroid zweckmäßig eine
der in der DE-OS 24 56 586 aufgeführten Substanzen oder eine
Mischung davon zugesetzt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur
Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens, welches in
einer ersten Ausführungsform Cholesterinesterase, NAD- bzw.
NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase, NAD oder NADP,
Puffer und gegebenenfalls Stabilisierungsmittel und/oder ein
oberflächenaktives Mittel enthält oder daraus besteht.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform besteht ein derartiges Reagens
aus Cholesterinesterase, NAD- bzw. NADP-abhängiger Cholesterindehydrogenase,
NAD(P), einem System zur Bestimmung von Cholestenon, Puffer
und gegebenenfalls Stabilisierungsmittel oder/und einem oberflächenaktiven
Mittel. Als System zur Bestimmung von Cholestenon
wird vorzugsweise ein mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierendes
Hydrazinderivat verwendet. Besonders bevorzugt wird
2,4-Dinitrophenylhydrazin als System zur Bestimmung von Cholestenon.
Die quantitative Zusammensetzung eines derartigen Reagens beträgt
zweckmäßig 0,04 bis 4 U Cholesterinesterase, 0,04 bis 50 U NAD-
bzw. NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase und 10 bis 100 mM
NAD bzw. NADP sowie, im Falle der Bestimmung von Cholestenon, 0,5 bis 10 mM
Hydrazinderivat, bezogen auf 2 ml Reagens. Falls das Reagens ein oberflächenaktives
Mittel wie Hydroxypolyäthoxydodecan enthält, so liegt dessen Konzenstration
zweckmäßig 0,1 bis 1%, entsprechend 0,002 bis 0,02 ml,
bezogen auf 2 ml Reagens (die in einem Testansatz üblicherweise
eingesetzte Menge).
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und Reagens läßt sich eine
sehr rasche und vollständige Bestimmung von gebundenem und freiem
Cholesterin, insbesondere auch in biologischen Proben wie Serum,
Blut und dergleichen durchführen. Ein besonderer Vorteil liegt
darin, daß keine zusätzlichen Meßreaktionen angekoppelt werden
müssen und die Bestimmung direkt mit den weitverbreiteten einfachen
Photometern durchgeführt werden kann.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Die Beispiele 1 und 4 erläutern die Herstellung der Cholesterindehydrogenase.
Eubacterium spec. ATCC 21 408, ein streng anaerober Mikroorganismus,
wird auf ein Medium folgender Zusammensetzung überimpft:
pro Liter
50 gfrisches Kalbshirn (homogenisiert)
15 gHefeextrakt (DIFCO)
15 gCasamino acids
2,5 gNaCl
2,0 gNatriumthioglycolat
2,0 gCholesterin
1,0 gNaHCO₃
0,5 gL-Cystin
7,5 g0,05%ige Methylenblaulösung
(pH-Wert 6,9-7,1; die Medien werden unmittelbar
vor Beimpfung durch Erhitzen sauerstofffrei
gemacht; alle Manipulationen - einschließlich
Aufreinigen - erfolgen im Isolator in N₂/H₂-
Atmosphäre).
Nach 30 bis 40 Stunden Bebrütung bei 37 bis 40°C hat sich das
Medium gallertartig verändert. Durch Zentrifugation und Resuspension
in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,5 wird die Biomasse 1 : 5 konzentriert
und dann in der Sorvallmühle (+ ⌀ 0,25-mm-Glasperlen 1 : 1,
3 min, Schalterstellung 4) aufgeschlossen.
Zum zentrifugierten Rohextrakt wird Ammonsulfat bis zu einer
Konzentration von 3,1 M gegeben; die Fällung wird in 0,05 M
Phosphatpuffer pH 7,5 aufgenommen und auf eine Säule, die mit
Molekularsiebmaterial auf Basis von vernetztem Dextran gefüllt
ist, gegeben. Die Elution erfolgt wieder mit 0,05 M Phosphatpuffer
pH 7,5; die aktiven Fraktionen werden vereinigt und eingefroren.
Beispiel 2 (nachgereicht)
0,02 ml Serum werden zu 1,0 ml 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer pH 7,5
der 0,4% Hydroxypolyäthoxydodecan enthält, gegeben. Nach Zugabe
von 0,02 ml (= 2 U) Cholesterinesterase-Lösung sowie 0,05 ml
Cholesterindehydrogenase-Lösung von Beispiel 1 und 0,1 ml NADP-Lösung (13 mM)
und Inkubation für 30 Min. bei 25°C werden 2 ml 1 mM 2,4-Dinitrophenylhydrazin
10%ige Salzsäure-Lösung zum Reaktionsgemisch pipettiert. Nach
einer weiteren 30minütigen Inkubation bei 25°C werden 3,0 ml
Wasser zur Reaktionslösung gegeben und anschließend gegen einen
Reagentien-Leerwert (anstatt Serum wird Wasser eingesetzt) bei
405 nm in einem geeigneten Photometer gemessen.
Die Auswertung erfolgt über einen mitgeführten Cholesterin-Standard.
Die Messung einer typischen Probe ergab 147 mg Cholesterin/100 ml
Serum. Die Vergleichsbestimmung mit einem handelsüblichen Reagens
auf Basis von Cholesterinoxydase ergab 149 mg Cholesterin/100 ml
Serum.
Beispiel 3 (nachgereicht)
1,89 ml Phosphatpuffer, pH 7,5 (0,5 M), der 0,4% Hydroxypolyäthoxydodecan
enthält, werden mit 0,1 ml NADP-Lösung (13 mM) und 0,02 ml Serum gemischt
und in eine Küvette gegeben. In einem geeigneten Photometer
wird bei 365 nm die Extinktion E₁ abgelesen. Nach Zugabe von
0,02 ml (=2 U) Cholesterinesterase-Lösung und 0,05 ml Cholesterindehydrogenase-
Lösung nach Beispiel 1 wird bei 25°C im Wasserbad
inkubiert.
Nach 30 min wird die Extinktion E₂ abgelesen. Die Extinktionsdifferenz
E₂-E₁ = E geht in die Berechnung ein.
Die Berechnung erfolgt nach dem Lambert-Behr'schen Gesetz. Die
Messung einer typischen Probe ergab 150 mg Cholesterin/100 ml
Serum. Eine Vergleichsbestimmung mit einem handelsüblichen Reagens
auf Basis von Cholesterinoxydase ergab 149 mg Cholesterin/100 ml
Serum.
Beispiel 4
Gewinnung einer Cholesterindehydrogenase aus Rattenleber
Rattenleber wird mit der 3fachen Menge 0,25 M Saccharose homogenisiert
und bei 80 000 G zentrifugiert. Der erhaltene Überstand
wird bei pH 7,0 mit Ammonsulfat auf 30% Sättigung gebracht
und der Niederschlag abzentrifugiert. Der Überstand wird mit einem
gleichen Volumen gesättigter Ammonsulfat-Lösung versetzt und der
erhaltene Niederschlag abzentrifugiert und gegen destilliertes
Wasser dialysiert.
Das Dialysat wird mit 1 M Phosphat-Puffer auf 0,2 M Phosphatgehalt
und pH 6,0 eingestellt und mit 0,1 Vol. Aluminiumoxydgel
versetzt. Die Suspension wird dann zentrifugiert, der Niederschlag
verworfen und der Überstand mit Ammonsulfat bis 2,7 M versetzt.
Der hierbei auftretende Niederschlag wird abzentrifugiert
und auf c = 10 ml aufgelöst. Die erhaltene Enzymlösung enthält
ca. 0,005 U/ml.
1 ml dieser Lösung gibt nach dem in den Beispielen 2 und 3 beschriebenen
Verfahren anstelle des dort verwendeten Dehydrogenasepräparates
praktisch gleiche Resultate.
Claims (9)
1. Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin
oder gebundenem Cholesterin durch Freisetzung des
gebundenen Cholesterin mit einer Cholesterinesterase
und gleichzeitige oder anschließende Bestimmung
des freigesetzten Cholesterins mit einem
Cholesterin umsetzenden Enzym, insbesondere nach
Patent 25 06 712,
dadurch gekennzeichnet,
daß als Cholesterin umsetzendes
Enzym eine NAD- bzw. NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase,
die aus Eubacterium Sp. ATCC 21408
gewonnen wurde, oder aus Warmblüterleber verwendet
wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß Cholesterinesterase und NAD- bzw. NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase
der zu bestimmenden Probe gleichzeitig
zugesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß ein durch
mechanischen Aufschluß des Eubacterium in Abwesenheit
von oberflächenaktiven Mitteln und Abtrennung
der unlöslichen Bestandteile gewonnenes Enzympräparat
verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch
gekennzeichnet, daß ein durch
Ammonsulfatzusatz bis zu einer Konzentration von
3,1 M gefälltes, gereinigtes Cholesterindehydrogenasepräparat
verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß eine Cholesterindehydrogenase aus Eubacterium Sp. ATCC 21 408 verwendet wird, wobei
das Bakterium in sauerstofffreier Atmosphäre in einem
Thioglycolsäure und ein eine 3-β-OH-Gruppe
aufweisendes Steroid enthaltenden Nährmedium
gezüchtet wurde.
6. Reagens zur Durchführung des Verfahrens von Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet,
daß es
Cholesterinesterase
NAD- bzw. NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase
NAD oder NADP
Puffer und gegebenenfalls
Stabilisierungsmittel und/oder
ein oberflächenaktives Mittel enthält oder daraus besteht.
Cholesterinesterase
NAD- bzw. NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase
NAD oder NADP
Puffer und gegebenenfalls
Stabilisierungsmittel und/oder
ein oberflächenaktives Mittel enthält oder daraus besteht.
7. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß es
Cholesterinesterase
NAD- bzw. NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase
ein NAD- oder NADP-System zur Bestimmung von Cholestenon
Puffer und gegebenenfalls
Stabilisierungsmittel und/oder ein oberflächenaktives Mittel enthält oder daraus besteht.
Cholesterinesterase
NAD- bzw. NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase
ein NAD- oder NADP-System zur Bestimmung von Cholestenon
Puffer und gegebenenfalls
Stabilisierungsmittel und/oder ein oberflächenaktives Mittel enthält oder daraus besteht.
8. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß das System zur
Bestimmung von Cholestenon ein mit Ketogruppen
unter Hydrazonbildung reagierendes Hydrazinderivat
ist.
9. Reagens nach Anspruch 8, gekennzeichnet
durch einen Gehalt an 2,4-Dinitrophenylhydrazin.
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