SE532009C2 - Anordning och förfarande för kolesterolbestämning - Google Patents

Description

25 30 532 ÜÜQ kolesteroloxidas. Detta enzym utmärker sig av god stabilitet, det är lätt att använda och det är kommersiellt tillgängligt.

Ett annat enzym som används vid kolesterolbestämningar är kolesteroldehydrogenas, användningen av vilken visas i en analytisk del av patentpublikationen EP O 244 825. I enlighet med denna publikation så måste proven inkuberas vid en särskild temperatur under en förbestämd tidsperiod.

Användningen av kolesteroldehydrogenas för bestämning av kolesterol visas även i t ex US-patenten 4 829 816 och 4 181 575. Båda dessa patent avser bestämningen av totalt kolesterol med hjälp av våtkemiska metoder som inkluderar långa inkubationstider och definierade temperaturer.

I avsikt att åstadkomma ett nytt, snabbt och enkelt förfarande för bestämningen av totalt kolesterol i blod så studerades särskilt en anordning (mikrokyvett) av engångstyp, som inkluderar ett torrt reagens, av den typ som först visades i US-patentet 4 088 448 eftersom användnigen av denna typ av mikrokyvett erbjuder flera fördelar. Denna mikrokyvett medger provtagning av vätskor, blandning av provet med ett lämpligt reagens, tex för färgutveckling, i samma kärl som det som används för den efterföljande mätningen. Vidare så förenklas provtagningsproceduren, antalet redskap reduceras i de flesta fall, beroende på typ av analys, analysens exakthet förbättras avsevärt genom att man gör analysförfarandet oberoende av handhavandetekniken hos operatören som utför analysen. Proceduren är även anmärkningsvärt snabb och eftersom den medger att provvätskan omedelbart blandas med reagenset och sedan medger mätning kort därefter, utan tidskrävande mellansteg.

Svften med uppfinningen _ Ett syfte med föreliggande uppfinning avser en provtagningsanordning och ett förfarande för enkel kvantitativ bestämning av totalt kolesterol i blod.

Ett annat syfte med uppfinningen avser en provtagningsanordning och ett förfarande för kvantitativ bestämning av totalt kolesterol i blod, vilket förfarande kan utföras vid rumstemperatur. 10 15 20 25 30 5532 ÜÜÜ Ett annat syfte med uppfinningen är att åstadkomma en provtagnings- anordning som inkluderar en kolesterolreagenskomposition som kan lagras under långa tidsperioder.

Ytterligare ett annat syfte med uppfinningen är att åstadkomma en provtagningsanordning för snabb kvantitativ bestämning av totalt kolesterol i blod.

Ytterligare ett annat syfte med uppfinningen är att åstadkomma en provtagningsanordning för kvantitativ slutpunktsbestämning (”end-point”~ bestämning) av totalt kolesterol i blod.

Ytterligare ett annat syfte med uppfinningen är att åstadkomma en provtagningsanordning för kvantitativ bestämning av totalt kolesterol i serum/plasma, varvid outspätt helblod införs l anordningen.

Sammanfattning av uppfinningen Under utvecklingen av den uppfinningsenliga provtagningsanordnlngen och det uppfinnlngsenliga förfarandet så misslyckades flera försök med att använda kolesteroloxidaset i en mikrokyvett l enlighet med US-patentet 4 088 448 (såsom diskuteras ovan) och inga reproducerbara resultat kunde erhållas. Det antas att dessa misslyckanden var beroende på det faktum att mikrokyvettens konstruktion med den kapillära öppningen skapade en specifik reaktionsmiljö i mikrokyvetten och att denna miljö inte är lämplig för reaktioner med kolesteroloxldas. lnte heller fungerade det andra enzymet, kolesteroldehydrogenas, tillfredsställande i kombination med de andra reagensen som är nödvändiga för kolesterolbestämningen. Man upptäckte dock överraskande att om ett buffrande ämne, vilket behövs för reaktionen, separerades från resten av reagenskompositionen inklusive dehydrogenaset i anordningen så kunde en framgångsrik temperaturoberoende kvantitativ slutpunktsbestämning av totalt kolesterol erhållas.

Man upptäckte att syftena ovan uppnåddes helt eller delvis genom en uppfinningsenlig provtagningsanordning och även genom användning av ett uppfinningsenligt förfarande, såsom definieras nedan. 10 15 20 25 30 532 ÜÜH Den uppfinningsenliga provtagningsanordningen är en provtagnings- anordning för upptagning av ett blodprov och för tillhandahållande av blod- provet för analys av totalt kolesterol i nämnda blodprov, varvid nämnda anordning innefattar: en mottagningskavitet för mottagande, genom kapillär verkan, av blodprovet som skall analyseras, varvid nämnda mottagnings- kavitet har en förbestämd liten volym; och en analyskavitet, anordnad i förbindelse med mottagningskaviteten, varvid nämnda analyskavitet har en förbestämd optisk våglängd; varvid nämnda mottagningskavitet innehåller en torkad buffert, och nämnda analyskavitet innehåller ett torkat reagens.

Det uppfinningsenliga förfarandet är ett förfarande för kvantitativ bestämning av den totala kolesterolkoncentrationen i ett blodprov av serum/plasma genom slutpunktsanalys innefattande: a) att man bringar serum/plasma i kontakt med en torkad buffert, varvid bufferten löses i blodprovet och buffrar detta; b) att man bringar en liten, definierad volym av det buffrade serumet/plasman i kontakt med ett torkat reagens, varvid nämnda reagens innefattar kolesteroldehydrogenas; kolesterolesteras; en eller flera substanser ur gruppen som består av diaforas, fenazin-metosulfat, fenazin-etosulfat, fenazin-fenosulfat och Meldolas blått; en eller flera substanser ur gruppen som består av NAD, NADP, tio-NAD, tio-NADP, nikotinamld-purin-dinukleotid, nikotinamid-metylpurin-dinukleotid och nikotinamid-2-klor-metylpurin-dinukleotid; ett eller flera ytaktiva ämnen ur gruppen som består av polyoxietylener, alkylglukosider, tio-glukosider, sampolymer och gallsyror; och ett redox-indikatorfärgämne; och c) att man genom transmissionspektrofotometri över en förbestämd optisk våglängd mäter färgförändringen som orsakas av reaktionen mellan reagenset och kolesterol i den definierade volymen av det buffrade serumet/plasman i avsikt att kvantitativt bestämma kolesterolkoncentrationen däri.

Kort beskrivning av ritninoarna Figur 1 är en schematisk vy framifrån av en utföringsform av den uppfinningsenliga provtagningsanordningen. Figur 1 åskådliggör även schematiskt en utföringsform av användningen av nämnda provtagnings- anordning. 10 15 20 25 30 532 005 Figur 2 är en graf som visar korrelationen mellan kolesterolbestämning i enlighet med en utföringsform av det uppfinningsenliga förfarandet och ett referensförfarande.

Detalierad beskrivninqav uppfinningen Uppfinningen hänför sig särskilt till total kolesterolbestämning i små blodvolymer. l detta sammanhang så avser begreppet "blod" att betyda hetblod, plasma och/eller serum. l enlighet med en föredragen utföringsform av uppfinningen så är det blod som införs in i anordningen vare sig utspätt eller förbehandlat. Begreppet ”små volymer” betyder volymer mellan 0,1 och 0,001 ml, företrädesvis mellan 0,03 och 0,001 ml.

Beteckningen ”serum/plasma” eller "plasma/serum" är avsedd att innefatta blodserum, blodplasma och vilka som helst mellansteg däremellan.

Anledningen till att i vissa fall inte uttryckligt definiera en blodfraktion som "serum" eller "plasma" är att ifall ett blodprov analyseras, utan tillsats av antikoagulanter, inom några få minuter efter det att blodprovet förvärvats från en patient så kommer verkligt serum inte hinna bildas, och mätningen utförs på ett mellanliggande steg mellan plasma och serum efter avlägsnade av blodkropparna. lfall avlägsnandet av blodkropparna och mätningen utförs nästan omgående efter det att blodet förvärvats från en patient så kommer mätningen i huvudsak att göras på plasma. En blodkomponent som förekommer i både plasma och serum kommer, på grund av avlägsnandet av fibrinogenet från serum, förekomma i en koncentration på 3% mindre i plasma ijämförelse med koncentrationen i serum.

I denna ansökan avses begreppet "kavitet" att tolkas som en volym eller kammare som definieras av väggytor. Kaviteterna (volymerna) hos anordningen enligt föreliggande uppfinning är dock inte fullständigt definierade, eller inneslutna, av dessa ytor, utan har inlopp och/eller utlopp där ytorna inte är fullständigt sammanfogade. Kaviteterna (volymerna) är vanligen inte evakuerade, utan kan innehålla gas (vanligen luft), ett torkat reagens och/eller buffert, en vätska (såsom ett blodprov när anordningen används), etc. 10 15 20 25 30 532 OÜB Provtagningsanordningen enligt föreliggande uppfinning är utformad på så sätt att den håller den torkade bufferten separerad från det torkade reagenset, och gör det på så sätt möjligt att hålla reagenset vid ett pH som är oberoende av buffertens pH medan reagenset är i torkad form (t ex vid lagring av provtagningsanordningen). Genom att man har möjlighet att optimera reagensets pH för lagringsstabilitet så kan den uppfinningsenliga anordningens hållbarhet förbättras avsevärt. Detta kan åstadkommas genom att man utformar provtagningsanordningen med ett flertal kaviteter.

Med andra ord; ifall ett blodprov först bringas i kontakt med bufferten, och löser denna, och sedan bringas i kontakt med reagenset, och löser även detta, så utsätts reagensets föreningar för det pH som ges av bufferten först efter det att de bringats i kontakt med blodprovet. Eftersom det torkade reagenset bringas i kontakt med provet först vid det tillfälle då det är avsett att reagera med detsamma så undviks problem med stabilitet över lång tid avseende reagensets föreningar vid det pH som ges av bufferten med hjälp av denna provtagningsanordning. l sin enklaste form så införs ett serum/plasma-prov in i provtagnings- anordningen, och i detta fall så behövs endast mottagnings- och analys- kaviteterna. l dess kommersiellt mest intressanta form så införs ett prov av outspätt helblod in i anordningen. I detta fall måste anordningen utformas på så sätt att den inkluderar ytterligare kaviteter som är anpassade att avlägsna provets blodkroppar genom centrifugering, eftersom cellerna, ifall de före- kommer i analyskaviteten, kommer störa kolesterolbestämningen. En anordning som visar avlägsnandet av blodkroppar genom centrifugering och som kan används år t ex anordningen enligt US-patentet 5 472 671 (som härmed införlivas genom hänvisning).

Mottagningskaviteten har en förbestämd volym, vilken medger att den mottager en förbestämd oföränderlig blodvolym (serum/plasma) vilken sedan kan överföras till analyskaviteten. Detta säkerställer att en specifik och känd volym bringas att reagera med det torkade reagenset i analyskaviteten.

Analyskaviteten har en förbestämd optisk väglängd, vilken säkerställer att när en fotometer används över analyskaviteten i avsikt att erhålla ett 10 15 20 25 30 532 ÜÜÜ mätvärde så kan detta värde direkt korreleras till kolesterolkoncentrationen hos blodet däri.

För bestämningen av totalt kolesterol i en serumfraktion så kan det uppfinningsenliga förfarandet således även inkludera centrifugering av helblod för avlägsnade av blodkroppar och fibrinogen från helblodet innan det på så sätt erhållna serumet bringas i kontakt med det torra reagenseti provtagningsanordningen.

På liknande sätt kan det uppfinningsenliga förfarandet, för bestämning av totalt kolesterol i en plasmafraktion, inkludera att man bringar oförändrat helblod i kontakt med en antikoagulant och utsätter den erhållna blandningen för centrifugering i avsikt att avlägsna blodkroppar innan den på så sätt erhållna plasman bringas i kontakt med det torra reagenset i provtagnings- anordningen.

Dessa prepareringssteg, centrifugering eventuellt föregått av användning av en antikoagulant, kan utföras innan blodprovet införs in i provtagningsanordningen, eller efter att helblod införts, genom t ex centrifugering av provtagningsanordningen. l det senare fallet, med hänvisning till figur 1, så kan en provtagnlngsanordning som innefattar fyra kaviteter användas: en första kavitet 1 (en inloppskavitet) i förbindelse med provtagningsanordningens omgivning via ett inlopp, och eventuellt innehållande ett torrt tillsatsmedel såsom ett vätningsmedel, för mottagande av ett blodprov, företrädesvis helblod, från anordningens omgivning genom kapillär verkan; en andra kavitet 2 (en centrifugeringsmottagningskavitet), företrädesvis icke-kapillär, iförbindelse med den första kaviteten 1 och in i vilken provet kan överföras genom centrifugering; en tredje kavitet 3 (mottagningskaviteten), företrädesvis kapillär och innehållande den torkade bufferten och eventuellt ett vätningsmedel, l förbindelse med den andra kaviteten 2 och in i vilken provets serum/plasma-fraktion kan överföras genom kapillär verkan efter att centrifugeringen avslutats; och en fiärde kavitet 4 (analyskaviteten), i förbindelse med den tredje kaviteten 3 och in i vilken provet kan överföras genom centrifugering, innehållande det torkade reagenset. 10 15 20 25 30 532 ÜÛB En föredragen användning av anordningen med fyra kaviteter ovan är att man inför helblod in i anordningen direkt från en patients stuckna finger.

Med hänvisning till Figur 1 så dras 10 först blodet in i inloppskaviteten 1 genom kapiilär verkan. Detta kan underlättas genom ett vätningsmedel i torr form avsatt i inloppskaviteten 1 vid tillverkningen av anordningen, och genom att anordningen har en spetsig utformning som åstadkommer en spets vid inloppskavitetens 1 inlopp vilket kan bringas i kontakt med blodet från ett stucket finger. Anordningen kan sedan utsättas för centrifugering 11, så att blodet överförs från inloppskaviteten 1 till centrifugeringsmottagningskaviteten 2, och så att blodkopparna i blodet i huvudsak separeras 12 från plasman.

Efter slutet på centrifugeringen dras 13 blodplasman, genom kapiilär verkan, från centrifugeringsmottagningskaviteten 2 in i mottagningskaviteten 3, vari torkad buffert snabbt löses i en specifik plasmavolym definierad av mottagningskavitetens 3 volym. Efter att bufferten har lösts i plasman, och på så sätt buffrat denna, så utsätts anordningen åter för centrifugering 14, varigenom den buffrade plasman överförs till analyskaviteten 4 där det torkade reagenset för kolesterolbestämningen löses i den buffrade plasman.

Efter reaktion med reagenset så bestäms det totala kolesteroleti plasman genom absorptionsfotometri.

Provtagningsanordningen kan vara av engångstyp, dvs den är anordnad att endast användas en gång. Provtagningsanordningen tillhanda- håller ett kit, vilket kan lagras stabilt under en lång tid före användning för utförande av en bestämning av totalt kolesterol, eftersom provtagnings- anordningen är i stånd att mottaga ett vätskeformigt prov och håller samtliga reagens som behövs för att tillhandahålla provet till kolesterolmätning. Detta är särskilt möjliggjort ifall provtagningsanordningen är anpassad för använd- ning endast en gång och kan formas utan beaktande av möjligheten att rengöra provtagningsanordningen och åter anbringa ett reagens. identiska enheter av den uppfinningsenliga provtagningsanordningen kan mass- produceras med en mycket liten avvikelsetolerans, varigenom mätningar som utförs med användning av en specifik enhet direkt kan jämföras med mätningar som gjorts med användning av andra enheter av samma uppfinningsenliga provtagningsanordning. 10 15 20 25 30 532 G09 Provtagningsanordningen kan även gjutas i ett plastmaterial och därigenom tillverkas till låg kostnad. Således kan det fortfarande vara kostnadseffektivt att använda en provtagningsanordning av engångstyp.

Vidare så deformeras anordningen inte vid hantering och användning av anordnlngen, genom att man formar provtagningsanordningen av ett styvt plastmaterial, varigenom oföränderliga volymer och former hos anordningens kaviteter efter tillverkning säkerställs, varigenom även en oföränderlig optisk våglängd säkerställs.

I enlighet med en utföringsform av det uppfinningsenliga förfarandet så utförs de följande reaktionsstegen med de angivna reagensingredienserna: kolesterolesleras 1) Kolesterolester + H20 Kolesterol + RCOOH 2) Kmestero' + N AD., kolesteroldehydrogenas NADH + H* e, Kolest-4-en-3-on + díaforas 3) NADH + MTT _----> Formazan + NAD* ingredienserna i det torkade reagenset är inte begränsade till de vilka exemplifieras i reaktionsschemat ovan, utan diskuteras i mer detalj nedan.

Kolesterolesteraset kan erhållas från olika sorter som har olika molmassa, pH-optimum etc.

Koenzymet kan vara NAD, företrädesvis ß-NAD, NADP, tio-NAD, tio- NADP, nikotinamid-purin-dinukleotld, nikotinamid-metylpurin-dinukleotid och nikotinamid-Z-klor-metylpurin-dinukleotid.

Vidare så kan kolesteroldehydrogenaset erhållas från olika sorter som har olika molmassa, pH-optimum etc. Exempel på publikationer som rör kolesteroldehydrogenas är de offentliga japanska patenten 89 183/1983 och 89 200/1983, vari framställningen av kolesteroldehydrogenas visas. l det uppfinningsenliga förfarandet innefattar kolesteroldehydrogenas enbart NAD- eller NAD-analogberoende enzymer. Även diaforas kan erhållas från olika sorter och är kommersiellt tillgängligt. Diaforas kan dock ersättas med kända substanser, såsom fenazin-metosulfat, fenazin-etosulfat, fenazin-fenosulfat och Meldolas blått 10 15 20 25 30 532 ÜÜÜ 10 etc. Det finns även andra kända NAD-analoger, såsom den bäst kända NADP, som kan reduceras av kolesteroldehydrogenasreaktionen och överföra reduktionen till ett färgämne eller ett färgsystem.

MTT (3-(4,5-dimetyltiazol-2-1)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid) är ett exempel på ett redox-indikatorfärgämne, vilket ger ett gott resultat när den används i det uppfinningsenliga förfarandet, fast många andra tetrazolium- föreningar kan användas. Det förekommer även flera andra kända typer av färgförändrande substanser, vilka är i stånd att ändra färg när de påverkas av NADH och diaforas. Tetrazoliumföreningar är fördelaktiga eftersom formazan- färgen bildas irreversibelt under normala reaktionsförhållanden. l enlighet med en föredragen utföringsform så används MTT som ett redox-indikator- färgämne och absorbansen mäts inom intervallet 630-680 nm, särskilt 640 nm, med en mätning för bakgrundsjustering inom intervallet 700-900 nm, särskilt vid 700 eller 840 nm. våglängden för absorbansmätningen beror på redox-färgen som används. För färger som lämpligen används i enlighet med det uppfinnings- enliga förfarandet kan våglängden variera mellan 500 och 750 nm.

Dessutom kan reagenset innehålla nonjonaktiva ytaktiva ämnen såsom polyoxietylener och/eller alkylglukosider och/eller tio-glukosider och/eller sampolymer och/eller anjonaktiva ytaktiva ämnen såsom gallsyror eller enzym såsom fosfolipas som medel för lysering av lipoproteinet. Dessutom så kan ytaktiva ämnen användas till vätning av den torra reagensmatrlsen. ldealt så bör det ytaktiva ämnet, eller de ytaktiva ämnena, uppvisa de följande egenskaperna: 1. orsaka snabb fästning av det torra reagenset genom att reducera ytspänningen. 2. lysera lipoproteinet i avsikt att frisätta kolesterolet och kolesterolestern 3. hålla den bildade formazanen i lösning 10 15 20 25 *S32 ÜÜQ 11 Halterna av de olika föreningarna i det torkade reagenset är inte kritiska men kan med fördel vara inom de följande intervallen, såsom beräknade för ett prov på 1 ml outspätt helblod: Substans Kvantitet Kolesterolesteras 20 - 5 000 U/ml Kolesteroldehydrogenas 20 - 5 000 U/ml Diaforas (lanaloger) 20 - 50 000 U/ml -NAD (lanaloger) 12 - 100 mmol/ml Redox-indikatorfärg/Tetrazoliumsalt (MTT-Br) (lanaloger) 12 - 25 mmol/ml Triton X-100 0,1 - 5 vikt% Substanserna ovan är blandade i avsikt att bilda en suspension, vilken kan frystorkas i analyskaviteten hos den uppfinningsenliga provtagnings- anordningen.

Uppfinningen àskådliggörs med hjälp av följande icke-begränsande exempel.

Exempel Bestämning av kolesterol i serum/plasma.

En reagenslösning som inkluderar 1% Triton X-100 i vatten fram- ställdes. MTT (3-(4,5-dimetyltiazol-2-1)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid) tillsattes till lösningen och blandades tills MTT:t lösts. En vattenhaltig lösning av kolesteroldehydrogenas, kolesterolesteras, diaforas och ß-NAD tillsattes till den erhållna lösningen och 3-6 pl av denna lösning fylldes i analyskaviteten hos de uppfinningsenliga provtagningsanordningarna av engångstyp. 1 ml av reagenskompositionen inkluderade: 200 U Kolesterolesteras, Genzyme 200 U Kolesteroldehydrogenas, Amano 1700 U Diaforas, Unitika 20 mM ß-NAD, Sigma 15 mM MTT-Br, Acros 10 mg Triton X-100, Merck 1 ml vatten som varit föremål för jonbytning 10 15 20 25 532 1309 12 En Tris-buffertlösning som hade ett pH på 9,0 fylldes på liknande sätt in i mottagningskaviteten hos de uppfinningsenliga provtagningsanordning- arna av engångstyp.

Provtagningsanordningarna som inkluderade reagenset och bufferten frystes vid -45°C och frystorkades i avsikt att erhålla provtagningsanordnlngar som inkluderade ett torkat reagens och en torkad buffert i respektive kaviteter.

En erhållen provtagningsanordning användes såsom följer: En definierad serumlplasma-provvolym drogs in i mottagningskaviteten med hjälp av kapiilär verkan. Den torkade bufferten löstes i serumet/plasman.

Provtagningsanordningen var sedan föremål för centrifugering på så sätt att det buffrade serumet/plasman tvingades in i analyskaviteten som innehåller det torkade reagenset. Den torkade reagenskompositionen löstes i serumet/plasman, varigenom pH ändrades till 8,5, och serumets/plasmans kolesterol bringades att reagera med kolesterolesteras och kolesterolde- hydrogenas såsom definieras i de kemiska reaktionerna ovan. De kemiska reaktionerna resulterade i en färgkoncentrationsföråndring. Genom transmissionsspektrometrimätningar vid 640 nm och justering för bakgrund vid 840 nm så kunde kolesteroIkoncentrationen i serum/plasma-provet kvantitativt bestämmas. Hela processen, från indragning av provet till mätningen, tar typiskt mindre än 5 minuter att utföra, vanligen cirka 2 minuter.

Figur 2 visar förhållandet mellan kolesterolbestämningen enligt föreliggande uppfinning och ett referensförfarande för slutpunktsbestämning, och såsom kan ses så är överensstämmelsen god.

Claims (16)

10 15 20 25 30 532 ÛÜE* PATENTKRAV

1. Provtagningsanordning för upptagning av ett blodprov och för tillhandahållande av blodprovet för analys av totalt kolesterol i nämnda blodprov, varvid nämnda anordning innefattar: en mottagningskavitet för mottagande, genom kapillär verkan, av blodprovet som skall analyseras, varvid nämnda mottagningskavitet har en förbestämd liten volym; och en analyskavitet, anordnad i förbindelse med mottagningskaviteten, varvid nämnda analyskavitet har en förbestämd optisk våglängd; varvid nämnda mottagningskavitet innehåller en torkad buffert, och nämnda analyskavitet innehåller ett torkat reagens; varvid reagenset som analyskaviteten innehåller innefattar kolesteroldehydrogenas; varvid analyskaviteten står i förbindelse med mottagningskaviteten på så sätt att spontant flöde av kroppsvätskan från mottagningskaviteten till analyskaviteten förhindras och på så sätt att blodet från blodprovet kan tvingas från mottagningskaviteten till analyskaviteten genom anbringande av centrifugal verkan på anordningen.

2. Anordning enligt krav 1, varvid anordningen är tillverkad av ett styvt material och analyskaviteten har en oföränderlig optisk väglängd.

3. Anordning enligt krav 1 eller 2, varvid bufferten som mottagnings- kaviteten innehåller har ett pH på 8-10, företrädesvis 9.

4. Anordning enligt något av kraven 1-3, varvid mottagningskaviteten innehåller ett vätningsmedel.

5. Anordning enligt något av kraven 1-4, varvid reagenset som analyskaviteten innehåller vidare innefattar kolesterolesteras; en eller flera substanser ur gruppen som består av diaforas, fenazin- metosulfat, fenazin-etosulfat, fenazin-fenosulfat och Meldolas blått; en eller flera substanser ur gruppen som består av NAD, NADP, tio- NAD, tio-NADP, nikotinamid-purin-dinukleotid, nikotinamid-metylpurin- dinukleotid och nikotinamid-Z-klor-metylpurin-dinukleotid; 10 15 20 25 30 532 ÜÜB IL! ett eller flera ytaktiva ämnen ur gruppen som består av polyoxietylener, alkylglukosider, tio-glukosider, sampolymer och gallsyror; och ett redox-indikatorfärgämne.

6. Anordning enligt något av kraven 1-5, varvid redox- indikatorfärgämnet är 3-(4,5-dimetyltiazol-2-1)-2,5-difenyl-2H- tetrazoliumbrornid (MTT).

7. Anordning enligt något av kraven 1-6, varvid reagenset innefattar diaforas.

8. Anordning enligt något av kraven 1-7, vidare innefattande: en inloppskavitet för upptagning av blod från ett ställe utanför anordningen genom kapillär verkan; och en centrifugeringsmottagningskavitet anordnad i förbindelse med inloppskaviteten på så sätt att spontant flöde av blodet från inloppskaviteten till centrifugeringsmottagningskaviteten förhindras och på så sätt att blodet kan tvingas in i centrifugeringsmottagningskaviteten från inloppskaviteten genom anbringande av centrifugal verkan på anordningen, varvid nämnda centrifugeringsmottagningskavitet är i kapillär förbindelse med mottagningskaviteten för åstadkommande av transport av vätska från centrifugeringsmottagningskaviteten till mottagningskaviteten genom kapillär verkan.

9. Förfarande för kvantitativ bestämning av den totala kolesterol- koncentrationen i ett blodprov av serum/plasma genom slutpunktsanalys innefattande: a) att man bringar serum/plasma i kontakt med en torkad buffert, varvid bufferten löses i blodprovet och buffrar detta; b) att man bringar en liten, definierad volym av det buffrade serumet/plasman i kontakt med ett torkat reagens, varvid nämnda reagens innefattar kolesteroldehydrogenas; kolesterolesteras; en eller flera substanser ur gruppen som består av diaforas, fenazin- metosulfat, fenazin-etosulfat, fenazin-fenosulfat och Meldolas blått; 10 15 20 25 30 532. ÛÜÉ! 15 en eller flera substanser ur gruppen som består av NAD, NADP, tio- NAD, tio-NADP, nikotinamid-purin-dinukleotid, nikotinamid-metylpurin- dinukleotid och nikotinamid-Z-klor-metylpurin-dinukleotid; ett eller flera ytaktiva ämnen ur gruppen som består av polyoxietylener, alkylglukosider, tio-glukosider, sampolymer och gallsyror; och ett redox-indikatorfärgämne; och c) att man genom transmissionspektrofotometri över en för- bestämd optisk väglängd mäter färgförändringen som orsakas av reaktionen mellan reagenset och kolesterol iden definierade volymen av det buffrade serumet/plasman i avsikt att kvantitativt bestämma kolesterolkoncentrationen däri.

10. Förfarande enligt krav 9, varvid redox-indikatorfärgämnet är 3-(4,5- dimetyltiazol-2-1)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT).

11. Förfarande enligt krav 9 eller 10, varvid mätningen genom trans- missionspektrofotometri utförs inom intervallet 630-680 nm, företrädesvis vid 640 nm.

12. Förfarande enligt något av kraven 9-11, vidare innefattande att man utför en andra transmissionspektrofotometrimätning, i avsikt att kompensera för bakgrundsstörning, vid en våglängd på över 700 nm.

13. Förfarande enligt något av kraven 9-12, varvid reagenset innefattar diaforas.

14. Förfarande enligt något av kraven 9-13, varvid den lilla, definierade volymen av den buffrade plasman eller det buffrade serumet är mellan 0,1 och 0,001 ml, företrädesvis mellan 0,03 och 0,001 ml.

15. Förfarande enligt något av kraven 9-14, varvid nämnda förfarande vidare inkluderar att man centrifugerar helblod för avlägsnade av röda blodkroppar från helblodet före steg a) för bestämning av kolesterol- koncentrationen i serum/plasma-fraktionen av nämnda helblod.

16. Förfarande enligt något av kraven 9-15, varvid mätningen utförs vid ett serum/plasma-pH på 8-9, företrädesvis 8,5.