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Technisches Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein
Verfahren zur Bestimmung des Gesamtcholesterins im Blut. Insbesondere
betrifft die Erfindung ein Probenahmevorrichtung und ein Verfahren zur
spektrophotometrischen Messung des Gesamtcholesterins im Blut.
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Technologischer Hintergrund
der Erfindung
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Cholesterin
ist ein für die Körperzellen lebenswichtiges Sterinfett,
das hauptsächlich von der Leber gebildet wird. Da Cholesterin
hydrophob ist, kann es nicht direkt im Blutstrom gelöst
und transportiert werden, sondern wird als Teil von Lipoproteinen
transportiert. Der größte Teil des Blutcholesterins,
etwa 80 Prozent, liegt als Teil von LDL (Lipoprotein mit niedriger
Dichte) – Partikeln vor, aber auch andere Lipoproteine,
wie zum Beispiel HDL (Lipoprotein mit hoher Dichte), können
Cholesterin transportieren. In der klinischen Analytik sind sowohl
der LDL- als auch der HDL-Cholesteringehalt von signifikantem Interesse,
aber auch die Gesamtkonzentration des Cholesterins im Blut ist sehr
wichtig.
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In
Zusammenhang mit der Einführung verschiedener neuer Medikamente,
wie zum Beispiel der Statine, die Ende der 1990er Jahre zur Behandlung
eines erhöhten Serumcholesterinspiegels verwendet wurden, hat
die Not wendigkeit patientennaher Verfahren sowohl bei der Untersuchung
als auch bei der Beobachtung des Cholesterins zugenommen, wobei
die klinischen Ansprüche an die Genauigkeit und Fehlerfreiheit
mit einer wünschenswerten Ungenauigkeit von um die 3% hoch
sind. Es ist offensichtlich, dass ein einfacher, schneller und temperaturunabhängiger
Test zur quantitativen Bestimmung des Gesamtcholesterins im Blut
eine wichtige Hilfe in den Arztpraxen sein kann.
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Sowohl
chemische als auch enzymatische Verfahren zur Gesamtcholesterinmessung
sind bekannt, und die Messung des Gesamtcholesterins im Plasma oder
Serum wird in Zentrallaboren in Krankenhäusern durchgeführt.
Die am häufigsten verwendete chemische Verfahren ist die
Liebermann-Burchard-Reaktion, wobei Cholesterin als ein typischer
Alkohol mit starken, konzentrierten Säuren reagiert und
eine farbige Substanz bildet. Heute werden jedoch größtenteils
enzymatische Verfahren verwendet. Die enzymatische Reaktion beginnt
mit der Hydrolyse des Cholesterinesters, bei der freies Cholesterin
entsteht, und das freie Cholesterin wird dann durch das Enzym Cholesterinoxidase
oxidiert. Dieses Enzym ist bekannt für seine gute Stabilität,
es ist einfach im Gebrauch und es ist kommerziell erhältlich.
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Ein
weiteres Enzym, das zur Cholesterinbestimmung verwendet wird, ist
Cholesterindehydrogenase, dessen Verwendung in einem analytischen
Element in der Patentveröffentlichung
EP 0 244 825 veröffentlicht ist.
Gemäß dieser Veröffentlichung muss die
Probe bei einer bestimmten Temperatur für eine vorgeschriebene Zeit
inkubiert werden. Der Gebrauch der Cholesterindehydrogenase zur
Bestimmung des Cholesterins ist beispielsweise auch in den
US-Patenten 4 892 816 und
4 181 575 veröffentlicht.
Beide Patente betreffen die Gesamtcholesterinbestimmung über
nasschemische Verfahren, die lange Inkubationszeiten und definierte
Temperaturen beinhalten.
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Um
ein neues, schnelles und einfaches Verfahren zur Gesamtcholesterinbestimmung
im Blut bereitzustellen, wurde eine Einwegvorrichtung (Mikroküvette),
die ein Trockenreagenz nach Art des ersten veröffentlichten
US-Patents 4 088 448 beinhaltet,
erforscht, da der Gebrauch dieser Art von Mikroküvette
verschiedene Vorteile bietet. Diese Mikroküvette erlaubt
die Probenentnahme einer Flüssigkeit und das Durchmischen
der Probe mit einem geeigneten Reagenz, zum Beispiel zur Farbentwicklung,
im selben Gefäß wie das, das für die nachfolgende
Messung verwendet wird. Weiterhin ist die Probenentnahme vereinfacht,
die Anzahl an Geräten ist verringert, und in den meisten
Fällen, je nach Analytikart, wird die Genauigkeit der Analyse
dadurch, dass der Analysevorgang unabhängig von der Arbeitsweise
des die Analyse durchführenden Laboranten ist, deutlich
verbessert. Der Vorgang ist auch bemerkenswert schnell, da er es
erlaubt, die flüssige Probe sofort mit dem Reagenz zu mischen
und es dann erlaubt, die Messung kurz danach durchzuführen,
ohne durch Zwischenschritte Zeit zu verlieren.
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Aufgabe der Erfindung
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Eine
Aufgabe der Erfindung betrifft eine Probenahmevorrichtung und ein
Verfahren zur einfachen quantitativen Bestimmung des Gesamtcholesterins
im Blut.
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Eine
andere Aufgabe der Erfindung betrifft eine Probenahmevorrichtung
und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Gesamtcholesterins
im Blut, die bei Raumtemperatur durchgeführt werden kann.
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Eine
andere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Probenahmevorrichtung
bereitzustellen, die eine Cholesterinreagenzzusammensetzung einschließt,
die über einen längeren Zeitraum gelagert werden
kann.
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Noch
eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Probenahmevorrichtung
zur raschen quantitativen Bestimmung des Gesamtcholesterins im Blut
bereitzustellen.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Probenahmevorrichtung
zur quantitativen Grenzpunktbestimmung des Gesamtcholesterins im
Blut bereitzustellen.
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Noch
eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Probenahmevorrichtung
zur quantitativen Bestimmung des Gesamtcholesterins im Serum/Plasma
bereitzustellen, wobei unverdünntes Vollblut in die Vorrichtung
eingebracht wird.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Bei
der Entwicklung der erfinderischen Probeentnahmevorrichtung und
des Verfahrens scheiterten verschiedene Versuche, die Cholesterinoxidase
in einer Mikroküvette gemäß des
US-Patents 4 088 448 (wie oben
beschrieben) zu verwenden, und keine reproduzierbaren Ergebnisse
konnten erreicht werden. Es wird angenommen, dass diese Fehler dadurch
begründet sind, dass der Aufbau der Mikroküvette
mit der Kapillaröffnung in der Mikroküvette eine
bestimmte Reaktionsumgebung schafft, und dass diese Umgebung für
Reaktionen mit der Cholesterinoxidase nicht geeignet ist.
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Das
andere Enzym, Cholesterindehydrogenase, funktionierte ebenfalls
nicht zufriedenstellend in Kombination mit den anderen Reagenzien,
die zur Cholesterinbestimmung nötig sind. Es wurde jedoch
unerwarteterweise gefunden, dass, falls ein Pufferreagenz, das für
die Reaktion benötigt wird, vom Rest der Reagenzzusammensetzung,
die die Dehydrogenase in der Vorrichtung beinhaltet, getrennt wurde,
eine erfolgreiche, temperaturunabhängige quantitative Grenzpunktbestimmung
des Gesamtcholesterins erreicht werden konnte.
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Es
wurde daher gefunden, dass die oben genannten Aufgaben vollständig
oder teilweise durch eine erfinderische Probenahmevorrichtung und,
wie unten dargelegt, durch die Anwendung eines erfinderischen Verfahrens
erreicht werden.
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Die
erfinderische Probenahmevorrichtung ist eine Probenahmevorrichtung
zum Aufnehmen einer Blutprobe und zum Bereitstellen der Blutprobe
zur Analyse des Gesamtcholesterins in besagter Blutprobe, wobei
die Vorrichtung umfasst: einen Aufnahmehohlraum zum Aufnehmen durch
Kapillarwirkung der zu analysierenden Blutprobe, wobei der Aufnahmehohlraum
ein vorbestimmtes kleines Volumen hat; und einen Analysehohlraum,
der in Verbindung mit dem Aufnahmehohlraum angeordnet ist, wobei
der Analysenhohlraum eine vorbestimmte optische Weglänge
hat; wobei der bezeichnete Aufnahmehohlraum einen Trockenpuffer,
und der Analysehohlraum enthält ein Trockenreagenz enthält.
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Das
erfinderische Verfahren ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung
der Gesamtcholesterinkonzentration über die Grenzpunktanalyse
in einer Serum/Plasma-Blutprobe, umfassend:
- a)
Kontaktieren des Serums/Plasmas mit dem Trockenpuffer, wobei der
Puffer in der Blutprobe gelöst wird und diese dabei puffert;
- b) Kontaktieren eines kleinen, definierten Volumens des gepufferten
Serums/Plasmas mit einem Trockenreagenz, wobei das Reagenz Cholesterindehydrogenase
beinhaltet; Cholesterinesterase; eine oder mehrere Substanzen der
Gruppe, die sich aus Diaphorase, Phenazinmethosulfat, Phenazinethosulfat,
Phenazinphenosulfat und Meldolablau zusammensetzt; eine oder mehrere
Substanzen aus der Gruppe, die sich aus NAD, NADP, Thio-NAD, Thio-NADP,
Nikotinamidpurindinukleotid, Nikotinamidmethylpurindinukleotid und
Nikotinamid-2-Chloromethylpurindinukleotid zusammensetzt; ein oder
mehrere Tenside aus der Gruppe, die sich aus Polyoxiethylenen, Alkylglukosiden,
Thioglukosiden, Copolymeren und Gallensäure zusammensetzt;
und ein Redoxindikatorfarbstoff; und
- c) Messen des durch die Reaktion des Reagenz mit dem Cholesterin
im definierten Volumen des gepufferten Serums/Plasmas hervorgehenden
Farbwechsels durch Transmissionsspektrophotometrie über
eine vorbestimmte optische Weglänge, um die darin enthaltene
Cholesterinkonzentration quantitativ zu bestimmen.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt
eine schematische Vorderansicht einer Ausführungsform der
erfinderischen Probenahmevorrichtung. 1 veranschaulicht
auch schematisch eine Ausführungsform des Verfahrens zur
Verwendung dieser Probenahmevorrichtung.
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2 zeigt
ein Diagramm, das den Zusammenhang zwischen der Cholesterinbestimmung
gemäß einer Ausführungsform des erfinderischen
Verfahren und eines Referenzverfahrens darlegt.
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Genaue Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Gesamtcholesterinbestimmung
in kleinen Blutvolumina. In diesem Zusammenhang soll unter dem Ausdruck „Blut” Vollblut,
Plasma und/oder Serum verstanden werden. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Blut,
das in die Vorrichtung eingebracht wird, weder verdünnt
noch vorbehandelt. Der Ausdruck „kleine Volumina” meint
Volumina zwischen 0,1 und 0,001 ml, bevorzugt zwischen 0,03 und
0,001 ml.
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Die
Bezeichnung „Serum/Plasma” oder „Plasma/Serum” umfasst
Blutserum, Blutplasma und zwischenliegende Zustände. Der
Grund dafür, dass manchmal ein Teil des Blutes nicht ausdrücklich
als „Serum” oder „Plasma” bezeichnet
wird, ist, dass, wenn eine Blutprobe ohne Zugabe von Antigerinnungsmitteln
analysiert wird, eigentliches Serum keine Zeit hat, sich innerhalb
weniger Minuten nach der Gewinnung des Blutes von dem Patienten
zu bilden, und die Messung nach dem Entfernen der Blutzellen in
einem Zwischenzustand zwischen Plasma und Serum durchgeführt
wird. Wenn das Entfernen der Zellen und die Messung fast direkt nach
der Gewinnung des Blutes von dem Patienten durchgeführt
werden, wird die Messung im Wesentlichen mit Plasma durchgeführt.
Eine Blutkomponente, die sowohl im Plasma als auch im Serum vorkommt,
wird durch das Entfernen des Fibrinogens aus dem Serum in einer
um 3% geringeren Konzentration im Plasma als im Serum vorliegen.
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In
dieser Anmeldung soll der Ausdruck „Hohlraum” als
durch Wandoberflächen definiertes Volumen oder Kammer verstanden
werden. Die Hohlräume (Volumina) der Vorrichtung gemäß der
vorliegenden Erfindung sind dagegen nicht vollständig durch
diese Oberflächen definiert oder eingeschlossen, sondern
haben Einlässe und/oder Auslässe, an denen die
Oberflächen nicht vollständig aneinander gefügt
sind. Die Hohlräume (Volumina) sind gewöhnlich
nicht evakuiert, sondern können ein Gas (üblicherweise
Luft), ein getrocknetes Reagenz und/oder einen Puffer, eine Flüssigkeit
(wie beispielsweise eine Blutprobe, wenn die Vorrichtung in Gebrauch
ist), und so weiter enthalten.
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Die
Probenahmevorrichtung der vorliegenden Erfindung ist so gestaltet,
dass sie den getrockneten Puffer getrennt von dem getrockneten Reagenz
enthält, so dass es möglich ist, das Reagenz bei
einem pH unabhängig des pHs des Puffers zu halten, während
das Reagenz in getrockneter Form (zum Beispiel während
Lagerung der Probenahmevorrichtung) vorliegt. Durch die Möglichkeit,
den Reagenz-pH zur Lagerungsstabilität ungeachtet des optimalen
Reagenz-pHs zur Reaktion mit einer Blutprobe zu optimieren, kann
die Haltbarkeitsdauer der erfindungsgemäßen Vorrichtung
in hohem Maße verbessert werden. Dies kann durch Ausstattung
der Probenahmevorrichtung mit einer Mehrzahl von Hohlräumen
erreicht werden.
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Anders
ausgedrückt, wenn eine Blutprobe zunächst mit
dem Puffer in Kontakt kommt, den sie löst, und dann mit
dem Reagenz in Kontakt kommt, das sie ebenfalls löst, sind
die Reagenzkomponenten nur dem pH ausgesetzt, der durch den Puffer
nach Kontakt mit der Blutprobe verursacht wurde. Da das getrocknete
Reagenz sich zu dem Zeitpunkt, zu dem es mit der Probe reagieren
soll, nur in Kontakt mit dieser befindet, werden Probleme mit der
Langzeitstabilität der Reagenzkomponenten bei dem durch
den Puffer verursachten pH in dieser Probenahmevorrichtung verhindert.
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In
seiner einfachsten Form wird eine Serum/Plasma-Probe in die Probenahmevorrichtung
eingebracht, wobei in diesem Fall nur der Aufnahme- und Analysehohlraum
benötigt werden. In seiner kommerziell interessantesten
Form wird jedoch eine Probe unverdünnten Vollblutes in
die Vorrichtung eingebracht. In diesem Fall muss die Vorrichtung
so gestaltet sein, dass sie zusätzliche Hohlräume,
die zum Entfernen der Blutzellen der Probe durch Zentrifugieren
ausgerichtet sind, umfasst, da die Zellen die Cholesterinbestimmung
behindern, wenn sie in dem Analysenhohlraum vorliegen. Eine Vorrichtung,
die das Entfernen von Blutzellen durch Zentrifugieren beschreibt,
und die verwendet werden könnte, ist beispielsweise die
Vorrichtung des
US-Patentes 5,472,671 (die
hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen wird).
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Der
Aufnahmehohlraum hat ein vorbestimmtes Volumen, das es erlaubt,
ein vorbestimmtes, unveränderliches Volumen an Blut (Serum/Plasma)
aufzunehmen, das dann zu dem Analysenhohlraum transferiert wird.
Dies stellt sicher, dass ein bestimmtes und bekanntes Volumen mit
dem Trockenreagenz in dem Analysenhohlraum reagiert.
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Der
Analysenhohlraum hat eine vorbestimmte optische Weglänge,
die sicherstellt, dass, wenn ein Photometer zur Erlangung eines
Messwertes verwendet wird, dieser Wert direkt mit der Cholesterinkonzentration
einer Blutprobe zusammenhängt.
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Für
die Gesamtcholesterinbestimmung in einer Serumfraktion sollte das
erfindungsgemäße Verfahren auch das Zentrifugieren
von Vollblut zum Entfernen von Blutzellen und Fibrinogen aus dem
Vollblut umfassen, bevor das so erhaltene Serum mit dem Trockenreagenz
in der Probenahmevorrichtung in Kontakt kommt.
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In ähnlicher
Weise sollte zur Gesamtcholesterinbestimmung in einer Plasmafraktion
das erfindungsgemäße Verfahren den Kontakt von
unverändertem Vollblut mit einem Antigerinnungsmittel und
einem Zentrifugieren der erhaltenen Mischung zum Entfernen von Blutzellen
umfassen, bevor das so erhaltene Plasma mit dem Trockenreagenz in
der Probenahmevorrichtung in Kontakt gerät.
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Diese
vorbereitenden Schritte können, wobei das Zentrifugieren
optional durch die Benutzung eines Antigerinnungsmittels vorgeschaltet
wird, durchgeführt werden, bevor die Blutprobe in die Probenahmevorrichtung
eingebracht worden ist, oder nach dem Einbringen von Vollblut durch
beispielsweise Zentrifugieren der Probenahmevorrichtung. In diesem
letzteren Fall kann, mit Bezug auf 1 eine Probenahmevorrichtung,
die vier Hohlräume umfasst, angewendet werden: einen ersten
Hohlraum 1 (einen Einlasshohlraum), der über einen
Einlass mit der Umgebung der Probenahmevorrich tung in Verbindung
steht, und der optional einen Trockenzusatz wie zum Beispiel ein
Feuchthaltemittel und/oder ein Antigerinnungsmittel umfasst, zum
Aufnehmen einer Blutprobe, bevorzugt Vollblut, durch Kapillarwirkung
von außerhalb der Vorrichtung; einen zweiten Hohlraum 2 (einen
Zentrifugier-Aufnahmehohlraum), der vorzugsweise nicht kapillar
ist, der mit dem ersten Hohlraum 1 verbunden ist und in
den die Probe durch Zentrifugieren übertragen werden kann;
einen dritten Hohlraum 3 (der Aufnahmehohlraum), der vorzugsweise
kapillar ist und der den Trockenpuffer und optional ein Feuchthaltemittel
umfasst, der mit dem zweiten Hohlraum 2 in Verbindung steht
und in den die Serum-/Plasma-Fraktion der Probe durch Kapillarwirkung
nach dem Ende des Zentrifugierens übertragen werden kann; und
einen vierten Hohlraum 4 (der Analysenhohlraum), der mit
dem dritten Hohlraum 3 verbunden ist, und in den die Probe über
Zentrifugieren übertragen werden kann, und der das Trockenreagenz
enthält.
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Ein
bevorzugter Gebrauch der obigen Vierhohlraumvorrichtung ist es,
Vollblut direkt von einem eingestochenen Finger des Patienten in
die Vorrichtung einzubringen. Mit Bezug auf 1 wird das
Blut zuerst durch Kapillarwirkung in den Einlasshohlraum 1 eingesogen,
Schritt 10. Dieses kann durch ein Feuchthaltemittel in
trockener Form unterstützt werden, das bei der Herstellung
der Vorrichtung in den Einlasshohlraum 1 eingebracht worden
ist, und dadurch, dass die Vorrichtung eine spitz zulaufende Gestaltung
hat, die einen Punkt an dem Einlass des Einlasshohlraums 1 vorsieht,
der den Kontakt mit dem Blut des eingestochenen Fingers herstellen
kann. Die Vorrichtung kann dann einem Zentrifugieren, Schritt 11,
unterworfen werden, so dass das Blut von dem Einlasshohlraum 1 in
den Zentrifugier-Aufnahmehohlraum 2 übertragen
wird, und so, dass die Blutzellen des Blutes im Wesentlichen von
dem Plasma getrennt werden, Schritt 12. Am Ende des Zentrifugierens
wird das Blutplasma über Kapillarwirkung von dem Zentrifugier-Aufnahmehohlraum 2 in
den Aufnahmehohlraum 3 gezogen, Schritt 13, wo
sich getrockneter Puffer in einem bestimmten Volumen des Plasmas, das durch
das Volumen des Ausfnahmehohlraums 3 bestimmt ist, schnell
löst. Nachdem sich der Puffer in dem Plasma gelöst
hat, wobei er dieses puffert, wird die Vorrichtung wieder einem
Zentrifugieren unterworfen, Schritt 14, wobei das gepufferte
Plasma zu dem Analysenhohlraum 4 übertragen wird,
wo das Trockenreagenz zur Cholesterinbestimmung in dem gepufferten
Plasma gelöst wird. Nach der Reaktion mit dem Reagenz wird über
Absorptionsphotometrie das Gesamtcholesterin des Plasmas bestimmt.
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Die
Probenahmevorrichtung soll wegwerfbar sein, dass heißt,
sie ist so konzipiert, dass sie nur einmal verwendet wird. Die Probenahmevorrichtung
sieht ein Kit, das vor dem Gebrauch über einen langen Zeitraum haltbar
gelagert werden kann, zur Gesamtcholesterinbestimmung vor, da die
Probenahmevorrichtung dazu fähig ist, eine flüssige
Probe aufzunehmen und alle benötigten Reagenzien beinhaltet,
um die Probe einer Cholesterinmessung zu unterziehen. Dies ist insbesondere
dann nötig, wenn die Probenahmevorrichtung nur zum Einmalgebrauch
vorgesehen ist und ohne Rücksicht auf Möglichkeiten
die Probenahmevorrichtung zu reinigen und das Reagenzes wiederzuverwenden
ausgebildet ist. Identische Einheiten der erfindungsgemäßen
Probenahmevorrichtung können mit einer sehr geringen Abweichungstoleranz
in Massen produziert werden, wobei Messungen, die durch Gebrauch
einer bestimmten Einheit gemacht wurden, direkt mit Messungen, die
durch den Gebrauch anderer Einheiten derselben erfindungsgemäßen
Probenahmevorrichtung gemacht wurden, verglichen werden können.
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Die
Probenahmevorrichtung kann auch aus einem Plastikmaterial geformt
werden und dadurch zu geringen Kosten hergestellt werden. Dabei
kann der Gebrauch von wegwerfbaren Probenahmevorrichtungen immer
noch kosteneffizient sein.
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Weiterhin
kann die Vorrichtung durch die Bildung der Probenahmevorrichtung
aus einem unbiegsamen Plastikmaterial nicht während der
Bedienung und des Gebrauchs der Vorrichtung verformt werden, so dass
unveränderliche Volumina und Formen der Vorrichtungshohlräume
nach der Herstellung gewährleistet werden, und folglich
auch eine unveränderliche optische Weglänge gewährleistet
wird.
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Gemäß einer
Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens werden die folgenden Reaktionsschritte mit den angegebenen
Reagenzinhaltsstoffen durchgeführt:
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Die
Inhaltsstoffe des Trockenreagenz sind nicht auf die, die in dem
obigen Reaktionsschema beispielhaft dargestellt sind, beschränkt,
sondern werden unten detaillliert erörtert.
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Die
Cholesterinesterase kann aus verschiedenen Spezies, die verschiedene
Molargewichte, pH-Optima, usw. haben, erhalten werden.
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Das
Coenzym kann NAD, bevorzugterweise β-NAD, NADP, Thio-NAD,
Thio-NADP, Nikotinamidpurindinukleotid, Nikotinamidmethylpurindinukleotid
und Nikotinamid-2-Chloromethylpurindinukleotid sein.
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Auch
die Cholesterindehydrogenase kann aus verschiedenen Spezies, die
unterschiedliche Molargewichte, pH-Optima, usw. haben, erhalten
werden. Beispiele von Veröffentlichungen, die die Cholesterindehydrogenase
betreffen, sind die offengelegten
japanischen
Patente Nr. 89 138/1983 und
89 200/1983 , in denen die Darstellung
von Cholesterindehydrogenase offenbart ist. In dem erfindungsgemäßen
Verfahren umfasst Cholesterindehydrogenase nur von NAD- oder NAD-Analogen
abhängige Enzyme.
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Diaphorase
kann ebenfalls aus verschiedenen Spezies erhalten werden und ist
kommerziell erhältlich. Diaphorase jedoch kann durch bekannte
Substanzen ersetzt werden, wie etwa Phenazinmethosulfat, Phenazinethosulfat,
Phenazinphenosulfat, Meldolablau, usw. Es gibt außerdem
andere bekannte NAD-Analoge, wie etwa das äußerst
bekannte NADP, das durch die Cholesterindehydrogenase-Reaktion reduziert
werden kann und das die Reduktion auf ein Pigment oder Farbsystem überträgt.
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MTT
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-1)-2,5-DiPhenyl-2-H-Tetrazolinbromid)
ist ein Beispiel eines Redoxindikatorpigments, das gute Ergebnisse
erzielt, wenn es in dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet wird, obwohl viele andere Tetrazoline benutzt werden können.
Es gibt außerdem etliche andere bekannte Arten farbwechselnder
Substanzen, die dazu imstande sind, ihre Farbe zu wechseln, wenn
NADH und Diaphorase auf sie wirken. Tetrazolinverbindungen sind
insofern vorteilhaft, da das Formazanpigment unter normalen Reaktionsbedingungen
irreversibel gebildet wird.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform wird MTT als Redoxindikatorpigment
verwendet, wobei der Absorptionskoeffizient in dem Bereich 630–680
nm gemessen wird, insbesondere bei 640 nm mit einer Messung zur
Hintergrundkorrektur in dem Bereich 700–900 nm oder insbesondere
bei 700 nm oder 840 nm.
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Die
Wellenlänge zur Messung des Absorptionskoeffizienten hängt
von dem verwendeten Redoxpigment ab. Bei Pigmenten, die zum Gebrauch
gemäß des erfindungsgemäßen
Verfahrens geeignet sind, kann die Wellenlänge zwischen
500 und 750 nm variieren.
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Das
Reagenz kann zusätzlich nichtionische Tenside wie Polyoxyethylene
und/oder Alkylglukoside und/oder Thio-Glukoside und/oder Copolymere
und/oder anionische Tenside wie Gallensäuren oder Enzyme wie
Phospholipase als Agenzien zur Lipoproteinlyse enthalten. Tenside
können zusätzlich zur Benetzung der Trockenreagenzmatrix
verwendet werden. Idealerweise sollten die Tenside die folgenden
Merkmale besitzen:
- 1. Bewirken von schnellem
Setzen des Trockenreagenz durch Reduktion der Oberflächenspannung.
- 2. Lysieren des Lipoproteins, um Cholesterin und Cholesterinester
freizusetzen.
- 3. Löslichhalten des gebildeten Formazans.
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Die
Inhaltsstoffe der verschiedenen Bestandteile in der Trockenreagenzzusammensetzung
sind nicht kritisch, sollten aber vorzugsweise, gerechnet auf eine
Probe von 1 ml unverdünnten Vollbluts, in den folgenden
Bereichen liegen:
| Substanz | Menge |
| Cholesterinesterase | 20–5000
U/ml |
| Cholesterindehydrogenase | 20–5000
U/ml |
| Diaphorase
(/Analoge) | 20–50000
U/ml |
| β-NAD
(/Analoge) | 12–100
mmol/ml |
| Redoxindikatorpigment/Tetrazolinsalz
(MTT-Br) (/Analoge) | 12–25
mmol/ml |
| Triton
X-100 | 0,1–5%
(w/w) |
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Die
obigen Substanzen werden zur Bildung einer Suspension vermischt,
die in dem Analysenhohlraum der erfindungsgemäßen
Probenahmevorrichtung gefriergetrocknet werden.
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Die
Erfindung wird durch die folgenden, nicht beschränkenden
Beispiele beschrieben.
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Beispiel
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Cholesterinbestimmung
im Serum/Plasma.
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Eine
Reagenzlösung, die 1% Triton X-100 in Wasser enthält,
wurde hergestellt. MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-1)-2,5-DiPhenyl-2-H-Tetrazolinbromid)
wurde zu der Lösung hinzugefügt und solange gemischt, bis
das MTT gelöst war. Eine wässrige Lösung
aus Cholesterindehydrogenase, Cholesterinesterase, Diaphorase und β-NAD
wurde zu der erhaltenen Lösung hinzugefügt und
3–6 μl wurden in den Analysenhohlraum 4 der
erfindungsgemäßen wegwerfbaren Probenahmevorrichtung
eingefüllt.
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1
ml der Reagenzzusammensetzung umfasst:
| 200
U | Cholesterinesterase,
Genzyme |
| 200
U | Cholesterindehydrogenase,
Amano |
| 1700
U | Diaphorase,
Unitika |
| 20
mM | β-NAD,
Sigma |
| 15
mM | MTT-Br,
Acros |
| 10
mg | Triton
X-100, Merck |
| 1 ml | destilliertes
Wasser |
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Eine
Tris-Pufferlösung mit einem pH von 9,0 wurde auf ähnliche
Art in den Aufnahmehohlraum 3 der erfindungsgemäßen
wegwerfbaren Probenahmevorrichtung eingefüllt.
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Die
Probenahmevorrichtungen, die das Reagenz und den Puffer umfassen,
wurden bei –45°C gefroren und gefriergetrocknet,
um Probenahmevorrichtungen zu erhalten, die in den entsprechenden
Hohlräumen ein Trockenreagenz und einen getrockneten Puffer
umfassen.
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Eine
erhaltene Probenahmevorrichtung wurde wie folgt verwendet:
Ein
definiertes Serum-/Plasmaprobenvolumen wurde durch Kapillarwirkung
in den Aufnahmehohlraum 3 gezogen. Der Trockenpuffer löst
sich in dem Serum/Plasma. Die Probenahmevorrichtung wurde dann zentrifugiert,
so dass das gepufferte Serum/Plasma in den Analysenhohlraum 4,
der das Trockenreagenz enthält, gedrückt wird.
Die Trockenreagenzzusammensetzung löst sich in dem Serum/Plasma,
wobei sich der pH zu 8,5 verändert, und das Serum/Plasma,
wie in den obigen chemischen Reaktionen beschrieben, mit Cholesterinesterase
und Cholesterindehydrogenase reagiert. Die chemischen Reaktionen
führen zu einer Veränderung der Pigmentkonzentration.
Die Konzentration des Cholesterins in der Serum/Plasma-Probe kann
durch Transmissionsspektroskopiemessungen bei 640 nm und Hintergrundsausgleich
bei 840 nm bestimmt werden. Der Gesamtprozess vom Einziehen in die
Probe bis zur Messung benötigt typischerweise weniger als
fünf Minuten zum Durchführen, gewöhnlich
etwa zwei Minuten.
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2 zeigt
die Beziehung zwischen der Cholesterinbestimmung gemäß der
vorliegenden Erfindung und einem Referenzverfahren zur Endpunktbestimmung,
wobei die Übereinstimmung, wie man sieht, gut ist.
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Zusammenfassung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Probenahmevorrichtung zum Aufnehmen
einer Blutprobe und zum Bereitstellen der Blutprobe zur Gesamtcholesterinanalyse
in der Blutprobe. Die Vorrichtung umfasst einen Aufnahmehohlraum
(3) zum Aufnehmen der zu analysierenden Blutprobe durch
Kapillarwirkung, wobei der Aufnahmehohlraum (3) ein vorbestimmtes
kleines Volumen aufweist; und einen Analysenhohlraum (4),
der so angeordnet ist, dass er in Verbindung mit dem Aufnahmehohlraum
(3) steht, wobei der Analysenhohlraum (4) eine
vorbestimmte optische Weglänge aufweist. Der Aufnahmehohlraum
(3) beinhaltet einen Trockenpuffer und der Analysenhohlraum
(4) beinhaltet ein Trockenreagenz. Die Erfindung betrifft
außerdem ein Verfahren zur quantitativen Gesamtcholesterinbestimmung
durch Endpunktanalyse in einer Serum-/Plasma-Blutprobe.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
-
- - EP 0244825 [0005]
- - US 4892816 [0005]
- - US 4181575 [0005]
- - US 4088448 [0006, 0013]
- - US 5472671 [0025]
- - JP 89138/1983 [0039]
- - JP 89200/1983 [0039]
